Summary
在这里，我们描述了一种新方法，通过注射葡萄糖，检测两种副生物的共享血液循环的成功建立，这种注射对副生子的损害最小，而且对寄生虫没有致命。
Abstract
寄生虫症是一种实验方法，将两种平行动物沿着身体的纵轴进行手术结合。我们提出了一个方案，用于检测通过注射葡萄糖的胆热静脉在副生物中成功建立血性。建造了益生菌小鼠。通过尾静脉将葡萄糖注射到供体小鼠中，并在不同时间点使用血胶仪测量两只小鼠的血糖水平波动。结果表明，葡萄糖注射后，供体小鼠血糖水平在1分钟后急剧上升，此后缓慢下降。同时，受体小鼠的血糖水平在注射后15分钟达到峰值。与埃文斯蓝，用作葡萄糖的阳性对照获得类似的结果。血糖水平的同步波动表明两小鼠之间的血流成功。
Introduction
寄生虫症是一种建模方法，其中两个活生物体通过手术连接，并发展成为一个与共享循环系统1的单一生理系统。由于单个个体产生的物质可以通过共享循环系统同时作用于两种动物，因此这些模型已广泛用于生理学研究。自19世纪中叶保罗·伯特2号开创的益生菌实验以来，构建生物模型的方法已经标准化。然而，一个简单方便的方法，以验证成功建立血性。据报道，交叉循环可以通过在其中一种副生物中注射0.5%埃文斯蓝色染料，然后用微孔板读取器3测量两种副生物血液中的Evans蓝色吸收率，从而成功地评估。另一种方法需要特定小鼠品种，其中包含 CD45.1+- 和 CD45.2=- 标记单核细胞在每个寄生虫中。然后，细胞细胞测定通过测量脾脏或血液4中单核细胞中的两个标记的频率来确定血液的血性。然而，这些方法往往对动物是致命的或繁琐的，并且非常需要一种安全而简单的方法来快速可靠地验证副生物模型。在这项研究中，我们建立了一种用于此目的的新方法，在寄生虫化小鼠模型中进行了验证。从尾静脉抽取的血液样本中的葡萄糖浓度使用胶质测定仪进行测量，供体小鼠和受体小鼠的葡萄糖水平变化模式被认为是循环性血球症的征兆。我们给这种方法命名为"葡萄糖波动法"。这种验证方法的应用并不仅限于小鼠，但可以扩展到不同的病理模型，但那些葡萄糖代谢严重调节不良的模型除外。该过程简单、省时且安全。
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Protocol
所有涉及动物及其护理的程序均经哈尔滨医科大学动物护理与使用委员会批准。
注：该方法所需的工具和设备列在材料表中。
1. 材料和动物的制备
- 从标准实验室动物供应商处订购重量在 20 g-25 g 之间的 C57BL/6 雄性小鼠。
- 将小鼠以12小时光的周期内房屋：在24~26°C下黑暗12小时，并可获取水和食物。
2. 寄生虫症
- 通过注射20克/L 2，2，2-三溴二醇，浓度为0.1 mL/10 g，麻醉小鼠。
- 用Q-tip涂抹眼膏，以防止眼睛干燥。
- 如前所述5.5进行寄生虫化手术。
- 将鼠标置于上等位置。用电动护眼把从肘部上方约 1 厘米开始，到膝盖下方 1 厘米，彻底擦去一只鼠标的左侧和另一只鼠标的右侧。使用脱毛霜完全清除被擦过的皮肤上的毛皮。
- 用碘化物擦拭被刮掉的区域。将鼠标放在由无菌垫覆盖的加热垫上。
- 使用一把锋利的剪刀，在每个动物的被割的一侧，使用一把锋利的剪刀，从肘部上方0.5厘米到膝盖关节以下0.5厘米，创建纵向皮肤切口。
- 在切口后轻轻地将皮肤从皮下筋膜上分离。
- 用3-0缝合连接副生子的油原和膝盖。
- 用连续的5-0缝合被修过的皮肤。
- 将 0.5 mL 0.9% NaCl 下皮注射到每只小鼠，以防止脱水。
- 将曲马多（10毫克/25克/天）肌肉内注射到每只小鼠，以减轻疼痛。
3. 循环奇默主义的验证
- 葡萄糖波动法
注：在寄生虫病手术后第10天，使用葡萄糖波动法（无禁食）验证副生间循环性的成功构建。- 以0.1 mL/10g的浓度向每只小鼠注射20克/升2，2，2-三溴二苯醚，对副生子进行麻醉。
- 将捐赠小鼠固定在静脉视觉鼠标尾部固定器中。
- 用浸泡在70-75%酒精中的棉球擦去一个副生物尾部侧侧的牛静脉，以清洁尾巴和粘长血管。
- 将含有葡萄糖的1.0 mL注射器放在右手处，保持针头与静脉平行（小于15°）。
- 将针头插入距尾端约 2⁄4 厘米的位置。
- 在10秒内向供体注射100μL葡萄糖（1.2克/千克）。
注：术语供体是指通过尾静脉接受葡萄糖注射的寄生虫。接受者是另一个副生，不直接接受葡萄糖。 - 用碘化物清洁脚趾。用剪刀切断供体小鼠和受赠小鼠的脚趾，在注射葡萄糖后的不同时间点采集一滴血（1分5分、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟和60分钟）。在每个采集时间点取出血块，以避免更多的损害。
注：一次检查采集的血液量为10-25 ul，总为90-225 ul。 - 将血液滴入血糖仪测试条的中心，以检测血糖水平。
- 使用埃文的蓝色计数器作为正控制3。
- 将200 μL的0.5%埃文的蓝色反染色内环注射到供体小鼠中。
