Summary
Her presenterer vi en arbeidsflyt for uttrykk, rensing og liposome binding av SNX-BAR heterodimerer i gjær.
Abstract
SNX-BAR proteiner er en evolutionarily, bevart klasse av membran remodeling proteiner som spiller nøkkelroller i sortering og smugling av proteiner og lipider under endocytose, sortering i endosomal systemet, og autofagi. Sentralt i SNX-BAR protein funksjon er evnen til å danne homodimers eller heterodimerer som binder membraner ved hjelp av svært bevarte phox-homologi (PX) og BAR (bin/Amphiphysin/RVs) domener. I tillegg kan oligomerisering av SNX-BAR dimers på membraner lokke fram dannelsen av membran tubuli og blemmer, og denne aktiviteten er antatt å reflektere deres funksjoner som pels proteiner for endosome-avledet transport bærere. Forskere har lenge utnyttet in vitro bindende studier ved hjelp av rekombinant SNX-BAR proteiner på syntetiske liposomer eller gigantiske unilamellære blemmer (GUVs) for å avdekke presis makeup av lipider som trengs for å drive membran remodeling, og dermed avsløre deres virkningsmekanisme. Men på grunn av tekniske utfordringer med doble uttrykks systemer, toksisitet av SNX protein uttrykk i bakterier, og dårlig løselighet av individuelle SNX-BAR proteiner, har de fleste studier hittil undersøkt SNX-BAR homodimers, inkludert ikke-fysiologiske dimers som dannes underuttrykk i bakterier. Nylig har vi optimalisert en protokoll for å overvinne de store svakhetene ved en typisk bakteriell uttrykk system. Ved hjelp av denne arbeidsflyten demonstrerer vi hvordan du kan uttrykke og rense store mengder SNX-heterodimerer og hvordan du Rekonstituer dem på syntetiske liposomer for bindende og tubulation analyser.
Introduction
Membran-bundet organeller som plasma membranen, den endoplasmatiske retikulum, det Golgi apparatet, lysosome (gjær vacuole), og endosome utgjør endomembrane systemet av eukaryote cellen. De fleste organeller har evnen til å kommunisere og utveksle materiale med andre organeller gjennom vesicle transport bærere. Hvordan cellen koordinerer emballasjen og dannelsen av vesicle transport bærere innenfor endomembrane systemet er ikke godt forstått. Imidlertid er proteiner og lipider som utgjør mye av endomembrane systemet kjent for å stamme fra internalizing endocytic blemmer fra plasma membranen (PM). Endosome er den primære Acceptor organelle for disse blemmer og består av flere sammenkoblede sett av rørformede organeller. Den viktigste funksjonen til endosome er å lette nærings kjøp, regulere protein og lipid omsetning, beskytte mot patogen infeksjon, og å tjene som den primære påfyll av lipider for plasma membranen. Etter hvert som endosome mottar Hovedtyngden av Last proteiner og lipider fra plasma membranen, fungerer den som et sorterings rom ved å isolere cargos inn i rørformede endosomal transport bærere (ETCs). Alle proteiner som ikke er sequestered i ETCs, blir etterlatt for å bli degradert via Endo-lysosomal-systemet. Den feilregulering av Last sortering i ETCS kan føre til tap av næringsinnhold opptak, protein omsetning eller lipid homeostase, noe som resulterer i mange metabolske, utviklingsmessige, og nevrologiske lidelser1,2. Til tross for ETCs sentrale rolle ved endosome, kan imidlertid den underliggende mekanismen for hvordan endosome selektivt koordinerer emballasjen til en rekke heterogene cargos i rørformede bærere ikke er kjent.
The sortering nexin (SNX) familie er en evolutionarily bevart klasse av proteiner som har blitt funnet å være avgjørende for mange vesicle transport reaksjoner i cellen3,4,5. Sortering nexins er rekruttert til endosome membran og bistand i lasten fangst via deres karakteristiske phox homologi (PX) domene, som binder phosphatidylinositol-3-monofosfat (PtdIns (3) P), en lipid beriket på endosome membran. Pattedyr kode 33 SNX proteiner, som kan videre deles inn i flere underfamilier, i henhold til tilstedeværelsen av andre domener1. Mest spesielt er SNX-BAR gruppe den største gruppe bestående av tolv i menneske, mens i spirende gjær, Saccharomyces cerevisiae, gruppe er redusert til bare syv SNX-barer. SNX-BAR proteiner har både en PX domene og en bin-Amphiphysin-RVs (BAR) domene som utløser lipid reservoarer å binde positive krumning membraner. Følgelig SNX-BAR-familien har en naturlig affinitet for endosome og kan megle ETC formasjon via deres membran remodeling evner. In vitro, remodeling egenskapene til SNX-barer kan bli indusert ved tilsetning av renset SNX-barer til syntetiske liposomer og den påfølgende dannelsen av smale, belagt tubuli kan bli visualisere av elektron mikroskopi. Ved hjelp av disse metodene, har forskerne fastslått at både oligomerisering konsentrasjon og innsnevring styrke ser ut til å variere blant SNX-BAR familien antyder de kunne hjelpe i både dannelse og scission av ETCs.
