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Genetics

Espressione, purificazione e rilegatura lipososo di eterodimeri SNX-BAR

Published: December 6, 2019 doi: 10.3791/60413

Summary

Qui, presentiamo un flusso di lavoro per l'espressione, purificazione e rilegatura lipososo di eterodimeri SNX-BAR in lievito.

Abstract

Le proteine SNX-BAR sono una classe evolutivamente conservata di proteine di rimodellamento della membrana che svolgono un ruolo chiave nella selezione e nel traffico di proteine e lipidi durante l'endocitosi, lo smistamento all'interno del sistema endosomico e l'autofagia. Fondamentale per la funzione della proteina SNX-BAR è la capacità di formare omodimeri o eterodimeri che legano le membrane utilizzando domini di fox-homologia (PX) e BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs). Inoltre, l'oligomerizzazione dei dimeri SNX-BAR sulle membrane può suscitare la formazione di tubuli e vesciche di membrana e questa attività è pensata per riflettere le loro funzioni come proteine del mantello per i portatori di trasporto derivati dall'endosoma. I ricercatori hanno a lungo utilizzato studi di legame in vitro utilizzando proteine SNX-BAR ricombinanti su liposomi sintetici o vescicle unilamellar giganti (GUT) per rivelare la marcatura precisa dei lipidi necessari per guidare il rimodellamento della membrana, rivelando così il loro meccanismo di azione. Tuttavia, a causa di sfide tecniche con sistemi a doppia espressione, tossicità dell'espressione proteica SNX-BAR nei batteri e scarsa solubilità delle singole proteine SNX-BAR, la maggior parte degli studi finora hanno esaminato gli omodimeri SNX-BAR, compresi i dimeri non fisiologici che si formano durante l'espressione nei batteri. Recentemente, abbiamo ottimizzato un protocollo per superare le principali carenze di un tipico sistema di espressione batterica. Utilizzando questo flusso di lavoro, dimostriamo come esprimere e purificare con successo grandi quantità di eterodimeri SNX-BAR e come ricostituirli su liposomi sintetici per i saggi di rilegatura e tubazione.

Introduction

Gli organelli legati a membrane come la membrana plasmatica, il reticolo endoplasmico, l'apparato Golgi, il lisosoma (vacuolo di lievito) e l'endosoma costituiscono il sistema endomembrano della cellula eucabolica. La maggior parte degli organelli ha la capacità di comunicare e scambiare materiale con altri organelli attraverso vettori di trasporto vescicolo. Il modo in cui la cellula coordina l'imballaggio e la formazione di vettori di trasporto vescicolo all'interno del sistema endomembrana non è ben compreso. Tuttavia, le proteine e i lipidi che costituiscono gran parte del sistema dell'endomembrana sono noti per provenire dall'interiorizzazione delle vesciche endocitiche dalla membrana plasmatica (PM). L'endosoma è l'organello accettatore primario per queste vescicle ed è composto da più set interconnessi di organelli tubolari. La funzione principale dell'endosoma è quella di facilitare l'acquisizione di nutrienti, regolare il turnover di proteine e lipidi, proteggere dall'infezione patogena e fungere da fonte primaria di rifornimento di lipidi per la membrana plasmatica. Poiché l'endosoma riceve la maggior parte delle proteine del carico e dei lipidi dalla membrana plasmatica, agisce come un compartimento di smistamento isolando i carichi in vettori di trasporto endosomici tubolari (ETC). Tutte le proteine non sequestrate negli ETC vengono lasciate degradare attraverso il sistema endososomico. La disregolazione dello smistamento del carico negli ETC può portare alla perdita di assorbimento di nutrienti, turnover proteico o omeostasi lipidica, con conseguente numerosa disturbi metabolici, di sviluppo e neurologici1,2. Tuttavia, nonostante gli ETC ruolo centrale presso l'endosoma, il meccanismo sottostante di come l'endosoma può coordinare selettivamente l'imballaggio di una moltitudine di carichi eterogenei in vettori tubolari non è noto.

La famiglia di nexin a cinta (SNX) è una classe evolutivamente conservata di proteine che sono state trovate critiche per molte reazioni di trasporto vescicle nella cella3,4,5. Le nexine di smistamento vengono reclutate nella membrana endosomicosa e aiutano nella cattura del carico attraverso il loro caratteristico dominio di omologia fox (PX), che lega fosfatoylinostolo-3-monofosfato (PtdIns(3)P), un lipido arricchito sulla membrana endosoma. I mammiferi codificano trentatré proteine SNX, che possono essere ulteriormente suddivise in più sottofamiglie, in base alla presenza di altri domini1. In particolare, la sottofamiglia SNX-BAR è la più grande sottofamiglia composta da dodici in umani, mentre in lievito in erba, Saccharomyces cerevisiae, la sottofamiglia è ridotta a soli sette SNX-BAR. Le proteine SNX-BAR hanno sia un dominio PX che un dominio Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR) che attiva serbatoi lipidici per legare membrane di curvatura positive. Di conseguenza, la famiglia SNX-BAR ha una naturale affinità per l'endosoma e può mediare la formazione etc attraverso le loro capacità di rimodellamento della membrana. In vitro, le proprietà di rimodellamento delle SNX-BAR possono essere indotte dall'aggiunta di SNX-BAR purificati ai liposomi sintetici e la successiva formazione di tubuli stretti e rivestiti può essere visualizzata mediante microscopia elettronica. Utilizzando questi metodi, i ricercatori hanno determinato che sia la concentrazione di oligomerizzazione che la forza di costrizione sembrano variare tra la famiglia SNX-BAR suggerendo che potrebbero aiutare sia nella formazione che nella scissione degli ETC.

