Summary
Hier presenteren we een workflow voor de expressie, zuivering en liposoom binding van SNX-BAR heterodimers in gist.
Abstract
SNX-BAR eiwitten zijn een evolutionair gekonveerde klasse van membraan remodellering eiwitten die belangrijke rollen spelen bij het sorteren en handel in eiwitten en lipiden tijdens endocytose, sorteren binnen het endosomale systeem en autophagie. Centraal in de SNX-BAR proteïne-functie is de mogelijkheid om homodimers of heterodimers te vormen die de membranen binden met sterk geconcongeerde phox-homologie (PX) en BAR (bin/Amphiphysin/RVS) domeinen. Bovendien kan oligomerisatie van SNX-Bar Dimeren op membranen de vorming van membraan tubuli en blaasjes opwekken en deze activiteit wordt verondersteld hun functies als vacht eiwitten voor endosome-afgeleide transport dragers weer te geven. Onderzoekers hebben lang gebruikt in vitro bindende studies met behulp van recombinant SNX-BAR eiwitten op synthetische liposomen of gigantische unilamellaire blaasjes (Guv's) om de precieze make-up van lipiden die nodig zijn om membraan remodellering te stimuleren onthullen, dus onthullen hun werkingsmechanisme. Echter, als gevolg van technische uitdagingen met dubbele expressie systemen, toxiciteit van SNX-Bar eiwit expressie in bacteriën, en slechte oplosbaarheid van individuele SNX-Bar eiwitten, de meeste studies tot nu toe hebben onderzocht SNX-Bar homodimers, met inbegrip van niet-fysiologische Dimeren die vormen tijdens de expressie in bacteriën. Onlangs hebben we een protocol geoptimaliseerd om de grote tekortkomingen van een typisch bacteriële expressie systeem te overwinnen. Met behulp van deze workflow laten we zien hoe we grote hoeveelheden SNX-BAR heterodimers kunnen uitdrukken en zuiveren en hoe ze deze kunnen reconstitueren op synthetische liposomen voor bindende en tubulatie testen.
Introduction
Aan het membraan gebonden organellen zoals het plasma membraan, het endoplasmatische reticulum, het Golgi-apparaat, lysosoom (gist vacuole) en endosome omvatten het endomembraansysteem-systeem van de eukaryote cel. De meeste organellen hebben de mogelijkheid om via blaasje transporteurs materiaal met andere organellen te communiceren en uit te wisselen. Hoe de cel de verpakking en de vorming van blaasje transport dragers binnen het endomembraansysteem-systeem coördineert, is niet goed begrepen. Echter, de eiwitten en lipiden die een groot deel van het endomembraansysteem-systeem vormen, zijn bekend dat ze afkomstig zijn van het internaliseren van endocytische blaasjes uit het plasma membraan (PM). De endosome is de primaire acceptor organel voor deze blaasjes en bestaat uit meerdere onderling verbonden sets van buisvormige organellen. De belangrijkste functie van de endosome is het vergemakkelijken van nutriënten verwerving, reguleren van de omzet van eiwitten en lipiden, beschermen tegen pathogenen infectie, en dienen als de primaire bijvullen bron van lipiden voor het plasma membraan. Omdat de endosome het grootste deel van de lading eiwitten en lipiden uit het plasma membraan ontvangt, fungeert het als een sorteer compartiment door cargo's te isoleren in tubulaire endosomale transport dragers (ETCs). Alle eiwitten die niet in ETCs worden opgenomen, worden afgebroken via het Endo-lysosomale systeem. De disregulatie van de lading sortering in ETCS kan leiden tot het verlies van nutriëntenopname, eiwit omzet of lipide homeostase, resulterend in talrijke metabole, ontwikkelings-en neurologische aandoeningen1,2. Ondanks de centrale rol van ETCs bij de endosome, is het onderliggende mechanisme van de manier waarop de endosome de verpakking van een veelheid van heterogene cargo's selectief kunnen coördineren in buisvormige dragers, echter niet bekend.
Het sorteren van nexin (SNX) familie is een evolutionair gekonveerde klasse van eiwitten die zijn gebleken kritisch te zijn voor vele blaasje transport reacties in de cel3,4,5. Het sorteren van nexins wordt gerekruteerd naar het endogeen membraan en hulp bij het opvangen van de lading via hun karakteristieke phox homologie (PX) domein, dat phosphatidylinositol-3-monofosfaat bindt (PtdIns (3) P), een lipide verrijkt op het endoeen membraan. Zoogdieren coderen 33 SNX-eiwitten, die verder kunnen worden onderverdeeld in meerdere subfamilies, afhankelijk van de aanwezigheid van andere domeinen1. Met name de SNX-BAR subfamilie is de grootste onderfamilie bestaande uit twaalf mensen, terwijl in ontluikende gist, Saccharomyces cerevisiae, de onderfamilie wordt gereduceerd tot slechts zeven SNX-BARs. SNX-BAR eiwitten hebben zowel een PX domein als een bin-Amphiphysin-RVS (BAR) domein dat lipide reservoirs activeert om positieve kromming membranen te binden. Bijgevolg heeft de SNX-BAR familie een natuurlijke affiniteit voor de endosome en kan ze de vorming van ETC bemedieren via hun membraan remodellering capaciteiten. In vitro kunnen de verbouwingen van SNX-BARs worden geïnduceerd door de toevoeging van gezuiverde SNX-staven aan synthetische liposomen en de daaropvolgende vorming van smalle, gecoate tubuli kan worden gevisualiseerd door elektronenmicroscopie. Met behulp van deze methoden, onderzoekers hebben vastgesteld dat beide oligomerisatie concentratie en vernauwing sterkte lijken te variëren tussen de SNX-Bar familie suggereren dat ze konden helpen in zowel de vorming en de scissie van ETCS.
