Summary
Ici nous décrivons une nouvelle méthode de détecter l’établissement réussi de la circulation sanguine partagée de deux parabionts par une injection caudale de veine de glucose, qui cause des dommages minimaux et n’est pas mortelle aux parabionts.
Abstract
La parabiose est une méthode expérimentale pour combiner chirurgicalement deux animaux parallèles le long de l’axe longitudinal du corps. Nous présentons un protocole pour détecter l’établissement réussi du chimerism de sang dans les parabionts par une injection caudale de veine de glucose. Des souris parabiotiques ont été construites. Le glucose a été injecté dans la souris de distributeur par la veine de queue, et la fluctuation du niveau de glucose sanguin a été mesurée dans les deux souris utilisant un glucomètre de sang à différents points de temps. Nos résultats ont prouvé qu’après injection de glucose, le niveau de glucose sanguin dans les souris de distributeur a augmenté brusquement après 1 min et a diminué lentement par la suite. Pendant ce temps, le taux de glucose sanguin des souris receveuses a atteint un sommet de 15 min après l’injection. Des résultats similaires ont été obtenus avec Evans bleu, utilisé comme un contrôle positif pour le glucose. La fluctuation synchrone des niveaux de glucose sanguin indique que le flux sanguin entre les deux souris a été établi avec succès.
Introduction
La parabiose est une méthode de modélisation dans laquelle deux organismes vivants sont réunis chirurgicalement et se développent comme un système physiologique unique avec un système circulatoire partagé1. Ces modèles ont été largement utilisés pour étudier la physiologie en raison de l’avantage que les substances produites par un seul individu peuvent agir sur les deux animaux en même temps via le système circulatoire partagé. Depuis le milieu des années 1800, lorsque les expériences parabiotiques ont été lancées par Paul Bert2, les méthodes de construction de modèles parabiotiques sont devenues standardisées. Cependant, une méthode simple et commode pour vérifier l’établissement réussi du chimérisme de sang a été manquante. Il a été rapporté que la circulation croisée peut être évaluée avec succès en injectant intrapéritonement 0,5% de colorant bleu Evans dans l’un des parabionts suivi par la mesure de l’absorption du bleu Evans dans le sang des deux parabionts avec un lecteur de microplaque3. Une autre méthode nécessite une race de sourisspécifique qui contient CD45.1 - et CD45.2- monocytes étiquetés dans chaque parabiont. La cytométrie cellulaire est ensuite utilisée pour déterminer le chimérisme sanguin en mesurant la fréquence des deux marqueurs dans les monocytes de la rate ou du sang4. Cependant, ces méthodes sont souvent mortelles ou encombrantes pour les animaux, et une méthode sûre et simple pour une vérification rapide et fiable des modèles parabiotiques est hautement souhaitable. Dans cette étude, nous avons établi une nouvelle méthode à cet effet, qui a été validée dans un modèle de souris de parabiose. La concentration de glucose dans les échantillons de sang prélevés dans une veine de queue est mesurée à l’aide d’un glucomètre, et le modèle de changements du niveau de glucose chez les souris donneuses et bénéficiaires est considéré comme une indication de chimérisme de circulation. Nous avons nommé cette méthode la « méthode de fluctuation du glucose ». L’application de cette méthode de validation ne se limite pas aux souris, mais pourrait être étendue à divers modèles pathologiques, sauf pour ceux qui ont une dysrégulation sérieuse du métabolisme du glucose. La procédure est simple, gain de temps, et sûr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures impliquant les animaux et leurs soins ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale Harbin.
REMARQUE : Les outils et l’équipement requis pour la méthode sont énumérés dans le Tableau des matériaux.
1. Préparation des matériaux et des animaux
- Commandez des souris mâles C57BL/6 dont le poids se siédesde entre 20 g et 25 g auprès d’un fournisseur d’animaux de laboratoire standard.
- Loger les souris dans un cycle de 12 h de lumière : 12 h d’obscurité à 24 à 26 oC avec un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture.
2. Parabiose
- Anesthésiez les souris par injection intrapéritonéale de 20 g/L 2,2,2-tribromoéthanol à une concentration de 0,1 mL/10 g. Confirmer l’anesthésiation appropriée comme indiqué par la relaxation musculaire, la respiration lente et régulière, la perte du réflexe de stimulation de la peau, et la disparition du réflexe cornéen.
