Summary
כאן, אנו מציגים זרימת עבודה עבור הביטוי, טיהור וליפופי מחייב של SNX-BAR הטרודימרים ב שמרים.
Abstract
החלבונים SNX-BAR הם מחלקה שימור אבולוציונית של שיפוץ הממברנה חלבונים המשחקים תפקידי מפתח במיון ובסחר של חלבונים ושומנים במהלך אנדוקציטוזה, מיון בתוך מערכת אנדוזוממית, ו האוטומטית. מרכזי לפונקציה SNX-BAR חלבון היא היכולת ליצור הומודימרס או הטרודימרים הקושרים ממברנות באמצעות שימור מאוד phox-הומולוגיה (PX) ו בר (Bin/אמפיפילפסין/מ א) תחומים. בנוסף, oligomerization של SNX-בר דימרס על ממברנות יכול לעורר את היווצרות tubules קרום ושלפוחיות ופעילות זו היא חשבה לשקף את התפקודים שלהם כמו חלבונים מעיל עבור הובלה אנדובית נגזר. החוקרים מנוצלים זמן רב במחקרים מחייב מבחנה באמצעות רקומביננטי SNX-BAR חלבונים על ליפוזומים סינתטיים או unilamellar שלפוחיות ענק (GUVs) כדי לחשוף את האיפור המדויק של שומנים הדרושים כדי לנהוג שיפוץ הממברנה, ובכך לחשוף את המנגנון שלהם של פעולה. עם זאת, בשל אתגרים טכניים עם מערכות ביטוי כפול, רעילות של ביטוי חלבון SNX-BAR בחיידקים, ואת מסיסות העניים של הפרט SNX-BAR חלבונים, רוב המחקרים עד כה נבדקו SNX-בר הומודימרס, כולל di, שאינם פיסיולוגיים הטופס במהלך הביטוי בחיידקים. לאחרונה, יש לנו אופטימיזציה פרוטוקול כדי להתגבר על החסרונות העיקריים של מערכת ביטויים טיפוסית בקטריאלי. באמצעות זרימת עבודה זו, אנו מדגימים כיצד לבטא ולטהר בהצלחה כמויות גדולות של הטרודימרים SNX-BAR וכיצד ליצור מחדש אותם על ליפוזומים סינתטיים עבור כריכה ובטלציה assays אמר.
Introduction
ממברנה מאוגד אורגלים כגון קרום הפלזמה, הרשתית האנדופלזמית, מנגנון golgi, ליזוזום (שמרים בלואים), ו אנדוטיפ מהווים את מערכת endomembrane של התא איקריוטית. לרוב המארגנים יש את היכולת לתקשר ולהחליף חומר עם מנשאים אחרים באמצעות נושאות הובלה של שלפוחית לפוחית. כיצד התא מתאם את האריזה והיווצרות של נושאות הובלה שלפוחית לפוחית בתוך מערכת endomembrane אינו מובן היטב. עם זאת, החלבונים והשומנים המהווים חלק ניכר מהמערכת הendomembrane, ידועים כנובעים מהפנמה ושלפוחיות מקרום הפלזמה (PM). האנדוכמה היא הקבלה העיקרית לשלפוחיות אלה והיא מורכבת ממספר סטים של מערכות מחוברות. הפונקציה העיקרית של אנדוכמה היא להקל על רכישת מזינים, לווסת חלבון ומחזור השומנים, להגן מפני זיהום הפתוגן, ולשמש מקור החידוש העיקרי של שומנים עבור קרום הפלזמה. כמו אנדוכמה מקבל את רוב המטען של חלבונים ושומנים מקרום הפלזמה, הוא משמש תא מיון על ידי בידוד מטענים לתוך נושאות הובלה אנדוזומלית צינורי (etcs). חלבונים שאינם מחולק ל-ETCs נותרו להיות מושפל באמצעות מערכת האנדו-ליסוזומל. דיסרגולציה של מיון מטענים לתוך etcs יכול להוביל לאובדן ספיגת מזינים, מחזור החלבון או הומאוסטזיס ליפיד, וכתוצאה מכך רבים מטבולית, התפתחותית, הפרעות נוירולוגיות1,2. עם זאת, למרות התפקיד המרכזי etcs ב אנדוכמה, המנגנון הבסיסי של איך אנדוכמה יכול באופן סלקטיבי לתאם את האריזה של המון מטענים הטרוגנית לתוך נושאות צינורי אינו ידוע.
המשפחה nexin מיון (snx) הוא מחלקה שימור אבולוציונית של חלבונים שנמצאו להיות קריטי עבור תגובות הובלה שלפוחית רבים בתא3,4,5. מיון nexins מגויסים הממברנה אנדוזום וסיוע בלכידת מטענים באמצעות מאפיין phox הומולוגיה האופיינית (PX), אשר מאגד זרחן-monophosphate (2), השומנים מועשר בקרום אנדוזום. יונקים לקודד 33 SNX חלבונים, אשר ניתן לחלק עוד לתוך משפחות משנה מרובות, על פי נוכחותם של תחומים אחרים1. בעיקר, SNX-BAR משפחה היא המשפחה המשנה הגדולה ביותר המורכבת של שתים עשרה בבני אדם, בעוד שמרים להאביק, סכביסים cerevisiae ס, משפחת התת מופחת רק שבעה snx-בארים. החלבונים SNX-BAR יש גם תחום PX וגם Bin-אמפיפילוסין-מ א (בר) התחום המפעיל מאגרים שומנים לאגד ממברנות עקמומיות חיובית. אפוא, משפחת SNX-BAR יש זיקה טבעית עבור אנדוזום והוא יכול לתווך ועוד היווצרות דרך שיפוץ הממברנה שלהם יכולות. ב מבחנה, תכונות שיפוץ של SNX-ברים יכול להיגרם על ידי תוספת של מטוהרים SNX-בארים ליפוזומים סינתטיים והיווצרות בעקבות צרה, tubules מצופה יכול להיות מדמיין על ידי אלקטרון מיקרוסקופ. באמצעות שיטות אלה, החוקרים קבעו כי גם ריכוז oligomerization וכוח מכווץ להיראות להשתנות בין משפחת SNX-BAR רומז שהם יכולים לסייע הן היווצרות המספריים של ETCs.