De SNX-BARs kunnen verder worden geclassificeerd door hun exclusieve door dimerisatie-eigenschappen. In vitro binding testen en structurele studies hebben aangetoond dat SNX-BAR eiwitten alleen specifieke homodimers of heterodimers kunnen vormen. Daarom, in principe, elke potentiële SNX-BAR dimer-oligomeren zou kunnen bieden een tubulus Coat voor een Cargo-specifieke handel traject en ook, de beperkte oligomerisatie van de andere SNX-BAR protomers, kunnen definiëren verschillende export trajecten. Echter, vanwege het grote aantal SNX-BARs en diversiteit binnen de SNX-familie, is een één Sorteer nexin-One Cargo hypothese hoogst onwaarschijnlijk. In plaats daarvan een gecoördineerde inspanning met behulp van een veelheid van factoren, zoals SNX-BARs, lading, lipide specificiteit en andere afhankelijkheden is waarschijnlijker. Evenzo, recente studies van de gist SNX4 familie geopenbaard bewijs voor extra lipide specificiteit, buiten PtdIns (3) P, te versterken endosome transport dragers6. In deze studie, SNX-Bar homodimer Mvp1-Mvp1 werd gezuiverd van bacteriën en inheemse heterodimers Snx4-Atg20 en Vps5-Vps17 werden uitgedrukt en gezuiverd in hoge opbrengst van gist, terwijl alleen Snx4-Atg20 werd gevonden om bij voorkeur binden fosfatidylserine (PS) en vormen smalle buis-achtige structuren in liposoom bindende studies6. Terwijl anderen in het veld hebben onthuld belangrijke eigenschappen van de SNX-BARs met behulp van recombinantly gezuiverde SNX-Bar homodimers van bacteriën, toxiciteit in verband met uitdrukken SNX-Bar heterodimers in vergelijkbare systemen hebben hun inheemse karakterisering7,8,9,10belemmerd. Daarom, zonder een betrouwbaar systeem te verkrijgen zuivere recombinantly uitgedrukt inheemse heterodimers, onderzoekers moeten afzien van deze onderzoekslijnen. In Figuur 1presenteren we een vierdelige workflow aan 1) om een gist-stam te maken die de SNX-Bar heterodimers overdrukt voor het zuiveren van tandem-affiniteit, 2) Express en zuiveren inheemse SNX-Bar heterodimers, 3) bereid unilamellaire synthetische liposomen, en 4) opzetten van een liposoom tubulatie of sedimentaties Assay, het verstrekken van een essentieel instrument voor onderzoekers om de groeiende catalogus van het sorteren nexins gevonden in de natuur te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. constructie van gist stam
- Begin met TVY614 (pep4Δ:: LEU2 Prb1Δ:: Hisg prc1Δ:: HIS3)11 als de bovenliggende stam. Deze stam is een tekort aan vacuollaire proteasen, die bijdragen aan de meerderheid van de eiwitafbraak na cel lysis, en daarom zorgt voor een schonere en efficiëntere zuivering.
- Ontwerp primers12 en integreer tandem Affinity zuivering (TAP) tag op het C-eindpunt van ATG20 (SNX-Bar ORF 1) met behulp van homologe recombinatie. Gebruik de polymerase kettingreactie (PCR) om integraties te bevestigen (Figuur 2).
- Voer een Western-Blot van cellysaat uit tegen de TIKTAG om de juiste integratie13te bevestigen.
Opmerking: We raden aan om 3 OD (1 OD ≈ 1 x 107 cellen) van cellen te oogsten voor SDS-page en Western Blot-verificatie. Houd er rekening mee dat de integratie van de TAP-tag moet plaatsvinden voordat de endogene promotors worden vervangen door de promotor GAL1, zodat u gemakkelijker tikken op tagverificatie via Western Blot. - Vervang endogene Snx4 (SNX-BAR ORF1) en Atg20 (SNX-BAR ORF 2) promotors met niet-gelabelde GAL1 promotor met behulp van sequentiële homologeuze recombinatie en transformatiestappen van elke afzonderlijke ORF14.
- Gebruik flankerende primers buiten de integratie sites om PCR te bevestigen succesvolle integraties (Figuur 2). Dit zal resulteren in een nulfenotype van de beoogde SNX-staven bij afwezigheid van galactose in het groeimedium.
