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Genetics

अभिव्यक्ति, शुद्धि, और नवोदित खमीर SNX-बार Heterodimers के Liposome बाध्यकारी

Published: December 6, 2019 doi: 10.3791/60413
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Cell Biology, Yale School of Medicine, 2Department of Biological Sciences, University of North Carolina at Charlotte

Summary

यहां, हम खमीर में SNX-बार विषमता की अभिव्यक्ति, शुद्धिकरण और लिपोसोम बाइंडिंग के लिए एक कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

एसएनएक्स-बार प्रोटीन झिल्ली रीमॉडलिंग प्रोटीन का एक विकासवादी रूप से संरक्षित वर्ग है जो एंडोसाइटोसिस के दौरान प्रोटीन और लिपिड की छंटाई और तस्करी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, एंडोसोमल प्रणाली के भीतर छंटाई, और ऑटोफैगी। सेंट्रल टू एसएनएक्स-बार प्रोटीन फंक्शन होमोडिमर्स या हेटेरोडिमर बनाने की क्षमता है जो अत्यधिक संरक्षित फोक्स-होमोलॉजी (पीएक्स) और बार (बिन/एम्फीफिसिन/आरवीएस) डोमेन का उपयोग करके झिल्ली को बांधते हैं । इसके अलावा, झिल्ली पर एसएनएक्स-बार डिमरकाकरण झिल्ली ट्यूबल और वेसिकल्स के गठन को प्रकाश में लासकता है और इस गतिविधि को एंडोसोम-व्युत्पन्न परिवहन वाहकों के लिए कोट प्रोटीन के रूप में उनके कार्यों को प्रतिबिंबित करने के लिए सोचा जाता है। शोधकर्ताओं ने लंबे समय से सिंथेटिक liposomes या विशाल unilamellar vesicles (GUVs) पर recombinant SNX-बार प्रोटीन का उपयोग कर में इन विट्रो बाध्यकारी अध्ययनका उपयोग किया है झिल्ली remodeling ड्राइव करने के लिए आवश्यक लिपिड के सटीक श्रृंगार प्रकट करने के लिए, इस प्रकार कार्रवाई के अपने तंत्र का खुलासा । हालांकि, दोहरी अभिव्यक्ति प्रणालियों के साथ तकनीकी चुनौतियों के कारण, बैक्टीरिया में एसएनएक्स-बार प्रोटीन अभिव्यक्ति की विषाक्तता, और व्यक्तिगत एसएनएक्स-बार प्रोटीन की खराब घुलनशीलता, आज तक के अधिकांश अध्ययनों ने एसएनएक्स-बार होमोडोर्स की जांच की है, जिसमें बैक्टीरिया में अभिव्यक्ति के दौरान फार्म का गैर-शारीरिक डिमर शामिल है। हाल ही में, हमने एक विशिष्ट जीवाणु अभिव्यक्ति प्रणाली की प्रमुख कमियों को दूर करने के लिए एक प्रोटोकॉल का अनुकूलन किया है। इस कार्यप्रवाह का उपयोग करके, हम प्रदर्शित करते हैं कि बड़ी मात्रा में एसएनएक्स-बार हेटेरोडिमर्स को सफलतापूर्वक कैसे व्यक्त और शुद्ध किया जाए और उन्हें बाध्यकारी और ट्यूबुलेशन परख के लिए सिंथेटिक लिपोसोम पर कैसे पुनर्गठित किया जाए।

Introduction

झिल्ली से बंधे ऑर्गेनेल्स जैसे प्लाज्मा झिल्ली, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम, गोल्गी उपकरण, लासोसोम (खमीर वैक्यूल), और एंडोसोम में यूकेरियोटिक सेल की एंडोम्मेम्ब्रेन सिस्टम शामिल है। अधिकांश ऑर्गेनेल्स में वेसिकल परिवहन वाहकों के माध्यम से अन्य ऑर्गेनेल्स के साथ सामग्री का संचार और आदान-प्रदान करने की क्षमता होती है। कैसे सेल पैकेजिंग और एंडोम्मेब्रेन प्रणाली के भीतर वेसिकल परिवहन वाहक के गठन का समन्वय अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है । हालांकि, एंडोम्मेम्ल सिस्टम का अधिकांश गठन करने वाले प्रोटीन और लिपिड प्लाज्मा झिल्ली (पीएम) से एंडोसाइटिक वेसिकल्स को आंतरिक करने से उत्पन्न होने के लिए जाने जाते हैं। एंडोसोम इन वेसिकल्स के लिए प्राथमिक स्वीकारकर्ता ऑर्गेनेल है और इसमें ट्यूबलर ऑर्गेनेल्स के कई परस्पर सेट शामिल हैं। एंडोसोम का मुख्य कार्य पोषक तत्वों के अधिग्रहण की सुविधा, प्रोटीन और लिपिड कारोबार को विनियमित करना, रोगजनक संक्रमण से बचाना और प्लाज्मा झिल्ली के लिए लिपिड के प्राथमिक भरपाई स्रोत के रूप में काम करना है। चूंकि एंडोसोम प्लाज्मा झिल्ली से कार्गो प्रोटीन और लिपिड के थोक प्राप्त करता है, यह ट्यूबलर एंडोसोमल परिवहन वाहक (ईटीसी) में कार्गो को अलग करके एक छंटाई डिब्बे के रूप में कार्य करता है। ईटीसी में तनहा नहीं होने वाले किसी भी प्रोटीन को एंडो-लाइसोसोमल सिस्टम के माध्यम से अपमानित करने के लिए छोड़ दिया जाता है । ईटीसी में कार्गो छंटाई के डिस्रेगुलेशन से पोषक तत्वों के तेज, प्रोटीन टर्नओवर या लिपिड होमोस्टोसिस की हानि हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप कई मेटाबोलिक, विकासात्मक और न्यूरोलॉजिकल विकार1,2हो सकते हैं। हालांकि, एंडोसोम में ईटीसीएस केंद्रीय भूमिका के बावजूद, कैसे एंडोसोम चुनिंदा ट्यूबलर वाहकों में विषम कार्गो की एक भीड़ की पैकेजिंग का समन्वय कर सकते है की अंतर्निहित तंत्र ज्ञात नहीं है ।

