Summary
Hier beschreiben wir eine neue Methode, um die erfolgreiche Etablierung der gemeinsamen Durchblutung von zwei Parabionten durch eine kaudale Veneninjektion von Glukose zu erkennen, die minimale Schäden verursacht und für die Parabionten nicht tödlich ist.
Abstract
Parabiose ist eine experimentelle Methode zur chirurgischen Kombination von zwei parallelen Tieren entlang der Längsachse des Körpers. Wir präsentieren ein Protokoll zum Nachweis der erfolgreichen Etablierung von Blutchimäremismus in Parabionten durch eine kaudale Veneninjektion von Glukose. Parabiotische Mäuse wurden konstruiert. Glukose wurde der Spendermaus durch die Schwanzvene injiziert, und die Fluktuation des Blutzuckerspiegels wurde bei beiden Mäusen mit einem Blutglukometer zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der Blutzuckerspiegel bei Spendermäusen nach 1 min stark angestiegen ist und danach langsam abnahm. In der Zwischenzeit erreichte der Blutzuckerspiegel der Empfängermäuse 15 min nach der Injektion. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Evans blue erzielt, der als Positivkontrolle für Glukose verwendet wird. Die synchrone Fluktuation des Blutzuckerspiegels zeigt an, dass der Blutfluss zwischen den beiden Mäusen erfolgreich nachgewiesen wurde.
Introduction
Parabiose ist eine Modellierungsmethode, bei der zwei lebende Organismen chirurgisch miteinander verbunden sind und sich als ein einziges physiologisches System mit einem gemeinsamen Kreislaufsystem entwickeln1. Solche Modelle wurden häufig für das Studium der Physiologie verwendet, da der Vorteil besteht, dass die von einem einzelnen Individuum produzierten Substanzen über das gemeinsame Kreislaufsystem gleichzeitig auf beide Tiere wirken können. Seit Mitte des 18. Jahres, als parabiotische Experimente von Paul Bert2entwickelt wurden, sind die Methoden zur Konstruktion parabiotischer Modelle standardisiert. Es fehlt jedoch eine einfache und bequeme Methode, um die erfolgreiche Etablierung des Blutchimertums zu überprüfen. Es wurde berichtet, dass die Kreuzzirkulation erfolgreich durch intraperitoneally Injektion 0,5% Evans blauer Farbstoff in einem der Parabionten gefolgt von der Messung der Absorption von Evans blau im Blut der beiden Parabionten mit einem Mikroplattenleser3. Eine andere Methode erfordert eine bestimmte Mausrasse, die CD45.1+- und CD45.2+- markierte Monozyten in jedem Parabiont enthält. Die Zellzytometrie wird dann verwendet, um den Blutchimärerum zu bestimmen, indem die Häufigkeit der beiden Marker in Monozyten aus Milz oder Blut gemessen wird4. Jedoch, Diese Methoden sind oft tödlich oder umständlich für die Tiere, und eine sichere und einfache Methode für eine schnelle und zuverlässige Überprüfung von parabiotischen Modellen ist sehr wünschenswert. In dieser Studie haben wir eine neue Methode zu diesem Zweck etabliert, die in einem Mausmodell der Parabiose validiert wurde. Die Glukosekonzentration in Blutproben aus einer Schwanzvene wird mit einem Glukometer gemessen, und das Muster der Veränderungen des Glukosespiegels bei Spender- und Empfängermäusen gilt als Hinweis auf Zirkulationschimäre. Wir nannten diese Methode die "Glucose-Schwankungsmethode". Die Anwendung dieser Validierungsmethode ist nicht auf Mäuse beschränkt, sondern könnte auf verschiedene pathologische Modelle mit Ausnahme von Modellen mit schwerer Dysregulation des Glukosestoffwechsels ausgedehnt werden. Das Verfahren ist einfach, zeitsparend und sicher.
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Protocol
Alle Verfahren, an denen Tiere und ihre Pflege beteiligt waren, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Harbin Medical University genehmigt.
ANMERKUNG: Die für die Methode erforderlichen Werkzeuge und Ausrüstungen sind in der Materialtabelleaufgeführt.
1. Herstellung von Materialien und Tieren
- Bestellen Sie C57BL/6 männliche Mäuse mit einem Gewicht zwischen 20 g-25 g bei einem Standard-Labortierlieferanten.