2. gist inductie en SNX-BAR dimer zuivering
Opmerking: Gistcellen kunnen worden gekweekt op standaard YPD (gistextract, peptone, en 2% glucose) agar platen, omdat de modificaties chromosomaal geïntegreerd zijn.
- Inoculeren een groot wattenstaafje in 50 mL standaard YP (gistextract en peptone) medium met 2% raffinose en 0,1% glucose als koolstofbron in een kolf ten minste 4x het volume van de cultuur en groeien 's nachts in 30 ° c Shaker om een goede beluchting mogelijk te maken. Verwacht dat de groei in dit medium langzamer zal zijn in vergelijking met standaard YPD.
- Volgende ochtend, gebruik de 50 mL precultuur te inoculeren in 1 L standaard YP medium met 2% raffinose en 0,1% glucose en groeien voor 4-5 h in 30 ° c Shaker.
Opmerking: Het volume van de precultuur gebruikt voor het inoculeren van 1 L-cultuur kan worden aangepast, afhankelijk van de OD600 van de precultuur. De OD600 van de 1 L-cultuur na de inoculatie moet rond de 0,2 zijn om ten minste twee doublings toe te staan tijdens de groei van 4-5 uur.- Gebruik een verbijsterd Fernbach kolf voor groei om een goede beluchting mogelijk te maken, een kolf van 2,8 liter volstaat. Minder beluchting kan resulteren in een tragere groei en kleinere celpellet bij het oogsten.
- Controleer OD600 om ervoor te zorgen dat cultuur zich in de log fase (0.5-1) na 4-5 h van groei. Afhankelijk van de groei van de stam, aanpassingen aan de groeitijd te laten ten minste twee doublings. Voeg toe aan 2% galactose en groei 's nachts in 30 °C Shaker.
Opmerking: De OD600 na de nachtelijke groei kan variëren, maar de cultuur moet verzadigd zijn. Houd er rekening mee dat cellen niet hoeven te worden verwijderd uit 0,1% glucose voor toevoeging van 2% galactose voor dit groei protocol. We raden aan om 3 OD van niet-geïnduceerde en geïnduceerde cellen te oogsten bij deze stap voor SDS-PAGE en Western Blot ter verificatie (Figuur 3A, B, Lane 1-2). - Oogst cellen door centrifugeren bij 4500 x g gedurende 15 minuten. Hier kan een swingende emmer rotor worden gebruikt die geschikt is voor de volume cultuur van 1 liter.
- Breng de gist pellet over in een conische buis van 50 mL; indien nodig kan een tweede Centrifugeer stap worden uitgevoerd. De celpellet zal over het algemeen ongeveer 10-15 mL in volume zijn, gemeten met Afstudeer markeringen en kan onmiddellijk worden gebruikt of opgeslagen bij-80 °C.
- Respendeer pellet in 15 mL zuiverings buffer (50 mM tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mm Dithiothreitol (DTT), cocktail van proteaseremmer) om het uiteindelijke volume rond 30 ml te maken.
- Chill een homogenisator 4 °C voor gebruik en equilibreren met een zuiverings buffer. Lyse cellen met behulp van een mechanische cel disruptor of homogenisator. Laad het monster in de homogenisator en lyse op 20000-25000 psi voor 2-3 rondes; Houd er rekening mee dat als cellen worden lysed, meer ingangsdruk is vereist voor het behoud van 20000-25000 psi. Verzamel het cellysaat in een conische buis van 50 mL op ijs.
Opmerking: Als er extra monsters moeten worden gelyseerd, moet de homogenisator grondig worden gereinigd en geëscaleerd voordat het volgende monster wordt geladen. Houd alle cellysaten op ijs. - Wis onmiddellijk het cellenlysaat bij 35.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °c. Breng het supernatant voorzichtig over in een nieuwe buis. Merk op dat de lipiden van celllysis naar de top zullen zweven tijdens het centrifugeren en geen invloed zullen hebben op zuivering.
Opmerking: We raden u aan 0,5-1% van het lysaat en de pellet voor SDS-PAGE samples op te slaan. Normaalgesproken worden geen grote verschillen waargenomen en kan een extra Western-Blot worden uitgevoerd om de TAP eiwit oplosbaarheid te bevestigen (respectievelijkFiguur 4, Lanes 1 en 2). - 300 μL IgG-sepharose-kralen met zuiverings buffer. Voeg toe aan de gewiste cel lysaat en inincuberen voor 2 h, draaiend bij 4 °C.
- Verzamel kralen in een 10 mL chromatografie kolom en laat ongebonden lysaat doorstromen.
- Was kralen met 10 mL wasbuffer (50 mM tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mm DTT), waarbij 1 ml tegelijk wordt toegevoegd en volledig door stroomt.