Den SNX-barer kan bli ytterligere klassifisert av sine eksklusive dimerization egenskaper. Analyser og strukturelle studier har vist at SNX-BAR proteiner bare kan danne spesifikke homodimers eller heterodimerer. Derfor, i prinsippet, kan hver potensiell SNX-BAR dimer-oligomer gi en tubule pels for en Last-spesifikk menneskehandel sti og likeledes, den begrensede oligomerisering av de andre SNX-BAR protomers, kanne likeledes definere distinkte eksport trasé. Men på grunn av det store antallet SNX-barer og mangfoldet i SNX-familien, er det svært usannsynlig med én sorterings nexin-en Last hypotese. I stedet en koordinert innsats ved hjelp av en rekke faktorer som SNX-barer, Last, lipid spesifisitet og andre avhengigheter er mer sannsynlig. Likeledes, nyere studier av gjær SNX4 familien avdekket bevis for ekstra lipid spesifisitet, utover PtdIns (3) P, til forsterke endosome transport bærere6. I denne studien, SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1 ble renset fra bakterier og innfødte heterodimerer Snx4-Atg20 og Vps5-Vps17 ble uttrykt og renset i høy avkastning fra gjær, mens bare Snx4-Atg20 ble funnet å fortrinnsvis bind fosfatidylserin (PS) og danner smale rør-lignende strukturer i liposome bindende studier6. Mens andre i feltet har avdekket viktige egenskaper av SNX-barer bruker recombinantly renset SNX-bar homodimers fra bakterier, har toksisitet forbundet med å uttrykke SNX-bar heterodimerer i lignende systemer hindret deres innfødte karakterisering7,8,9,10. Derfor, uten et pålitelig system for å få rene recombinantly uttrykt innfødt heterodimerer, må forskerne avkall disse linjene av etterforskningen. I figur 1, presenterer vi en fire-del arbeidsflyt til 1) konstruere en gjær STAMME overexpressing SNX-bar heterodimerer for tandem affinitet rensing, 2) uttrykke og RENSE native SNX-bar heterodimerer, 3) forberede unilamellære syntetiske liposomer, og 4) sette opp en liposome tubulation eller sedimentations analysen, som gir et viktig verktøy for forskere å undersøke den voksende katalog av sortering nexins funnet i naturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. gjær stammekonstruksjon
- Begynn med TVY614 (pep4Δ:: LEU2 Prb1Δ:: HisG prc1Δ:: HIS3)11 som den overordnede belastningen. Denne belastningen er mangelfull for vacuolar proteaser, som bidrar til flertallet av protein degradering etter cellelyse, og derfor gir en renere og mer effektiv rensing.
- Design primere12 og integrere tandem affinitet rensing (tap) tag på C-Terminus av ATG20 (SNX-bar ORF 1) ved hjelp homologe rekombinasjon. Bruk polymerase kjedere reaksjon (PCR) for å bekrefte integrasjoner (figur 2).
- Utfør en vestlig blott av celle lysat mot TAP-taggen for å bekrefte riktig integrasjon13.
Merk: Vi anbefaler høsting 3 OD (1 OD ≈ 1 x 107 celler) av celler for SDS-side og Western Blot verifisering. Merk at integrering av TAP-koden bør skje før du erstatter den endogene arrangørene med GAL1 promoter å tillate enklere trykk tag verifisering via Western Blot. - Erstatt endogene Snx4 (SNX-BAR ORF1) og Atg20 (SNX-BAR ORF 2) arrangører med umerkede GAL1 arrangøren bruker sekvensiell homologe rekombinasjon og transformasjon trinn for hver enkelt ORF14.
- Bruk flankerer primere utenfor integrasjons stedene til PCR for å bekrefte vellykket integrasjoner (figur 2). Dette vil resultere i en null fenotype av målrettede SNX-barer i fravær av galaktose i vekstmedium.