ה-SNX-פסי יכול להיות מסווג עוד יותר על ידי מאפייני dimerization בלעדית שלהם. בעלי מבחנה מתורבת ומחקרים מבניים הוכיחו כי החלבונים SNX-BAR יכול רק ליצור הומודימרים ספציפיים או הטרודיומרס. לכן, בעיקרון, כל פוטנציאל SNX-בר dimer-oligomer יכול לספק מעיל כדורית עבור מסלול מטען ספציפי הסחר ובדומה, oligomeriטיזציה מוגבלת של אחרים SNX-BAR protomers, יכול גם להגדיר שבילים ייצוא ברורים. עם זאת, בשל המספר הגדול של SNX-ברים וגיוון בתוך משפחת SNX, מיון אחד nexin-השערת מטען אחד הוא מאוד סביר. במקום זאת מאמץ מתואם באמצעות ריבוי של גורמים כגון SNX-ברים, מטענים, ספציפיות לשומנים ויחסי תלות אחרים סביר יותר. כמו כן, מחקרים שנעשו לאחרונה של משפחת שמרים SNX4 חשף ראיות לפרטים נוספים ליפיד, מעבר ל-Dins (3) P, כדי להיות הפוטנציאל של ספקיות התחבורה6. במחקר זה, snx-BAR הומודימר Mvp1-Mvp1 היה מטוהר מן החיידקים הטרודימרים הילידים Snx4-Atg20 ו Vps5-Vps17 ביטאו ומטוהרים בתשואה גבוהה של שמרים, בעוד Snx4-Atg20 נמצא להיות מרוצה באופן מיותר מחייב פוספוליייסרין (PS) וטופסמבנים כמו צינור צר ליפוכמה מ בעוד אחרים בשדה חשפו תכונות חשובות של snx-ברים באמצעות recombinantly מטוהרים snx-בר הומודימרס מן החיידקים, רעילות הקשורים בהבעת snx-bar הטרודימרס במערכות דומות הפריע האפיון המקורי שלהם7,8,9,10. לכן, ללא מערכת אמינה כדי להשיג recombinantly טהורה ביטא הטרודימרים הילידים, החוקרים חייבים לוותר על שורות אלה של חקירה. באיור 1, אנו מציגים זרימת עבודה ארבעה חלקים ל 1) לבנות זן שמרים להביע את הביטוי snx-BAR הטרודימרים עבור טיהור האהדה הדו, 2) מהיר ומטהר מקורי snx-BAR הטרודימרס, 3) להכין ליפוזומים unilamellar סינתטיים, ו 4) להגדיר ליפוכמה בעיות או מדידים, מתן כלי חיוני עבור חוקרים לחקור את הקטלוג הגדל של מיון nexins נמצא בטבע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. שמרים הזנים הבנייה
- התחל עם TVY614 (pep4Δ:: LEU2 Prb1Δ:: Hisg prc1Δ:: HIS3)11 כמתח האב. זן זה הוא לקוי של הפרוטאוסיס החלבונים, אשר תורמים הרוב של השפלה חלבון לאחר הליזה התאים, ולכן מאפשר טיהור נקי ויעיל יותר.
- עיצוב התחל12 ולשלב טיהור האהדה הדו (ברז) תג ב-C הטרמינוס של ATG20 (snx-BAR orf 1) באמצעות שילוב מחדש של הומוולוגי. השתמש בתגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי לאשר שילובים (איור 2).
- בצע את הכתם המערבי של התא ליפוסט נגד תג הקש כדי לאשר אינטגרציה נכונה13.
הערה: אנו ממליצים על הקציר 3 OD (1 OD ≈ 1 x 107 תאים) של תאים עבור sds-העמוד ואימות כתמי מערבי. שים לב ששילוב של תג ה-טאפ אמור להתרחש לפני החלפת היזמים האנדודוגני עם היזם GAL1 כדי לאפשר אימות תגים קל יותר באמצעות אבן חשופה מערבית. - החלף אנדודוגני Snx4 (SNX-BAR ORF1) ו-Atg20 (SNX-BAR ORF 2) היזמים עם היזם GAL1 לא מתויג באמצעות שילוב סדרתי של הומוולוגי ושלבי המרה של כל ORF יחיד14.
- השתמש באגפים מחוץ לאתרי האינטגרציה ל-PCR המאשר שילובים מוצלחים (איור 2). הדבר יגרום לפנוטיפ מסוג null של ברים ממוקדים בהעדר גלקטוז במדיום הגדילה.
2. שמרים אינדוקציה ו SNX-בר Dimer טיהור
הערה: תאים שמרים ניתן להפיץ על YPD סטנדרטי (תמצית שמרים, peptone, ו 2% גלוקוז) לוחות אגר כאשר השינויים הם כרומוסומלית משולבים.