Opmerking: We raden u aan 2% van de gebonden IgG-kralen te sparen voor een SDS-PAGE sample. Typisch, we observeren vier grote bands; twee SNX-BAR eiwitten en IgG zware en lichte kettingen (Figuur 4, Lane 3). We raden aan om equivalente hoeveelheden ' eluate ' en ' IgG Beads na TEV ' te bewaren om te vergelijken voor de decolleté-efficiëntie van TEV. - Verzamel kralen en breng ze over naar een microcentrifuge buis. Voeg toe aan 500 μL totaal volume met verse reinigings buffer en 2 μL 10 mg/mL TEV protease en inincuberen 's nachts, draaibaar bij 4 °C.
- Verwijder de supernatant de volgende ochtend volledig met een 27 G naald en evalueer de eiwit zuiverheid met 10% Polyacrylamide SDS-PAGE (Figuur 4, Lane 4).
Opmerking: Meestal verkrijgen we 500 μL van 0,5-1 mg/mL 95% zuivere heterodimer (Figuur 4, Lane 4). Extra zuivering met behulp van Calmoduline hars kan ook worden gedaan, maar we meestal zien een aanzienlijke vermindering van de opbrengst en raden stoppen hier als zuiverheid is > 90%. TEV interfereert niet met liposoom binding assays, hoewel TEV kan bovendien worden verwijderd met behulp van ni-NTA agarose kralen15. - Om zich te concentreren, breng het monster over naar een 0,5 mL centrifugale filter met 10 KDa cutoff en centrifuge volgens de instructies van de fabrikant tot 50 μL of minder. Kwantificeer de geconcentreerde eiwitten met behulp van de Bradford Protein assay. Bewaren bij 4 °C en binnen één week gebruiken.
3. voorbereiding van liposoom
- Aankoop commercieel beschikbare lipiden: fosfatidylserine (PS), PI3P, ergosterol, en dunlaag (PC). Indien nodig, respendeert in Aanbevolen oplosmiddel om de voorraad lipiden te maken.
Opmerking: Lipiden worden geresuspendeerd in een methanol/chloroform mengsel per fabrikant aanbevelingen. Zorg ervoor dat de lipiden voorraden helder zijn en op kamertemperatuur worden opgewarmd voordat u deze gebruikt. Resuspendeerde lipiden kunnen worden opgeslagen onder Argon-gas en worden verzegeld met een Wax-Film (of gelijkwaardig) bij-20 °C gedurende 6-12 maanden of totdat het verlies van de activiteit wordt waargenomen. - Bereken het vereiste volume van elke lipide kolf om een mengsel te maken met de gewenste lipide-samenstelling (Zie tabel 1). Neem een totaal van 1 mol van lipiden in het lipide mengsel.
- Voer deze stap uit in een chemische rook afzuigkap. Reinig glas spuiten door een volledige spuithoeveelheid van chloroform op te tekenen en deze in een afvalbak te verwijderen. Herhaal twee keer. Gebruik bij de overdracht van chloroform alleen glazen spuiten of pipetten. Bij het opstellen van chloroform trekt u de stop langzaam in om het inbrengen van gasbellen in de spuit te voorkomen.
- Gebruik glazen spuiten om voorraad lipiden over te brengen zoals berekend in een schone glazen kweek buis om een eind lipide mengsel te maken van 1% PI3P, 20% ergosterol, 30% PS, PC (tabel 1). Afhankelijk van de oplosmiddelen wordt elk lipide in geresuspendeerd, het mengsel kan bewolkt na toevoeging van elk lipide.
Opmerking: Om de concentraties van PS (0-30%) te variëren, past u de volumes dienovereenkomstig aan en compenseert u met verschillende PC'S (tabel 1). - Droog het lipide mengsel voorzichtig af met behulp van stikstofgas dat gericht is op het lipide-mengsel in een cirkelvormige beweging om lipiden gelijkmatig te drogen. Gebruik een lage gasstroom om de lipiden aan de onderkant van de glazen buis te houden tijdens het droogproces. Wikkel de glazen kweek buis met folie, laat de opening onbedekt, en verder dehydraat in vacuüm voor 1 h.
- Voeg 400 μL bindings buffer (50 mM tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2) toe om de lipiden volledig te dehydraat om een uiteindelijke liposoom concentratie van 2,5 mm te maken.
Opmerking: De uiteindelijke liposoom concentratie kan worden aangepast door een meer of minder bindende buffer toe te voegen. Zo kan bijvoorbeeld een bindings buffer van 200 μL worden toegevoegd om indien nodig een liposoom concentratie van 5 mM te produceren (zie hieronder).- Resuspendeer lipiden door te schudden op gemiddelde snelheid op een Vortex bij kamertemperatuur gedurende 30 min. buffer moet troebel worden weergegeven als lipiden worden geresuspendeerd.
- Breng resuspendeerde liposomen over naar een micro centrifugebuis. Vanaf dit punt kunnen plastic pipetpunten worden gebruikt omdat lipiden niet langer in chloroform worden geresuspendeerd. Merk op dat de liposoom-oplossing er troebel moet uitzien.
- Ontdooi liposomen zeven tot acht keer door de microcentrifuge buis eerst in vloeibare stikstof te subfusie, vervolgens in een waterbad van 37 °C. Het liposoom mengsel moet vóór het ontdooien volledig bevroren en stevig worden weergegeven door het oog.
