Summary
Aquí, presentamos un flujo de trabajo para la expresión, purificación y unión liposoma de heterodímeros SNX-BAR en levadura.
Abstract
Las proteínas SNX-BAR son una clase evolutivamente conservada de proteínas de remodelación de membranas que desempeñan un papel clave en la clasificación y el tráfico de proteínas y lípidos durante la endotosis, la clasificación dentro del sistema endosomal y la autofagia. La función proteica central de SNX-BAR es la capacidad de formar homodímeros o heterodímeros que unen membranas utilizando dominios altamente conservados de phox-homología (PX) y BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs). Además, el oligomerización de los dimers SNX-BAR en las membranas puede resultar en la formación de túbulos de membrana y vesículas y se cree que esta actividad refleja sus funciones como proteínas de capa para los portadores de transporte derivados del endosoma. Los investigadores han utilizado durante mucho tiempo estudios de unión in vitro utilizando proteínas SNX-BAR recombinantes en liposomas sintéticos o vesículas unilameláres gigantes (GUVs) para revelar la composición precisa de los lípidos necesarios para impulsar la remodelación de la membrana, revelando así su mecanismo de acción. Sin embargo, debido a los desafíos técnicos con los sistemas de doble expresión, la toxicidad de la expresión de proteínaSNX-BAR en bacterias y la baja solubilidad de las proteínas SNX-BAR individuales, la mayoría de los estudios realizados hasta la fecha han examinado los homodímeros SNX-BAR, incluidos los dimers no fisiológicos que se forman durante la expresión en bacterias. Recientemente, hemos optimizado un protocolo para superar las principales deficiencias de un sistema de expresión bacteriana típica. Usando este flujo de trabajo, demostramos cómo expresar y purificar con éxito grandes cantidades de heterodímeros SNX-BAR y cómo reconstituirlos en liposomas sintéticos para ensayos de unión y tublación.
Introduction
Los orgánulos ligados a la membrana como la membrana plasmática, el retículo endoplasmático, el aparato Golgi, el lisosoma (vacuole de levadura) y el endosoma comprenden el sistema endomembrana de la célula eucariota. La mayoría de los orgánulos tienen la capacidad de comunicarse e intercambiar material con otros orgánulos a través de portadores de transporte vesícula. No se entiende bien cómo la célula coordina el envasado y la formación de portadores de transporte de vesículas dentro del sistema de endomembrana. Sin embargo, se sabe que las proteínas y lípidos que constituyen gran parte del sistema de endomembrana se originan a partir de vesículas endoccíticas internalizadoras de la membrana plasmática (PM). El endosoma es el principal orgánulo aceptador para estas vesículas y se compone de múltiples conjuntos interconectados de orgánulos tubulares. La función principal del endosoma es facilitar la adquisición de nutrientes, regular la rotación de proteínas y lípidos, proteger de la infección de patógenos y servir como la principal fuente de reposición de lípidos para la membrana plasmática. Como el endosoma recibe la mayor parte de proteínas de carga y lípidos de la membrana plasmática, actúa como un compartimento de clasificación mediante el aíslamiento de cargas en los transportadores endosómicos tubulares (ETC). Cualquier proteína que no se secuestre en los ETCs se deja degradar a través del sistema endo-lisosomal. La desregulación de la clasificación de carga en ETCs puede conducir a la pérdida de la sutoma de nutrientes, rotación de proteínas o homeostasis lipídica, lo que resulta en numerosos trastornos metabólicos, de desarrollo y neurológicos1,2. Sin embargo, a pesar del papel central de los CTE en el endosoma, no se conoce el mecanismo subyacente de cómo el endosoma puede coordinar selectivamente el empaquetado de una multitud de cargas heterogéneas en portadores tubulares.
La familia de nexina de clasificación (SNX) es una clase evolutivamente conservada de proteínas que se han encontrado críticas para muchas reacciones de transporte vesícula en la celda3,4,5. Los nexinos de clasificación se reclutan para la membrana endosoma y ayudan en la captura de carga a través de su característico dominio de la homología phox (PX), que une el fosfatidilinositol-3-monofosfato (PtdIns(3)P), un lípido enriquecido en la membrana endosoma. Los mamíferos codifican treinta y tres proteínas SNX, que se pueden dividir en múltiples subfamilias, según la presencia de otros dominios1. Más notablemente, la subfamilia SNX-BAR es la subfamilia más grande que consta de doce en humanos, mientras que en levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae, la subfamilia se reduce a sólo siete SNX-BARs. Las proteínas SNX-BAR tienen un dominio PX y un dominio Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR) que activa los reservorios lipídis para unir curvaturas positivas. En consecuencia, la familia SNX-BAR tiene una afinidad natural por el endosoma y puede mediar la formación de ETC a través de sus capacidades de remodelación de membrana. In vitro, las propiedades de remodelación de sNX-BARs pueden ser inducidas por la adición de SNX-BARpurificados a liposomas sintéticos y la posterior formación de túbulos estrechos y recubiertos se puede visualizar mediante microscopía electrónica. Utilizando estos métodos, los investigadores han determinado que tanto la concentración de oligomerización como la fuerza de constricción parecen variar entre la familia SNX-BAR, lo que sugiere que podrían ayudar tanto en la formación como en la cissión de los CTE.