2. gjær induksjon og SNX-BAR dimer rensing
Merk: Gjærceller kan spres på standard YPD (gjærekstrakt, peptone, og 2% glukose) agar plater som modifikasjoner er chromosomally integrert.
- Vaksinere en stor serviett med celler i 50 mL standard YP (gjærekstrakt og peptone) medium med 2% raffinose og 0,1% glukose som karbon kilde i en kolbe minst 4X volumet av kulturen og vokser over natten i 30 ° c shaker å tillate riktig lufting. Forvent at veksten i dette mediet vil bli tregere sammenlignet med standard YPD.
- Neste morgen, bruk 50 mL preculture til å vaksinere i 1 L standard YP medium med 2% raffinose og 0,1% glukose og vokse for 4-5 t i 30 ° c shaker.
Merk: Volumet av preculture som brukes til å vaksinere 1 L kultur kan justeres avhengig av OD600 av preculture. OD600 av 1 L kulturen etter inoculation bør være rundt 0,2 for å tillate minst to doublings under 4-5 h vekst.- Bruk en forbløffet fernbach kolbe for vekst for å tillate riktig lufting, en 2,8 L volum kolbe er tilstrekkelig. Mindre lufting kan føre til tregere vekst og mindre celle pellets ved høsting.
- Sjekk OD600 for å sikre at kulturen er i loggen fase (0,5-1) etter 4-5 h av vekst. Avhengig av veksten av belastningen, foreta justeringer vekst tid å tillate minst to doublings. Legg til 2% galaktose og vokse over natten i 30 ° c shaker.
Merk: OD600 etter over natten veksten kan variere, men kulturen skal være mettet. Merk at celler ikke trenger å bli fjernet fra 0,1% glukose før tillegg av 2% galaktose for denne veksten protokollen. Vi anbefaler høsting 3 OD av uninduced og indusert celler på dette trinnet for SDS-side og Western Blot for verifisering (Figur 3A, B, Lane 1-2). - Harvest celler ved sentrifugering på 4500 x g i 15 min. En svingende skuffe rotor som passer til volum kulturen på 1 L, kan brukes her.
- Overfør gjær pellet til en 50 mL konisk rør; andre sentrifugering trinn kan utføres etter behov. Celle pellet vil vanligvis være rundt 10-15 mL i volum målt ved eksamens markeringer og kan brukes umiddelbart eller oppbevares ved-80 ° c.
- Resuspend pellet i 15 mL rense buffer (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mm DITHIOTREITOL (DTT), protease inhibitor cocktail) for å gjøre det endelige volumet rundt 30 ml.
- Chill en homogenisator 4 ° c før bruk og likevekt den med rensing buffer. Lyse celler ved hjelp av en mekanisk celle disruptor eller homogenisator. Last prøven inn i homogenisator og lyse på 20000-25000 PSI for 2-3 runder; oppmerksom på at som celler blir lysert, mer input press er nødvendig for å opprettholde 20000-25000 PSI. Samle celle lysat i et 50 mL konisk rør på is.
Merk: Hvis det må lysert flere prøver, skal homogenisator rengjøres grundig og equilibrated før neste prøve. Hold alle celle lysater på isen. - Fjern umiddelbart celle lysat ved 35 000 x g for 1 t ved 4 ° c. Overfør supernatanten forsiktig inn i det nye røret. Merk at lipider fra cellelyse vil flyte til toppen under sentrifugering og vil ikke påvirke rensing.
Merk: Vi anbefaler å spare 0,5-1% av lysat og pellet for SDS-side prøver. Vanligvis er ingen store forskjeller observert og en ekstra Western Blot kan gjøres for å bekrefte TAP protein løselighet (Figur 4, Lanes 1 og 2, henholdsvis). - Likevekt 300 μL av IgG sepharose perler med rensing buffer. Legg til den tomme cellen lysat og ruge for 2 t, roterende ved 4 ° c.
- Samle perler i en 10 mL kromatografi kolonne og la ubundne lysat å strømme gjennom.
- Vask perler med 10 mL vaskebuffer (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mm DTT), legger til 1 ml av gangen og tillater det å strømme gjennom helt.
Merk: Vi anbefaler å spare 2% av Bound-IgG perler for SDS-side sample. Vanligvis observerer vi fire store band; to SNX proteiner og IgG Heavy og Light kjeder (Figur 4, Lane 3). Vi anbefaler at du sparer tilsvarende mengder "eluatet" og "IgG-perler etter TEV" for å sammenligne TEV. - Samle perler og overføre dem til en mikrosentrifugen tube. Legg til 500 μL av total volum med frisk vaskebuffer og 2 μL av 10 mg/mL TEV protease og ruge over natten, roterende ved 4 ° c.