- Appliquer l’onduleur ophtalmique avec un Q-tip pour prévenir les yeux secs.
- Effectuer la procédure de parabiose comme précédemment décrit5.
- Placez les souris en position de supine. Raser soigneusement le côté gauche d’une souris et le côté droit de l’autre souris à partir d’environ 1 cm au-dessus du coude à 1 cm au-dessous du genou avec un rasage électrique. Utilisez de la crème dépilatoire pour effacer totalement la fourrure sur la peau rasée.
- Essuyez les zones rasées avec de l’iodophor. Placer les souris sur un coussinet chauffé recouvert d’un tampon stérile.
- Créez des incisions cutanées longitudinales à partir de 0,5 cm au-dessus du coude à 0,5 cm sous l’articulation du genou à l’aide d’une paire de ciseaux pointus sur le côté rasé de chaque animal.
- Détachez doucement la peau du fascia sous-cutané après l’incision.
- Connectez l’olecranon et le genou du parabiont avec une suture 3-0.
- Suturer la peau rasée avec une suture continue 5-0.
- Injecter 0,5 ml de 0,9 % de NaCl sous-cutanée à chaque souris pour prévenir la déshydratation.
- Injecter du tramadol (10 mg/25 g/jour) par voie intramusculaire à chaque souris pour soulager la douleur.
3. Validation du chimérisme de circulation
- Méthode de fluctuation du glucose
REMARQUE : Vérifier la construction réussie du chimerism de circulation entre les parabionts utilisant la méthode de fluctuation de glucose (aucun jeûne) le 10ème jour après chirurgie de parabiosis.- Anesthésiez les parabionts par injection intrapéritonéale de 20 g/L 2,2,2-tribromoéthanol à chaque souris à une concentration de 0,1 mL/10 g.
- Fixez les souris donneuses dans un fixateur veineux de queue visuelle-souris.
- Frotter les veines caudales sur le flanc de l’une des queues du parabiont avec une boule de coton imbibée d’alcool de 70 à 75 % pour nettoyer la queue et dilater les vaisseaux sanguins.
- Tenez une seringue de 1,0 ml contenant du glucose dans la main droite et gardez l’aiguille parallèle à la veine (moins de 15 degrés).
- Insérez l’aiguille à une position située à environ 2 à 4 cm de l’extrémité de la queue.
- Injecter 100 ll de glucose (1,2 g/kg) dans le donneur dans les 10 s.
REMARQUE : Le terme donneur se réfère au parabiont qui reçoit l’injection de glucose par la veine de queue. Le destinataire est l’autre parabiont, qui ne reçoit pas le glucose directement. - Nettoyer les orteils avec l’iodophor. Couper les orteils des souris du donneur et du receveur à l’aide d’un ciseau et recueillir une goutte de sang à différents moments après l’injection de glucose (1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min et 60 min). Retirez le caillot de sang à chaque point de collecte pour éviter plus de dommages.
REMARQUE : Le volume du sang recueilli était de 10-25 ul pour un essai, et de 90-225 ul au total. - Égoutter le sang dans le centre des bandes de test de glucometer pour la détection de niveau de glucose.
- Utilisez le Contre-tache bleu d’Evan comme un contrôle positif3.
- Injecter 200 l de 0,5 % de la contre-tache bleue d’Evan intraperitoneally dans la souris du donneur.
- 2 h plus tard, euthanasiez les parabionts par injection intrapéritonéale de 20 g/L 2,2,2-tribromoethanol à chaque souris à une concentration de 0.2 mL/10 g, et recueillez le sang des deux parabionts par perforation cardiaque.
- Centrifuger les échantillons de sang à 916 x g pendant 15 min.
- Recueillir le sérum du supernatant.
- Diluer le sérum avec 0,9% NaCl à 1:50.
- Mesurer l’absorption des échantillons de sérum dilué à 620 nm à l’égard d’un spectrophotomètre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chez six souris donneuses, le taux de glucose sanguin a fortement augmenté pour atteindre 26,5 'mol/L (augmentation de 173 %) à une moyenne de 1 min après l’injection de 100 l de glucose (1,2 g/kg) dans la veine de la queue, puis a diminué graduellement à 13,3 'mol/L à 60 min. Chez les souris receveuses, la glycémie augmentait lentement après l’injection et atteignait le premier niveau de pointe à 15 min (augmentation de 47 %, 12,2 'mol/L). Sur la base des résultats ci-dessus, la norme pour le chimérime de circulation a été établie comme suit: 1) une forte augmentation du taux de glucose sanguin (une augmentation minimale de 100% ou de l’amol/L) chez les souris donneuses dans un délai de 1 min après l’injection de glucose, et 2) une augmentation significative du taux de glucose sanguin chez les souris receveuses 15 min après injection (une augmentation minimale de 37%) (Figure 1).