- איחסן מעטה גדול של תאים לתוך 50 mL של התקן YP (תמצית שמרים ו peptone) בינונית עם 2% רפפיז ו 0.1% גלוקוז כמקור פחמן בבקבוקון לפחות 4x נפח של התרבות ולצמוח לילה ב 30 מעלות צלזיוס שייקר כדי לאפשר aeration תקין. לצפות כי הצמיחה במדיום זה יהיה איטי יותר לעומת YPD סטנדרטי.
- למחרת בבוקר, השתמש 50 mL טרום התרבות לתוך 1 L של מדיום YP סטנדרטי עם 2% רפפיז ו 0.1% גלוקוז ולצמוח עבור 4-5 h ב 30 ° c שייקר.
הערה: הנפח של התרבות הקדם המשמש לאיחסן 1 התרבות יכול להיות מותאם בהתאם OD600 של התרבות הקדם. OD600 של התרבות 1 L לאחר החיסון צריך להיות סביב 0.2 כדי לאפשר לפחות שני טווח במהלך הצמיחה 4-5 h.- השתמש בבקבוקון פרנבאך מבולבל לצמיחה כדי לאפשר האנטנה הנכונה, הבקבוקון של 2.8 L מספיקה. האנטנה פחות עלולה לגרום לצמיחה איטית יותר ואת הגלולה הקטנה התאים על הקציר.
- בדוק OD600 כדי לוודא שהתרבות היא בשלב היומן (0.5-1) לאחר 4-5 h של הצמיחה. בהתאם לצמיחה של המתח, לבצע התאמות לזמן הצמיחה כדי לאפשר לפחות שני טווח. מוסיפים ל 2% גלקטוז וגדלים לילה ב -30 ° צ' שייקר.
הערה: ה-OD600 לאחר שצמיחת הלילה עשויה להשתנות, אך התרבות צריכה להיות רוויה. שימו לב שאין צורך להסיר תאים מ-0.1% גלוקוז לפני הוספת 2% גלקטוז לפרוטוקול גדילה זה. אנו ממליצים לקצור 3 OD של תאים בלתי המושרה והמושרה בשלב זה עבור SDS-עמוד ואבן חשופה מערבית לאימות (איור 3A, B, ליין 1-2). - הקציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 4500 x g עבור 15 דקות. ניתן להשתמש כאן ברוטור דלי מתנדנד התואם לתרבות הנפח 1 L.
- העבר את הגלולה שמרים לתוך צינורית חרוט 50 mL; שלב צנטריפוגה שני עשוי להתבצע לפי הצורך. הגלולה תא בדרך כלל יהיה סביב 10-15 mL בנפח כפי שנמדד על ידי הסימונים הסיום ניתן להשתמש מיד או מאוחסן ב-80 ° c.
- להשהות את הגלולה ב 15 מאגר טיהור mL (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM הנאל, 1.5 mM MgCl2, 1 מ"מ Dithioitol (dtt), קוקטייל פרוטאז מעכבי) כדי להפוך את הנפח הסופי סביב 30 מ ל.
- לצנן את ההומוגניף 4 ° צ' לפני השימוש ושיווי משקל עם מאגר טיהור. Lyse תאים באמצעות מייצב תא מכני או הומוגניצר. לטעון מדגם לתוך ההומוגניצר ו lyse ב 20000-25000 psi עבור 2-3 סיבובים; שימו לב כי כאשר התאים הופכים הפוך, לחץ הקלט יותר נדרש כדי לשמור 20000-25000 psi. לאסוף את התא ליפוסט בשפופרת חרוט 50 mL על קרח.
הערה: אם יש צורך בדגימות נוספות, ההומוגניקה צריכה להתנקות ביסודיות ולהיות מעורפלת לפני טעינת המדגם הבא. . השאר את כל התאים מתים על קרח - ברור מיד את התא לאחר מכן ב 35,000 x g עבור 1 h ב 4 ° c. העבר בזהירות את הסופרנט. לתוך צינור חדש שים לב כי ליפידים מתוך הפירוק התא יהיה לצוף לראש במהלך צנטריפוגה ולא ישפיע על טיהור.
הערה: אנו ממליצים לחסוך 0.5-1% של הליפוסט ואת הגלולה עבור הדגימות של SDS-PAGE. בדרך כלל, לא נצפו הבדלים עיקריים וכתמי מערביות נוספים ניתן לבצע כדי לאשר מסיסות החלבון ברז (איור 4, נתיבים 1 ו-2, בהתאמה). - משקל 300 μL של חרוזים מספרד של IgG עם מאגר טיהור. להוסיף את התא הנקי ליפוסט ואת הדגירה עבור 2 h, מסתובבת 4 ° c.
- לאסוף חרוזים בטור כרומטוגרפיה 10 mL ולאפשר ליפוסט מאוגד לזרום דרך.
- לשטוף חרוזים באמצעות 10 מ ל של מאגר לשטוף (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM הנאקל, 1.5 mM MgCl2, 1 מ"מ dtt), הוספת 1 mL בכל פעם ומאפשר לו לזרום באופן מלא.