- Neste morgen, fjerne supernatanten helt ved hjelp av en 27 G nål og vurdere protein renhet med 10% polyakrylamid SDS-side (Figur 4, Lane 4).
Merk: Vi får vanligvis 500 μL av 0,5-1 mg/mL 95% ren heterodimer (Figur 4, Lane 4). Ytterligere rensing bruker calmodulin harpiks kan også gjøres, men vi vanligvis ser en betydelig reduksjon i utbytte og anbefaler å stoppe her hvis renhet er > 90%. TEV ikke forstyrrer liposome bindende analyser, men TEV kan i tillegg fjernes ved hjelp av ni-NTA agarose perler15. - For å konsentrere deg, overfører du prøven til et 0,5 mL sentrifugal filter med 10 KDa-grense og sentrifuger i henhold til produsentens anvisninger til 50 μL eller mindre. Kvantifisere de konsentrerte proteinene ved hjelp av Bradford protein analysen. Oppbevares ved 4 ° c og brukes innen en uke.
3. liposome forberedelse
- Kjøp kommersielt tilgjengelige lipider: fosfatidylserin (PS), PI3P, ergosterol og phosphatidylcholine (PC). Om nødvendig, resuspend i anbefalt løsningsmiddel for å gjøre lager lipider.
Merk: Lipider er resuspendert i en metanol/kloroform blanding per produsentens anbefalinger. Kontroller at lipid aksjer er klare og varmet til romtemperatur før du bruker. Resuspendert lipider kan oppbevares under Argon-gass og forseglet ved hjelp av voks film (eller tilsvarende) ved-20 ° c i 6-12 måneder eller til tap av aktivitet er observert. - Beregn volumet som kreves av hvert lipid lager for å lage en blanding med ønsket lipid sammensetning (se tabell 1). Anta totalt 1 muldvarp av lipider i lipid blandingen.
- Utfør dette trinnet i en kjemisk avtrekks hette. Rengjør glass sprøyter ved å trekke opp et fullt sprøyte volum av kloroform og kaste det i en avfallsbeholder. Gjenta to ganger til. Ved overføring av kloroform, bruk kun glass sprøyter eller pipetter. Når du tegner opp kloroform, må du trekke i proppen langsomt for å forhindre at gassbobler blir introdusert i sprøyten.
- Bruk glass sprøyter for å overføre lager lipider som beregnet til et rent glass kultur rør for å lage en endelig lipid blanding av 1% PI3P% ergosterol, 30% PS, PC (tabell 1). Avhengig av løsemidler hver lipid er resuspendert i, blandingen kan slå skyet ved tilsetning av hver lipid.
Merk: For å variere konsentrasjonen av PS (0-30%), justere volumer tilsvarende og kompensere med varierende PC (tabell 1). - Forsiktig tørke ned lipid blandingen ved hjelp av nitrogen gass rettet mot lipid blandingen i en sirkulær bevegelse for å tørke lipider jevnt. Bruk lav gass strømning for å holde lipider på bunnen av glassrøret under tørkeprosessen. Pakk glasset kultur rør med folie, forlater åpningen avdekket, og ytterligere tørke i vakuum for 1 t.
- Tilsett 400 μL av bindings buffer (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2) for å fullstendig tørke lipider for å lage en endelig liposome konsentrasjon på 2,5 mm.
Merk: Endelig liposome konsentrasjon kan justeres ved å legge til mer eller mindre bindende buffer. 200 μL bindings buffer kan for eksempel tilsettes for å produsere en liposome konsentrasjon på 5 mM ved behov (se nedenfor).- Resuspend lipider ved risting på middels hastighet på en Vortex ved romtemperatur i 30 min. buffer skal vises skyet som lipider er resuspendert.
- Overfør resuspendert liposomer til et mikrosentrifugen rør. Fra dette punktet, kan plast pipette brukes som lipider er ikke lenger resuspendert i kloroform. Vær oppmerksom på at den liposome løsningen skal se uklar ut.
- Frys-Tin liposomer syv til åtte ganger ved submerging den mikrosentrifugen røret først i flytende nitrogen, deretter i en 37 ° c vannbad. Den liposome blandingen skal vises helt frosset og solid av øyet før tine.