La concentration de colorant bleu Evans dans le sérum des parabionts a également indiqué la construction réussie du chimérisme de circulation (figure 2). Nous avons euthanasié les parabionts après la mesure de glucose sanguin utilisant 5 ml de 2,2,2-tribromoethanol (20 g/L). Les jonctions vasculaires sous-cutanées entre les parabionts ont été clairement observées (figure 3).
La figure 1 supplémentaire montre que les souris donneuses ont eu une augmentation significative de glucose sanguin 1 min après injection de glucose, alors que le niveau de glucose sanguin des souris destinataires n’était pas élevé, qui a démontré que le chimerism de circulation dans les parabionts n’a pas été avec succès établi 1 jour après chirurgie de parabiose. De même, le taux d’OD sanguin chez les souris receveuses n’était pas aussi élevé que celui des sourisdonneuses (figure supplémentaire 2).
Basé sur les résultats de la méthode de fluctuation de glucose, nous avons constaté que deux paires de parabionts n’ont pas établi le chimerism de sang 15 jours après chirurgie de parabiose. Comme le montre le tableau 1 supplémentaire, les deux souris receveuses n’ont pas eu une augmentation du taux de glucose sanguin dans les 60 minutes après l’injection de glucose chez les souris donneuses. La concentration sanguine d’Evans bleu chez les deux receveurs n’a pas non plus été élevée(tableau supplémentaire 2), ce qui a démontré que la méthode de fluctuation du glucose était aussi sensible que la méthode bleue Evans.
De plus, pour évaluer l’influence du glucose injecté sur le métabolisme de l’insuline, nous avons détecté le taux d’insuline dans le sang de 1 h et 3 h après l’injection de 100 l de glucose (1,2 g/kg) chez la souris(figure supplémentaire 3). Le niveau d’insuline de sang a été remarquablement diminué 1 h après injection de glucose en raison du glucose rapidement augmenté et a récupéré aux niveaux normaux à 3 h. Ces résultats ont démontré que les effets du glucose que nous avons injectésur le métabolisme d’insuline étaient restorables.
Figure 1 : Changements du taux de glucose sanguin dans les parabionts après injection de glucose par la veine caudale. (A) Taux de glucose sanguin des souris donneuses. (B) Taux de glucose sanguin des souris receveuses (n - 6). Les données sont présentées comme la moyenne de la SEM.
Figure 2 : Concentration de bleu Evans dans des échantillons de sérum de parabionts mesurés par un lecteur de microplaques. Les données sont présentées comme la moyenne de la SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Génération de vasoganglions sous-cutanés dans la peau connectée entre les parabionts. À gauche : Image représentative des souris de parabiose. À droite: Une image représentative du vasoganglion sous-cutané entre les parabionts. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1 : Le taux de glucose sanguin des parabionts a été examiné 1 jour après chirurgie de parabiose. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 2 : La concentration de bleu d’Evans mesurée par le lecteur de microplate dans le sérum des parabionts 1 jour après chirurgie de parabiose. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 3 : La concentration d’insuline dans le sérum des souris après injection de glucose. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| 0 min | 5 min | 15 min | 20 min | 40 min | 60 min | |
| Donateur-1 | 5.7 | 26.2 | 21.2 | 17.6 | 16.9 | 15.4 |
| Récipiendaire-1 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
| Donateur-2 | 8.4 | 25.5 | 21.1 | 20.5 | 17.4 | 13.8 |
| Récipiendaire-2 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
Tableau supplémentaire 1 : Niveau de glucose sanguin (mol/L) dans les parabionts 15 jours après chirurgie de parabiose.