- Die Mäuse in einem Zyklus von 12 h Licht: 12 h Dunkelheit bei 24 bis 26 °C mit ad libitum Zugang zu Wasser und Nahrung.
2. Parabiose
- Anästhetisieren Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 20 g/L 2,2,2-Tribromoethanol in einer Konzentration von 0,1 ml/10 g. Bestätigen Sie die richtige Anästhesisierung, wie durch Muskelentspannung, langsame und stetige Atmung, Verlust des Hautstimulationsreflexes und Das Verschwinden des Hornhautreflexes angezeigt wird.
- Ophthalmologische Salbe mit einer Q-Spitze auftragen, um trockene Augen zu verhindern.
- Führen Sie das Parabiose-Verfahren wie zuvor beschrieben5.
- Setzen Sie die Mäuse in die Supine-Position. Rasieren Sie die linke Seite einer Maus und die rechte Seite der anderen Maus ab ca. 1 cm über dem Ellenbogen bis 1 cm unterhalb des Knies mit einem elektrischen Rasierer. Verwenden Sie Enthaarungscreme, um das Fell auf der rasierten Haut vollständig zu löschen.
- Wischen Sie die rasierten Bereiche mit Iodophor ab. Legen Sie die Mäuse auf ein beheiztes Pad, das von einem sterilen Pad bedeckt ist.
- Erstellen Sie Längshauteinschnitte von 0,5 cm über dem Ellenbogen bis 0,5 cm unterhalb des Kniegelenks mit einer scharfen Schere auf der rasierten Seite jedes Tieres.
- Die Haut nach dem Schnitt sanft von der subkutanen Faszie lösen.
- Verbinden Sie das Olecranon und das Knie des Parabionts mit einer 3-0-Naht.
- Nahn die rasierte Haut mit einer kontinuierlichen 5-0 Naht.
- Injizieren Sie 0,5 ml 0,9% NaCl subkutan in jede Maus, um Austrocknung zu verhindern.
- Injizieren Tramadol (10 mg/25 g/Tag) intramuskulär zu jeder Maus, um Schmerzen zu lindern.
3. Validierung des Zirkulationschimmers
- Glukose-Schwankungsmethode
HINWEIS: Überprüfen Sie die erfolgreiche Konstruktion des Zirkulationschimimismus zwischen Parabionten mit der Glukosefluktuationsmethode (kein Fasten) am 10. Tag nach der Parabiose-Operation.- Anästhetisieren Sie die Parabionten durch intraperitoneale Injektion von 20 g/L 2,2,2-Tribromethanol an jede Maus in einer Konzentration von 0,1 ml/10 g.
- Fixieren Sie die Spendermäuse in einem Venous Visual-Mouse Schwanzfixator.
- Reiben Sie die kaudalen Venen in der Flanke eines Schwanzes des Parabionts mit einer In 70-75% Alkohol getränkten Baumwollkugel, um den Schwanz zu reinigen und die Blutgefäße zu verdünnen.
- Halten Sie eine 1,0 ml Spritze mit Glukose in der rechten Hand und halten Sie die Nadel parallel zur Vene (weniger als 15°).
- Setzen Sie die Nadel an einer Position von ca. 2 x 4 cm von der Schwanzspitze ein.
- Injizieren Sie 100 l Glukose (1,2 g/kg) innerhalb von 10 s in den Spender.
HINWEIS: Der Begriff Spender bezieht sich auf das Parabiont, das die Glukose-Injektion durch die Schwanzvene erhält. Der Empfänger ist der andere Parabiont, der Glukose nicht direkt erhält. - Reinigen Sie die Zehen mit Iodophor. Schneiden Sie die Zehen der Spender- und Empfängermäuse mit einer Schere ab und sammeln Sie einen Tropfen Blut zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion von Glukose (1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min und 60 min). Entfernen Sie das Blutgerinnsel an jedem Sammelzeitpunkt, um weitere Schäden zu vermeiden.
HINWEIS: Das Volumen des gesammelten Blutes war 10-25 ul für einen Test, und 90-225 ul insgesamt. - Tropfte das Blut in die Mitte der Glucometer-Teststreifen für den Nachweis des Glukosespiegels.
- Verwenden Sie Evans blauen Counterstain als Positivkontrolle3.