הערה: אנו ממליצים לחסוך 2% מחרוזי ה-IgG המאוגדים עבור מדגם SDS-PAGE. בדרך כלל אנו צופים בארבע להקות גדולות; שני חלבונים SNX-BAR ו-IgG כבדים וקלים שרשראות (איור 4, ליין 3). אנו ממליצים על שמירת כמויות שוות ערך של ' הללויה ' ו ' IgG חרוזים לאחר TEV ' כדי להשוות עבור יעילות מחשוף TEV. - לאסוף חרוזים ולהעביר אותם צינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף ל 500 μL של נפח כולל עם מאגר כביסה טרי ו-2 μL של 10 מ"ג ליטר/מ ל TEV פרוטאז ו-דגירה לילה, מסתובבת 4 ° c.
- למחרת בבוקר, להסיר את supernatant לחלוטין באמצעות המחט 27 G ולהעריך טוהר החלבון על ידי מערכת של 10% פוליאקרילאמיד SDS-עמוד (איור 4, ליין 4).
הערה: אנחנו בדרך כלל להשיג 500 μL של 0.5-1 מ"ג/mL של 95% הטרודימר טהור (איור 4, ליין 4). טיהור נוסף באמצעות שרף קלמודולין יכול להיעשות גם, אולם אנו בדרך כלל רואים ירידה משמעותית בתשואה וממליצים לעצור כאן אם הטוהר הוא > 90%. TEV אינה מפריעה ליפופי כמה מחייב, למרות TEV ניתן להסיר בנוסף באמצעות Ni-נ. ת. ע. חרוזים15. - כדי להתרכז, להעביר את המדגם למסנן צנטריפוגלי 0.5 mL עם 10 הפסקת KDa ו צנטריפוגה על פי הוראות היצרן כדי 50 μL או פחות. לכמת את החלבונים מרוכז באמצעות שיטת ברדפורד חלבון. החנות ב -4 ° c ושימוש בתוך שבוע אחד.
3. ליפומין הכנה
- לרכוש שומנים זמינים מסחרית: זרחן (PS), PI3P, ergosterol, ו זרחן (PC). במידת הצורך, השהה מחדש בממס המומלץ כדי להפוך את המלאי לשומנים.
הערה: שומנים הם מושעה מחדש בתערובת מתנול/כלורופורם לכל המלצות של היצרן. ודא מניות השומנים הם ברורים ומחוממים לטמפרטורת החדר לפני השימוש. שומנים מחדש ניתן לאחסן תחת גז ארגון אטום באמצעות סרט שעווה (או שווה ערך) ב-20 ° c עבור 6-12 חודשים או עד אובדן הפעילות הוא נצפתה. - לחשב את אמצעי האחסון הנדרש של כל מלאי השומנים כדי ליצור תערובת עם הרכב השומנים הרצוי (ראה טבלה 1). להניח בסך הכל 1 שומה של שומנים בתערובת השומנים.
- בצעו את הצעד הזה. בתוך מכסה כימי ניקוי זכוכית מזרקים על ידי ציור נפח מזרק מלא של כלורופורם ולהשליך אותו במיכל פסולת. . אני חוזר עוד פעמיים בעת העברת כלורופורם, השתמש רק מזרקים זכוכית או פיפטות. כאשר מושכים את כלורופורם, משוך את הפקק לאט כדי למנוע היכרות עם בועות הגז במזרק.
- שימוש מזרקים זכוכית כדי להעביר ליפידים מלאי כפי שמחושב לתוך צינור זכוכית נקייה התרבות לעשות תערובת שומנים סופית של 1% PI3P, 20% ergosterol, 30% PS, PC (שולחן 1). בהתאם ממיסים כל השומנים הוא מושהה מחדש, התערובת עלולה להפוך מעונן עם תוספת של כל השומנים.
הערה: כדי לשנות ריכוזים של PS (0-30%), התאם את אמצעי האחסון בהתאם ופיצוי באמצעות מחשב משתנה (טבלה 1). - יבש בקפידה את תערובת השומנים באמצעות גז חנקן בבימויו של תערובת השומנים בתנועה מעגלית לשומנים יבשים אחיד. השתמש בזרימת הגז הנמוך כדי לשמור על השומנים בתחתית צינור הזכוכית במהלך הייבוש. עטוף את צינור הזכוכית עם נייר כסף, להשאיר את הפתח נחשף, ועוד מייבשים בואקום עבור 1 h.
- הוסף 400 μL של מאגר האיגוד (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM הנאקל, 1 מ"מ MgCl2) כדי להפוך את השומנים לחלוטין לעשות ליפוף הסופי ריכוז של 2.5 mM.
הערה: ניתן לכוונן ליפובי ריכוז סופי על-ידי הוספת מאגר מחייב פחות או יותר. לדוגמה, 200 μL מאגר כריכה ניתן להוסיף כדי לייצר ליפוכמה ריכוז של 5 מ"מ אם יש צורך (ראה להלן).- השעיית שומנים מחדש על ידי טלטול על מהירות בינונית על מערבולת בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות. המאגר צריך להיראות מעונן כמו שומנים הם מושעה מחדש.
- העבר ליפוזומים מחדש. לצינור מיקרוצנטריפוגה מנקודה זו והלאה, טיפים לצינורות פלסטיק עשוי לשמש כשומנים הם כבר לא מושעה מחדש ב כלורופורם. לשים לב כי הפתרון ליפומין צריך להיראות מעורפל.
- הקפאת הפשרת ליפוזומים שבעה עד שמונה פעמים על ידי מיזוג הצינורית מיקרוצנטריפוגה תחילה בחנקן נוזלי, ואז באמבט מים 37 ° c. התערובת ליפוכמה צריך להופיע קפוא לחלוטין מוצק על ידי עין לפני הפשרה.