Los SNX-BARs se pueden clasificar aún más por sus propiedades exclusivas de dimerización. Los ensayos de unión in vitro y los estudios estructurales han demostrado que las proteínas SNX-BAR sólo pueden formar homodímeros o heterodímeros específicos. Por lo tanto, en principio, cada potencial dimer-oligomero SNX-BAR podría proporcionar una capa de túbulo para una vía de tráfico específica de carga y, del mismo modo, la oligomerización restringida de los otros protomeros SNX-BAR, también puede definir distintas vías de exportación. Sin embargo, debido al gran número de SNX-BARs y diversidad dentro de la familia SNX, una hipótesis de carga nexin-one de clasificación es altamente improbable. En su lugar, es más probable un esfuerzo coordinado utilizando una multitud de factores como SNX-BARs, carga, especificidad lipídica y otras dependencias. Asimismo, estudios recientes de la familia de levaduras SNX4 revelaron evidencia de especificidad lipídica adicional, más allá de PtdIns(3)P, para potenciar losportadoresde transporte endosoma6. En este estudio, el homodimer SNX-BAR Mvp1-Mvp1 fue purificado a partir de bacterias y heterodímeros nativos Snx4-Atg20 y Vps5-Vps17 fueron expresados y purificados en alto rendimiento de la levadura, mientras que sólo Snx4-Atg20 se encontró para unir preferentemente fosfatidilserina (PS) y formar estructuras estrechas tipo tubo en estudios de unión liposoma6. Mientras que otros en el campo han revelado importantes propiedades de los SNX-BARs utilizando homodímeros SNX-BAR purificados recombinantemente de bacterias, toxicidad asociada con la expresión de heterodímeros SNX-BAR en sistemas similares han obstaculizado su caracterización nativa7,8,9,10. Por lo tanto, sin un sistema confiable para obtener heterodímeros nativos expresados recombinantemente puros, los investigadores deben renunciar a estas líneas de investigación. En la Figura 1, presentamos un flujo de trabajo de cuatro partes para 1) construir una cepa de levadura sobreexpresando heterodímeros SNX-BAR para purificación de afinidad en tándem, 2) expresar y purificar heterodímeros nativos SNX-BAR, 3) preparar liposomas sintéticos unilamellares, y 4) establecer un ensayo de tubulación liposoma o sedimentaciones, proporcionando una herramienta vital para que los investigadores investiguen el creciente catálogo de nexinos de clasificación encontrados en la naturaleza.
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Protocol
1. Construcción de cepas de levadura
- Comience con TVY614 (pep4 ::LEU2 prb1 ::hisG prc1 ::HIS3)11 como la cepa principal. Esta cepa es deficiente para las proteasas vacuolar, que contribuyen a la mayor parte de la degradación de las proteínas después de la lisis celular, y por lo tanto permite una purificación más limpia y eficiente.
- Diseñe imprimaciones12 e integre la etiqueta de purificación de afinidad en tándem (TAP) en el término C de Atg20 (SNX-BAR ORF 1) utilizando una recombinación homóloga. Utilice la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para confirmar las integraciones (Figura 2).
- Realice una mancha occidental de lisado celular contra la etiqueta TAP para confirmar la integración adecuada13.
NOTA: Recomendamos la cosecha de 3 OD (1 OD a 1 x 107 células) de células para la verificación de SDS-PAGE y western blot. Tenga en cuenta que la integración de la etiqueta TAP debe producirse antes de reemplazar los promotores endógenos con el promotor GAL1 para permitir una verificación más fácil de la etiqueta TAP a través de western blot. - Sustituya los promotores endógenos Snx4 (SNX-BAR ORF1) y Atg20 (SNX-BAR ORF 2) por un promotor GAL1 sin etiquetar utilizando pasos de recombinación y transformación homólogos secuenciales de cada ORF14individual.
- Utilice imprimaciones de flanqueo fuera de los sitios de integración para que el PCR confirme las integraciones correctas(Figura 2). Esto dará lugar a un fenotipo nulo de los SNX-BARs dirigidos en ausencia de galactosa en el medio de crecimiento.