- Voer stappen uit waarbij chloroform wordt uitgevoerd in een chemische rook afzuigkap. Reinig twee glazen spuiten van 1 mL door de volledige spuit volumes van chloroform op te tekenen en te verwijderen, drie keer per stuk, om eventuele rest lipiden weg te halen. Breng elke glazen spuit met ultrapuur water in evenwicht door twee spuit volumes op te tekenen en vervolgens met een bindende buffer door twee spuit volumes op te tekenen.
- Monteer de mini-extruder volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Het 1 200 nm-membraan en twee stukjes filter steunen (Zie tabel van de materialen) door elk in een bindende buffer te subfusie.
- Sandwich het membraan tussen het filter ondersteunt en plaatst in de mini-extruder. Om het dode volume in de gemonteerde mini-extruder te reduceren en om ervoor te zorgen dat de assemblage luchtdicht is, passeert u een volume bindings buffer dat vergelijkbaar is met het volume van het liposoom mengsel via Mini-Extruder met behulp van de 1 mL glazen spuiten.
- Gebruik een van de glazen spuiten van 1 mL en trek het liposoom mengsel op. Keer de microcentrifuge buis om de laatste van het liposoom mengsel in de buisdop te verzamelen voor het optekenen in de glazen spuit.
- Extrude liposomen door het 200 nm-membraan 19-21 keer door te geven. Verzamel geëxtrudeerde liposomen in een nieuwe micro centrifugebuis.
Opmerking: Geëxtrudeerde liposomen moeten minder bewolkt lijken dan liposomen vóór de extrusie. Liposomen moeten dezelfde dag worden gebruikt en op ijs worden opgeslagen. De laatste extrusie moet liposomen in de spuit tegenover het begin plaatsen.
4. SNX-BAR Liposome binding en Tubulatie
- Preclear gezuiverd eiwit bij 100.000 x g in een ultracentrifuge gedurende 20 minuten bij 4 °c voorafgaand aan het uitvoeren van liposoom binding en sedimentatie experimenten. Verwijder het supernatant en breng het over naar een nieuwe microcentrifuge buis; de pellet niet storen als er een is.
- Om liposoom binding en tubulatie testen uit te voeren, incuberen 4 μM gezuiverde Snx4-Atg20 en 2,5 mM liposomen in een totaal reactievolume van 20 μL, variërend van het volume van de liposomen toegevoegd.
Opmerking: In hetzelfde experiment moet hetzelfde volume liposomen worden gebruikt. - Incuberen de reactie bij 30 °C gedurende 30 minuten.
Opmerking: We raden aan om de hoeveelheid van 2,5 mM liposomen die aan elke reactie wordt toegevoegd te maximaliseren door niet minder dan 10 μL-liposomen te gebruiken om visualisatie tijdens sedimentatie mogelijk te maken. Als 10 μL van 2,5 mM liposomen wordt gebruikt bij een reactie van 20 μL, zal de uiteindelijke concentratie van liposomen 1,25 mM zijn. Als de gezuiverde eiwitten verdund zijn en er meer volume nodig is voor 4 μM eiwit, kunnen de lipiden tijdens de rehydratatie stap worden geresuspendeerd in 200 μL om de concentratie van liposomen te verdubbelen (zie stap 3,6); echter, dit zal moeten weten de eiwitconcentratie voorafgaand aan het maken van de liposomen. -
Visualiseren en kwantificeren liposoom tubulatie.
- Process liposoom binding reacties onmiddellijk voor elektronenmicroscopie analyse. Steek monsters op een koolstofgecoat kopergaas rooster en een negatieve vlek met 1% uranylacetaat (Figuur 5B)16.
- Analyseer monsters op een transmissie elektronen microscoop (200 kV).
- Gebruik beeldanalyse software om de diameter van de tubulus te meten en te kwantificeren. Om de tubulusdiameter van een enkele tubulus nauwkeurig te kwantificeren, neemt u drie diameter metingen langs de lengte van een tubulus en gemiddeld (Figuur 5B).
Opmerking: Er werd een tweestapsvariantie gebruikt om de statistische significantie te bepalen (Figuur 5E). Uranyl acetaat is zowel radioactief als giftig. Om deze stap uit te voeren, is een juiste Lab-veiligheidscertificering vereist.
-
Liposoom binding en sedimentatie.
- Breng de reactie (20 μL, vanaf stap 4,3) over in een centrifugebuis van polycarbonaat en gebruik een compatibele rotor om 20 minuten bij 4 °C te draaien bij 100.000 x g in een ultracentrifuge. Verwijder voorzichtig het supernatant en breng het over naar de nieuwe micro centrifugebuis. Merk op dat de pellet intact moet blijven.
- Regeer de pellet in SDS-PAGE 40 μL van de monster buffer en breng over naar een nieuwe microcentrifuge buis. Voeg 20 μL monster buffer toe aan het supernatant. Laad equivalente hoeveelheden pellet en supernatant in een 10% Polyacrylamide SDS-PAGE gel en voer Coomassie kleuring uit om SNX-BARs te visualiseren die gebonden zijn aan liposomen (Figuur 5a).