Gli SNX-BAR possono essere ulteriormente classificati in base alle loro esclusive proprietà di dimerizzazione. I saggi e gli studi strutturali che legano in vitro che le proteine SNX-BAR possono formare solo omodimeri o eterodimeri specifici. Pertanto, in linea di principio, ogni potenziale dimero-oligomero SNX-BAR potrebbe fornire un rivestimento tubulo per un percorso di traffico specifico del carico e, allo stesso modo, l'oligomerizzazione limitata degli altri protomeri SNX-BAR, può anche definire percorsi di esportazione distinti. Tuttavia, a causa del gran numero di SNX-BAR e della diversità all'interno della famiglia SNX, una specifica che smista l'ipotesi del carico nexin-one è altamente improbabile. Invece uno sforzo coordinato utilizzando una moltitudine di fattori come SNX-BAR, carico, specificità lipidica e altre dipendenze è più probabile. Allo stesso modo, recenti studi della famiglia lievito SNX4 hanno rivelato prove di ulteriore specificità dei lipidi, oltre PtdIns(3)P, per potenziare i vettori di trasporto endosomi6. In questo studio, SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1 è stato purificato da batteri e eterodimeri nativi Snx4-Atg20 e Vps5-Vps17 sono stati espressi e purificati in alta resa da lievito, mentre solo Snx4-Atg20 è stato trovato per legare preferibilmente phosphatidylserine (PS) e formare stretta-tubo come le strutture di legame6. Mentre altri nel campo hanno rivelato importanti proprietà delle SNX-BAR utilizzando omodimeri SNX-BAR ricombinanti purificati dai batteri, la tossicità associata all'espressione di eterodimeri SNX-BAR in sistemi simili hanno ostacolato la loro caratterizzazione nativa7,8,9,10. Pertanto, senza un sistema affidabile per ottenere eterodimeri nativi puramente espressi in modo ricombinante, i ricercatori devono rinunciare a queste linee di indagine. Nella Figura 1, presentiamo un flusso di lavoro in quattro parti a 1) costruire un ceppo di lievito sovraesprimendo eterodimeri SNX-BAR per la purificazione dell'affinità tandem, 2) esprimere e purificare gli eterodimeri nativi SNX-BAR, 3) preparare liposomi sintetici unilamellar, e 4) impostare un sussidio di tubulazione o sedimentazioni liposomiche, fornendo uno strumento vitale per i ricercatori per studiare il crescente catalogo di retissine di smistamento presenti in natura.

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Protocol

1. Costruzione del ceppo di lievito

  1. Iniziare con TVY614 (pep4:::LEU2 prb1::hisG prc1 :::HIS3)11 come ceppo padre. Questo ceppo è carente per le proteasi vacuolare, che contribuiscono alla maggior parte della degradazione delle proteine dopo la lisi cellulare, e quindi consente una purificazione più pulita ed efficiente.
  2. Progetta primer12 e integra il tag TAP (TL) di affinità tandem al C-terminus di Atg20 (SNX-BAR ORF 1) utilizzando la ricombinazione omologa. Utilizzare la reazione a catena della polimerasi (PCR) per confermare le integrazioni (Figura 2).
  3. Eseguire una macchia occidentale di lisa tollei cella sul tag TAP per confermare la corretta integrazione13.
    NOT: Per la verifica delle macchie occidentali e SDS, si consiglia di raccogliere 3 OD (1 OD x 1 x 107 celle) di celle. Si noti che l'integrazione del tag TAP deve avvenire prima di sostituire i promotori endogeni con il promotore GAL1 per consentire una più facile verifica del tag TAP tramite una macchia occidentale.
  4. Sostituire i promotori endogeni Snx4 (SNX-BAR ORF1) e Atg20 (SNX-BAR ORF 2) con promotori GAL1 senza tag utilizzando passaggi sequenziali di ricombinazione omologa e trasformazione di ogni singolo ORF14.
  5. Utilizzare i numeri di rete flanking al di fuori dei siti di integrazione per PCR per confermare le integrazioni riuscite (Figura 2). Ciò si tradurrà in un fenotipo nullo delle SNX-FORR mirate in assenza di galactosi nel mezzo di crescita.

2. Induzione del lievito e purificazione del dimero SNX-BAR

NOT: Le cellule di lievito possono essere propagate su piastre di agar YPD standard (estratto di lievito, peptone e 2% di glucosio) poiché le modifiche sono cromosomiche integrate.