2. Inducción de levadura y purificación de dimer SNX-BAR
NOTA: Las células de levadura se pueden propagar en las placas de agar estándar YPD (extracto de levadura, peptona y 2% glucosa) ya que las modificaciones se integran cromosómicamente.
- Inocular un gran hisopo de células en 50 ml de medio estándar DeP (extracto de levadura y peptona) con 2% de rafinosa y 0,1% de glucosa como fuente de carbono en un matraz al menos 4 veces el volumen del cultivo y crecer durante la noche en un agitador de 30 oC para permitir una aireación adecuada. Espere que el crecimiento en este medio será más lento en comparación con el YPD estándar.
- A la mañana siguiente, utilice la precultura de 50 ml para inocular en 1 L de medio YP estándar con 2% de rafinosa y 0,1% de glucosa y crezca durante 4-5 h en un agitador de 30 oC.
NOTA: El volumen de precultivo utilizado para inocular cultivo de 1 L puede ajustarse dependiendo de laDo6 600 de la precultura. El OD600 del cultivo de 1 L después de la inoculación debe ser alrededor de 0.2 para permitir al menos dos duplicaciones durante el crecimiento de 4-5 h.- Utilice un matraz Fernbach desconcertado para el crecimiento para permitir una aireación adecuada, un matraz de volumen de 2,8 L es suficiente. Menos aireación puede resultar en un crecimiento más lento y pellet celular más pequeño al cosechar.
- Marque OD600 para asegurarse de que la referencia cultural está en la fase de registro (0,5-1) después de 4-5 h de crecimiento. Dependiendo del crecimiento de la cepa, realice ajustes en el tiempo de crecimiento para permitir al menos dos duplicaciones. Añadir al 2% de galactosa y crecer durante la noche en un agitador de 30 oC.
NOTA: La OD600 después del crecimiento nocturno puede variar, pero la cultura debe estar saturada. Tenga en cuenta que las células no necesitan ser eliminadas de 0.1% glucosa antes de la adición de 2% galactosa para este protocolo de crecimiento. Recomendamos cosechar 3 OD de células no inducidas e inducidas en este paso para SDS-PAGE y western blot para verificación(Figura 3A, B, Carril 1-2). - Cosecha de células por centrifugación a 4500 x g durante 15 min. Aquí se puede utilizar un rotor de cucharón oscilante que acomode el cultivo de volumen de 1 L.
- Transfiera el pellet de levadura a un tubo cónico de 50 ml; un segundo paso de centrifugación se puede realizar según sea necesario. El pellet celular generalmente será alrededor de 10-15 mL en volumen según lo medido por las marcas de graduación y puede ser utilizado inmediatamente o almacenado a -80 oC.
- Resuspenda el pellet en tampón de purificación de 15 ml (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM de ditiothreitol (TDT), cóctel inhibidor de la proteasa) para hacer el volumen final alrededor de 30 ml.
- Enfriar un homogeneizador a 4 oC antes de usarlo y equilibrarlo con tampón de purificación. Células Lyse usando un disruptor mecánico de células u homogeneizador. Cargue la muestra en el homogeneizador y cargue a 20,000-25,000 psi para 2-3 rondas; tenga en cuenta que a medida que las células se lisan, se requiere más presión de entrada para mantener 20,000-25,000 psi. Recoger el lisado celular en un tubo cónico de 50 ml sobre hielo.
NOTA: Si es necesario aplicar muestras adicionales, el homogeneizador debe limpiarse y equilibrarse a fondo antes de cargar la siguiente muestra. Mantenga todos los líticos celulares en hielo. - Limpie inmediatamente el lisado celular a 35.000 x g durante 1 h a 4 oC. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo. Tenga en cuenta que los lípidos de la lisis celular flotarán hasta la parte superior durante la centrifugación y no afectarán la purificación.
NOTA: Recomendamos ahorrar 0.5-1% del lisado y pellet para muestras SDS-PAGE. Típicamente, no se observan diferencias importantes y se puede hacer una mancha occidental adicional para confirmar la solubilidad de la proteína TAP(Figura 4, Carriles 1 y 2, respectivamente). - Equilibrar 300 l de perlas de sepharose IgG con tampón de purificación. Añadir al lisado celular despejado e incubar durante 2 h, girando a 4oC.
- Recoger las perlas en una columna de cromatografía de 10 ml y permitir que el lisado sin ataduras fluya a través.
- Lave las perlas con 10 ml de tampón de lavado (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM de TDT), añadiendo 1 ml a la vez y permitiendo que fluya completamente.