छंटाई नेक्सिन (एसएनएक्स) परिवार प्रोटीन का एक विकासवादी रूप से संरक्षित वर्ग है जो सेल3,4,5में कई वेसिकल परिवहन प्रतिक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण पाया गया है। छंटाई नेक्सिन को एंडोसोम झिल्ली में भर्ती किया जाता है और उनकी विशेषता फोक्स होमोलॉजी (पीएक्स) डोमेन के माध्यम से कार्गो कैप्चर में सहायता की जाती है, जो फोस्फेटिडिलिओसिटोल-3-मोनोफॉस्फेट (पीटीडीइन्स (3)पी) को बांधती है, जो एंडोसोम झिल्ली पर समृद्ध एक लिपिड है। स्तनधारी ३३ SNX प्रोटीन को एन्कोड करते हैं, जिन्हें अन्य डोमेन1की उपस्थिति के अनुसार कई उपपरिवारों में विभाजित किया जा सकता है । सबसे विशेष रूप से, SNX-बार उपपरिवार सबसे बड़ा उपपरिवार है जिसमें मानव में बारह शामिल हैं, जबकि नवोदित खमीर में, सैचारोमाइसेस सेरेविसियामें, उपपरिवार सिर्फ सात SNX-BARs तक कम हो जाता है। एसएनएक्स-बार प्रोटीन में पीएक्स डोमेन और बिन-एम्फीफिसिन-आरवीएस (बार) डोमेन दोनों होते हैं जो लिपिड जलाशयों को सकारात्मक वक्रता झिल्ली को बांधने के लिए ट्रिगर करता है। नतीजतन, SNX-बार परिवार के एंडोसोम के लिए एक प्राकृतिक लगाव है और उनकी झिल्ली remodeling क्षमताओं के माध्यम से ईटीसी गठन मध्यस्थता कर सकते हैं । विट्रो में, एसएनएक्स-बीएआरएस के रीमॉडलिंग गुणों को सिंथेटिक लिपोसोम्स के लिए शुद्ध एसएनएक्स-बीएआरएस के अलावा प्रेरित किया जा सकता है और बाद में संकीर्ण, लेपित ट्यूबल के गठन की कल्पना इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा की जा सकती है। इन तरीकों का उपयोग करते हुए, शोधकर्ताओं ने निर्धारित किया है कि दोनों oligomerization एकाग्रता और कसना शक्ति SNX-बार परिवार के बीच बदलती है सुझाव है कि वे दोनों गठन और ETCs के कैंची में सहायता कर सकता है दिखाई देते हैं ।

एसएनएक्स-बीएआरएस को उनके अनन्य डामरीकरण गुणों द्वारा आगे वर्गीकृत किया जा सकता है। इन विट्रो बाध्यकारी परखों और संरचनात्मक अध्ययनों से पता चला है कि एसएनएक्स-बार प्रोटीन केवल विशिष्ट होमोडिमर्स या हेट्रोडोर बना सकते हैं। इसलिए, सैद्धांतिक रूप से, प्रत्येक संभावित एसएनएक्स-बार डिमर-ओलिगोमर कार्गो-विशिष्ट तस्करी मार्ग के लिए एक ट्यूबल कोट प्रदान कर सकता है और इसी तरह, अन्य एसएनएक्स-बार प्रॉटोमर का प्रतिबंधित अल्पाचारण, विशिष्ट निर्यात मार्गों को भी परिभाषित कर सकता है। हालांकि, SNX-BARs और SNX परिवार के भीतर विविधता की बड़ी संख्या के कारण, एक छंटाई नेक्सिन-एक कार्गो परिकल्पना बहुत संभावना नहीं है । इसके बजाय SNX-BARs, कार्गो, लिपिड विशिष्टता और अन्य निर्भरता जैसे कारकों की एक भीड़ का उपयोग कर एक समन्वित प्रयास अधिक संभावित है । इसी तरह, खमीर SNX4 परिवार के हाल के अध्ययनों से पता चला अतिरिक्त लिपिड विशिष्टता के लिए सबूत, PtdIns (3) पी से परे, एंडोसोम परिवहन वाहक6शक्तिशाली करने के लिए । इस अध्ययन में, एसएनएक्स-बार होमोडिमर एमवीपी1-एमवीपी 1 को बैक्टीरिया और देशी हेटेरोडिमर्स Snx4-Atg20 और Vps5-Vps17 से शुद्ध किया गया था, जबकि केवल Snx4-Atg20 को तरजीही रूप से फॉस्फेटिफायर (पीएस) और प्रूलोसोमअध्ययनमें संकीर्ण ट्यूब जैसी संरचनाओं को तैयार करने के लिए पाया गया था । जबकि क्षेत्र के अन्य लोगों ने बैक्टीरिया से पुनः शुद्ध एसएनएक्स-बार होमोडिमर्स का उपयोग करके एसएनएक्स-बीएआरएस के महत्वपूर्ण गुणों का खुलासा किया है, इसी तरह की प्रणालियों में एसएनएक्स-बार हेटेरोडिमर्स व्यक्त करने से जुड़ी विषाक्तता ने उनके मूल लक्षण वर्णन7,8,9,10में रुकावट पैदा की है। इसलिए, शुद्ध पुनः रूप से व्यक्त देशी विषमता प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय प्रणाली के बिना, शोधकर्ताओं को जांच की इन पंक्तियों को त्याग ना करना चाहिए। चित्रा 1में, हम 1 के लिए एक चार भाग कार्यप्रवाह पेश करते हैं) एक खमीर तनाव का निर्माण करते हैं जो मिलकर आत्मीयता शुद्धि के लिए SNX-बार विषमता पर अधिक व्यक्त करता है, 2) व्यक्त और शुद्ध देशी SNX-बार विषमता, 3) unilamellar सिंथेटिक liposomes तैयार करते हैं, और 4) एक liposome ट्यूबुलेशन या तलछट परख की स्थापना की, शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करने के लिए प्रकृति में पाया छंटाई नेक्सिन की बढ़ती सूची की जांच ।

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Protocol

1. खमीर तनाव निर्माण

  1. TVY614 के साथ शुरू(pep4Τ::LEU2 prb10::hisG prc11::HIS3)11 माता पिता तनाव के रूप में । यह तनाव vacuolar proteases के लिए कमी है, जो सेल lysis के बाद प्रोटीन क्षरण के बहुमत के लिए योगदान है, और इसलिए एक क्लीनर और अधिक कुशल शुद्धि के लिए अनुमति देता है ।
  2. डिजाइन प्राइमर12 और समरूप पुनर्संयोजन का उपयोग करके Atg20 (SNX-बार ORF 1) के सी-टर्मिनस पर मिलकर आत्मीयता शुद्धि (टैप) टैग को एकीकृत करें। एकीकरण(चित्र ा 2)की पुष्टि करने के लिए पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग करें।
  3. उचित एकीकरण13की पुष्टि करने के लिए टैप टैग के खिलाफ सेल लाज़ट का एक पश्चिमी दाग प्रदर्शन करें ।
    नोट: हम एसडीएस-पेज और वेस्टर्न ब्लॉट सत्यापन के लिए कोशिकाओं की 3 ओडी (1 ओडी 1 x 107 कोशिकाओं) की कटाई की सलाह देते हैं। ध्यान दें कि टैप टैग का एकीकरण पश्चिमी दाग के माध्यम से आसान टैप टैग सत्यापन के लिए अनुमति देने के लिए GAL1 प्रमोटर के साथ एंडोजेनस प्रमोटरों को बदलने से पहले होना चाहिए।
  4. प्रत्येक व्यक्ति ओआरएफ14के अनुक्रमिक समरूप पुनर्संयोजन और परिवर्तन चरणों का उपयोग करके अनटैग किए गए GAL1 प्रमोटर के साथ एंडोजेनस एसएनएक्स4 (एसएनएक्स-बार ओआरएफ1) और Atg20 (SNX-BAR ORF 2) प्रमोटरों को बदलें।
  5. पीसीआर के लिए एकीकरण साइटों के बाहर फ्लैंकिंग प्राइमर का उपयोग सफल एकीकरण(चित्र ा 2)की पुष्टि करें। इसके परिणामस्वरूप विकास माध्यम में गैलेक्टोज के अभाव में लक्षित एसएनएक्स-बीएआरएस का एक नल फेनोटाइप होगा।