  1. Inoculare un grande tampone di cellule in 50 mL di YP standard (estratto di lievito e peptone) medio con 2% raffinose e 0,1% glucosio come fonte di carbonio in un flacone almeno 4x il volume della coltura e crescere durante la notte in 30 sshaker c per consentire una corretta aerazione. Aspettatevi che la crescita in questo mezzo sarà più lenta rispetto allo YPD standard.
  2. La mattina successiva, utilizzare la precultura di 50 mL per inoculare in 1 L del mezzo standard YP con 2% raffinose e 0.1% glucosio e crescere per 4-5 h in 30 sshaker.
    NOT: Il volume della precultura utilizzato per inoculare 1 coltura L può essere regolato a seconda dell'OD600 della precultura. L'OD600 della coltura 1 L dopo l'inoculazione dovrebbe essere di circa 0,2 per consentire almeno due raddoppi durante la crescita di 4-5 h.
    1. Utilizzare una fiaschetta Fernbach sconcertata per la crescita per consentire una corretta aerazione, un pallone di volume da 2,8 L è sufficiente. Una minore aerazione può provocare una crescita più lenta e un pellet cellulare più piccolo al momento della raccolta.
  3. Controllare OD600 per assicurarsi che le impostazioni cultura siano nella fase di log (0,5-1) dopo 4-5 h di crescita. A seconda della crescita della deformazione, apportare modifiche al tempo di crescita per consentire almeno due raddoppi. Aggiungete al 2% di galactose e cresconate durante la notte in agitatore a 30 gradi centigradi.
    NOT: L'OD600 dopo la crescita overnight può variare, ma la coltura dovrebbe essere satura. Si noti che le cellule non hanno bisogno di essere rimossi da 0.1% glucosio prima di aggiunta di 2% galactose per questo protocollo di crescita. Si consiglia di raccogliere 3 OD di cellule non indotte e indotte in questo passaggio per SDS-PAGE e western blot per la verifica(Figura 3A, B, Corsia 1-2).
  4. Raccogliere cellule per centrifugazione a 4500 x g per 15 min. Qui può essere utilizzato un rotore a benna oscillante che ospita la coltura del volume 1 L.
  5. Trasferire il pellet di lievito in un tubo conico da 50 mL; un secondo passo di centrifugazione può essere eseguito in base alle esigenze. Il pellet cellulare sarà generalmente di circa 10-15 mL di volume come misurato dalla marcatura di graduazione e può essere utilizzato immediatamente o immagazzinato a -80 gradi centigradi.
    1. Resuspend pellet in buffer di purificazione da 15 mL (50 mM MM PH 7.4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol (DTT), cocktail inibitore della proteasi) per fare il volume finale intorno ai 30 mL.
  6. Raffreddare un omogeneizzatore di 4 gradi centigradi prima dell'uso e abtenerlo con tampone di purificazione. Le cellule di Lyse utilizzando un disgregatore a cellule meccaniche o omogeneizzatore. Caricare il campione nell'omogeneizzatore e la liscite a 20.000-25.000 psi per 2-3 giri; Si noti che man mano che le cellule vengono lizzate, è necessaria una maggiore pressione di input per mantenere 20.000-25.000 psi. Raccogliere il lisato cellulare in un tubo conico da 50 mL sul ghiaccio.
    NOT: Se è necessario eseguire l'unlza mento, l'omogeneizzatore deve essere accuratamente pulito ed equilibrato prima di caricare il campione successivo. Tenere tutti i lismi cellulari sul ghiaccio.
  7. Cancellare immediatamente il lisato cellulare a 35.000 x g per 1 h a 4 gradi centigradi. Trasferire con attenzione il supernatante in un nuovo tubo. Si noti che i lipidi dalla lisi cellulare galleggiano verso l'alto durante la centrifugazione e non influenzeranno la purificazione.
    NOT: Si consiglia di risparmiare lo 0,5-1% del lisate e del pellet per i campioni SDS-PAGE. In genere, non si osservano differenze importanti e si può fare una macchia occidentale aggiuntiva per confermare la solubilità della proteina TAP (Figura 4, Corsie 1 e 2, rispettivamente).
  8. Equilibrate 300 -L di Perline sepharose IgG con tampone di purificazione. Aggiungere alla cella cancellata lisata e incubare per 2 h, ruotando a 4 gradi centigradi.
  9. Raccogliere perline in una colonna di cromatografia da 10 mL e consentire il flusso di lisa non vincolata.
  10. Lavare perline utilizzando 10 mL di buffer di lavaggio (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT), aggiungendo 1 mL alla volta e permettendogli di fluire completamente.
    NOT: Si consiglia di risparmiare il 2% delle perline IgG rilegate per il campione SDS-PAGE. Tipicamente, osserviamo quattro bande principali; due proteine SNX-BAR e IgG Heavy e Light Chains(Figura 4, Corsia 3). Consigliamo di risparmiare quantità equivalenti di perline "eluate" e "IgG dopo TEV" per confrontarle con l'efficienza della scissione TEV.
  11. Raccogliere le perline e trasferirle in un tubo di microcentrifuga. Aggiungete fino a 500 l di volume totale con tampone di lavaggio fresco e 2 10 mg/mL di proteasi TEV da 10 mg/mL e incubate durante la notte, ruotando a 4 gradi centigradi.
  12. La mattina successiva, rimuovere completamente il supernatante utilizzando un ago da 27 G e valutare la purezza delle proteine del 10% poliacrilammide SDS-PAGE (Figura 4, Corsia 4).
    NOT: In genere si ottengono 500 L di 0,5-1 mg/mL del 95% di eterodimero puro(Figura 4, Corsia 4). Ulteriore purificazione utilizzando resina calmodulin può anche essere fatto, tuttavia in genere vediamo una significativa riduzione della resa e consigliamo di fermarsi qui se la purezza è >90%. TEV non interferisce con i saggi di legame liposoma, anche se TEV può essere rimosso ulteriormente utilizzando Ni-NTA agarose perline15.
  13. Per concentrarsi, trasferire il campione a un filtro centrifugo da 0,5 mL con 10 cutoff kDa e centrifuga secondo le istruzioni del produttore a 50 o meno l. Quantificare le proteine concentrate utilizzando l'analizzatore di proteine Bradford. Conservare a 4 gradi centigradi e utilizzare entro una settimana.