NOTA: Recomendamos ahorrar el 2% de las perlas IgG enlazadas para la muestra SDS-PAGE. Típicamente, observamos cuatro bandas principales; dos proteínas SNX-BAR y Cadenas Pesadas y Ligeras IgG(Figura 4,Carril 3). Recomendamos ahorrar cantidades equivalentes de 'eluido' y 'IgG perlas después de TEV' para comparar para la eficiencia de escisión TEV. - Recoger las perlas y transferirlas a un tubo de microcentrífuga. Añadir a 500 l de volumen total con tampón de lavado fresco y 2 ml de proteasa TEV de 10 mg/ml e incubar durante la noche, girando a 4oC.
- A la mañana siguiente, retire el sobrenadante completamente usando una aguja de 27 G y evalúe la pureza de la proteína en un 10% de poliacrilamida SDS-PAGE(Figura 4,Carril 4).
NOTA: Por lo general, obtenemos 500 l de 0,5-1 mg/ml de heterodímero puro al 95%(Figura 4,Carril 4). También se puede realizar una purificación adicional con resina de calmodulina, sin embargo, normalmente vemos una reducción significativa en el rendimiento y recomendamos detenerse aquí si la pureza es >90%. TEV no interfiere con los ensayos de unión liposoma, aunque teV se puede eliminar adicionalmente utilizando cuentas de agarosa Ni-NTA15. - Para concentrarse, transfiera la muestra a un filtro centrífugo de 0,5 ml con corte y centrífuga de 10 KDa de acuerdo con las instrucciones del fabricante a 50 ml o menos. Cuantifique las proteínas concentradas utilizando el ensayo de proteínas Bradford. Conservar a 4oC y utilizarlo en el plazo de una semana.
3. Preparación de liposomas
- Comprar lípidos disponibles comercialmente: fosfatidilserina (PS), PI3P, ergosterol, y fosfatidilcolina (PC). Si es necesario, resuspenda en el disolvente recomendado para hacer lípidos en stock.
NOTA: Los lípidos se resuspenden en una mezcla de metanol/cloroformo según las recomendaciones del fabricante. Asegúrese de que las existencias de lípidos estén claras y calentadas a temperatura ambiente antes de usarlos. Los lípidos resuspendidos pueden almacenarse bajo gas de argón y sellarse con película de cera (o equivalente) a -20 oC durante 6-12 meses o hasta que se observe la pérdida de actividad. - Calcular el volumen requerido de cada stock de lípidos para crear una mezcla con la composición lipídica deseada (ver Tabla 1). Supongamos un total de 1 lunar de lípidos en la mezcla de lípidos.
- Realice este paso en una campana de humo químico. Limpie las jeringas de vidrio mediante la elaboración de un volumen completo de cloroformo y descartándolo en un contenedor de residuos. Repita dos veces más. Al transferir cloroformo, utilice únicamente jeringas o pipetas de vidrio. Cuando extraiga cloroformo, tire del tapón lentamente para evitar la introducción de burbujas de gas en la jeringa.
- Utilice jeringas de vidrio para transferir los lípidos en stock calculados en un tubo de cultivo de vidrio limpio para hacer una mezcla final de lípidos de 1% PI3P, 20% ergosterol, 30% PS, PC (Tabla 1). Dependiendo de los disolventes en los que se resuspende cada lípido, la mezcla puede volverse turbia al adición de cada lípido.
NOTA: Para variar las concentraciones de PS (0-30%), ajuste los volúmenes en consecuencia y compense con diferentes PC(Tabla 1). - Seque cuidadosamente la mezcla de lípidos utilizando gas nitrógeno dirigido a la mezcla de lípidos en un movimiento circular para secar los lípidos uniformemente. Utilice un flujo de gas bajo para mantener los lípidos en la parte inferior del tubo de vidrio durante el proceso de secado. Envuelva el tubo de cultivo de vidrio con papel de aluminio, dejando la abertura sin tapar, y deshidrate aún más en vacío durante 1 h.
- Añadir 400 ml de tampón de unión (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2) para deshidratar completamente los lípidos para hacer una concentración de liposoma final de 2,5 mM.
NOTA: La concentración final de liposoma se puede ajustar añadiendo más o menos tampón de unión. Por ejemplo, se puede añadir un tampón de unión de 200 l para producir una concentración de liposoma de 5 mM si es necesario (ver más abajo).- Resuspender los lípidos agitando a velocidad media en un vórtice a temperatura ambiente durante 30 min. El tampón debe aparecer turbio a medida que se resuspenden los lípidos.
- Transfiera los liposomas resuspendidos a un tubo de microcentrífuga. A partir de este punto, las puntas de pipeta de plástico se pueden utilizar ya que los lípidos ya no se resuspenden en cloroformo. Tenga en cuenta que la solución liposoma debe verse turbia.
- Liposomas de congelación-descongelación de siete a ocho veces sumergiendo el tubo de microcentrífuga primero en nitrógeno líquido, luego en un baño de agua de 37 oC. La mezcla de liposomas debe aparecer completamente congelada y sólida por ojo antes de descongelarse.