- 2小时后，以0.2 mL/10g的浓度向每只小鼠注射20克/L 2，2，2-三溴二苯丙醇，对副生子实施安乐死，并通过心脏穿刺从两种副生物中采集血液。
- 在916 x g下将血液样本离心15分钟。
- 从上清液收集血清。
- 在1：50用0.9%NaCl稀释血清。
- 使用分光光度计测量620nm稀释血清样品的吸光度。
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Representative Results
在6只供体小鼠中，通过尾静脉注射100μL葡萄糖（1.2克/千克）后，血糖水平急剧上升至26.5μmol/L（173%增加），然后逐渐降至13.3μmol/L，60分钟。在受体小鼠中，注射后血糖缓慢升高，并在15分钟达到第一峰水平（增加47%，12.2μmol/L）。根据上述结果，循环血球化的标准设定如下：1）注射葡萄糖后1分钟内供体小鼠血糖水平急剧上升（至少增加100%或>20 μmol/L），2）注射后15分钟受体小鼠血糖水平显著增加（至少增加37%）（图1）。
在副生子血清中，Evans蓝色染料的浓度也表明循环性血症的构建成功（图2）。我们使用5 mL的2，2，2-三溴二苯醚（20克/升）在血糖测量后对副生物进行安乐死。清晰可见副生之间的皮下血管结（图3）。
补充图1显示，供体小鼠在葡萄糖注射后血糖水平显著升高1分钟，而受体小鼠的血糖水平未升高，表明在益生菌手术后1天内未成功建立副生物循环性。同样，受体小鼠的血液OD水平没有供体小鼠的血液OD水平高（补充图2）。
根据葡萄糖波动法的结果，发现两对副生在益生菌手术后15天未建立血性。如补充表1所示，两名受体小鼠在将葡萄糖注射到供体小鼠后60分钟内血糖水平没有增加。两位受试者的埃文斯蓝血浓度也没有升高（补充表2），这表明葡萄糖波动法与埃文斯蓝法一样敏感。
此外，为了评估注射葡萄糖对胰岛素代谢的影响，我们在小鼠中注射100μL（1.2克/千克）后检测出血液胰岛素水平为1小时3小时（补充图3）。葡萄糖注射后，血液胰岛素水平显著下降1小时，葡萄糖迅速增加，3小时恢复到正常水平。这些结果表明，我们注射的葡萄糖对胰岛素代谢的影响是可恢复的。
图1：通过牛脉注射葡萄糖后，副生子的血糖水平变化。（A） 供体小鼠的血糖水平.（B） 受体小鼠的血糖水平 （n = 6）。数据以平均值形式显示，SEM._p < 0.05、#p < 0.01、#p < 0.001 vs. 0 分钟。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：由微板读取器测量的寄生虫血清样本中埃文斯蓝的浓度。数据以平均值 = SEM. _p < 0.001 （n = 6） 表示。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：在副生间相连的皮肤中产生皮下血管冈体。左图：寄生虫化小鼠的代表性图像。右图：副生间皮下血管的代表性图像。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图1：在寄生虫化手术后1天对副生子的血糖水平进行了检测。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图2：在益生菌手术后1天，由微孔板读取器在寄生虫血清中测量的Evans蓝色浓度。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图3：葡萄糖注射后小鼠血清中胰岛素的浓度。请点击此处查看此图的较大版本。
| 0 分钟 | 5分钟 | 15分钟 | 20分钟 | 40分钟 | 60分钟 | |
| 捐助者-1 | 5.7 | 26.2 | 21.2 | 17.6 | 16.9 | 15.4 |
| 收件人-1 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
| 捐助者-2 | 8.4 | 25.5 | 21.1 | 20.5 | 17.4 | 13.8 |
| 收件人-2 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
补充表1：寄生虫的血糖水平（μmol/L）在益生菌手术后15天。
| 控制-1 | 捐助者-1 | 收件人-1 | 控制-2 | 捐助者-2 | 收件人-2 | |
| OD 值 | 0.059 | 0.935 | 0.062 | 0.068 | 0.862 | 0.073 |
补充表2：在寄生虫化手术后15天，在寄生虫中，Evans蓝色（OD值）的血液浓度。
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Discussion
寄生虫学是指通过实验方法6、7、8连接两只活体动物建立共同血管系统的外科技术。该模型的优点是，单个个体产生的物质可以同时作用于两种动物。因此，寄生虫病模型可用于探索物质或因素在相关疾病中的作用，得出许多有意义的创新结论。鉴于其巨大的应用价值，该模型使人们对心血管系统疾病8、9、10、11、12、13、神经系统疾病14、15、器官移植16、糖尿病17、18有了更好的了解。