- Om de hoeveelheid SNX-BAR complex in de pellet fractie kwantificeren, kwantificeren band intensiteiten met behulp van densitometrie en kwantificeren het aandeel van SNX-BAR eiwitten in de pellet Fractie.
Opmerking: Er werd een tweestapsvariantie gebruikt om de statistische significantie te bepalen (Figuur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol beschrijft een methode voor reproduceerbare en robuuste productie van endogene gist SNX-BAR complexen die kunnen worden gebruikt voor downstream membraan remodellering testen (Figuur 1). De bouw van de gist stam gebruikt voor zuivering maakt gebruik van de efficiëntie van homologe recombinatie in ontluikende gist, waardoor wijzigingen kunnen worden aangebracht aan de genomische loci van de beoogde SNX-staven (Figuur 2). Dit ontwerp heeft twee voordelen, (i) omdat selectie niet nodig is om de wijzigingen te handhaven, standaard YP medium kan worden gebruikt, waardoor groei naar een hogere celdichtheid en dus een hogere productie van eiwitten en (II) de uitdrukkings niveaus van de beoogde SNX-BARs zal zelfs zijn, het optimaliseren van de productie van het heterodimer complex. Voorafgaand aan de toevoeging van galactose vertonen de getargete SNX-staven een nulfenotype en kunnen daardoor resulteren in een groei fout of andere bekende defecten die specifiek zijn voor de beoogde SNX-staven. Bovendien, groei in 2% raffinose en 0,1% glucose is langzamer dan groei in 2% glucose. Daarom kan de groeiperiode voorafgaand aan de galactose-inductie optimalisatie voor elke bepaalde stam vereisen. Om te controleren op de juiste inductie van SNX-BAR expressie, is een Western-vlek tegen de TAP-tag waarschijnlijk vereist, omdat de eiwit niveaus van de SNX-staven mogelijk niet worden gedetecteerd via Coomassie Stain (Figuur 3). Omdat slechts één lid van het SNX-BAR-complex een tag heeft, kan de expressie van de niet-gelabelde eiwitten echter niet worden bevestigd, tenzij alle stappen van de zuivering zijn voltooid. Na zuivering van de SNX-BAR heterodimer, moeten de banden van de twee SNX-BARs lijken te zijn in 1:1 stochiometrische verhouding en er moeten weinig tot geen contaminerende bands (Figuur 4, Lane 4). Als er extra contaminerende banden, en de beginnende gist stam is al protease-deficiënte, meer proteaseremmer kan worden toegevoegd tijdens cel lysis. Bovendien kan een tweede zuiveringsstap met behulp van Calmoduline hars worden uitgevoerd.
Bij het uitvoeren van membraan remodeling testen (Figuur 5), dezelfde voorbereiding van liposomen en gezuiverde eiwitten moeten worden gebruikt in hetzelfde experiment. Als er meerdere zuiverings preparaten van eiwitten nodig zijn om de gewenste concentratie te bereiken, combineer dan al het eiwit dat wordt gezuiverd voorafgaand aan het uitvoeren van het experiment. Liposomen moeten op dezelfde dag worden gemaakt en gebruikt (tabel 1). Bij het uitvoeren van liposoom sedimentatie testen is het van cruciaal belang dat het gezuiverde eiwit wordt voorafgegaan door dezelfde sedimentatie condities van 100.000 x g gedurende 20 minuten onmiddellijk voorafgaand aan het inbrokken met liposomen, omdat neergeprecipiteerd eiwit de resultaten kan scheeftrekken. Bovendien moet de liposoom pellet intact blijven na sedimentatie.