2. खमीर प्रेरण और SNX-बार डिमर शुद्धि

नोट: खमीर कोशिकाओं को मानक वाईपीडी (खमीर निकालने, पेप्टोन, और 2% ग्लूकोज) एगर प्लेटों पर प्रचारित किया जा सकता है क्योंकि संशोधन गुणसूत्र रूप से एकीकृत होते हैं।

  1. कोशिकाओं के एक बड़े झाड़ू को मानक वाईपी (खमीर निकालने और पेप्टोन) माध्यम के 50 मिलीएल में 2% रफिनोज और 0.1% ग्लूकोज के साथ कार्बन स्रोत के रूप में कम से कम 4x संस्कृति की मात्रा को कम से कम 4x और उचित वातारण की अनुमति देने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस शेकर में रात भर बढ़ता है। उम्मीद है कि मानक वाईपीडी की तुलना में इस माध्यम में विकास धीमा होगा।
  2. अगली सुबह, 50 मिलीआर प्रीकल्चर का उपयोग 2% रैफिनोज और 0.1% ग्लूकोज के साथ मानक वाईपी माध्यम के 1 एल में टीका लगाने के लिए करें और 30 डिग्री सेल्सियस शेकर में 4-5 घंटे के लिए बढ़ें।
    नोट: 1 एल संस्कृति का टीका लगाने के लिए उपयोग की जाने वाली पूर्वसंस्कृति की मात्रा को प्रीकल्चर के ओडी600 के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। टीका के बाद 1 एल संस्कृति के ओडी६०० के आसपास ०.२ होना चाहिए 4-5 एच विकास के दौरान कम से दो दोहरीकरण के लिए अनुमति देते हैं ।
    1. उचित वातारण की अनुमति देने के लिए विकास के लिए एक चकित फर्नबाख फ्लास्क का उपयोग करें, 2.8 एल वॉल्यूम फ्लास्क पर्याप्त है। कम वातारण कटाई पर धीमी वृद्धि और छोटे सेल गोली में परिणाम हो सकता है।
  3. ओडी600 की जांच करें सुनिश्चित करें कि संस्कृति विकास के 4-5 घंटे के बाद लॉग चरण (0.5-1) में है। तनाव के विकास के आधार पर, विकास के समय में समायोजन करने के लिए कम से दो दोहरीकरण के लिए अनुमति देते हैं । 2% गैलेक्टोज में जोड़ें और 30 डिग्री सेल्सियस शेकर में रातोंरात बढ़ें।
    नोट: रातोंरात विकास के बाद ओडी६०० भिन्न हो सकता है लेकिन संस्कृति को संतृप्त किया जाना चाहिए । ध्यान दें कि कोशिकाओं को इस विकास प्रोटोकॉल के लिए 2% गैलेक्टोज के अलावा से पहले 0.1% ग्लूकोज से हटाने की आवश्यकता नहीं है। हम सत्यापन के लिए एसडीएस-पेज और पश्चिमी दाग(चित्रा 3ए, बी,लेन 1-2) के लिए इस चरण में अप्रेरित और प्रेरित कोशिकाओं की 3 ओडी की कटाई की सलाह देते हैं।
  4. 15 00 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा फसल कोशिकाओं 15 मिन के लिए। एक झूल बाल्टी रोटर जो 1 एल वॉल्यूम संस्कृति को समायोजित करता है, इसका उपयोग यहां किया जा सकता है।
  5. खमीर गोली को 50 मीटर शंकुट्यूब में स्थानांतरित करें; एक दूसरा केंद्रीकरण कदम आवश्यकतानुसार किया जा सकता है। सेल पैलेट आम तौर पर मात्रा में लगभग 10-15 मीटर के रूप में स्नातक चिह्नों द्वारा मापा जाएगा और तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
    1. 15 mL शुद्धि बफर में गोली को फिर से निलंबित (50 एमएम ट्रिस पीएच 7.4, 300 एमएम एनएसीएल, 1.5 एमएम एमजीसीएल2,1 एमएम डिथिओथ्रिटॉल (डीटीटी), प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल) 30 मीटर के आसपास अंतिम मात्रा बनाने के लिए।
  6. उपयोग से पहले एक समरूप4 डिग्री सेल्सियस ठंडा करें और शुद्धिकरण बफर के साथ इसे समतुल्य करें। यांत्रिक कोशिका बाधित या होमोजेनेज़र का उपयोग करके लाइसे कोशिकाएं। 2-3 राउंड के लिए 20,000-25,000 साई पर समरूपता में लोड नमूना; ध्यान दें कि जैसे-जैसे कोशिकाएं बढ़ जाती हैं, 20,000-25,000 साई को बनाए रखने के लिए अधिक इनपुट दबाव की आवश्यकता होती है। बर्फ पर 50 मीटर शंकुई ट्यूब में सेल लाइसेट ले लीजिए।
    नोट: यदि अतिरिक्त नमूनों को लाइकेड करने की आवश्यकता है, तो अगले नमूने को लोड करने से पहले समरूप को अच्छी तरह से साफ और समतुल्य किया जाना चाहिए। बर्फ पर सभी सेल लाइसेट्स रखें।
  7. 1 घंटे के लिए 35,000 x ग्राम पर सेल लाइसेट को तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस पर साफ करें। ध्यान से नई ट्यूब में supernatant हस्तांतरण। ध्यान दें कि सेल लिसिस से लिपिड सेंट्रलाइज्ड के दौरान शीर्ष पर तैरेंगे और शुद्धि को प्रभावित नहीं करेंगे।
    नोट: हम एसडीएस-पेज के नमूनों के लिए lysate और पैलेट का 0.5-1% बचाने की सलाह देते हैं। आमतौर पर, कोई बड़ा अंतर नहीं देखा जाता है और नल प्रोटीन घुलनशीलता(क्रमशः चित्रा 4,लेन 1 और 2) की पुष्टि करने के लिए एक अतिरिक्त पश्चिमी दाग किया जा सकता है।
  8. शुद्धिकरण बफर के साथ आईजीजी सेफलोस मोतियों के 300 माइक्रोन को समरूप करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाते हुए 2 घंटे के लिए क्लीयर सेल लिसैट और इनक्यूबेट में जोड़ें।
  9. 10 मीटर क्रोममेटोग्राफी कॉलम में मोतियों को इकट्ठा करें और अनबाउंड लाइसेट को प्रवाहित करने की अनुमति दें।
  10. वॉश बफर (50 एम ट्राई पीएच 7.4, 300 एमएम एनएसीएल, 1.5 एमएम एमजीसीएल2,1 एमएम डीटीटी) का उपयोग करके मोतियों को धोएं, एक समय में 1 एमएल जोड़ना और इसे पूरी तरह से प्रवाहित करने की अनुमति दें।
    नोट: हम एसडी-पेज नमूने के लिए बाउंड-आईजीजी मोतियों का 2% बचाने की सलाह देते हैं। आमतौर पर, हम चार प्रमुख बैंड का निरीक्षण करते हैं; दो SNX-बार प्रोटीन और आईजीजी हैवी और लाइट चेन(चित्रा 4,लेन 3) । हम टीईवी क्लीवेज दक्षता की तुलना करने के लिए 'एल्यूएट' और 'ईजी मोतियों के बाद टीईवी' की बराबर मात्रा को सहेजने की सलाह देते हैं।
  11. मोतियों को इकट्ठा करें और उन्हें माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब पर स्थानांतरित करें। ताजा धोने बफर के साथ कुल मात्रा के ५०० μL और 10 मिलीग्राम/mL TEV प्रोटीज़ के 2 μL और रातोंरात इनक्यूबेट, 4 डिग्री सेल्सियस पर घूर्णन के साथ जोड़ें ।
  12. अगली सुबह, 27 जी सुई का उपयोग करके सुपरनेट को पूरी तरह से हटा दें और प्रोटीन शुद्धता का आकलन 10% पॉलीएक्रिलैमाइड एसडीएस-पेज(चित्रा 4,लेन 4) द्वारा करें।
    नोट: हम आम तौर पर 95% शुद्ध विषमताका 0.5-1 मिलीग्राम/mL के 500 μL प्राप्त(चित्र4,लेन 4) । Calmodulin राल का उपयोग कर अतिरिक्त शुद्धि भी किया जा सकता है, लेकिन हम आम तौर पर उपज में एक महत्वपूर्ण कमी देखते है और यहां रोकने की सलाह अगर शुद्धता है >90% । TEV liposome बाध्यकारी परख के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, हालांकि TEV अतिरिक्त नी-NTA agarose मोती15का उपयोग कर हटाया जा सकता है ।
  13. ध्यान केंद्रित करने के लिए, नमूना को 10 केडीए कटऑफ और अपकेंद्री के साथ 0.5 मीटर अपकेंद्रित्र फिल्टर में स्थानांतरित करें निर्माता के निर्देशों के अनुसार 50 माइक्रोन या उससे कम। ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख का उपयोग कर केंद्रित प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और एक सप्ताह के भीतर उपयोग करें।