- Injizieren Sie 200 l 0,5% Evans blaues Gegenfleck intraperitoneal in die Spendermaus.
- 2 h später die Parabionten durch intraperitoneale Injektion von 20 g/L 2,2,2-Tribromoethanol an jede Maus in einer Konzentration von 0,2 ml/10 g einschläfern und Blut aus beiden Parabionten durch Herzpunktion sammeln.
- Zentrifuge die Blutproben bei 916 x g für 15 min.
- Serum vom Überstand sammeln.
- Das Serum mit 0,9% NaCl bei 1:50 verdünnen.
- Messen Sie die Absorption der verdünnten Serumproben bei 620 nm mit einem Spektralphotometer.
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Representative Results
Bei sechs Spendermäusen stieg der Blutzuckerspiegel bei durchschnittlich 1 min nach der Injektion von 100 l Glukose (1,2 g/kg) durch die Schwanzvene drastisch auf 26,5 mol/L (173% Anstieg) und sank dann nach und nach auf 13,3 'mol/L bei 60 min. Bei Empfängermäusen erhöhte sich der Blutzucker nach der Injektion langsam und erreichte den ersten Spitzenwert nach 15 min (47% Anstieg, 12,2 mol/L). Basierend auf den obigen Ergebnissen wurde der Standard für Zirkulationschimäre wie folgt festgelegt: 1) ein starker Anstieg des Blutzuckerspiegels (mindestens 100 % Anstieg oder >20 Mol/L) bei Spendermäusen innerhalb von 1 min nach der Glukoseinjektion und 2) eine signifikante Erhöhung des Blutzuckerspiegels bei Empfängermäusen 15 min nach der Injektion (mindestens 37 % Anstieg)(Abbildung 1).
Die Konzentration von Evans Blaufarbstoff im Serum von Parabionten deutete auch auf den erfolgreichen Aufbau von Zirkulationschimärem hin (Abbildung 2). Wir haben die Parabionten nach der Blutzuckermessung mit 5 ml 2,2,2-Tribromethanol (20 g/L) eingeschläfert. Die subkutanen Gefäßverbindungen zwischen den Parabionten wurden deutlich beobachtet (Abbildung 3).
Ergänzende Abbildung 1 zeigt, dass die Spendermäuse einen signifikanten Blutzuckerspiegel 1 min nach der Glukoseinjektion erhöhten, während der Blutzuckerspiegel der Empfängermäuse nicht erhöht war, was zeigte, dass der Kreislaufchimmerismus bei Parabionten 1 Tag nach einer Parabioseoperation nicht erfolgreich festgestellt wurde. Ebenso war der BLUT-OD-Spiegel bei Empfängermäusen nicht so hoch wie der von Spendermäusen(Zusatzabbildung 2).
Basierend auf den Ergebnissen der Glukose-Schwankungsmethode fanden wir heraus, dass zwei Parabiontenpaare 15 Tage nach der Parabiose-Operation keinen Blutchimmelismus etablierten. Wie in der ergänzenden Tabelle 1dargestellt, hatten die beiden Empfängermäuse innerhalb von 60 min nach der Glukoseinjektion in die Spendermäuse keinen erhöhten Blutzuckerspiegel. Die Blutkonzentration von Evans blue bei den beiden Empfängern war ebenfalls nicht erhöht (Zusatztabelle 2), was zeigte, dass die Glukosefluktuationsmethode so empfindlich war wie die Evans-Blaumethode.
Um den Einfluss der injizierten Glukose auf den Insulinstoffwechsel zu bewerten, haben wir den Insulinspiegel 1 h und 3 h nach der Injektion von 100 l Glukose (1,2 g/kg) bei Mäusen nachgewiesen(Zusätzliche Abbildung 3). Der Insulinspiegel im Blut wurde nach der Glukoseinjektion aufgrund einer schnell erhöhten Glukose deutlich gesenkt und bei 3 h auf ein normales Niveau zurückgewonnen. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Auswirkungen von Glukose, die wir auf den Insulinstoffwechsel injizierten, wiederherspräsbar waren.