Figuur 1: SNX-staaf binding assay-stroomdiagram. Kort, in stappen 1-2, we ingenieur GAL promotors in twee SNX-BAR genomische loci, het vervangen van elk van de endogene promotors en ingenieur een C-Terminal TAP tag in een van de twee SNX-BAR loci. Vervolgens, in stappen 3-7, induceren we de cellen met galactose en zuiveren de SNX-BAR heterodimers tot homogeniteit. In de stappen 8-12 berekenen en bereiden we unilamellaire liposomen. Tot slot kunnen we de SNX-BAR heterodimers combineren met unilamellaire liposomen en twee testen uitvoeren; Stap 14a-16A omvatten membraan tubulatie en 14b-16A betrekken de sedimentatie test. Zie tekst voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: integratiestrategie voor SNX-bar. Twee SNX-Bar loci waren gericht op Gal expressie met behulp van homologe recombinatie. De SNX-BAR ORF1 (Atg20) werd bovendien getarget om een C-Terminal TAP tag uit te drukken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: galactose-inductie controle. (a-B) Om GAL inductie van Atg20-TAP te controleren, raden wij een SDS-PAGE en Western Blot analyse van celextracten geïnduceerd met 2% galactose (A, B, Lane 2) en ongeduceerd (A, B, Lane 1). C) het Western Blot-membraan wordt ook ontdaan en gepropapt met anti-pgk1 voor een laad regeling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: voorbeeld zuivering van Atg20-Snx4 heterodimers. Gistcellen die zijn ontworpen om Atg20-TAP en Snx4 aangedreven door galactose-promoters te uiten, werden geïnduceerd met 2% galactose, gelyseerd en gebonden met behulp van IgG sepharose, en geeleerd met TEV protease. Monsters van elke stap van zuivering worden weergegeven in 10% SDS-PAGE. Lane 1: geïnduceerde supernatant van lysate. Lane 2: geïnduceerde pellet van lysate. Lane 3: monster van gebonden eiwitten aan IgG sepharose. Baan 4: TEV eluaat van zuivere Atg20-Snx4 heterodimers van IgG sepharose. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: representatieve liposoom binding en tubulatie test. A) de SNX-Bar heterodimers, Atg20-Snx4 en Vps5-Vps17 uit gist, werden uitgedruct, gezuiverd en gebonden aan synthetische liposomen zoals beschreven in tekst. Merk op dat Mvp1 homodimers vormt en werd uitgedrukt in bacteriën. B) micro grafieken van Snx4-Atg20 liposoom tubulatie test en tubulus metingen (inzet). C) SNX-Bar binding aan verschillende liposoom composities werd gekwantificeerd door densitometrie. Grafiek geeft de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde aan. * * p < 0,002. D) de diameter van de Tubulus werd gekwantificeerd en in de tekst beschreven. Schaalbalk = 200 nm. Foutbalken vertegenwoordigen twee richtings analyse van variantie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Typische Liposome samenstelling | DOPC | DOPS | Ergosterol | PI3P-C16 |
| Mw | 786,1 | 810,0 | 396,7 | 957,0 |
| mol Fractie | 49% | 30 | 20 | 1 |
| Voorraad mM | 32,0 | 12,0 | 25,0 | 1,0 |
| Massa (mg) | 385,2 | 243,0 | 79,3 | 9,6 |
| Concentratie (mg/mL) | 25,2 | 9,7 | 9,9 | 1,0 |
| Volume naar RXN (mL) | 15,3 | 25,0 | 8,0 | 10,0 |
Tabel 1: liposoom recept. Synthetische liposomen werden bereid met behulp van een combinatie van DOPC, DOPS, ergosterol en PI3P. We berekenen de uiteindelijke concentratie tot 1 mol van lipide. Onze standaardsamenstelling omvat 20% ergosterol, 1% PI3P, DOPS (tot 30%), en verschillende hoeveelheden DOPC. Tabel bevat een typische formulering voor 400 μL van 30% DOPS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier demonstreren we een geoptimaliseerde workflow om SNX-Bar Dimeren in gist te zuiveren en twee testen om hun biofysische eigenschappen op synthetische liposomen te evalueren. Het belangrijkste voordeel ten opzichte van typische recombinant eiwit expressie in Escherichia coli of andere systemen is het vermogen om SNX-Bar eiwitten gelijkmatig te uiten in een inheemse gastheer, waardoor de toxiciteit en onoplosbaarheid problemen in zuiverende SNX-staven in andere systemen worden vermeden. Het is ook opmerkelijk dat ons systeem niet vereist moleculair klonen of het uitboren van meerdere expressie vectoren17. Onze dubbele SNX-BAR giststammen worden gedreven door chromosomally ontworpen galactose promoters, waardoor zelfs expressie bij inductie. Een belangrijke overweging is dat er bij afwezigheid van galactose weinig tot geen uitdrukking zal zijn van de beoogde SNX-staven, waardoor een nulfenotype ontstaat. Bovendien vinden we dat SNX-BARs de neiging hebben om C-Terminal Tags goed te verdragen, waardoor we de TIKTAG aan het C-Terminus kunnen toevoegen. Afhankelijk van het eiwit dat wordt getagd, kan er echter ook een N-terminale TIKTAG worden gebruikt12. Bovendien, aangezien SNX-BARs alleen 1:1 dimers vormen, is slechts één eiwit vereist om te worden gelabeld voor zuiverings doeleinden. Echter, sommige SNX-staven die normaal vormen heterodimers in de cel is aangetoond dat het vormen van homodimers onder niet-fysiologische concentraties7. Daarom is het van cruciaal belang dat bij de zuivering van de heterodimer de stoichiometrische verhouding van de twee SNX-staven 1:1 is, die kan worden geverifieerd door een aliquot van het gezuiverde complex op een SDS-PAGE gel te draaien en Coomassie-kleuring uit te voeren. Eenmaal ontworpen, deze giststammen kunnen worden opgeslagen in de eeuwigheid als 15% (v/v) glycerol voorraad bij-80 ° c en/of aanvullend aangepast aan het opvragen van aanvullende bindende partners. Onze workflow duurt meestal 2-3 weken voor de bouw van de stam en 3-4 dagen voor expressie en zuivering en 1 dag voor liposoom binding testen. Wij geloven dat deze workflow onderzoekers kan helpen de lipide specificiteit van SNX-BAR eiwitten te begrijpen met behulp van native BAR eiwitten op synthetische liposomen of gigantische unilamellaire blaasjes (Guv's) en de precieze make-up te onthullen van lipiden die nodig zijn om membraan remodeling te stimuleren, waardoor hun werkingsmechanisme wordt onthuld.