3. लिपोसोम तैयारी

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लिपिड खरीदें: फॉस्फेटिपल्लेसेरिन (पीएस), पीआई 3पी, एर्गोस्टेरोल, और फॉस्फेटिडिलकोलिन (पीसी)। यदि आवश्यक हो, तो स्टॉक लिपिड बनाने के लिए अनुशंसित सॉल्वेंट में फिर से निलंबित करें।
    नोट: लिपिड को निर्माता की सिफारिशों के अनुसार मेथनॉल/क्लोरोफॉर्म मिश्रण में फिर से निलंबित कर दिया जाता है। सुनिश्चित करें कि लिपिड स्टॉक स्पष्ट और उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान के लिए गरम कर रहे हैं । पुनः निलंबित लिपिड को आर्गन गैस के नीचे संग्रहीत किया जा सकता है और 6-12 महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर मोम फिल्म (या समकक्ष) का उपयोग करके या गतिविधि की हानि के बाद तक सील किया जा सकता है।
  2. वांछित लिपिड संरचना (टेबल 1देखें) के साथ मिश्रण बनाने के लिए प्रत्येक लिपिड स्टॉक की आवश्यक मात्रा की गणना करें। लिपिड मिश्रण में लिपिड के कुल 1 तिल मान लें।
  3. एक रासायनिक धुएं हुड में इस कदम को अंजाम देते हैं। क्लोरोफॉर्म की पूरी सिरिंज मात्रा को खींचकर और इसे बेकार कंटेनर में छोड़कर ग्लास सीरिंज को साफ करें। दो बार और दोहराएं। क्लोरोफॉर्म स्थानांतरित करते समय, केवल ग्लास सीरिंज या पिपेट का उपयोग करें। क्लोरोफॉर्म को खींचते समय, सिरिंज में गैस बुलबुले की शुरूआत को रोकने के लिए धीरे-धीरे डाट पर खींचें।
  4. 1% PI3P, 20% एर्गोस्टेरोल, 30% पीएस, पीसी(टेबल 1)का अंतिम लिपिड मिश्रण बनाने के लिए एक साफ ग्लास कल्चर ट्यूब में गणना के रूप में स्टॉक लिपिड स्थानांतरित करने के लिए ग्लास सीरिंज का उपयोग करें। प्रत्येक लिपिड को रिस्पेंड करने वाले सॉल्वैंट्स के आधार पर, मिश्रण प्रत्येक लिपिड के अलावा बादल बदल सकता है।
    नोट: पीएस (0-30%) की सांद्रता को अलग करने के लिए, तदनुसार मात्रा को समायोजित करें और अलग-अलग पीसी(तालिका 1)के साथ क्षतिपूर्ति करें।
  5. लिपिड मिश्रण को एक गोलाकार गति में लिपिड मिश्रण पर निर्देशित नाइट्रोजन गैस का उपयोग करके लिपिड मिश्रण को ध्यान से सूखा लें ताकि लिपिड को समान रूप से सूखा जा पडा जा। सुखाने की प्रक्रिया के दौरान कांच की नली के नीचे लिपिड रखने के लिए कम गैस प्रवाह का उपयोग करें। कांच की संस्कृति ट्यूब को पन्नी के साथ लपेटें, उद्घाटन खुला छोड़ दें, और 1 घंटे के लिए वैक्यूम में आगे निर्जलित करें।
  6. 2.5 मीटर की अंतिम लिपोसोम एकाग्रता बनाने के लिए लिपिड को पूरी तरह से निर्जलित करने के लिए बाध्यकारी बफर (50 एमएम ट्रिस पीएच 7.4, 300 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम एमजीसीएल2)के 400 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: अंतिम लिपोसोम एकाग्रता को कम या ज्यादा बाध्यकारी बफर जोड़कर समायोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 200 μL बाध्यकारी बफर को 5 mM की एक लिपोसोम एकाग्रता का उत्पादन करने के लिए जोड़ा जा सकता है यदि आवश्यक हो (नीचे देखें)।
    1. 30 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर भंवर पर मध्यम गति पर हिलाकर लिपिड को फिर से निलंबित करें । बफर को बादल दिखाई देने चाहिए क्योंकि लिपिड को फिर से निलंबित कर दिया जाता है ।
  7. एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब पर पुनः निलंबित लिपोसोम स्थानांतरित करें। इस बिंदु से, प्लास्टिक पिपेट युक्तियों का उपयोग किया जा सकता है क्योंकि लिपिड को क्लोरोफॉर्म में अब फिर से निलंबित नहीं किया जाता है। ध्यान दें कि लिपोसोम समाधान बादल दिखना चाहिए।
  8. फ्रीज-गल लिपोसोम्स तरल नाइट्रोजन में पहले माइक्रोसेंट्रिकट्यूब को जलमग्न करके सात से आठ बार, फिर 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में। लिपोसोम मिश्रण विगलन से पहले आंख से पूरी तरह से जमे हुए और ठोस दिखाई देना चाहिए।
  9. रासायनिक धुएं के हुड में क्लोरोफॉर्म से जुड़े कदमों को करें। किसी भी अवशिष्ट लिपिड को हटाने के लिए क्लोरोफॉर्म की पूर्ण सिरिंज की मात्रा को तैयार करके और त्यागकर दो 1 मिलील ग्लास सिरिंज साफ करें। दो सिरिंज की मात्रा तैयार करके अल्ट्राप्योर पानी के साथ प्रत्येक ग्लास सिरिंज को अलग करें, फिर दो सिरिंज वॉल्यूम तैयार करके बाध्यकारी बफर के साथ संतुलन करें।
  10. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार मिनी एक्सट्रूडर को इकट्ठा करें। बाध्यकारी बफर में प्रत्येक को जलमग्न करके एक 200 एनएम झिल्ली और फिल्टर के दो टुकड़े समर्थन करता है (सामग्री की तालिकादेखें) को समतुल्य करें।
  11. सैंडविच फिल्टर के बीच झिल्ली का समर्थन करता है और मिनी एक्सट्रूडर में जगह है। इकट्ठे मिनी एक्सट्रूडर में मृत मात्रा को कम करने और यह सुनिश्चित करने के लिए कि असेंबली हवा-तंग है, 1 एमएल ग्लास सीरिंज का उपयोग करके मिनी-एक्सट्रूडर के माध्यम से लिपोसोम मिश्रण की मात्रा के बराबर बाध्यकारी बफर की मात्रा पारित करें।
  12. 1 मिलीग्लास सीरिंज में से एक का उपयोग करें और लिपोसोम मिश्रण को खींचें। कांच की सिरिंज में ड्राइंग के लिए ट्यूब कैप में लिपोसोम मिश्रण के अंतिम को इकट्ठा करने के लिए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को उलटना।
  13. 200 एनएम झिल्ली 19-21 बार से गुजरकर लिपोसोम निकालें। नई एक माइक्रोसेंरिफ्यूज ट्यूब में बाहर निकाले गए लिपोसोम ्स लीजिए।
    नोट: बाहर निकालने वाले लिपोसोम ्सको से पहले लिपोसोम ्स की तुलना में कम बादल दिखाई देने चाहिए। लिपोसोम का उपयोग उसी दिन किया जाना चाहिए और बर्फ पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। पिछले निष्कासन में शुरू हुई सिरिंज के विपरीत में लिपोसोम रखना चाहिए।