3. Preparazione del liposoma

  1. Acquistare lipidi disponibili in commercio: fosfhatidylserine (PS), PI3P, ergosterolo e fosfatidicicolina (PC). Se necessario, risospendere nel solvente consigliato per fare lipidi di riserva.
    NOT: I lipidi vengono risospesi in una miscela di metanolo/cloroformio per le raccomandazioni del produttore. Assicurarsi che le scorte di lipidi siano chiare e riscaldate a temperatura ambiente prima dell'uso. I lipidi risospesi possono essere conservati sotto gas argon e sigillati con pellicola di cera (o equivalente) a -20 gradi centigradi per 6-12 mesi o fino a quando non si osserva la perdita di attività.
  2. Calcolare il volume richiesto di ogni brodo lipidico per creare una miscela con la composizione lipidistica desiderata (vedere la tabella 1). Assumere un totale di 1 talpa di lipidi nella miscela di lipidi.
  3. Eseguire questo passaggio in una cappa di fumi chimici. Pulire le siringhe di vetro elaborando un volume di siringhe completo di cloroformio e scartandolo in un contenitore di rifiuti. Ripetere altre due volte. Quando si trasferisce il cloroformio, utilizzare solo siringhe di vetro o pipette. Quando si rediga il cloroformio, tirare lentamente il tappo per evitare l'introduzione di bolle di gas nella siringa.
  4. Utilizzare siringhe di vetro per trasferire i lipidi di riserva calcolati in un tubo di coltura del vetro pulito per creare una miscela di lipidi finale dell'1% PI3P, del 20% di ergosterolo, del 30% PS, del PC (Tabella 1). A seconda dei solventi in cui ogni lipido viene risospeso, la miscela può diventare torbida dopo l'aggiunta di ogni lipido.
    NOT: Per variare le concentrazioni di PS (0-30%), regolare i volumi di conseguenza e compensare con PC variabile (Tabella 1).
  5. Asciugare accuratamente la miscela lipidiconica utilizzando gas di azoto diretto alla miscela lipidida in un movimento circolare per asciugare uniformemente i lipidi. Utilizzare un basso flusso di gas per mantenere i lipidi nella parte inferiore del tubo di vetro durante il processo di essiccazione. Avvolgere il tubo di coltura del vetro con un foglio, lasciando scoperta l'apertura, e disidratare ulteriormente nel vuoto per 1 h.
  6. Aggiungere 400 l di buffer di legame (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2) per disidratare completamente i lipidi per fare una concentrazione liposografica finale di 2,5 mM.
    NOT: La concentrazione liposomafinale finale può essere regolata aggiungendo più o meno buffer di legame. Ad esempio, è possibile aggiungere 200 buffer di rilegatura ll per produrre una concentrazione lipososo di 5 mM, se necessario (vedere di seguito).
    1. Risospendere i lipidi agitando la velocità media su un vortice a temperatura ambiente per 30 minuti.
  7. Trasferire i liposomi sospesi in un tubo di microcentrifuga. Da questo punto in poi, le punte di pipetta di plastica possono essere utilizzate poiché i lipidi non vengono più sospesi nel cloroformio. Si noti che la soluzione lipososo dovrebbe apparire nuvoloso.
  8. Congelare i liposomi da sette a otto volte immergendo il tubo di microcentrifuga prima in azoto liquido, poi in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi. La miscela lipososo dovrebbe apparire completamente congelato e solido ad occhio prima dello scongelamento.
  9. Eseguire passi che coinvolgono il cloroformio in una cappa di fumi chimici. Pulire due siringhe di vetro da 1 mL redimando e scartando tutti i volumi di siringhe di cloroformio, tre volte ciascuna, per rimuovere eventuali lipidi residui. Ogni siringa di vetro con acqua ultrapura con l'elaborazione di due volumi di siringa, poi eclita con tampone di rilegatura elaborando due volumi di siringa.
  10. Assemblare il mini-estrusore secondo le raccomandazioni del produttore. Un Equilibrate da 200 nm e due pezzi di supporti filtranti (vedi Tabella dei materiali)unendoli in un buffer di rilegatura.
  11. Sandwich la membrana tra i supporti del filtro e posto nel mini-estrusore. Per ridurre il volume morto nel mini-estrusore assemblato e per assicurarsi che l'assemblaggio sia a tenuta d'aria, passare un volume di tampone di legame paragonabile al volume della miscela lipososo
  12. Utilizzare una delle siringhe di vetro da 1 mL e redigere la miscela lipososo. Invertire il tubo di microcentrifuga per raccogliere l'ultima miscela lipososo societa' nel tappo del tubo per l'attingmento nella siringa di vetro.
  13. Estrusioni liposomi passando attraverso la membrana di 200 nm 19-21 volte. Raccogliere liposomi estruso in un nuovo tubo di microcentrifuga.
    NOT: I liposomi estrusi dovrebbero apparire meno torbidi dei liposomi prima dell'estrusione. I liposomi devono essere usati lo stesso giorno e conservati sul ghiaccio. L'ultima estrusione dovrebbe mettere i liposomi nella siringa di fronte a quella in cui è iniziata.