| Contrôle-1 | Donateur-1 | Récipiendaire-1 | Contrôle-2 | Donateur-2 | Récipiendaire-2 | |
| Valeur OD | 0.059 | 0.935 | 0.062 | 0.068 | 0.862 | 0.073 |
Tableau supplémentaire 2 : Concentration sanguine du bleu d’Evans (valeur d’OD) dans les parabionts 15 jours après chirurgie de parabiose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parabiose se réfère à la technique chirurgicale de connecter deux animaux vivants pour établir un système vasculaire commun par des moyens expérimentaux6,7,8. L’avantage de ce modèle est que les substances produites par un seul individu peuvent agir sur les deux animaux en même temps. Ainsi, le modèle de parabiose peut être utilisé pour explorer le rôle d’une substance ou d’un facteur dans une maladie connexe, produisant de nombreuses conclusions significatives et novatrices. Compte tenu de sa grande valeur d’application, le modèle a apporté une meilleure compréhension des maladies du système cardiovasculaire8,9,10,11,12,13, troubles du système nerveux14,15, transplantation d’organes16, et le diabète17,18.
Cependant, la vérification de l’établissement réussi du chimerisme de circulation est la première étape et déterminante pour des études avec le parabiosis. Des études actuelles ont rapporté quelques méthodes pour détecter le chimerism de circulation. Loffredo et coll.4 ont signalé que le chimérisme sanguin a été confirmé chez les couples parabiotiques en mesurant la fréquence mixte des monocytes dans la rate avec différents marqueurs étiquetés chez les souris donneur (CD45.1) et les souris(CD45.2). Dans cette méthode, des souris spécifiques avec CD45.1-ou CD45.2- monocytes étiquetés pour chaque parabiont ont été utilisés pour la parabiose. La cytométrie cellulaire était nécessaire pour déterminer le chimérisme sanguin en mesurant l’intégration des cellules sanguines marquées. De plus, Marta et coll.3 ont évalué la circulation croisée en injectant par voie intrapéritone 200 'L de colorant bleu Evans de 0,5 % dans l’un des parabionts. Le sang des deux parabionts a été recueilli 2 h plus tard par ponction cardiaque. Le chimérime sanguin a été déterminé par une concentration bleue accrue d’Evans chez les souris destinataires, qui a été testée par un lecteur de microplate. Bien que ces stratégies nous permettent de déterminer le chimérisme sanguin, il ya encore de nombreuses limitations qui ne peuvent pas être ignorés. Tout d’abord, pour les méthodes létales, le chimérisme sanguin ne peut être confirmé qu’à l’exécution. Cependant, dans notre méthode, l’établissement du chimérisme sanguin peut être testé à tout moment après la chirurgie parabiose. Les parabionts avec le chimerism établi infructueux de circulation peuvent être exclus pour une étude plus approfondie à l’avance pour réduire la charge de travail inutile. En effet, en utilisant notre méthode de fluctuation du glucose, nous avons été en mesure de choisir les souris avec la construction infructueuse de chimérisme sanguin dans certains parabionts, qui pourrait être due à un temps insuffisant de parabiose, manipulation de chirurgie instable, la cicatrisation des plaies retardées, ou le tissu corporel déconnecté causé par la lutte des animaux. Dans de telles circonstances, l’échec du chimérisme sanguin a également été confirmé par l’utilisation de la méthode bleue Evans. Ces résultats indiquent que la méthode de fluctuation du glucose était aussi efficace que la méthode bleu Evans(figure supplémentaire 1 et figure supplémentaire 2, tableau supplémentaire 1 et tableau supplémentaire 2). Deuxièmement, les méthodes de validation actuellement utilisées sont excessivement longues et difficiles, par opposition à cette nouvelle méthode, qui est simple et efficace.