4. SNX-बार Liposome बाध्यकारी और ट्यूबुलेशन

  1. लिपोसोम बाध्यकारी और तलछट प्रयोगों को संचालित करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मीटर के लिए एक अल्ट्रासेंट्रिकफ्यूज में 100,000 x ग्राम पर प्रीक्लियर शुद्ध प्रोटीन। अधिनेता को हटादें और इसे एक नई माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें; अगर कोई है तो गोली को परेशान न करें।
  2. लिपोसोम बाध्यकारी और ट्यूबुलेशन परख करने के लिए, इनक्यूबेट 4 μM शुद्ध Snx4-Atg20 और 2.5 m liposomes 20 μL की कुल प्रतिक्रिया मात्रा में, liposomes की मात्रा बदलती जोड़ा ।
    नोट: इसी प्रयोग में, लिपोसोम की समान मात्रा का उपयोग किया जाना चाहिए।
  3. प्रतिक्रिया को 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करते हैं।
    नोट: हम तलछट के दौरान दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए 10 माइक्रोन लिपोसोम से कम का उपयोग करके प्रत्येक प्रतिक्रिया में जोड़े गए 2.5 m M liposomes की मात्रा को अधिकतम करने का सुझाव देते हैं। यदि 2.5 मीटर लिपोसोम के 10 माइक्रोन का उपयोग 20 माइक्रोन प्रतिक्रिया में किया जाता है, तो लिपोसोम ्स की अंतिम एकाग्रता 1.25 मीटर होगी। यदि शुद्ध प्रोटीन पतला हो जाते हैं और 4 माइक्रोएम प्रोटीन के लिए अधिक मात्रा की आवश्यकता होती है, तो लिपिड की एकाग्रता को दोगुना करने के लिए रिहाइड्रेशन चरण के दौरान 200 माइक्रोन में लिपिड को फिर से निलंबित किया जा सकता है (चरण 3.6 देखें); हालांकि, यह लिपोसोम बनाने से पहले प्रोटीन एकाग्रता जानने की आवश्यकता होगी।
  4. लिपोसोम ट्यूबुलेशन की कल्पना और मात्रा निर्धारित करें।
    1. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए तुरंत लिपोसोम बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं को संसाधित करें। कार्बन-लेपित तांबे के जाल ग्रिड और नकारात्मक दाग पर हाजिर नमूने 1% मूत्र एसीटेट(चित्रा 5बी)16का उपयोग कर ।
    2. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (200 केवी) पर नमूनों का विश्लेषण करें।
    3. ट्यूबल व्यास को मापने और निर्धारित करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। एक ट्यूबल के ट्यूबल व्यास को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए, एक ट्यूबल और औसत(चित्रा 5बी)की लंबाई के साथ तीन व्यास माप लें।
      नोट: विचरण के दो तरह के विश्लेषण का उपयोग सांख्यिकीय महत्व(चित्रा 5ई)निर्धारित करने के लिए किया गया था। यूरिनल एसीटेट रेडियोधर्मी और विषाक्त दोनों है। इस कदम को अंजाम देने के लिए उचित लैब सेफ्टी सर्टिफिकेशन की जरूरत होती है।
  5. लिपोसोम बाध्यकारी और तलछट।
    1. प्रतिक्रिया (20 μL, चरण 4.3 से) एक पॉली कार्बोनेट अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 किमी के लिए अल्ट्रासेंट्रिकफ्यूज में 100,000 x ग्राम पर स्पिन करने के लिए एक संगत रोटर का उपयोग करें। ध्यान से सुपरनेटेंट को हटा दें और नई माइक्रोसेंटाइज ट्यूब पर स्थानांतरित करें। ध्यान रहे कि गोली बरकरार रहनी चाहिए।
    2. नमूना बफर के SDS-PAGE 40 μL में गोली को फिर से निलंबित करें और एक नई माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। सुपरनेटेंट में नमूना बफर के 20 माइक्रोन जोड़ें। 10% पॉलीएक्रिलामाइड एसडीएस-पेज जेल में पैलेट और सुपरनेटेंट के बराबर मात्रा लोड करें और Liposomes(चित्रा 5ए)से बंधे SNX-BARs की कल्पना करने के लिए कूमासी धुंधला प्रदर्शन करें।
    3. पैलेट अंश में एसएनएक्स-बार परिसर की मात्रा निर्धारित करने के लिए, घनत्व का उपयोग करके बैंड तीव्रता की मात्रा निर्धारित करना और पैलेट अंश में एसएनएक्स-बार प्रोटीन के अनुपात की मात्रा निर्धारित करना।
      नोट: विचरण के दो तरह के विश्लेषण का उपयोग सांख्यिकीय महत्व(चित्रा 5सी)निर्धारित करने के लिए किया गया था।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल एंडोजेनस खमीर एसएनएक्स-बार परिसरों के प्रजनन योग्य और मजबूत उत्पादन के लिए एक विधि का वर्णन करता है जिसका उपयोग डाउनस्ट्रीम झिल्ली रीमॉडलिंग परखों(चित्रा 1)के लिए किया जा सकता है। शुद्धिकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले खमीर तनाव का निर्माण नवोदित खमीर में समरूप पुनर्संयोजन की दक्षता का लाभ उठाता है, जो लक्षित एसएनएक्स-बीएआरएस(चित्रा 2)के जीनोमिक लोकी में संशोधनों के लिए अनुमति देता है। इस डिजाइन के दो फायदे हैं, (i) के रूप में चयन संशोधनों को बनाए रखने के लिए आवश्यक नहीं है, मानक वाईपी माध्यम का उपयोग किया जा सकता है, जिससे उच्च कोशिका घनत्व में वृद्धि की अनुमति दी जा सकती है और इस प्रकार प्रोटीन का उच्च उत्पादन और (ii) लक्षित एसएनएक्स-बीएआरएस का अभिव्यक्ति स्तर भी होगा, जो विषमता जटिल के उत्पादन का अनुकूलन करेगा। गैलेक्टोस को जोडऩे से पहले, लक्षित एसएनएक्स-बीएआरएस एक नल फेनोटाइप का प्रदर्शन करेगा और इस प्रकार लक्षित एसएनएक्स-बीएआरएस के लिए विशिष्ट विकास दोष या अन्य ज्ञात दोष हो सकते हैं। इसके अलावा, 2% रफिनोज और 0.1% ग्लूकोज में वृद्धि 2% ग्लूकोज में वृद्धि की तुलना में धीमी है। इसलिए, गैलेक्टोज इंडक्शन से पहले विकास अवधि के लिए प्रत्येक विशेष तनाव के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। SNX-बार अभिव्यक्ति के उचित शामिल होने के लिए जांच करने के लिए, नल टैग के खिलाफ एक पश्चिमी दाग की संभावना है क्योंकि SNX-BARs के प्रोटीन के स्तर का पता नहीं लगाया जा सकता है Coomassie दाग(चित्रा 3)के माध्यम से । हालांकि, क्योंकि एसएनएक्स-बार परिसर के केवल एक सदस्य का टैग है, अनटैग प्रोटीन (एस) की अभिव्यक्ति की पुष्टि तब तक नहीं की जा सकती जब तक कि शुद्धिकरण के सभी चरण पूरे नहीं हो जाते। SNX-बार विषमता के शुद्धिकरण के बाद, दो SNX-BARs के बैंड 1:1 stochiometric अनुपात में होना चाहिए और कोई दूषित बैंड के लिए थोड़ा होना चाहिए(चित्रा 4,लेन 4) । यदि अतिरिक्त दूषित बैंड हैं, और शुरुआती खमीर तनाव पहले से ही प्रोटीज़-कमी है, तो सेल लिसिस के दौरान अधिक प्रोटीज़ अवरोधक जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, कैलोडुलिन राल का उपयोग करके एक दूसरा शुद्धिकरण कदम किया जा सकता है।