4. Rilegatura e tubazione Liposoma SNX-BAR

  1. Proteina purificata preclear a 100.000 x g in un'ultracentrifuga per 20 minuti a 4 gradi centigradi prima di condurre esperimenti di legame e sedimentazione liposomici. Rimuovere il supernatante e trasferirlo in un nuovo tubo di microcentrifuga; non disturbare il pellet se ce n'è uno.
  2. Per eseguire saggi di legame e tubazione liposoma, incubare 4 spurdati Snx4-Atg20 e 2,5 mM di liposomi in un volume di reazione totale di 20 gradi, variando il volume dei liposomi aggiunti.
    NOT: Nello stesso esperimento, si dovrebbe usare lo stesso volume di liposomi.
  3. Incubare la reazione a 30 gradi centigradi per 30 min.
    NOT: Si consiglia di massimizzare la quantità di rossesomi da 2,5 mm aggiunti a ogni reazione utilizzando non meno di 10 liposomi l per consentire la visualizzazione durante la sedimentazione. Se in una reazione di 20 m viene utilizzato 10 ll di 2,5 m di liposomi, la concentrazione finale di liposomi sarà di 1,25 mM. Se le proteine purificate sono diluite e è necessario più volume per 4 proteine M, i lipidi possono essere risospesi in 200 gradi durante la fase di reidratazione per raddoppiare la concentrazione di liposomi (vedere Passo 3.6); tuttavia, questo richiederà conoscere la concentrazione proteica prima di fare i liposomi.
  4. Visualizza e quantifica la tubazione liposoma.
    1. Reazioni di legame lipososo del processo immediatamente per l'analisi della microscopia elettronica. Avvistare i campioni su una griglia di maglie di rame rivestite in carbonio e una macchia negativa utilizzando l'1% di acetato uranilo (Figura 5B)16.
    2. Analizzare i campioni su un microscopio elettronico a trasmissione (200 kV).
    3. Utilizzare il software di analisi delle immagini per misurare e quantificare il diametro del tubulo. Per quantificare con precisione il diametro del tubulo di un singolo tubulo, adottare tre misure di diametro lungo la lunghezza di un tubulo e la media (Figura 5B).
      NOT: L'analisi bidirezionale della varianza è stata utilizzata per determinare la significatività statistica (Figura 5E). L'acetato di urane è sia radioattivo che tossico. Per eseguire questo passaggio è necessaria una certificazione di sicurezza di laboratorio adeguata.
  5. Rilegatura e sedimentazione liposoma.
    1. Trasferire la reazione (20 , dal gradino 4,3) a un tubo di centrifuga di policarbonato e utilizzare un rotore compatibile per girare a 100.000 x g in un ultracentrifuga per 20 min a 4 gradi centigradi. Rimuovere con attenzione il supernatante e trasferirlo nel nuovo tubo di microcentrifuga. Si noti che il pellet deve rimanere intatto.
    2. Risospendere il pellet in SDS-PAGE 40 - L di buffer campione e trasferirlo in un nuovo tubo di microcentrifuga. Aggiungere 20 l di buffer di campionamento al supernatante. Caricare quantità equivalenti di pellet e supernatant in un gel SDS-PAGE poliacrilamide del 10% ed eseguire la colorazione Coomassie per visualizzare SNX-BAR vincolati ai liposomi (Figura 5A).
    3. Per quantificare la quantità di complesso SNX-BAR nella frazione di pellet, quantificare le intensità della banda utilizzando densitometria e quantificare la proporzione delle proteine SNX-BAR nella frazione di pellet.
      NOT: L'analisi bidirezionale della varianza è stata utilizzata per determinare la significatività statistica (Figura 5C).