- Utfør trinn som involverer kloroform i en kjemisk avtrekks hette. Rengjør to 1 mL glass sprøyter ved å trekke opp og kaste full sprøyte volumer av kloroform, tre ganger hver, for å fjerne eventuelle rester av lipider. Likevekt hver glass sprøyte med ultrarent vann ved å trekke opp to sprøyte volumer, og likevekt deretter med bindings buffer ved å utarbeide to sprøyte volumer.
- Monter mini-Ekstruder i henhold til produsentens anbefalinger. Likevekt 1 200 NM membran og to stykker av filter støtter (se tabell over materialer) ved submerging hver i bindende buffer.
- Smørbrødet membranen mellom filteret støtter og plasser i mini-Ekstruder. For å redusere de døde volum i den sammensatte mini-Ekstruder og for å sikre at forsamlingen er lufttett, passerer et volum av bindende buffer sammenlignes med volumet av liposome blandingen gjennom mini-Ekstruder ved hjelp av 1 mL glass sprøyter.
- Bruk en av 1 mL glass sprøyter og trekk opp liposome blandingen. Vend mikrosentrifugen røret for å samle den siste av liposome blandingen i rør lokket for å trekke opp i glass sprøyten.
- Extrude liposomer ved å passere gjennom 200 NM membran 19-21 ganger. Samle ekstrudert liposomer i et nytt mikrosentrifugen rør.
Merk: Ekstrudert liposomer skal vises mindre skyet enn liposomer før ekstrudering. Liposomer bør brukes samme dag og lagres på is. Den siste ekstrudering bør plassere liposomer i sprøyten motsatt av den som den begynte i.
4. SNX-BAR liposome binding og Tubulation
- Preclearens renset protein ved 100 000 x g i en ultracentrifuge i 20 min ved 4 ° c før gjennomføring liposome binding og sedimentering eksperimenter. Fjern supernatanten og overfør den til en ny mikrosentrifugen tube; ikke forstyrr pellet hvis det er en.
- For å utføre liposome bindende og tubulation analyser, ruge 4 μM renset Snx4-Atg20 og 2,5 mM liposomer i et total reaksjons volum på 20 μL, varierende volum av liposomer lagt til.
Merk: I samme eksperiment bør samme volum av liposomer brukes. - Ruge reaksjonen ved 30 ° c i 30 min.
Merk: Vi foreslår at du maksimerer mengden av 2,5 mM liposomer til hver reaksjon ved å bruke ikke mindre enn 10 μL liposomer for å muliggjøre visualisering under sedimentering. Hvis 10 μL av 2,5 mM liposomer brukes i en 20 μL reaksjon, vil den endelige konsentrasjonen av liposomer være 1,25 mM. Hvis renset proteiner er fortynnet og mer volum kreves for 4 μM protein, kan lipider bli resuspendert i 200 μL under rehydrering trinn for å doble konsentrasjonen av liposomer (se trinn 3,6); Dette vil imidlertid kreve å kjenne protein konsentrasjonen før du gjør liposomer. -
Visualiser og kvantifisere liposome tubulation.
- Behandle liposome bindende reaksjoner umiddelbart for elektron mikroskopi analyse. Spot prøver på en karbon-belagt kobber mesh Grid og negativ flekk med 1% uranylnitratet acetate (figur 5B)16.
- Analyser prøver på et overførings elektronmikroskop (200 kV).
- Bruk bildeanalyse programvare for å måle og kvantifisere tubule diameter. For å nøyaktig kvantifisere tubule diameter på en enkelt tubule, ta tre diameter målinger langs lengden av en tubule og gjennomsnittlig (figur 5B).
Merk: Toveis analyse av varians ble brukt til å bestemme statistisk betydning (figur 5E). Uranylnitratet acetate er både radioaktivt og giftig. Riktig sertifisering av laboratorie sikkerhet kreves for å utføre dette trinnet.
-
Liposome bindende og sedimentering.
- Overfør reaksjonen (20 μL, fra trinn 4,3) til en polykarbonat sentrifuge slange og bruk en kompatibel rotor til å spinne ved 100 000 x g i en ultracentrifuge i 20 min ved 4 ° c. Fjern forsiktig supernatanten og Overfør til nytt mikrosentrifugen rør. Merk at pellet skal være intakt.
- Resuspend pellet i SDS-PAGE 40 μL av prøve buffer og overføring til et nytt mikrosentrifugen rør. Tilsett 20 μL av prøve buffer i supernatanten. Last tilsvarende mengder pellet og supernatanten i en 10% polyakrylamid SDS-side gel og utfør Coomassie farging for å visualisere SNX-BARs bundet til liposomer (figur 5a).