झिल्ली रीमॉडलिंग परखों का संचालन करते समय(चित्रा 5),लिपोसोम और शुद्ध प्रोटीन की एक ही तैयारी का उपयोग एक ही प्रयोग में किया जाना चाहिए। यदि वांछित एकाग्रता तक पहुंचने के लिए प्रोटीन की कई शुद्धि तैयारी की आवश्यकता होती है, तो प्रयोग करने से पहले शुद्ध सभी प्रोटीन को मिलाएं। लिपोसोम ्स को उसी दिन(टेबल 1)के भीतर बनाया और इस्तेमाल किया जाना चाहिए । जब लिपोसोम तलछट परखों का आयोजन, यह महत्वपूर्ण है कि शुद्ध प्रोटीन 20 min के लिए १००,००० x ग्राम की एक ही तलछट की स्थिति का उपयोग कर तुरंत पहले 20 min के लिए एक ही तलछट शर्तों का उपयोग कर पहले से ही स्पष्ट है के रूप में उपजी प्रोटीन परिणाम तिरछा हो सकता है । इसके अलावा, लिपोसोम गोली तलछट के बाद बरकरार रहना चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: SNX-बार बाध्यकारी परख प्रवाह चार्ट । संक्षेप में, चरण 1-2 में, हम दो SNX-बार जीनोमिक लोकी में लड़की प्रमोटरों इंजीनियर, अंतर्जात प्रमोटरों में से प्रत्येक की जगह और इंजीनियर एक सी टर्मिनल नल टैग दो SNX-बार loci में से एक में । इसके बाद, चरण 3-7 में, हम गैलेक्टोज के साथ कोशिकाओं को प्रेरित करते हैं और एसएनएक्स-बार विषमता को एकरूपता के लिए शुद्ध करते हैं। चरण 8-12 में, हम गणना करते हैं और unilamellar liposomes तैयार करते हैं। अंत में, हम एसएनएक्स-बार हेटेरोडिमर्स को यूनिमेलर लिपोसोम्स के साथ जोड़ सकते हैं और दो परख कर सकते हैं; चरण 14a-16a झिल्ली ट्यूबुलेशन शामिल है और 14b-16a तलछट परख शामिल है । अधिक जानकारी के लिए पाठ देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: SNX-बार एकीकरण रणनीति। दो SNX-बार loci के मुताबिक़ पुनर्संयोजन का उपयोग कर GAL अभिव्यक्ति के लिए लक्षित किया गया । एसएनएक्स-बार ओआरएफ1 (Atg20) को अतिरिक्त रूप से सी-टर्मिनल टैप टैग व्यक्त करने के लिए लक्षित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: गैलेक्टोज इंडक्शन सत्यापन। (ए-बी) Atg20-TAP के जीएल इंडक्शन को सत्यापित करने के लिए, हम 2% गैलेक्टोज (ए, बी, लेन 2) और अप्रेरित (ए, बी, लेन 1) के साथ प्रेरित सेल अर्क के एसडी-पेज और पश्चिमी दाग विश्लेषण की सलाह देते हैं। (ग)वेस्टर्न ब्लॉट झिल्ली को भी उतार दिया जाता है और लोडिंग नियंत्रण के लिए एंटी-पीजीके1 के साथ जांच की जाती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: Atg20-Snx4 विषमता का उदाहरण शुद्धि। गैलेक्टोज प्रमोटरों द्वारा संचालित Atg20-TAP और Snx4 व्यक्त करने के लिए इंजीनियर खमीर कोशिकाओं को 2% गैलेक्टोज के साथ प्रेरित किया गया था, जो आईजीजी सेफलोस का उपयोग करके और बाध्य थे, और टीईवी प्रोटीज़ के साथ eluted थे। शुद्धिकरण के प्रत्येक चरण से नमूने 10% एसडीएस-पेज में दिखाए गए हैं। लेन 1: lysate के प्रेरित supernatant । लेन 2: lysate के प्रेरित गोली । लेन 3: आईजीजी सेफलोस के लिए बाध्य प्रोटीन का नमूना। लेन 4: आईजीजी सेफलोस से शुद्ध Atg20-Snx4 हेट्रोडिमर के TEV eluate । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिनिधि लिपोसोम बाध्यकारी और ट्यूबुलेशन परख। (क)एसएनएक्स-बार हेटेरोडिमर्स, एजी20-एसएनएक्स4 और वीपीएस5-वीपीएस17 खमीर से, व्यक्त किए गए, शुद्ध किए गए और पाठ में वर्णित सिंथेटिक लिपोसोम ्स से बंधे हुए थे। ध्यान दें कि Mvp1 होमोडोर बनाता है और बैक्टीरिया में व्यक्त किया गया था। (ख)एसएनएक्स4-एजी20 लिपोसोम ट्यूबुलेशन परख और ट्यूबल माप (इनसेट) के ईएम माइक्रोग्राफ। (ग)अलग-अलग लिपोसोम रचनाओं के लिए बाध्यकारी एसएनएक्स-बार को घनत्व द्वारा निर्धारित किया गया था। ग्राफ मतलब और मतलब की मानक त्रुटि इंगित करता है । **पी एंड एलटी; 0.002। (द) तुबुले व्यास को पाठ में वर्णित मात्रा में और ग्राफ किया गया था । स्केल बार = 200 एनएम। त्रुटि सलाखों के विचरण के दो तरह के विश्लेषण का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