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Representative Results

Questo protocollo descrive un metodo per la produzione riproducibile e robusta di complessi SNX-BAR di lievito endogeno che possono essere utilizzati per i saggi di rimodellamento della membrana a valle (Figura 1). La costruzione del ceppo di lievito utilizzato per la purificazione sfrutta l'efficienza della ricombinazione omologa nel lievito in erba, consentendo modifiche ai loci genomici della SNX-BAR mirata (Figura 2). Questo design ha due vantaggi, (i) come la selezione non è necessaria per mantenere le modifiche, standard YP medio può essere utilizzato, consentendo la crescita ad una maggiore densità cellulare e quindi maggiore produzione di proteine e (ii) i livelli di espressione del mirato SNX-BAR sarà uniforme, ottimizzando la produzione del complesso eterodimero. Prima dell'aggiunta di galactose, le SNX-BAR mirate mostreranno un fenotipo nullo e quindi possono comportare un difetto di crescita o altri difetti noti specifici delle SNX-BAR mirate. Inoltre, la crescita del 2% di raffinose e dello 0,1% di glucosio è più lenta della crescita del 2% del glucosio. Pertanto, il periodo di crescita prima dell'induzione di galactose può richiedere l'ottimizzazione per ogni particolare ceppo. Per verificare la corretta induzione dell'espressione SNX-BAR, è probabilmente necessaria una macchia occidentale contro il tag TAP poiché i livelli proteici dei SNX-BAR potrebbero non essere rilevati tramite la macchia Coomassie (Figura 3). Tuttavia, poiché solo un membro del complesso SNX-BAR ha un tag, l'espressione delle proteine senza tag non può essere confermata a meno che tutti i passaggi della purificazione non siano completati. Dopo la purificazione dell'eterodimero SNX-BAR, le bande dei due SNX-BAR dovrebbero apparire in rapporto stochiometrico 1:1 e ci dovrebbero essere poco o nessun acontante bande (Figura 4, corsia 4). Se ci sono ulteriori bande contaminanti, e il ceppo di lievito iniziale è già carente di proteasi, più inibitore della proteasi può essere aggiunto durante la lisi cellulare. Inoltre, può essere eseguita una seconda fase di purificazione utilizzando la resina calmodulin.

Quando si conducono saggi di rimodellamento della membrana (Figura 5), la stessa preparazione di liposomi e proteine purificate deve essere utilizzata nello stesso esperimento. Se sono necessari più preparati di purificazione delle proteine per raggiungere la concentrazione desiderata, combinare tutte le proteine purificate prima di condurre l'esperimento. I liposomi devono essere fatti e utilizzati entro lo stesso giorno (Tabella 1). Quando conduci analisi di sedimentazione liposomidi, è fondamentale che la proteina purificata sia pre-chiarita utilizzando le stesse condizioni di sedimentazione di 100.000 x per 20 minuti immediatamente prima dell'incubazione con i liposomi come proteina precipitata possono alterare i risultati. Inoltre, il pellet liposomato deve rimanere intatto dopo la sedimentazione.

Figure 1
Figura 1: diagramma di flusso di ansay vincolante SNX-BAR. In breve, nei passaggi 1-2, progettiamo promotori GAL in due loci genomici SNX-BAR, sostituendo ciascuno dei promotori endogeni e ingegnerizzando un tag TAP terminale C in uno dei due loci SNX-BAR. Successivamente, nei passi 3-7, induciamo le cellule con galactose e purifichiamo gli eterodimeri SNX-BAR all'omogeneità. Nei passaggi 8-12, calcoliamo e prepariamo liposomi unilamellar. Infine, possiamo combinare gli eterodimeri SNX-BAR con liposomi unilamellar ed eseguire due saggi; Passo 14a-16a coinvolgono tubazione della membrana e 14b-16a coinvolgono il saggio di sedimentazione. Vedere il testo per ulteriori dettagli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Strategia di integrazione SNX-BAR. Due loci SNX-BAR sono stati presi di mira per l'espressione GAL utilizzando la ricombinazione omologa. SNX-BAR ORF1 (Atg20) è stato inoltre preso di mira per esprimere un tag TAP terminale C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Verifica dell'induzione del galactose. (A-B) Per verificare l'induzione dell'elenco indirizzi globale di Atg20-TAP, si consiglia un'analisi SDS-PAGE e occidentale delle macchie di estratti cellulari indotta con 2% galactose (A, B, corsia 2) e non indotta (A, B, corsia 1). (C) Anche la membrana occidentale delle macchie viene spogliata e sondata con anti-pgk1 per un controllo del carico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Esempio di purificazione degli eterodimeri Atg20-Snx4. Le cellule di lievito progettate per esprimere Atg20-TAP e Snx4 guidate da promotori di galactosi sono state indotte con il 2% di galactose, lisciviato e legato utilizzando iggofali IgG, ed eluite con proteasi TEV. I campioni di ogni fase della purificazione sono mostrati in 10% SDS-PAGE. Corsia 1: supernatante indotto di lisa. Corsia 2: pellet indotto di lisato. Corsia 3: campione di proteine legate al setharose IgG. Corsia 4: TEV eluate gli eterodimeri Atg20-Snx4 puri di IgG sepharose. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Rappresentante rilegatura liposomale e saggio di tubazione. (A) Gli eterodimeri SNX-BAR, Atg20-Snx4 e Vps5-Vps17 dal lievito, sono stati espressi, purificati e legati a liposomi sintetici come descritto nel testo. Si noti che Mvp1 forma omodimeri ed è stato espresso in batteri. (B) Micrografie EM di misurazione di analisi e tubuli liposomi Snx4-Atg20 (inset). (C) L'associazione SNX-BAR a diverse composizioni liposomiche è stata quantificata dalla densitometria. Il grafico indica la media e l'errore standard della media. < 0,002. (D) I diametri dei tubuli sono stati quantificati e rappresentati graficamente come descritto nel testo. Barra della scala: 200 nm. Le barre di errore rappresentano l'analisi bidirezionale della varianza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Composizione liposoma tipica DOPC DOPS Ergosterolo PI3P-C16
Mw 786.1 810.0 396.7 957.0
mol frazione 49% 30% 20% 1%
Magazzino mM 32.0 12.0 25.0 1.0
Massa (mg) 385.2 243.0 79.3 9.6
Concentrazione (mg/mL) 25.2 9.7 9.9 1.0
Volume a RXN(mL) 15.3 25.0 8.0 10.0