Dans la présente étude, nous avons avec succès examiné pour le chimerism de circulation chez les souris parabiotiques par la méthode de fluctuation de glucose. Les souris ont été anesthésiés pour l’injection de glucose et les mesures de niveau de glucose sanguin, qui ont rendu leur manipulation plus facile. Nous avons injecté 100 lde de glucose (1,2 g/kg) par la veine de queue des souris dans les 10 s. Dans ces conditions, une fluctuation régulière des niveaux de glucose sanguin chez les souris donneuses et bénéficiaires a été observée. Fait important, la quantité de glucose que nous avons utilisé avait tendance à élever de façon stable le taux de glucose sanguin dans une certaine gamme. En outre, les résultats ont montré que le niveau d’insuline sanguine récupéré à la gamme normale 3 h après injection de glucose (Figure supplémentaire 3), suggérant que la quantité de glucose injecté dans les souris avait des effets minimes sur le métabolisme de l’insuline. En outre, la dose de glucose que nous avons donnée au donneur était inférieure à celle utilisée pour le test de tolérance au glucose des souris (pour le GTT, 2 g/kg de glucose est injecté par voie intrapéritone aux souris, ce qui équivaut à environ 1,6 g/kg par injection de veinecale caudale19,20,21), ce qui signifie que la dose de glucose pour la méthode de fluctuation du glucose ne causerait pas d’hyperglycémie et d’autres altérations dommageables. En conclusion, la méthode que nous avons utilisée est efficace, inoffensive et permet de gagner du temps. Cependant, il pourrait être limité aux souris diabétiques dans la parabiose, qui ont encore besoin d’autres expériences pour la confirmation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la National Nature Science Foundation of China (81570399 et 81773735), le National Key Research and Development Program of China - Traditional Chinese Medicine Modernization Research project (2017YFC1702003), et Hei Long Jiang Fonds scientifique pour la jeunesse exceptionnel (JC2017020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| curved forceps | JZ surgical Instruments, China | J31340 | |
| fine scissors | JZ surgical Instruments, China | WA1030 | |
| needle forcep | JZ surgical Instruments, China | 60017961 | |
| 2.5 mL syringes | Agilent, USA | 5182-9642 | |
| Tribromoethano | Sigma-Aldrich, USA | T48402-5G | |
| penicillin | Solarbio, China | IP0150 | |
| tramadol | Yijishiye, China | YJT712520 | |
| glucometer | Roche Diabetes Care, Indiana | Accu-Chek Active test strips | |
| Evan's blue Counterstain | Solarbio, China | G1810 | |
| depilatory cream | Nair, USA | LL9161 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp, USA | TP-22G | |
| Electrical shaver | Codos, China | CP-5000 | |
| 3-0,5-0 surgical suture |
Shanghai Medical Suture Needle Factory, China | SYZ 3-0#, SYZ 5-0# |
References
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Torres, M., et al. Parabiotic model for differentiating local and systemic effects of continuous and intermittent hypoxia. Journal of Applied Physiology (1985). 118 (1), 42-47 (2015).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153 (4), 828-839 (2013).
- Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. Journal of Visualized Experiments. (80), e50556 (2013).
- Conboy, M. J., Conboy, I. M., Rando, T. A. Heterochronic parabiosis: historical perspective and methodological considerations for studies of aging and longevity. Aging Cell. 12 (3), 525-530 (2013).
- Eggel, A., Wyss-Coray, T. A revival of parabiosis in biomedical research. Swiss Medical Weekly. 144, w13914 (2014).
- Brack, A. S. Ageing of the heart reversed by youthful systemic factors! EMBO Journal. 32 (16), 2189-2190 (2013).
- Wu, J. M., et al. Circulating cells contribute to cardiomyocyte regeneration after injury. Circulation Research. 116 (4), 633-641 (2015).
- Kaiser, J. 'Rejuvenation factor' in blood turns back the clock in old mice. Science. 344 (6184), 570-571 (2014).
- Rando, T. A., Finkel, T. Cardiac aging and rejuvenation--a sense of humors? New England Journal of Medicine. 369 (6), 575-576 (2013).
- Heidt, T., et al. Differential contribution of monocytes to heart macrophages in steady-state and after myocardial infarction. Circulation Research. 115 (2), 284-295 (2014).
- McPherron, A. C. Through thick and thin: a circulating growth factor inhibits age-related cardiac hypertrophy. Circulation Research. 113 (5), 487-491 (2013).
- Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nature Medicine. 20 (6), 659-663 (2014).
- Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
- Starzl, T. E., et al. The lost chord: microchimerism and allograft survival. Immunology Today. 17 (12), 577-584 (1996).
- Coleman, D. L. A historical perspective on leptin. Nature Medicine. 16 (10), 1097-1099 (2010).
- Salpeter, S. J., et al. Systemic regulation of the age-related decline of pancreatic beta-cell replication. Diabetes. 62 (8), 2843-2848 (2013).
- Sheldon, R. D., et al. Gestational exercise protects adult male offspring from high-fat diet-induced hepatic steatosis. Journal of Hepatology. 64 (1), 171-178 (2016).
- Martineau, M. G., et al. The metabolic profile of intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and increased fetal growth. Diabetes Care. 38 (2), 243-248 (2015).
- Wang, F., Liu, Y., Yuan, J., Yang, W., Mo, Z. Compound C Protects Mice from HFD-Induced Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. International Journal of Endocrinology. 2019, 3206587 (2019).