- Realizar pasos que impliquen cloroformo en una campana de humo químico. Limpie dos jeringas de vidrio de 1 ml mediante la elaboración y desechar los volúmenes completos de cloroformo, tres veces cada una, para eliminar los lípidos residuales. Equilibre cada jeringa de vidrio con agua ultrapura mediante la elaboración de dos volúmenes de jeringa, luego equilibre con el tampón de unión mediante la elaboración de dos volúmenes de jeringa.
- Montar el miniextrusor de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Equilibrar una membrana de 200 nm y dos piezas de soportes de filtro (ver Tabla de Materiales)sumergiendo cada uno en tampón de unión.
- Sandwich la membrana entre los soportes del filtro y colocar en el mini-extrusor. Para reducir el volumen muerto en el miniextrusor montado y para asegurarse de que el conjunto esté hermético, pase un volumen de tampón de unión comparable al volumen de la mezcla de liposomas a través de miniextrusor utilizando las jeringas de vidrio de 1 ml.
- Utilice una de las jeringas de vidrio de 1 ml y extraiga la mezcla de liposomas. Invierta el tubo de microcentrífuga para recoger la última mezcla de liposomas en la tapa del tubo para su dibujo en la jeringa de vidrio.
- Extruir liposomas pasando a través de la membrana de 200 nm 19-21 veces. Recoger liposomas extruidos en un nuevo tubo de microcentrífuga.
NOTA: Los liposomas extruidos deben aparecer menos turbios que los liposomas antes de la extrusión. Los liposomas deben utilizarse el mismo día y almacenarse en hielo. La última extrusión debe colocar liposomas en la jeringa opuesta a la que comenzó.
4. SNX-BAR Liposome Binding y Tubulation
- Proteína purificada preclear a 100.000 x g en una ultracentrífuga durante 20 minutos a 4 oC antes de realizar experimentos de unión y sedimentación de liposomas. Retire el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga; no moleste el pellet si lo hay.
- Para realizar ensayos de unión y tubulación liposomas, incubar liposomas purificados Snx4-Atg20 y 2,5 mM en un volumen de reacción total de 20 l, variando el volumen de liposomas añadidos.
NOTA: En el mismo experimento, se debe utilizar el mismo volumen de liposomas. - Incubar la reacción a 30oC durante 30 min.
NOTA: Sugerimos maximizar la cantidad de liposomas de 2,5 mM añadidos a cada reacción mediante el uso de no menos de 10 liposomas de l para permitir la visualización durante la sedimentación. Si se utilizan 10 ml de liposomas de 2,5 ml en una reacción de 20 ml, la concentración final de liposomas será de 1,25 mM. Si las proteínas purificadas se diluyen y se requiere más volumen para proteínas de 4 m, los lípidos pueden resuspenderse en 200 ml durante el paso de rehidratación para duplicar la concentración de liposomas (ver Paso 3.6); sin embargo, esto requerirá conocer la concentración de proteínas antes de hacer los liposomas. -
Visualizar y cuantificar la tubulación liposoma.
- Reacción de unión liposoma de proceso inmediatamente para el análisis de microscopía electrónica. Detecte muestras en una rejilla de malla de cobre recubierta de carbono y una mancha negativa utilizando un 1% de acetato de urila(Figura 5B)16.
- Analizar muestras en un microscopio electrónico de transmisión (200 kV).
- Utilice el software de análisis de imágenes para medir y cuantificar el diámetro de los túbulos. Para cuantificar con precisión el diámetro del túbulo de un solo túbulo, realice mediciones de tres diámetros a lo largo de la longitud de un túbulo y un promedio(Figura 5B).
NOTA: Se utilizó un análisis bidireccional de la varianza para determinar la significancia estadística(Figura 5E). El acetato de ursionl es tanto radiactivo como tóxico. Se requiere una certificación de seguridad de laboratorio adecuada para realizar este paso.
-
Unión y sedimentación de liposomas.
- Transfiera la reacción (20 l, del paso 4.3) a un tubo centrífugo de policarbonato y utilice un rotor compatible para girar a 100.000 x g en una ultracentrífuga durante 20 minutos a 4 oC. Retire con cuidado el sobrenadante y transfiera al nuevo tubo de microcentrífuga. Tenga en cuenta que el pellet debe permanecer intacto.
- Resuspenda el pellet en SDS-PAGE 40 l de tampón de muestra y transfiera a un nuevo tubo de microcentrífuga. Añadir 20 l de tampón de muestra al sobrenadante. Cargue cantidades equivalentes de pellets y sobrenadantes en un gel SDS-PAGE de poliacrilamida al 10% y realice la tinción de Coomassie para visualizar sNX-BARs enlazados a liposomas(Figura 5A).