Tabella 1: Ricetta liposoma. Liposomi sintetici sono stati preparati utilizzando una combinazione di DOPC, DOPS, ergosterolo e PI3P. Calcoliamo la concentrazione finale a 1 mol di lipido. La nostra composizione standard comprende il 20% di ergosterolo, l'1% PI3P, il DOPS (fino al 30%) e quantità variabili di DOPC. La tabella include una formulazione tipica per 400 -L del 30% di DOPS.

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Discussion

Qui, dimostriamo un flusso di lavoro ottimizzato per purificare i dimeri SNX-BAR nel lievito e due saggi per valutare le loro proprietà biofisiche sui liposomi sintetici. Il vantaggio principale rispetto alla tipica espressione proteica ricombinante in Escherichia coli o in altri sistemi è la capacità di esprimere uniformemente le proteine SNX-BAR in un host nativo, evitando così i problemi di tossicità e insolubilità riscontrati nella purificazione delle SNX-BAR in altri sistemi. È anche da notare che il nostro sistema non richiede la clonazione molecolare o l'afbose di più vettori di espressione17. I nostri ceppi di lievito SNX-BAR sono guidati da promotori di galactosi progettati cromosomici, garantendo così anche l'espressione all'induzione. Una considerazione importante è che in assenza di galactose, ci sarà poca o nessuna espressione degli SNX-BAR mirati, risultando così in un fenotipo nullo. Inoltre, scopriamo che sNX-BAR tendono a tollerare bene i tag C-terminal, permettendoci di aggiungere il tag TAP al capolinea C. Tuttavia, a seconda della proteina etichettata, un tag TAP N-terminale può essere utilizzato anche12. Inoltre, poiché le SNX-BAR formano solo dimeri 1:1, è necessaria una sola proteina per essere etichettata ai fini della purificazione. Tuttavia, alcuni SNX-BAR che normalmente formano eterodimeri nella cellula hanno dimostrato di formare omodimeri sotto concentrazioni non fisiologiche7. Pertanto, è fondamentale che dopo la purificazione dell'eterodimero, il rapporto stoichiometrico dei due SNX-BAR dovrebbe essere 1:1, che può essere verificato eseguendo un'aliquota del complesso purificato su un gel SDS-PAGE ed eseguendo la colorazione Coomassie. Una volta progettati, questi ceppi di lievito possono essere salvati in perpetuo come 15% (v/v) stock di glicerolo a -80 C e /o ulteriormente modificati per interrogare ulteriori partner di associazione. Il nostro flusso di lavoro richiede in genere 2-3 settimane per la costruzione di ceppi e 3-4 giorni per l'espressione e la purificazione e 1 giorno per i saggi di legame liposomano. Crediamo che questo flusso di lavoro possa aiutare i ricercatori a comprendere ulteriormente la specificità dei lipidi delle proteine SNX-BAR utilizzando proteine BAR native su liposomi sintetici o vescicle giganti di unilamellar (GUV) e rivelare l'esatta marcazione dei lipidi necessari per guidare il rimodellamento della membrana, rivelando così il loro meccanismo di azione.

Passaggi critici

Durante i nostri primi tentativi di purificare gli eterodimeri SNX-BAR da cellule carenti non proteasi, abbiamo spesso riscontrato rese ridotte e prodotti di degradazione. Pertanto, durante le fasi iniziali della costruzione del ceppo, crediamo che sia fondamentale iniziare con un ceppo di lievito parentale che è carente per una o più delle principali proteine vacuolare. In particolare, abbiamo trovato lievito ceppo TVY614, che è esaurito per pep4, prb1, e prc1, per essere il più ottimale. Utilizzando il ceppo TVY614, otteniamo regolarmente >90% puro Snx4-Atg20 eterodimeri(Figura 4 e Figura 5A). Tuttavia, la necessità di ablamele per tutte e tre le proteine può essere specifica della combinazione SNX-BAR. Ad esempio, gli eterodimeri Vps5-Vps17 sono stati purificati con successo in ceppi carenti non proteasi10 e quando abbiamo incluso l'aggiunta di un'ablazione PEP4, osserviamo modesti aumenti di resa e purezza (Figura 5A). Pertanto, a seconda delle applicazioni a valle dell'utente e della necessità di purezza o marcatori selezionabili, potrebbe esserci flessibilità durante la progettazione di ceppi di espressione.