- בצע שלבים הכרוכים בכלורופורם בתוך מכסה כימי. נקיון 2 1 מזרקים זכוכית על ידי ציור והשמטת כמויות מזרק מלא של כלורופורם, שלוש פעמים כל אחד, כדי להסיר את כל שומנים שיורית. באמצעות שרטוט של שתי כמות מזרקים באמצעות הצפת מאגר מחייב על-ידי הגדרת שני אמצעי אחסון של מזרק, השווה בין מזרק לבין שני מזרקים.
- הכנס את המיני-מכבש בהתאם להמלצות היצרן. שבטלאט 1 200 ממברנה ננומטר ושתי פיסות מסננים תומכות (ראה טבלת חומרים) על-ידי מיזוג כל אחד במאגר הכריכה.
- כריך את הקרום בין המסנן תומך ומקום מיני מכבש. כדי להקטין את הנפח המת ב התאספו מיני מכבש ולוודא ההרכבה היא הדוקה, לעבור נפח של מאגר מחייב בדומה לנפח של ליפופה תערובת דרך מיני הבלטת ממד באמצעות מזרקים זכוכית 1 mL.
- השתמש באחד מזרקים מזכוכית 1 mL ולצייר את ליפוכמה תערובת. היפוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה לאסוף את האחרון של ליפוכמה תערובת בפקק צינור לציור למעלה לתוך מזרק זכוכית.
- ליפוזומים הבלטה על ידי עובר דרך הממברנה 200 ננומטר 19-21 פעמים. לאסוף ליפוזומים הבלטת שפופרת מיקרוצנטריפוגה חדשה.
הערה: ליפוזומים עם הבלטה צריך להיראות פחות מעונן מאשר ליפוזומים לפני ההבלטה. יש להשתמש בליפוזומים באותו היום ולאחסנו בקרח. החול האחרון צריך להציב ליפוזומים במזרק המנוגד לאחד שהוא התחיל בו.
4. SNX-בר ליפוזום קשירה
- מראש חלבון מטוהרים ב 100,000 x g ב ultracentrifuge עבור 20 דקות ב 4 ° צ' לפני ניהול ליפוכמה ניסויים הכריכה ומשקעי. הסר את הסופרנטנט והעבר אותו לשפופרת מיקרוצנטריפוגה חדשה; לא להפריע הגלולה אם יש אחד.
- כדי לבצע ליפואת הקשירה מחייב ומוסר, דגירה 4 μM מטוהרים Snx4-Atg20 ו 2.5 מ"מ ליפוזומים בנפח התגובה הכולל של 20 μL, שינוי נפח של ליפוזומים הוסיף.
הערה: באותו ניסוי, יש להשתמש באותו כמות של ליפוזומים. - מודקון את התגובה ב 30 ° c עבור 30 דקות.
הערה: אנו מציעים למקסם את כמות ליפוזומים 2.5 mM הוסיף לכל תגובה באמצעות לא פחות מ 10 μL ליפוזומים כדי לאפשר הדמיה במהלך משקעי. אם 10 μL של 2.5 מילימטר ליפוזומים משמש בתגובה 20 μL, הריכוז הסופי של ליפוזומים יהיה 1.25 mM. אם חלבונים מטוהרים הם לדלל ונפח יותר נדרש עבור ארבעה μM חלבון, השומנים עשויים להיות מושעה מחדש ב 200 μL במהלך צעד מחדש להכפיל את הריכוז של ליפוזומים (ראה שלב 3.6); עם זאת, זה ידרוש לדעת את ריכוז החלבון לפני הפיכת ליפוזומים. -
. המחשה וליפוציה של מכמת
- הליך ליפובי מספר תגובות קשירה באופן מיידי לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני. דגימות ספוט על רשת הנחושת מצופה פחמן רשתות שליליות כתם באמצעות 1% uranyl אצטט (איור 5ב)16.
- ניתוח דגימות על מיקרוסקופ אלקטרוני שידור (200 kV).
- השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי למדוד ולכמת כדורית. למדידה מדויקת של כדורית בודדת, קחו שלוש מדידות בקוטר לאורך כדורית וממוצע (איור 5ב').
הערה: ניתוח דו-כיוון של סטיה שימש לקביעת משמעות סטטיסטית (איור 5E). אצטט uranyl הוא גם רדיואקטיבי וגם רעיל. אישור בטיחות מעבדה נכונה נדרש כדי לבצע שלב זה.
-
ליפוכמה מחייב ומשקעי שאיפה
- להעביר את התגובה (20 μL, משלב 4.3) לצינור צנטריפוגה פוליקרבונט ולהשתמש רוטור תואם ספין ב 100,000 x g ב ultracentrifuge עבור 20 דקות ב 4 ° c. הסר בזהירות את הסופרנטאנט. והעבר לצינור המיקרו-צנטריפוגה החדש . שים לב שהגלולה צריכה להישאר ללא פגע
- השהה מחדש את הגלולה ב-SDS-PAGE 40 μL של מאגר דגימה והעברה לשפופרת מיקרוצנטריפוגה חדשה. הוסף 20 μL של מאגר דגימה לסופרנטאנט. טעינת כמויות שוות ערך של גלולה ו supernatant ב 10% פוליאקרילאמיד SDS-דף ג'ל ולבצע כתמים Coomassie כדי להמחיש SNX-ברים הקשורים ליפוזומים (איור 5א).