विशिष्ट लिपोसोम संरचना DOPC डीओपी एर्गोस्टेरोल PI3P-C16
मेगावाट 786.1 810.0 396.7 957.0
मोल अंश 49% 30% 20% 1%
स्टॉक एमएम 32.0 12.0 25.0 1.0
मास (मिलीग्राम) 385.2 243.0 79.3 9.6
एकाग्रता (मिलीग्राम/mL) 25.2 9.7 9.9 1.0
आरएक्सएन (एमएल) के लिए वॉल्यूम 15.3 25.0 8.0 10.0

तालिका 1: लिपोसोम नुस्खा। डीओपीसी, डीओपी, एर्गोस्टेरोल और पीआई 3पी के संयोजन का उपयोग करके सिंथेटिक लिपोसोम तैयार किए गए थे। हम लिपिड के 1 मोल करने के लिए अंतिम एकाग्रता की गणना करते हैं। हमारी मानक संरचना में 20% एर्गोस्टेरोल, 1% पीआई3पी, डीओपी (30%) तक, और डीओपी की अलग-अलग मात्रा शामिल है। तालिका में 30% डीओपी के 400 माइक्रोन के लिए एक विशिष्ट निर्माण शामिल है।

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Discussion

यहां, हम खमीर में SNX-बार डिमर्स को शुद्ध करने के लिए एक अनुकूलित कार्यप्रवाह प्रदर्शित करते हैं और सिंथेटिक लिपोसोम पर उनके जैव भौतिक गुणों का मूल्यांकन करने के लिए दो परख देते हैं। एस्चेरिचिया कोलाई या अन्य प्रणालियों में विशिष्ट पुनः संयोजन प्रोटीन अभिव्यक्ति पर मुख्य लाभ एक देशी मेजबान में SNX-बार प्रोटीन को समान रूप से व्यक्त करने की क्षमता है, इस प्रकार अन्य प्रणालियों में SNX-BARs को शुद्ध करने में पाए जाने वाले विषाक्तता और अघुलनशीलता के मुद्दों से परहेज करना। यह भी उल्लेखनीय है कि हमारी प्रणाली को आणविक क्लोनिंग या मल्टीपल एक्सप्रेशन वैक्टर17को शरण देने की आवश्यकता नहीं है । हमारे दोहरे एसएनएक्स-बार खमीर उपभेदों गुणसूत्र इंजीनियर गैलेक्टोज प्रमोटरों द्वारा संचालित कर रहे हैं, इस प्रकार भी शामिल करने पर अभिव्यक्ति सुनिश्चित । एक महत्वपूर्ण विचार यह है कि गैलेक्टोज के अभाव में, लक्षित एसएनएक्स-बीएआरएस की कोई अभिव्यक्ति नहीं होगी, जिसके परिणामस्वरूप एक नल फेनोटाइप होगा। इसके अलावा, हम पाते हैं कि SNX-BARs सी-टर्मिनल टैग को अच्छी तरह से बर्दाश्त करते हैं, जिससे हम सी-टर्मिनस पर टैप टैग जोड़ सकते हैं। हालांकि, प्रोटीन टैग किए जाने के आधार पर, एन-टर्मिनल टैप टैग का उपयोग12भी किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, चूंकि एसएनएक्स-बीएआरएस केवल 1:1 डिमर्स बनाते हैं, इसलिए शुद्धिकरण उद्देश्यों के लिए केवल एक प्रोटीन को टैग किया जाना आवश्यक है। हालांकि, कुछ एसएनएक्स-बीएआरएस जो सामान्य रूप से सेल में हेटेरोडिमर बनाते हैं, उन्हें गैर-शारीरिक सांद्रता7के तहत होमोडिमर्स बनाने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि विषमता के शुद्धिकरण पर, दो एसएनएक्स-बीएआरएस का स्टोइचियोमेट्रिक अनुपात 1:1 होना चाहिए, जिसे एसडीएस-पेज जेल पर शुद्ध परिसर का एक बहाना चलाकर सत्यापित किया जा सकता है और कूमासी धुंधला प्रदर्शन कर सकता है। एक बार इंजीनियर होने के बाद, इन खमीर उपभेदों को 15% (v/v) ग्लाइसेरोल स्टॉक के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस और/या अतिरिक्त अतिरिक्त बाध्यकारी भागीदारों को क्वेरी में संशोधित किया जा सकता है। हमारे कार्यप्रवाह में आम तौर पर तनाव निर्माण के लिए 2-3 सप्ताह और अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए 3-4 दिन और लिपोसोम बाध्यकारी परख के लिए 1 दिन लगते हैं। हमें विश्वास है कि इस कार्यप्रवाह शोधकर्ताओं को आगे SNX-बार प्रोटीन की लिपिड विशिष्टता सिंथेटिक liposomes या विशाल unilamellar vesicles (GUVs) पर देशी बार प्रोटीन का उपयोग कर समझने में मदद कर सकते है और लिपिड के सटीक श्रृंगार प्रकट करने के लिए झिल्ली remodeling ड्राइव की जरूरत है, इस प्रकार कार्रवाई के अपने तंत्र का खुलासा ।

महत्वपूर्ण कदम

एसएनएक्स-बार विषमता को गैर-प्रोटीज़ कमी वाली कोशिकाओं से शुद्ध करने के हमारे पहले प्रयासों के दौरान, हमें अक्सर कम पैदावार और क्षरण उत्पाद मिले। इसलिए, तनाव निर्माण के प्रारंभिक चरणों के दौरान, हमारा मानना है कि माता-पिता के खमीर तनाव के साथ शुरू करना महत्वपूर्ण है जो एक या अधिक प्रमुख vacuolar प्रोटीनके लिए कमी है। विशेष रूप से, हमें खमीर तनाव TVY614 मिला, जो pep4, prb1और prc1के लिए समाप्त हो गया है, सबसे इष्टतम हो । TVY614 तनाव का उपयोग करके, हम नियमित रूप से प्राप्त करते हैं और 90% शुद्ध Snx4-Atg20 हेटेरोडिमर(चित्रा 4 और चित्रा 5ए)। हालांकि, सभी तीन प्रोटीन के लिए आवश्यकता SNX-बार संयोजन विशिष्ट हो सकता है । उदाहरण के लिए, Vps5-Vps17 हेट्रोडिमर को गैर-प्रोटीज़ कमी वाले उपभेदों10 में सफलतापूर्वक शुद्ध किया गया है और जब हमने PEP4 एब्लेशन के अलावा शामिल किया, तो हम उपज और शुद्धता(चित्र5ए)में मामूली वृद्धि का निरीक्षण करते हैं। इसलिए, उपयोगकर्ता के डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों और शुद्धता या चुनिंदा मार्कर की आवश्यकता के आधार पर, अभिव्यक्ति उपभेदों को डिजाइन करते समय लचीलापन हो सकता है।