Abbildung 1: Veränderungen des Blutzuckerspiegels in Parabionten nach Injektion von Glukose durch die kaudale Vene. (A) Blutzuckerspiegel von Spendermäusen. (B) Blutzuckerspiegel der Empfängermäuse (n = 6). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,00 1 vs. 0 min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Konzentration von Evans blau in Serumproben von Parabionten, die von einem Mikroplattenleser gemessen werden. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt. ***p < 0,001 (n = 6). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Erzeugung von subkutanen Vasoganglonen in verbundener Haut zwischen den Parabionten. Links: Repräsentatives Bild der Parabiosemäuse. Rechts: Ein repräsentatives Bild des subkutanen Vasogangs zwischen den Parabionten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Der Blutzuckerspiegel von Parabionten wurde 1 Tag nach der Parabiose-Operation getestet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 2: Die Konzentration von Evans blau gemessen durch Mikroplattenleser im Serum der Parabionten 1 Tag nach parabiose Chirurgie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 3: Die Insulinkonzentration im Serum der Mäuse nach der Glukoseinjektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| 0 min | 5 Min. | 15 Min. | 20 Min. | 40 Min. | 60 Min. | |
| Spender-1 | 5.7 | 26.2 | 21.2 | 17.6 | 16.9 | 15.4 |
| Empfänger-1 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
| Spender-2 | 8.4 | 25.5 | 21.1 | 20.5 | 17.4 | 13.8 |
| Empfänger-2 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
Ergänzende Tabelle 1: Blutzuckerspiegel bei Parabionten 15 Tage nach der Parabiose-Operation.
| Steuerung-1 | Spender-1 | Empfänger-1 | Steuerung-2 | Spender-2 | Empfänger-2 | |
| OD-Wert | 0.059 | 0.935 | 0.062 | 0.068 | 0.862 | 0.073 |
Ergänzende Tabelle 2: Blutkonzentration von Evans blau (OD-Wert) in Parabionten 15 Tage nach Parabiose-Operation.
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Discussion
Parabiose bezieht sich auf die chirurgische Technik der Verbindung zweier lebender Tiere, um ein gemeinsames Gefäßsystem mit experimentellen Mitteln zu etablieren6,7,8. Der Vorteil dieses Modells ist, dass die von einem einzelnen Individuum produzierten Substanzen auf beide Tiere gleichzeitig wirken können. So kann das Parabiose-Modell verwendet werden, um die Rolle eines Stoffes oder Faktors bei einer verwandten Krankheit zu erforschen, was viele aussagekräftige und innovative Schlussfolgerungen hervorbringt. Angesichts seines großen Anwendungswerts hat das Modell ein besseres Verständnis von Herz-Kreislauf-Erkrankungen8,9,10,11,12,13, Erkrankungen des Nervensystems14,15, Organtransplantation16und Diabetes17,18.
Die Überprüfung der erfolgreichen Etablierung des Zirkulationschimimismus ist jedoch der erste und entscheidende Schritt für Studien mit Parabiose. Aktuelle Studien haben einige Methoden zum Nachweis von Zirkulationchimimismus berichtet. Loffredo et al.4 berichteten, dass Blutchimäre bei parabiotischen Paaren bestätigt wurden, indem die gemischte Häufigkeit von Monozyten in der Milz mit verschiedenen markierten Markern im Spender (CD45.1+) und Empfänger (CD45.2+) Mäuse gemessen wurde. Bei dieser Methode wurden spezifische Mäuse mit CD45.1+- oder CD45.2+-labeled monocytes für jedes Parabiont für die Parabiose verwendet. Die Zellzytometrie war notwendig, um den Blutchimerismus zu bestimmen, indem die Integration der markierten Blutzellen gemessen wurde. Darüber hinaus bewerteten Marta et al.3 die Kreuzzirkulation durch intraperitoneal injizierte 200 l 0,5% Evans blauer Farbstoff in einem der Parabionten. Blut aus beiden Parabionten wurde 2 h später durch Herzpunktion gesammelt. Der Blutchimerismus wurde durch eine erhöhte Evans-Blaukonzentration bei den Empfängermäusen bestimmt, die von einem Mikroplattenleser getestet wurde. Obwohl diese Strategien es uns ermöglichen, den Blutchimäretum zu bestimmen, gibt es immer noch viele Einschränkungen, die nicht ignoriert werden können. Erstens kann bei tödlichen Methoden der Blutchimismus nur bei der Hinrichtung bestätigt werden. Jedoch, in unserer Methode, die Etablierung von Blut Chimäre kann jederzeit nach Parabiose-Operation getestet werden. Parabionten mit erfolglosem etablierten Zirkulationschimmerismus können für weitere Untersuchungen im Voraus ausgeschlossen werden, um unnötige Arbeitsbelastung zu reduzieren. Tatsächlich konnten wir mit unserer Glukosefluktuationsmethode die Mäuse mit erfolglosem Aufbau von Blutchimärem ismus in bestimmten Parabionten herauspicken, was möglicherweise auf eine unzureichende Zeit der Parabiose, instabile Operationsmanipulation, verzögerte Wundheilung oder abgekoppeltes Körpergewebe zurückzuführen ist, das durch Tierquälerei verursacht wird. Unter solchen Umständen wurde das Versagen des Blutchimärenismus auch mit der Evans blue Methode bestätigt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Glukosefluktuationsmethode ebenso wirksam war wie die Evans-Blaumethode(Ergänzende Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 2, Ergänzende Tabelle 1 und ergänzende Tabelle 2). Zweitens sind die derzeit verwendeten Validierungsmethoden übermäßig zeitaufwändig und schwierig, im Gegensatz zu dieser neuen Methode, die einfach und effektiv ist.