- Para cuantificar la cantidad de complejo SNX-BAR en la fracción de pellets, cuantifique las intensidades de la banda utilizando densitometría y cuantifique la proporción de proteínas SNX-BAR en la fracción de pellets.
NOTA: Se utilizó un análisis bidireccional de la varianza para determinar la significancia estadística(Figura 5C).
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Representative Results
Este protocolo describe un método para la producción reproducible y robusta de complejos endógenos de levadura SNX-BAR que se puede utilizar para ensayos de remodelación de membrana aguas abajo (Figura 1). La construcción de la cepa de levadura utilizada para la purificación aprovecha la eficiencia de la recombinación homóloga en levadura en ciernes, permitiendo modificaciones en los loci genómicos de los SNX-BARs específicos(Figura 2). Este diseño tiene dos ventajas, (i) ya que la selección no es necesaria para mantener las modificaciones, se puede utilizar el medio YP estándar, lo que permite el crecimiento a una mayor densidad celular y por lo tanto una mayor producción de proteína y (ii) los niveles de expresión de los SNX-BARs objetivo serán uniformes, optimizando la producción del complejo heterodimeño. Antes de la adición de galactosa, los SNX-BARs dirigidos exhibirán un fenotipo nulo y, por lo tanto, pueden dar lugar a un defecto de crecimiento u otros defectos conocidos específicos de los SNX-BAR starget. Además, el crecimiento en 2% de rafinosa y 0.1% glucosa es más lento que el crecimiento en 2% glucosa. Por lo tanto, el período de crecimiento antes de la inducción de galactosa puede requerir optimización para cada cepa en particular. Para comprobar la inducción adecuada de la expresión SNX-BAR, es probable que se requiera una mancha occidental contra la etiqueta TAP, ya que los niveles de proteína de los SNX-BARs pueden no detectarse a través de la mancha de Coomassie(Figura 3). Sin embargo, debido a que solo un miembro del complejo SNX-BAR tiene una etiqueta, la expresión de las proteínas sin etiquetar no se puede confirmar a menos que se completen todos los pasos de la purificación. Después de la purificación del heterodimero SNX-BAR, las bandas de los dos SNX-BAR deben parecer estar en una relación estequiométrica 1:1 y debe haber pocas o ninguna banda contaminante(Figura 4,carril 4). Si hay bandas contaminantes adicionales, y la cepa de levadura inicial ya es deficiente en proteasa, se puede agregar más inhibidor de la proteasa durante la lisis celular. Además, se puede realizar un segundo paso de purificación utilizando resina de calmodulina.
Al realizar ensayos de remodelación de membrana(Figura 5), se debe utilizar la misma preparación de liposomas y proteínas purificadas en el mismo experimento. Si se requieren múltiples preparaciones de purificación de proteínas para alcanzar la concentración deseada, combine toda la proteína purificada antes de realizar el experimento. Los liposomas deben hacerse y utilizarse en el mismo día(Tabla 1). Al realizar ensayos de sedimentación liposoma, es fundamental que la proteína purificada se predespeje utilizando las mismas condiciones de sedimentación de 100.000 x g durante 20 minutos inmediatamente antes de incubar con liposomas, ya que la proteína precipitada puede sesgar los resultados. Además, el pellet liposoma debe permanecer intacto después de la sedimentación.