- כדי לכמת את כמות הקומפלקס SNX-BAR בשבר הגלולה, מכמת עוצמות הלהקה באמצעות densi, לכמת את הפרופורציה של החלבונים SNX-BAR בשבר הגלולה.
הערה: ניתוח דו-כיוון של סטיה שימש לקביעת משמעות סטטיסטית (איור 5ג).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מתאר שיטה להפקת הייצור החזק של שמרים אנדוגניים מתחמי מערכות snx-BAR שניתן להשתמש בהם עבור שיפוץ קרום המטה ממברנה בחני (איור 1). הבנייה של זן שמרים המשמש לטיהור מנצל את היעילות של שילוב מחדש של הומוולוגי ב שמרים הנצה, המאפשר שינויים בבית גנומית של המוקד SNX-בארים (איור 2). עיצוב זה יש שני יתרונות, (אני) כבחירה אינו נדרש כדי לשמור על שינויים, בינונית YP סטנדרטי ניתן להשתמש, המאפשר צמיחה צפיפות התא גבוה יותר ולכן ייצור גבוה יותר של חלבון ו (ii) רמות הביטוי של SNX-בארים ממוקדות יהיה אפילו, אופטימיזציה של ייצור של קומפלקס הטרודימר. לפני תוספת של גלקטוז, SNX-ברים ממוקדות יהיה מוצג פנוטיפ null ובכך עלול לגרום לפגם גדילה או פגמים ידועים אחרים ספציפיים המיועדים SNX-ברים. יתר על כן, צמיחה ב 2% רפפיז ו 0.1% גלוקוז איטי יותר מאשר צמיחה ב 2% גלוקוז. לפיכך, תקופת הצמיחה לפני האינדוקציה של גלקטוז עשויה לדרוש אופטימיזציה לכל מאמץ מסוים. כדי לבדוק אינדוקציה נכונה של SNX-BAR ביטוי, כתם מערבי נגד תג ברז הוא כנראה נדרש מאז רמות החלבון של SNX-ברים לא ניתן לזהות באמצעות כתם Coomassieאיור 3. עם זאת, מאחר שרק חבר אחד במתחם SNX-BAR כולל תגית, ביטוי של החלבונים שאינם מתויגים לא יכול להיות מאושר אלא אם כן כל השלבים של הטיהור הושלמו. לאחר הטיהור של SNX-BAR הטרודימר, הלהקות של שני SNX-ברים צריך להיראות להיות ביחס 1:1 stochiometric וצריך להיות מעט לא להקות מזהם (איור 4, ליין 4). אם יש עוד להקות מזהם, ואת המתח ההתחלתי שמרים הוא כבר לקוי פרוטאז, מעכב פרוטאז יותר ניתן להוסיף במהלך הליזה תא. יתר על כן, צעד טיהור שני באמצעות שרף קלמודולין עשוי להתבצע.
בעת ניהול שיפוץ קרום ממברנה (איור 5), את הכנת ליפוזומים וחלבונים מטוהרים יש להשתמש באותו ניסוי. אם מספר ההכנות לטיהור החלבונים נדרשים כדי להגיע לריכוז הרצוי, לשלב את כל החלבון מטוהרים לפני לערוך ניסוי. ליפוזומים יש לעשות ולהשתמש בתוך אותו יום (שולחן 1). כאשר מבצעים ליפוכי משקעי שיפוע אומר, זה קריטי כי החלבון מטוהר הוא מראש באמצעות אותם תנאים משקעי של 100,000 x g עבור 20 דקות מיד לפני הדגירה עם ליפוזומים כמו חלבון זירז יכול להטות את התוצאות. יתר על כן, ליפופה גלולה צריך להישאר ללא שינוי לאחר משקעי.
איור 1: שיטת האיגוד של מאגד SNX-BAR. בקצרה, בשלבים 1-2, אנו מהנדס גל היזמים לתוך שני המקום הגנומי בר של SNX-BAR, החלפת כל אחד היזמים אנדודוגני ומהנדס C-טרמינל ברז תג לתוך אחד משני SNX-בר המקום. לאחר מכן, בשלבים 3-7, אנו מזרז את התאים עם גלקטוז ומטהר את הטרודימרים מסדרה "SNX-BAR" להומוגניות. בשלבים 8-12, אנו מחשבים ולהכין ליפוזומים unilamellar. לבסוף, אנחנו יכולים לשלב את הטרודימרים SNX-BAR עם ליפוזומים unilamellar ולבצע שני שאומר; שלב 14a-16a כרוך tubulation ממברנה ו 14a-16a לערב את הסדר שאיפה משקעי. עיין בטקסט לקבלת פרטים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: האסטרטגיה של שילוב SNX-BAR. שני SNX-BAR לוקוסים היו מיועדים ביטוי גל באמצעות שילוב הומוולוגי. SNX-BAR ORF1 (Atg20) היה ממוקד בנוסף כדי לבטא תג C-מסוף ברז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אימות האינדוקציה של גלקטוז. (א-ב) כדי לאמת את האינדוקציה של גל הAtg20-הברז, מומלץ לבצע ניתוח של כתמי נייר ומגוון מערבי של תמציות תאים המושרה ב-2% גלקטוז (א, ב, ליין 2) ובלתי המושרה (A, B, ליין 1). (ג) קרום כרוב מערבי הוא גם התפשט ונחקר עם anti-pgk1 עבור בקרת טעינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: טיהור דוגמה של Atg20-Snx4 הטרודימרס. תאי שמרים הAtg20 להביע את ה-ברז ו Snx4 מונע על ידי היזמים גלקטוז המושרה עם 2% גלקטוז, לאחר וכרוך באמצעות IgG הספרד, והוסטו עם פרוטאז TEV. דגימות מכל שלב של טיהור מוצג 10% SDS-עמוד. . ליין 1: המושרה על ידי הליפוסט ליין 2: המושרה הגלולה של ליפוסט. ליין 3: מדגם של חלבונים מאוגדים כדי IgG הספרד. ליין 4: TEV להתחמק טהור Atg20-Snx4 הטרודימרס מספרד IgG. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ליפופה מייצג ומחייב שיטת הקשירה. (א) סנקס-בר הטרודימרס, Atg20-Snx4 וVps5-Vps17 משמרים, הביעו ביטוי, מטוהרים וכבולים לליזומים סינתטיים כמתואר בטקסט. שימו לב כי הMvp1 צורות הומודימרים והיא באה לידי ביטוי בחיידק. (ב) מיקרוגרפים מסוג Snx4-Atg20 ליפוטמין ומדידות כדורית (שיבוץ). (ג) snx-מאגד בר ליפופי משתנים כמה יצירות היה ככמת על ידי densi, try. גרף מציין ממוצע ושגיאה סטנדרטית של הממוצע. * * p < 0.002. (ד) כדורית בדוגמת הטקסט, כתויינו ובגרף. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. קווי שגיאה מייצגים ניתוח דו-כיוון של סטיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| הרכב ליפוחלק אופייני | מיכל הג | מיכל כדורי | Ergosterol | PI3P-C16 |
| MW | 786.1 | 810.0 | 396.7 | 957.0 |
| מול שבר | 49% | 30 | 20 | 1 |
| מלאי ממ | 32.0 | 12.0 | 25.0 | 1.0 |
| מסה (מ ג) | 385.2 | 243.0 | 79.3 | 9.6 |
| ריכוז (mg/mL) | 25.2 | 9.7 | 9.9 | 1.0 |
| אמצעי אחסון ל-RXN (mL) | 15.3 | 25.0 | 8.0 | 10.0 |
טבלה 1: ליפומין מתכון. ליפוזומים סינתטיים הוכנו באמצעות שילוב של הדוג, DOPS, ergosterol, ו PI3P. אנו מחשבים את הריכוז הסופי. ל -1 מול השומנים ההרכב הסטנדרטי שלנו כולל 20% ergosterol, 1% PI3P, DOPS (עד 30%), וכמויות שונות של ה-דוג. הטבלה כוללת ניסוח אופייני עבור 400 μL של 30% DOPS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מדגימים זרימת עבודה ממוטבת כדי לטהר את SNX-בר דימרס ב שמרים ושני שאומר להעריך את המאפיינים הביופיסיים שלהם על ליפוזומים סינתטיים. היתרון העיקרי על הביטוי האופייני חלבון רקומביננטי ב es, coli או מערכות אחרות היא היכולת לבטא באופן שווה את החלבונים SNX-BAR במארח יליד, ובכך הימנעות רעילות ובעיות מסיסות שנמצאו בטיהור snx-ברים במערכות אחרות. זה גם בולט כי המערכת שלנו לא דורשת שיבוט מולקולרי או מחסה של וקטורים ביטויים מרובים17. כפול שלנו SNX-בר שמרים זנים מונעים על ידי היזמים גלקטוז מהונדסים, ובכך להבטיח אפילו ביטוי על אינדוקציה. שיקול חשוב הוא כי בהיעדר גלקטוז, לא יהיה מעט לביטוי של SNX-ברים ממוקדות, ובכך התוצאה היא פנוטיפ null. יתר על כן, אנו מוצאים כי SNX-ברים נוטים לסבול את התגים C-terminal היטב, המאפשר לנו להוסיף את התגית הקש על C-טרמינוס. עם זאת, בהתאם לחלבון המתויג, ייתכן שנעשה שימוש בתגית ' מסוף N 'ב-12. בנוסף, מאז SNX-בארים רק טופס 1:1 dimers, רק חלבון אחד נדרש להיות מתויג למטרות טיהור. עם זאת, כמה SNX-בארים שבדרך כלל יוצרים הטרודימרס בתא הוכחו ליצור הומומרים תחת ריכוזי שאינם פיזיולוגיים7. לכן, זה קריטי כי על טיהור של הטרודימר, את היחס סטויכולמטרי של שני snx-ברים צריך להיות 1:1, אשר ניתן לאמת על ידי הפעלת סדרת מחלקים של מורכבות מטוהרים על sds-עמוד ג'ל וביצוע כתמים coomassie. לאחר הנדסה, אלה זנים שמרים ניתן לשמור על הנצח כמו 15% (v/v) מלאי גליצרול ב-80 ° צ' ו/או בנוסף שונה כדי לבצע שאילתות שותפים מחייב נוספים. זרימת העבודה שלנו בדרך כלל לוקח 2-3 שבועות עבור הבנייה זן ו 3-4 ימים עבור ביטוי וטיהור ו 1 יום עבור ליפוכמה מחייב הכריכה. אנו מאמינים כי זרימת עבודה זו יכולה לעזור לחוקרים עוד להבין את הספציפיות לשומנים של חלבונים snx-bar באמצעות חלבונים מקומיים בר על ליפוזומים סינתטיים או unilamellar לפוחית לפוחיות ענק (guvs) ולחשוף את האיפור המדויק של ליפידים הדרושים שיפוץ הממברנה, ובכך לחשוף את מנגנון הפעולה שלהם.