जीन निर्माण का क्रम भी महत्वपूर्ण है। हम सी-मरणासन्न नल टैगिंग एसएनएक्स-बार ओआरएफ 1 पहले की सलाह देते हैं, ताकि गैलेक्टोज इंडक्शन(चित्रा 1)की आवश्यकता के बिना पश्चिमी दाग द्वारा अभिव्यक्ति की पुष्टि की जा सके। गैलेक्टोज इंडक्शन के दौरान, 2% रैफिनोज और 0.1% ग्लूकोज में रात भर कोशिकाओं को प्री-कंडीशन करना महत्वपूर्ण है। पूर्व की स्थिति में विफलता कोशिकाओं को बेहद धीमी गति से विकास या कोशिका मृत्यु में परिणाम है । हालांकि, कोशिकाओं के लिए रात भर के विकास के दौरान शेष ग्लूकोज को कम करना भी महत्वपूर्ण है, अन्यथा गैलेक्टोज इंडक्शन को नकारात्मक रूप से प्रभावित किया जा सकता है। नल टैग एसएनएक्स-बार प्रोटीन की अभिव्यक्ति एकरूपता का मूल्यांकन करने के लिए पश्चिमी दाग द्वारा कई अलग-थलग ों की जांच करने की भी सिफारिश की जाती है। हम आम तौर पर स्क्रीन 2-3 अलग और सबसे मजबूती से व्यक्त उंमीदवार उठाओ ।

संशोधन, वैकल्पिक दृष्टिकोण, और भविष्य के अनुप्रयोग

चरण 2.8 में, टैंडेम आत्मीयता शुद्धि (टैप) को आमतौर पर टीईवी क्लीवेज12के बाद आईजीजी और कैलोडुलिन मोतियों का उपयोग करके दो-चरण आत्मीयता शुद्धि की आवश्यकता होती है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में, हम बहुत अधिक उपज और शुद्धता के साथ TEV प्रोटीज़ द्वारा SNX-बार डिमर्स को elute करते हैं। हम शांत मोतियों का उपयोग करके बाद की आत्मीयता शुद्धि पाते हैं, असंगत और कम पैदावार पैदा करते हैं, इस प्रकार हम टीईवी दरार के बाद रोकने की सलाह देते हैं। एसएनएक्स-बार प्रोटीन और उसके (6) टैग किए गए टीवी प्रोटीज वाले टीवी एल्यूएट को नी-एनटीए अगारोज मोतियों द्वारा और शुद्ध किया जा सकता है। हालांकि, हम यह भी पाते है कि यह कदम समग्र SNX-बार प्रोटीन उपज को कम कर सकता है और अनावश्यक है, क्योंकि टीईवी प्रोटीज़ लिपोसोम बाध्यकारी या ट्यूबुलेशन परख के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है। इसलिए, यदि शुद्ध SNX-BARs किसी अन्य आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, हम उपयोगकर्ता को उनके परख में TEV प्रोटीज़ के प्रभाव का आकलन करने की सलाह देते हैं।

इस प्रकार अब तक, हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने में सफल रहे हैं और खमीर में Snx4-Atg20 और Vps5-Vps17 हेटेरोडिमर को शुद्ध करने के लिए वर्णित संशोधनों और सफलतापूर्वक सिंथेटिक लिपोस पर उनकी लिपिड विशिष्टता का आकलन किया है। हालांकि, हमारा मानना है कि प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक खमीर में एसएनएक्स-बीएआरएस में से किसी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। किसी भी अन्य जीवों से पुनः संयोजन एसएनएक्स-बार प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए प्रणाली का उपयोग करना भी संभव है। हालांकि, खमीर जीनोम में एक बहिर्जात जीन लोकस को एकीकृत करने के लिए तनाव निर्माण के एक अतिरिक्त कदम की आवश्यकता होगी। हमारा यह भी मानना है कि कार्गो प्रोटीन सहित बहुमेरिक परिसरों को शुद्ध करने के लिए प्रणाली का विस्तार किया जा सकता है । इस प्रकार, हमारा मानना है कि हमारी अभिव्यक्ति प्रणाली SNX-BARs के लिपिड निर्दिष्ट ों को समझने से परे विस्तार कर सकती है। भविष्य के अनुप्रयोगों शोधकर्ताओं को लिपोसोम पर पूरे कार्गो कैप्चर परिसरों का पुनर्गठन करने की अनुमति देगा ताकि यह समझा जा सके कि पूर्ण विधानसभाएं झिल्ली रीमॉडलिंग को कैसे प्रभावित कर सकती हैं ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए अनुसंधान को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय आयु र्इंध संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या GM060221 के तहत और राष्ट्रीय संस्थानों के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान द्वारा भाग में समर्थन दिया गया था पुरस्कार संख्या T32GM007223 के तहत स्वास्थ्य की । आर सी को यूएनसी-शार्लोट फैकल्टी रिसर्च ग्रांट प्रोग्राम द्वारा भाग में समर्थन दिया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm PC Membranes Avanti 610006
10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) Bio-Rad 731-1550
27 G needle BD Biosciences 301629
Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff Amicon UFC501024
Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer Avestin EF-C3
BCA assay Pierce 23225
Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Complete Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693116001
DOPC Avanti 850375
DOPS Avanti 840035
Ergosterol (Sigma) Sigma 47130-U
Extruder Set with Block 0.2 μL/1 mL Avanti 610000
FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV)
Glass culture tubes VWR 47729-570
IgG sepharose beads (GE Healthcare) GE Healthcare 17-0969-01
Microlter glass syringes Hamilton 7637-01
New Brunswick Excella E25 Eppendorf M1353-0000 or equivalent shaking 30 °C
Ni-NTA Magnetic Agarose Beads Pierce 78605
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94516
Parafilm M VWR 52858-076
PI3P Echelon P-3016 or Echelon equivalent
Polycarbonate bottle assembly Beckman Coulter 355622
TLA-100 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 343840
Type 45 Ti Rotor Beckman Coulter
Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve VWR 75871-436
Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) A&J Vacuum PN07050
Vortex with foam holder VWR 10153-838
VWR KIT MICROTUBE VWR 12620-880

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References

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जेनेटिक्स इश्यू 154 एसएनएक्स-बार शुद्धि एंडोसोम फॉस्फोलिपिड खमीर लिपोसोम्स
अभिव्यक्ति, शुद्धि, और नवोदित खमीर SNX-बार Heterodimers के Liposome बाध्यकारी
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Ma, M., Goyal, S., Burd, C. G., Chi, … More

Ma, M., Goyal, S., Burd, C. G., Chi, R. J. Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers. J. Vis. Exp. (154), e60413, doi:10.3791/60413 (2019).

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