Figura 1: Diagrama de flujo de ensayo de enlace SNX-BAR. Brevemente, en los pasos 1-2, diseñamos promotores de GAL en dos loci genómicos SNX-BAR, reemplazando a cada uno de los promotores endógenos y diseñando una etiqueta TAP de terminal C en uno de los dos loci SNX-BAR. A continuación, en los pasos 3-7, inducemos las células con galactosa y purificamos la heterodílica SNX-BAR a homogeneidad. En los pasos 8-12, calculamos y preparamos liposomas unilamelares. Por último, podemos combinar los heterodímeros SNX-BAR con liposomas unilamelares y realizar dos ensayos; El paso 14a-16a involucra la tublación de membrana y 14b-16a involucran el ensayo de sedimentación. Consulte el texto para obtener más detalles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estrategia de integración SNX-BAR. Dos loci SNX-BAR fueron dirigidos a la expresión GAL mediante recombinación homóloga. SNX-BAR ORF1 (Atg20) fue además dirigido a expresar una etiqueta TAP de terminal C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Verificación de inducción de galactosa. (A-B) Con el fin de verificar la inducción GAL de Atg20-TAP, recomendamos un análisis SDS-PAGE y western blot de extractos celulares inducidos con 2% galactosa (A, B, carril 2) y sin inducción (A, B, carril 1). (C) Membrana de mancha occidental también se despoja y sondea con anti-pgk1 para un control de carga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplo de purificación de heterodímeros Atg20-Snx4. Las células de levadura diseñadas para expresar Atg20-TAP y Snx4 impulsadas por promotores de galactosa fueron inducidas con 2% de galactosa, lysed y boundadas usando igG sepharose, y eluted con TEV proteasa. Las muestras de cada paso de purificación se muestran en 10% SDS-PAGE. Carril 1: sobrenadante inducido del lisado. Carril 2: perdigón inducido de lisado. Carril 3: muestra de proteínas unidas a la sepharose IgG. Carril 4: Eluido TEV de heterodímeros Atg20-Snx4 puros de sepharose IgG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ensayo representativo de unión y tublación de liposomas. (A) los heterodímeros SNX-BAR, Atg20-Snx4 y Vps5-Vps17 de levadura, fueron expresados, purificados y enlazados a liposomas sintéticos como se describe en el texto. Tenga en cuenta que Mvp1 forma homodímeros y se expresa en bacterias. (B) Micrografías EM del ensayo de tubulación de liposomas Snx4-Atg20 y mediciones de túbulos (inset). (C) La unión SNX-BAR a diferentes composiciones de liposomas se cuantificó mediante densitometría. El gráfico indica el error medio y estándar de la media. **p < 0.002. (D) Los diámetros de los túbulos se cuantificaron y graficaron como se describe en el texto. Barra de escala a 200 nm. Las barras de error representan el análisis bidireccional de la varianza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Composición liposoma típica | DOPC | Dops | Ergosterol | PI3P-C16 |
| Mw | 786.1 | 810.0 | 396.7 | 957.0 |
| fracción mol | 49% | 30% | 20% | 1% |
| Stock mM | 32.0 | 12.0 | 25.0 | 1.0 |
| Masa (mg) | 385.2 | 243.0 | 79.3 | 9.6 |
| Concentración (mg/ml) | 25.2 | 9.7 | 9.9 | 1.0 |
| Volumen a RXN(mL) | 15.3 | 25.0 | 8.0 | 10.0 |
Tabla 1: Receta liposoma. Los liposomas sintéticos se prepararon utilizando una combinación de DOPC, DOPS, ergosterol y PI3P. Calculamos la concentración final a 1 mol de lípidos. Nuestra composición estándar incluye 20% ergosterol, 1% PI3P, DOPS (hasta 30%) y cantidades variables de DOPC. La tabla incluye una formulación típica para 400 l de 30% DOPS.
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Discussion
Aquí, demostramos un flujo de trabajo optimizado para purificar dimers SNX-BAR en levadura y dos ensayos para evaluar sus propiedades biofísicas en liposomas sintéticos. La principal ventaja sobre la expresión típica de proteínas recombinantes en Escherichia coli u otros sistemas es la capacidad de expresar uniformemente proteínas SNX-BAR en un huésped nativo, evitando así los problemas de toxicidad e insolubilidad encontrados en la purificación de SNX-BARs en otros sistemas. También es notable que nuestro sistema no requiere clonación molecular o el alojamiento de múltiples vectores de expresión17. Nuestras cepas de levadura SNX-BAR duales son impulsadas por promotores de galactosa de ingeniería cromosómica, asegurando así una expresión uniforme tras la inducción. Una consideración importante es que en ausencia de galactosa, habrá poca o ninguna expresión de los SNX-BARs dirigidos, lo que resultará en un fenotipo nulo. Además, encontramos que los SNX-BARs tienden a tolerar bien las etiquetas C-terminal, lo que nos permite añadir la etiqueta TAP en el C-terminus. Sin embargo, dependiendo de la proteína que se va a etiquetar, también se puede utilizar una etiqueta TAP N-terminal12. Además, dado que los SNX-BAT sólo forman dimers 1:1, solo se requiere que una proteína sea etiquetada para fines de purificación. Sin embargo, se ha demostrado que algunos SNX-BAR que normalmente forman heterodímeros en la célula forman homodímeros bajo concentraciones no fisiológicas7. Por lo tanto, es fundamental que tras la purificación del heterodimer, la relación estequiométrica de los dos SNX-BARs debe ser 1:1, que se puede verificar ejecutando una alícuota del complejo purificado en un gel SDS-PAGE y realizando la tinción de Coomassie. Una vez diseñadas, estas cepas de levadura se pueden guardar a perpetuidad como un 15% (v/v) de stock de glicerol a -80 oC y/o modificarse adicionalmente para consultar socios de enlace adicionales. Nuestro flujo de trabajo normalmente toma 2-3 semanas para la construcción de cepas y 3-4 días para la expresión y purificación y 1 día para ensayos de unión liposoma. Creemos que este flujo de trabajo puede ayudar a los investigadores a comprender mejor la especificidad lipídica de las proteínas SNX-BAR utilizando proteínas BAR nativas en liposomas sintéticos o vesículas unilamelares gigantes (GUVs) y revelar la composición precisa de los lípidos necesarios para impulsar la remodelación de la membrana, revelando así su mecanismo de acción.