In der vorliegenden Studie haben wir erfolgreich auf Zirkulationschimmelismus bei parabiotischen Mäusen mit der Glukosefluktuationsmethode getestet. Die Mäuse wurden für die Glukoseinjektion und Blutzuckerspiegelmessungen anbeäsiert, was ihre Manipulation erleichterte. Wir injizierten 100 l Glukose (1,2 g/kg) durch die Schwanzvene der Mäuse innerhalb von 10 s. Unter diesen Bedingungen wurde eine regelmäßige Fluktuation des Blutzuckerspiegels bei Spender- und Empfängermäusen beobachtet. Wichtig ist, dass die Menge an Glukose, die wir verwendet haben, dazu neigte, den Blutzuckerspiegel innerhalb eines bestimmten Bereichs stabil zu erhöhen. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass sich der Insulinspiegel im Blut nach der Glukoseinjektion auf den normalen Bereich 3 h zurückzog(Ergänzende Abbildung 3), was darauf hindeutet, dass die Menge an Glukose, die den Mäusen injiziert wurde, minimale Auswirkungen auf den Insulinstoffwechsel hatte. Darüber hinaus war die Dosierung von Glukose, die wir dem Spender gaben, niedriger als die für den Glukosetoleranztest von Mäusen (für die GTT wird 2 g/kg Glukose intraperitoneal in jiziert, was etwa 1,6 g/kg durch kaudale Veneninjektion19,20,21) entspricht, was bedeutet, dass die Dosierung von Glukose für die Glukosefluktuation nicht hyperglykation und andere Veränderungen verursachen würde. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die von uns verwendete Methode effektiv, harmlos und zeitsparend ist. Es könnte jedoch auf diabetische Mäuse bei Parabiose beschränkt sein, die noch weitere Experimente zur Bestätigung benötigen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Nature Science Foundation of China (81570399 und 81773735), dem National Key Research and Development Program of China - Traditional Chinese Medicine Modernization Research Project (2017YFC1702003) und Hei Long Jiang unterstützt. Herausragender Jugendwissenschaftsfonds (JC2017020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| curved forceps | JZ surgical Instruments, China | J31340 | |
| fine scissors | JZ surgical Instruments, China | WA1030 | |
| needle forcep | JZ surgical Instruments, China | 60017961 | |
| 2.5 mL syringes | Agilent, USA | 5182-9642 | |
| Tribromoethano | Sigma-Aldrich, USA | T48402-5G | |
| penicillin | Solarbio, China | IP0150 | |
| tramadol | Yijishiye, China | YJT712520 | |
| glucometer | Roche Diabetes Care, Indiana | Accu-Chek Active test strips | |
| Evan's blue Counterstain | Solarbio, China | G1810 | |
| depilatory cream | Nair, USA | LL9161 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp, USA | TP-22G | |
| Electrical shaver | Codos, China | CP-5000 | |
| 3-0,5-0 surgical suture |
Shanghai Medical Suture Needle Factory, China | SYZ 3-0#, SYZ 5-0# |
References
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