Anche l'ordine di costruzione genica è importante. Si consiglia prima di codifica Tap C-terminale SNX-BAR ORF 1, al fine di confermare l'espressione da macchie occidentali senza la necessità di induzione galactose (Figura 1). Durante l'induzione del galactose, è fondamentale pre-condizionare le cellule durante la notte nel 2% raffinose e 0.1% glucosio. La mancata pre-condizionare le cellule provoca una crescita estremamente lenta o la morte cellulare. Tuttavia, è anche fondamentale per le cellule esaurire il glucosio rimanente durante la crescita durante la notte, altrimenti l'induzione galactose può essere influenzata negativamente. Si raccomanda inoltre di controllare più isolati da macchie occidentali per valutare l'omogeneità dell'espressione delle proteine SNX-BAR con tag TAP. Di solito lo schermo 2-3 isola e sceglie il candidato più robusto.

Modifica, approcci alternativi e applicazioni future

Nel passaggio 2.8, la purificazione dell'affinità tandem (TAP) richiede in genere una purificazione dell'affinità in due fasi utilizzando perle Igmoduli e caln dopo la scissione TEV12. Tuttavia, in questo protocollo, elutiamo i dimeri SNX-BAR da proteasi TEV con altissima resa e purezza. Troviamo la successiva purificazione dell'affinità utilizzando perline calmodulin produce rese incoerenti e ridotte, quindi si consiglia di fermarsi dopo la scissione TEV. L'eluato TEV contenente le proteine SNX-BAR e la sua proteasi TEV marcata possono essere ulteriormente purificate dalle perline di agarose Ni-NTA. Tuttavia, troviamo anche che questo passaggio può ridurre la resa complessiva delle proteine SNX-BAR ed è inutile, poiché la proteasi TEV non interferisce con i saggi di legame o tubazione. Pertanto, se la SNX-BAR purificata verrà utilizzata per qualsiasi altra applicazione, consigliamo all'utente di valutare l'impatto della proteasi TEV nei loro saggi.

Finora, siamo riusciti a utilizzare questo protocollo e le modifiche descritte per purificare gli eteromeri Snx4-Atg20 e Vps5-Vps17 nel lievito e abbiamo valutato con successo la loro specificità lipidica sui liposomi sintetici. Tuttavia, crediamo che il protocollo possa essere adattato con successo a qualsiasi SNX-BAR nel lievito. È anche possibile utilizzare il sistema per produrre proteine SNX-BAR ricombinanti da qualsiasi altro organismo. Tuttavia, ciò richiederebbe un ulteriore passo di costruzione del ceppo per integrare un locus genico esogeno nel genoma del lievito. Crediamo anche che il sistema possa essere ampliato per purificare i complessi multimerici, comprese le proteine del carico. Pertanto, crediamo che il nostro sistema di espressione possa estendersi oltre la comprensione che il lipido specifica di SNX-BAR. Le applicazioni future consentiranno ai ricercatori di ricostituire interi complessi di cattura del carico sui liposomi per capire come gli assemblaggi completi possono influenzare il rimodellamento della membrana.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of General Medical Sciences dei National Institutes of Health con il numero di premio GM060221 e in parte dall'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Salute sotto il numero premio T32GM007223. R.C. è stato sostenuto in parte dal PROGRAMMA UNC-Charlotte Faculty Research Grants.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm PC Membranes Avanti 610006
10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) Bio-Rad 731-1550
27 G needle BD Biosciences 301629
Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff Amicon UFC501024
Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer Avestin EF-C3
BCA assay Pierce 23225
Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Complete Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693116001
DOPC Avanti 850375
DOPS Avanti 840035
Ergosterol (Sigma) Sigma 47130-U
Extruder Set with Block 0.2 μL/1 mL Avanti 610000
FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV)
Glass culture tubes VWR 47729-570
IgG sepharose beads (GE Healthcare) GE Healthcare 17-0969-01
Microlter glass syringes Hamilton 7637-01
New Brunswick Excella E25 Eppendorf M1353-0000 or equivalent shaking 30 °C
Ni-NTA Magnetic Agarose Beads Pierce 78605
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94516
Parafilm M VWR 52858-076
PI3P Echelon P-3016 or Echelon equivalent
Polycarbonate bottle assembly Beckman Coulter 355622
TLA-100 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 343840
Type 45 Ti Rotor Beckman Coulter
Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve VWR 75871-436
Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) A&J Vacuum PN07050
Vortex with foam holder VWR 10153-838
VWR KIT MICROTUBE VWR 12620-880

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References

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  4. Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
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Genetica Numero 154 SNX-BAR purificazione endosoma fosfolipide lievito liposomi
Espressione, purificazione e rilegatura lipososo di eterodimeri SNX-BAR
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Ma, M., Goyal, S., Burd, C. G., Chi, More

Ma, M., Goyal, S., Burd, C. G., Chi, R. J. Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers. J. Vis. Exp. (154), e60413, doi:10.3791/60413 (2019).

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