然而，对成功建立循环寄生虫病的验证是研究寄生虫病的第一步和决定性的一步。目前的研究已经报道了一些检测循环性检测方法。Loffredo等人4报告说，通过测量供体（CD45.1+）和受体（CD45.2+）小鼠中具有不同标记标记的脾脏单核细胞的混合频率，在益生菌对中确认血性。在这种方法中，每个副生物的CD45.1+- 或CD45.2+标记的单核细胞用于寄生虫化。细胞细胞测量需要通过测量标记血细胞的整合来确定血液的血性。此外，Marta等人3通过在其中一种副生物中注射200μL的0.5%埃文斯蓝色染料来评估交叉循环。两种副生血的血液在2小时后通过心脏穿刺采集。血液分裂是由受体小鼠的Evans蓝色浓度增加决定的，这是由微板读取器测试的。虽然这些策略使我们能够确定血性，但仍有许多不可忽视的局限性。首先，对于致命方法，血液杀伤症只能在处决时确认。然而，在我们的方法中，在寄生虫病手术后随时可以测试造血术的建立。与不成功的既定循环性寄生虫可以排除进一步研究，以减少不必要的工作量。事实上，使用我们的葡萄糖波动方法，我们能够挑选出某些寄生虫中造血不成功的小鼠，这可能是由于寄生虫病时间不足、手术操作不稳定、伤口愈合延迟或动物挣扎导致身体组织脱节所致。在这种情况下，使用埃文斯蓝色方法也证实了血性分裂的失败。结果表明，葡萄糖波动法与埃文斯蓝法一样有效（补充图1和补充图2、补充表1和补充表2）。其次，与这种简单而有效的新方法相比，目前使用的验证方法过于耗时和困难。
本研究采用葡萄糖波动法，成功地对副生小鼠的循环性气率进行了试验。对小鼠进行葡萄糖注射和血糖水平测量的麻醉，这使得它们的操作更容易。我们在10秒内通过小鼠的尾静脉注射100μL葡萄糖（1.2克/千克）。在这些条件下，观察到供体小鼠和受体小鼠的血糖水平有规律的波动。重要的是，我们使用的葡萄糖量往往在一定范围内将血糖水平升高。此外，结果显示，注射葡萄糖后血液胰岛素水平恢复到正常范围3小时（补充图3），表明注射到小鼠体内的葡萄糖量对胰岛素代谢的影响最小。此外，我们给供体的葡萄糖剂量低于小鼠的葡萄糖耐受性测试（对于GTT，2克/千克葡萄糖在腹膜内注射给小鼠，通过胆碱注射19、20、21等于约1.6克/千克），这意味着葡萄糖波动法的葡萄糖剂量不会引起高血糖和其他破坏性改变。总之，我们使用的方法是有效的，无害的，并且节省时间。然而，它可能仅限于糖尿病小鼠在寄生虫病，这仍然需要进一步的实验来确认。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（81570399和81773735）、国家重点研究发展计划——中医药现代化研究项目（2017YFC1702003）和黑龙江的支持。杰出青年科学基金（JC2017020）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| curved forceps | JZ surgical Instruments, China | J31340 | |
| fine scissors | JZ surgical Instruments, China | WA1030 | |
| needle forcep | JZ surgical Instruments, China | 60017961 | |
| 2.5 mL syringes | Agilent, USA | 5182-9642 | |
| Tribromoethano | Sigma-Aldrich, USA | T48402-5G | |
| penicillin | Solarbio, China | IP0150 | |
| tramadol | Yijishiye, China | YJT712520 | |
| glucometer | Roche Diabetes Care, Indiana | Accu-Chek Active test strips | |
| Evan's blue Counterstain | Solarbio, China | G1810 | |
| depilatory cream | Nair, USA | LL9161 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp, USA | TP-22G | |
| Electrical shaver | Codos, China | CP-5000 | |
| 3-0,5-0 surgical suture |
Shanghai Medical Suture Needle Factory, China | SYZ 3-0#, SYZ 5-0# |
References
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