צעדים קריטיים
במהלך הניסיונות הראשונים שלנו לטיהור הטרודימרים SNX-BAR מתאי שאינם פרוטאז, לעתים קרובות מצאנו תשואות מופחת ומוצרי השפלה. לכן, במהלך השלבים הראשוניים של בניית הזנים, אנו מאמינים כי הוא קריטי כדי להתחיל עם זן שמרים הורים כי הוא חסר עבור אחד או יותר של מעבר מרכזי הפרוטאינסים העיקריים. בפרט, מצאנו זן שמרים TVY614, אשר מתרוקן עבור pep4, prb1, ו prc1, כדי להיות האופטימלי ביותר. באמצעות זן TVY614, אנחנו באופן קבוע להשיג > 90% טהור Snx4-Atg20 הטרודימרס (איור 4 ואיור 5א). עם זאת, את הצורך של כל שלושת הפרוטטינוסים להיות בלתי מתחברות עשוי להיות SNX-BAR שילוב ספציפי. לדוגמה, Vps5-Vps17 הטרודימרס כבר מטוהרים בהצלחה זנים שאינם פרוטאז לקוי10 וכאשר כללנו תוספת של הPEP4 אבלציה, אנו שומרים על עליות צנועות בתשואה וטוהר (איור 5א). לכן, בהתאם ליישומי המטה של המשתמש ואת הצורך טוהר או סמנים לבחירה, ייתכנו גמישות בעת עיצוב זנים הביטוי.
הסדר של בניית גנים הוא גם חשוב. אנו ממליצים על התיוג C-סופני הקש SNX-BAR ORF 1 הראשון, כדי לאשר ביטוי על ידי הכתם המערבי ללא צורך השראה גלקטוז (איור 1). במהלך האינדוקציה גלקטוז, הוא קריטי לתנאי קדם התאים בלילה ב 2% רפפיז ו-0.1% גלוקוז. אי מראש מצב התאים התוצאות בצמיחה איטית מאוד או מוות התאים. עם זאת, זה גם קריטי עבור התאים לרוקן את הגלוקוז הנותרים במהלך הצמיחה לילה, אחרת האינדוקציה גלקטוז יכול להיות מושפע לרעה. כמו כן, מומלץ לבדוק מספר מבודד על ידי הכתם המערבי כדי להעריך ביטוי הומוגניות של הברז מתויג של חלבונים SNX-BAR. אנחנו בדרך כלל מסך 2-3 מבודד לבחור את המועמד ביותר מכבש ביטוי.
שינויים, גישות חלופיות ויישומים עתידיים
בשלב 2.8, טיהור של אהדה דו-מושביים (ברז) בדרך כלל דורש טיהור שני שלבים באמצעות igg ו קלמודולין חרוזים לאחר מחשוף tev12. עם זאת, בפרוטוקול זה, אנו מאלטים snx-BAR דימרים על ידי פרוטאז tev עם תשואה גבוהה מאוד וטוהר. אנו מוצאים טיהור אהדה לאחר מכן באמצעות חרוזי קלמודולין מייצרת תשואה לא עקבית ומופחתת, ולכן אנו ממליצים לעצור לאחר מחשוף tev. TEV להתחמק מכיל את החלבונים SNX-BAR ואת שלו (6)-מתויג TEV פרוטאז יכול להיות מטוהרים נוספת על ידי Ni-נ. ת. ע. חרוזים. עם זאת, אנחנו גם מוצאים את השלב הזה יכול להפחית את התפוקה הכוללת של החלבון SNX-BAR והוא מיותר, מאז הפרוטאז TEV אינו מפריע ליפוכמה קשירה או מחייב. לכן, אם מטוהרים SNX-בארים ישמשו עבור כל יישום אחר, אנו ממליצים למשתמש להעריך את ההשפעה של פרוטאז TEV ב assays שלהם.
עד כה, הצלחנו באמצעות פרוטוקול זה ואת השינויים המתוארים כדי לטהר Snx4-Atg20 ו Vps5-Vps17 הטרודימרס ב שמרים העריכו בהצלחה ספציפיות שומנים שלהם על ליפוזומים סינתטיים. עם זאת, אנו מאמינים כי הפרוטוקול יכול להיות מותאם בהצלחה לכל אחד SNX-ברים בשמרים. ניתן גם להשתמש במערכת כדי לייצר רקומביננטי SNX-BAR חלבונים מכל אורגניזמים אחרים. עם זאת, זה ידרוש צעד נוסף של הבנייה זן לשלב לוקוס גנים אקסוגני לתוך הגנום שמרים. אנו גם מאמינים כי ניתן להרחיב את המערכת כדי לטהר מכלולי מולטימאריק כולל חלבונים מטענים. כך, אנו מאמינים מערכת ההבעה שלנו יכול להאריך מעבר להבנת השומנים מציין של SNX-ברים. יישומים עתידיים יאפשר לחוקרים ליצור מחדש מתחמי לכידת מטענים שלמים על ליפוזומים כדי להבין כיצד הרכבות מלא יכול להשפיע על שיפוץ הממברנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר הפרס GM060221 ובחלקו על ידי המוסד הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המוסדות הלאומיים של בריאות תחת מספר הפרס T32GM007223. מ. פ. הייתה נתמכת בחלקו על ידי תוכנית המענקים למחקר של הפקולטה UNC-שארלוט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 G needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| Ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 μL/1 mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 °C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 |
References
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