- For å kvantifisere mengden av SNX-kompleks i pellets fraksjonen, kvantifisere bånd intensitet ved hjelp av densitometri og kvantifisere andelen av proteiner av SNX i pellets fraksjonen.
Merk: Toveis analyse av varians ble brukt til å bestemme statistisk betydning (figur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver en metode for reproduserbar og robust produksjon av endogene gjær SNX-BAR komplekser som kan brukes til nedstrøms membran remodeling analyser (figur 1). Byggingen av gjær belastningen som brukes for rensing utnytter effektiviteten av homologe rekombinasjon i spirende gjær, noe som åpner for modifikasjoner på genomisk Loci av målrettede SNX-barer (figur 2). Denne designen har to fordeler, (i) som utvalg er ikke nødvendig for å opprettholde modifikasjoner, standard YP medium kan brukes, slik at for vekst til en høyere celle tetthet og dermed høyere produksjon av protein og (II) uttrykket nivåer av målrettede SNX-barer vil være enda, optimalisere produksjonen av heterodimer komplekse. Før tilsetting av galaktose, den målrettede SNX-barer vil vise en null fenotype og dermed kan føre til en vekst defekt eller andre kjente defekter som er spesifikke for målrettede SNX-barer. Videre er veksten i 2% raffinose og 0,1% glukose tregere enn vekst i 2% glukose. Derfor kan vekstperioden før galaktose induksjon krever optimalisering for hver enkelt belastning. Å sjekk for lated induksjon av SNX-stang gjengivelsen, en vest flekk imot det TAP tag er sikkert krevde siden protein høyder av det SNX-BARs kanskje ikke være oppdaget via Coomassie flekk (skikkelsen 3). Men, fordi bare ett medlem av SNX-BAR kompleks har en kode, uttrykk for umerkede protein (s) kan ikke bekreftes med mindre alle trinn av rensing er fullført. Etter rensing av SNX-BAR heterodimer, bandene av de to SNX-barer skal synes å være i 1:1 stochiometric ratio og det bør være liten eller ingen forurensende band (Figur 4, Lane 4). Hvis det er flere forurensende band, og start gjær belastningen er allerede protease, kan mer protease inhibitor tilsettes under cellelyse. Videre kan en andre rensing trinn ved hjelp av calmodulin harpiks utføres.
Når du gjennomfører membran remodeling analyser (figur 5), må den samme forberedelsen av liposomer og renset proteiner brukes i det samme eksperimentet. Hvis flere rensing preparater av protein er nødvendig for å nå ønsket konsentrasjon, kombinere alle protein renset før gjennomføre eksperimentet. Liposomer bør lages og brukes innen samme dag (tabell 1). Når gjennomfører liposome sedimentering analyser, det er en betenkelig det det renset protein er precleared benytter det likt sedimentering vilkårene av 100 000 x g for 20 min like før incubating med liposomer idet igangsatte protein kanskje skew resultater. Videre bør liposome pellet forbli intakt etter sedimentering.
Figur 1: SNX-bar bindende analysen flyt diagram. Kort, i trinn 1-2, vi ingeniør GAL arrangører i to SNX-BAR genomisk Loci, erstatte hver av endogene arrangører og ingeniør en C-terminal TAP tag i en av de to SNX-BAR Loci. Deretter, i trinn 3-7, induserer vi cellene med galaktose og renser SNX-BAR heterodimerer til homogenitet. I trinn 8-12 beregner og klargjør vi unilamellære liposomer. Til slutt kan vi kombinere SNX-BAR-heterodimerer med unilamellære liposomer og utføre to analyser; Trinn 14a-16A innebære membran tubulation og 14b-16A innebære sedimentering analysen. Se tekst for flere detaljer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: integrerings strategi for SNX-bar. To SNX-BAR-Loci ble rettet mot GAL-uttrykk ved hjelp av homologe rekombinasjon. SNX-BAR ORF1 (Atg20) ble i tillegg målrettet for å uttrykke en C-terminal TAP-kode. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: galaktose induksjon verifisering. (A-B) For å verifisere GAL induksjon av Atg20-TAP, anbefaler vi en SDS-side og Western Blot analyse av celle ekstrakter indusert med 2% galaktose (A, B, Lane 2) og uninduced (A, B, Lane 1). (C) Western Blot membran er også strippet og analysert med anti-pgk1 for en lasting kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: eksempel rensing av Atg20-Snx4 heterodimerer. Gjærceller konstruert for å uttrykke Atg20-TAP og Snx4 drevet av galaktose arrangører ble indusert med 2% galaktose, lysert og bundet ved hjelp av IgG-sepharose, og eluert med TEV protease. Prøver fra hvert trinn av rensing er vist i 10% SDS-side. Lane 1: indusert supernatanten av lysat. Lane 2: indusert pellet av lysat. Lane 3: utvalg av bundne proteiner til IgG-sepharose. Lane 4: TEV eluatet av ren Atg20-Snx4 heterodimerer fra IgG-sepharose. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representative liposome bindende og tubulation analysen. (A) SNX-bar heterodimerer, Atg20-Snx4 og Vps5-Vps17 fra gjær, ble uttrykt, renset, og bundet til syntetiske liposomer som beskrevet i teksten. Merk at Mvp1 former homodimers og ble uttrykt i bakterier. (B) EM micrographs av Snx4-Atg20 liposome tubulation analysen og tubule målinger (innfelt). (C) SNX-binding til varierende liposome komposisjoner ble kvantifisert av densitometri. Graph indikerer middelverdi og standard feil av gjennomsnittet. * * p < 0,002. (D) tubule diametre ble kvantifisert og grafisk som beskrevet i teksten. Scale bar = 200 NM. Feilfelt representerer toveis analyse av varians. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Typisk liposome sammensetning | DOPC | DOPS | Ergosterol | PI3P-C16 |
| Mw | 786,1 | 810,0 | 396,7 | 957,0 |
| mol brøkdel | 49 prosent | 30 | 20 | 1 |
| Lager mM | 32,0 | 12,0 | 25,0 | 1,0 |
| Mass (mg) | 385,2 | 243,0 | 79,3 | 9,6 |
| Konsentrasjon (mg/mL) | 25,2 | 9,7 | 9,9 | 1,0 |
| Volum til RXN (mL) | 15,3 | 25,0 | 8,0 | 10,0 |
Tabell 1: liposome oppskrift. Syntetiske liposomer ble fremstilt ved hjelp av en kombinasjon av DOPC, DOPS, ergosterol og PI3P. Vi beregner den endelige konsentrasjonen til 1 mol av lipid. Vår standard sammensetning omfatter 20% ergosterol, 1% PI3P, DOPS (opptil 30%) og varierende mengder DOPC. Tabell inkluderer en typisk formulering for 400 μL av 30% DOPS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi en optimalisert arbeidsflyt for å rense SNX-BAR-dimers i gjær og to analyser for å evaluere sine Biofysiske egenskaper på syntetiske liposomer. Den største fordelen over typiske rekombinant protein uttrykk i Escherichia coli eller andre systemer er evnen til å uttrykke SNX-bar proteiner i en innfødt vert, og dermed unngår toksisitet og uoppløselig problemer som finnes i rensende SNX-barer i andre systemer. Det er også bemerkelsesverdig at systemet ikke krever molekylær kloning eller harboring av flere uttrykk vektorer17. Våre Dual SNX-BAR gjær stammer er drevet av chromosomally konstruert galaktose arrangører, og dermed sikre selv uttrykk ved induksjon. En viktig faktor er at i fravær av galaktose, vil det være liten eller ingen uttrykk for målrettede SNX-barer, og dermed resulterer i en null fenotype. Videre finner vi at SNX-barer har en tendens til å tolerere C-terminal koder godt, slik at vi kan legge til TAP-koden på C-Terminus. Men avhengig av proteinet som merkes, kan en N-Terminal TAP-kode også brukes12. I tillegg, siden SNX-barer bare form 1:1 dimers, bare ett protein er nødvendig for å være tagget for rensing formål. Noen SNX-stolper som vanligvis danner heterodimerer i cellen, er imidlertid vist å danne homodimers under ikke-fysiologiske konsentrasjoner7. Derfor er det avgjørende at ved rensing av heterodimer, støkiometriske forholdet mellom de to SNX-barer bør være 1:1, som kan verifiseres ved å kjøre en alikvot av renset kompleks på en SDS-side gel og utføre Coomassie farging. Når konstruert, kan disse gjær stammer lagres i det uendelige som 15% (v/v) glyserol lager ved-80 ° c og/eller i tillegg endret til å spørre ytterligere bindende partnere. Vår arbeidsflyt tar vanligvis 2-3 uker for belastning konstruksjon og 3-4 dager for uttrykk og rensing og 1 dag for liposome bindende analyser. Vi tror at denne arbeidsflyten kan hjelpe forskerne videre forstå lipid spesifisitet av SNX-BAR proteiner bruker native BAR proteiner på syntetiske liposomer eller gigantiske unilamellære blemmer (GUVs) og avslører presis makeup av lipider som trengs for å drive membran remodeling, og dermed avsløre deres virkningsmekanisme.