Kritieke stappen
Tijdens onze eerste pogingen tot het zuiveren van SNX-BAR heterodimers uit niet-protease deficiënte cellen, vonden we vaak lagere opbrengsten en afbraakproducten. Daarom, tijdens de eerste stappen van de bouw van de stam, wij geloven dat het essentieel is om te beginnen met een ouder gist stam die is een tekort aan een of meer van de belangrijkste vacuole proteinases. In het bijzonder, we vonden gist stam TVY614, die is uitgeput voor pep4, prb1, en prc1, de meest optimale. Met behulp van de TVY614 stam verkrijgen we routinematig > 90% zuivere Snx4-Atg20 heterodimers (Figuur 4 en Figuur 5A). Echter, de noodzaak voor alle drie proteïnasen te worden ablatie kan SNX-Bar combinatie specifiek. Bijvoorbeeld, Vps5-Vps17 heterodimers zijn met succes gezuiverd in niet-protease deficiënte stammen10 en toen we de toevoeging van een PEP4 ablatie opgenomen, we observeren bescheiden stijgingen van de opbrengst en zuiverheid (Figuur 5a). Daarom, afhankelijk van de downstream toepassingen van de gebruiker en de behoefte aan zuiverheid of selecteerbare markeringen, kan er flexibiliteit bij het ontwerpen van expressie stammen.
De orde van genconstructie is ook belangrijk. We raden aan om C-terminaal te tikken op SNX-BAR ORF 1 als eerste, om de expressie van Western Blot te bevestigen zonder de noodzaak van galactose-inductie (Figuur 1). Tijdens de galactose-inductie, het is essentieel om te pre-condition de cellen 's nachts in 2% raffinose en 0,1% glucose. Falen van de cellen pre-condition resulteert in extreem langzame groei of celdood. Echter, het is ook van cruciaal belang voor de cellen te afbreken van de resterende glucose tijdens de nachtelijke groei, anders kan galactose inductie negatief worden beïnvloed. Het wordt ook aanbevolen om meerdere isolaten van Western Blot te controleren om de homogeniteit van de TAP met getagde SNX-BAR-eiwitten te evalueren. We geven meestal 2-3 isolaten en kiezen de meest krachtig uitgesproken kandidaat.
Aanpassing, alternatieve benaderingen en toekomstige toepassingen
In stap 2,8 vereist tandem affiniteits zuivering (TAP) meestal een tweestapsaffiniteits zuivering met behulp van IgG en Calmoduline kralen na TEV decolleté12. Echter, in dit protocol, we Elueer SNX-Bar Dimeren door TeV protease met zeer hoge opbrengst en zuiverheid. We vinden daaropvolgende affiniteit zuivering met Calmoduline kralen produceert inconsistent en verminderde opbrengsten, dus we raden stoppen na TEV decolleté. Het TEV-eluaat met de SNX-BAR eiwitten en zijn (6)-tagged TEV protease kan verder worden gezuiverd door ni-NTA agarose kralen. Echter, we vinden ook deze stap kan verminderen algehele SNX-Bar eiwitopbrengst en is niet nodig, aangezien TeV protease niet interfereert met liposoom binding of tubulation testen. Daarom, als de gezuiverde SNX-BARs zullen worden gebruikt voor een andere toepassing, raden wij de gebruiker de impact van TEV protease in hun testen beoordelen.
Tot nu toe zijn we succesvol geweest met dit protocol en de beschreven modificaties om Snx4-Atg20 en Vps5-Vps17 heterodimers in gist te zuiveren en hun lipide specificiteit met succes te hebben beoordeeld op synthetische liposomen. Wij zijn echter van mening dat het protocol met succes kan worden aangepast aan een van de SNX-BARs in gist. Het is ook mogelijk om het systeem te gebruiken om recombinant SNX-BAR eiwitten te produceren van andere organismen. Echter, dit zou een extra stap van de bouw van de stam nodig om een exogene gen Locus in het gist genoom te integreren. We geloven ook dat het systeem kan worden uitgebreid om multimere complexen, waaronder lading proteïnen, te zuiveren. Daarom geloven we dat ons uitdrukkings systeem kan reiken dan het begrijpen van de lipide-waarde van SNX-BARs. Toekomstige toepassingen zullen onderzoekers toelaten om hele lading vangst complexen op liposomen te reconstitueren om te begrijpen hoe volledige assemblages de remodellering van het membraan kunnen beïnvloeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het onderzoek dat in deze uitgave werd gerapporteerd, werd gesteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder het awardnummer GM060221 en deels door het Nationaal Instituut voor algemene medische wetenschappen van de nationale instituten van de gezondheid onder het gunnings nummer T32GM007223. R.C. werd deels gesteund door het UNC-Charlotte Faculty Research Grants-programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 G needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| Ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 μL/1 mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 °C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 |
References
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