Pasos críticos
Durante nuestros primeros intentos de purificar los heterodímeros SNX-BAR de células deficientes no proteasas, a menudo encontramos rendimientos reducidos y productos de degradación. Por lo tanto, durante los pasos iniciales de la construcción de la cepa, creemos que es fundamental comenzar con una cepa de levadura parental que es deficiente para una o más de las principales proteinasas vacuolares. En particular, encontramos cepa de levadura TVY614, que se agota para pep4, prb1,y prc1, para ser el más óptimo. Usando la cepa TVY614, obtenemos rutinariamente >90% heterodímeros Snx4-Atg20 puros(Figura 4 y Figura 5A). Sin embargo, la necesidad de ablar las tres proteinasas puede ser específica de la combinación SNX-BAR. Por ejemplo, los heterodímeros Vps5-Vps17 se han purificado con éxito en cepas deficientes no proteasas10 y cuando incluimos la adición de una ablación PEP4, observamos modestos aumentos en rendimiento y pureza(Figura 5A). Por lo tanto, dependiendo de las aplicaciones posteriores del usuario y la necesidad de pureza o marcadores seleccionables, puede haber flexibilidad al diseñar cepas de expresión.
El orden de construcción de genes también es importante. Recomendamos c-terminalLY TAP etiquetado SNX-BAR ORF 1 primero, con el fin de confirmar la expresión por western blot sin la necesidad de inducción de galactosa (Figura 1). Durante la inducción de galactosa, es fundamental pre-condicionar las células durante la noche en 2% rafinosa y 0.1% glucosa. La falta de condición previa de las células resulta en un crecimiento extremadamente lento o la muerte celular. Sin embargo, también es crítico para las células para agotar la glucosa restante durante el crecimiento durante la noche, de lo contrario la inducción de galactosa puede verse afectada negativamente. También se recomienda comprobar varios aislados por western blot para evaluar la homogeneidad de expresión de las proteínas SNX-BAR etiquetadas con TAP. Normalmente analizamos 2-3 aislados y elegimos al candidato más robusto y que expresa.
Modificación, enfoques alternativos y aplicaciones futuras
En el paso 2.8, la purificación de afinidad en tándem (TAP) normalmente requiere una purificación de afinidad de dos pasos utilizando perlas IgG y calmodulin después del escote TEV12. Sin embargo, en este protocolo, elugamamos los dimers SNX-BAR por teteasa con muy alto rendimiento y pureza. Encontramos la posterior purificación de afinidad utilizando perlas de calmodulina produce rendimientos inconsistentes y reducidos, por lo que recomendamos detenerse después del escote TEV. El eluido TEV que contiene las proteínas SNX-BAR y su proteasa TEV con etiqueta de 6 personas puede ser purificado aún más con perlas de agarosa Ni-NTA. Sin embargo, también encontramos que este paso puede reducir el rendimiento general de la proteína SNX-BAR y es innecesario, ya que la proteasa TEV no interfiere con los ensayos de unión o tublación de liposomas. Por lo tanto, si los SNX-BARs purificados se utilizarán para cualquier otra aplicación, recomendamos al usuario evaluar el impacto de la proteasa TEV en sus ensayos.
Hasta ahora, hemos tenido éxito utilizando este protocolo y las modificaciones descritas para purificar los heterodímeros Snx4-Atg20 y Vps5-Vps17 en levadura y hemos evaluado con éxito su especificidad lipídica en liposomas sintéticos. Sin embargo, creemos que el protocolo se puede adaptar con éxito a cualquiera de los SNX-BARs en levadura. También es posible utilizar el sistema para producir proteínas SNX-BAR recombinantes de cualquier otro organismo. Sin embargo, esto requeriría un paso adicional de construcción de cepas para integrar un locus gen exógeno en el genoma de la levadura. También creemos que el sistema se puede ampliar para purificar complejos multiméricos, incluidas las proteínas de carga. Por lo tanto, creemos que nuestro sistema de expresión puede extenderse más allá de la comprensión de los lípidos especificados de SNX-BARs. Las aplicaciones futuras permitirán a los investigadores reconstituir complejos de captura de carga entera en liposomas para entender cómo los ensamblajes completos pueden influir en la remodelación de membranas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio GM060221 y en parte por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales salud bajo el número de premio T32GM007223. R.C. fue apoyado en parte por el Programa de Becas de Investigación de la Facultad de la UNC-Charlotte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 G needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| Ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 μL/1 mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 °C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 |
References
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