Kritiske trinn
Under vårt første forsøk på rensing SNX-BAR heterodimerer fra ikke-protease mangelfull celler, vi ofte funnet redusert avkastning og fornedrelse produkter. Derfor, i løpet av de første trinnene i belastningen konstruksjon, tror vi det er avgjørende å begynne med en foreldrenes gjær stamme som er mangelfull for en eller flere av de store vacuolar proteinaser. Spesielt fant vi gjær stamme TVY614, som er utarmet for pep4, prb1, og prc1, å være den mest optimale. Ved hjelp av TVY614-belastningen får vi rutinemessig > 90% ren Snx4-Atg20-heterodimerer (Figur 4 og figur 5A). Imidlertid kan nødvendigheten for alle tre proteinaser være ablated være SNX-BAR kombinasjon spesifikke. For eksempel har Vps5-Vps17 heterodimerer blitt renset i ikke-protease mangelfull stammer10 og når vi inkluderte tillegg av en PEP4 ablasjon, observerer vi beskjedne økninger i utbytte og renhet (figur 5a). Derfor, avhengig av brukerens nedstrøms applikasjoner og behovet for renhet eller valgbar markører, kan det være fleksibilitet ved utforming uttrykk stammer.
Rekkefølgen av gen konstruksjonen er også viktig. Vi anbefaler C-uhelbredelig TAP tagging SNX-BAR ORF 1 først, for å bekrefte uttrykk av Western Blot uten behov for galaktose induksjon (figur 1). Under galaktose induksjon, er det avgjørende å pre-condition cellene over natten i 2% raffinose og 0,1% glukose. Unnlatelse av å pre-condition cellene resulterer i ekstremt langsom vekst eller celle død. Det er imidlertid også avgjørende for cellene å tømme gjenværende glukose under overnight vekst, ellers galaktose induksjon kan bli negativt påvirket. Det anbefales også å sjekke flere isolerer ved Western Blot å evaluere uttrykket homogenitet av TAP merket SNX-BAR proteiner. Vi vanligvis skjermen 2-3 isolere og hakke de fleste robust uttrykker kandidaten.
Modifisering, alternative tilnærminger og fremtidige bruksområder
I trinn 2,8 krever vanligvis tandem affinitet rensing (TAP) en to-trinns affinitet rensing ved hjelp av IgG og calmodulin perler etter TEV kløft12. Men i denne protokollen, eluere vi SNX-BAR dimers av TEV protease med svært høy avkastning og renhet. Vi finner påfølgende affinitet rensing bruker calmodulin perler produserer inkonsekvent og redusert avkastning, og dermed anbefaler vi å stoppe etter TEV kløft. Den TEV eluatet inneholder SNX-BAR proteiner og hans (6)-Tagged TEV protease kan bli ytterligere renset med ni-NTA agarose perler. Men vi finner også dette trinnet kan redusere samlede SNX-BAR protein yield og er unødvendig, siden TEV protease ikke forstyrrer liposome bindende eller tubulation analyser. Derfor, hvis renset SNX-barer vil bli brukt til andre programmer, anbefaler vi at brukeren vurdere virkningen av TEV protease i sine analyser.
Så langt har vi vært vellykket ved hjelp av denne protokollen og de beskrevne modifikasjoner for å rense Snx4-Atg20 og Vps5-Vps17 heterodimerer i gjær og har med hell vurdert sine lipid spesifisitet på syntetiske liposomer. Men vi tror at protokollen kan med hell tilpasses noen av SNX-barer i gjær. Det er også mulig å bruke systemet til å produsere rekombinant SNX-BAR proteiner fra alle andre organismer. Men dette ville kreve et ekstra trinn av belastningen konstruksjon for å integrere en eksogene genet geometrisk inn i gjær Genova. Vi tror også at systemet kan utvides til å rense multimeric komplekser inkludert Last proteiner. Derfor tror vi vårt uttrykk systemet kan strekke seg utover forstå lipid spesifiserer av SNX-barer. Fremtidige søknader vil tillate forskere å Rekonstituer hele lasten fangst komplekser på liposomer å forstå hvordan full forsamlinger kan påvirke membran remodeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health under pris nummer GM060221 og delvis av National Institute of General Medical Sciences i National Institutes av helse under tildeling nummer T32GM007223. R.C. ble støttet delvis av UNC-Charlotte fakultet Research Grants program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 G needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| Ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 μL/1 mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 °C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 |
References
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
