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Bioengineering

केमोटेक्टिक सामूहिक प्रवास के लिए माइक्रोफ्लूइडिक्स के साथ एकीकृत ट्रैक्शन माइक्रोस्कोपी

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/60415
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1
1Department of Biomedical Sciences, Korea University, 2Department of Mechanical Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3Department of Environmental Health, Harvard T.H. Chan School of Public Health

Summary

विकास में सामूहिक सेल प्रवास, घाव भरने, और कैंसर मेटास्टेसिस अक्सर विकास कारकों या संकेत अणुओं की ढाल द्वारा निर्देशित है। यहाँ वर्णित एक प्रयोगात्मक प्रणाली एक microfluidic प्रणाली के साथ कर्षण माइक्रोस्कोपी के संयोजन और कैसे जैव रासायनिक ढाल के तहत सामूहिक प्रवास के यांत्रिकी परिमाणित करने के लिए एक प्रदर्शन है.

Abstract

कोशिकाएँ रासायनिक उद्दीपकों के प्रक्रिया के प्रत्युत्तर में प्रवास पैटर्न परिवर्तित करती हैं, जिसमें उद्दीपकों की प्रवणता भी शामिल होती है। एक रासायनिक ढाल की दिशा में सेलुलर प्रवास, chemotaxis के रूप में जाना जाता है, विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, घाव भरने, और कैंसर मेटास्टेसिस. जबकि chemotaxis एकल कोशिकाओं के प्रवास के साथ ही विवो में कोशिकाओं के संग्रह modulates, इन विट्रो अनुसंधान एकल सेल chemotaxis पर केंद्रित है, आंशिक रूप से उचित प्रयोगात्मक उपकरणों की कमी के कारण. उस अंतर को भरने के लिए, यहाँ वर्णित एक अद्वितीय प्रयोगात्मक प्रणाली है कि microfluidics और micropatterning को जोड़ती है सामूहिक सेल प्रवास पर रासायनिक gradients के प्रभाव को प्रदर्शित करता है. इसके अलावा, कर्षण माइक्रोस्कोपी और मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी को सिस्टम में शामिल किया जाता है ताकि सब्सट्रेट पर सेलुलर बल में परिवर्तन के साथ-साथ पड़ोसी कोशिकाओं के बीच भी शामिल किया जा सके। सबूत के अवधारणा के रूप में, Madin-Darby कैनाइन गुर्दे (MDCK) कोशिकाओं के micropatterned परिपत्र द्वीपों के प्रवास hepatocyte विकास कारक (HGF), एक ज्ञात प्रकीर्णन कारक की एक ढाल के तहत परीक्षण किया है. यह पाया गया है कि HGF के उच्च एकाग्रता के पास स्थित कोशिकाओं को एक सेल द्वीप के भीतर विपरीत पक्ष पर उन लोगों की तुलना में तेजी से माइग्रेट. एक ही द्वीप के भीतर, सेलुलर कर्षण दोनों पक्षों पर समान है, लेकिन intercellular तनाव उच्च HGF एकाग्रता के पक्ष में बहुत कम है. इस उपन्यास प्रयोगात्मक प्रणाली सेलुलर सामूहिक द्वारा chemotactic प्रवास के यांत्रिकी का अध्ययन करने के लिए नए अवसर प्रदान कर सकते हैं.

Introduction

जैविक प्रणालियों में सेलुलर प्रवास एक मौलिक घटना ऊतक गठन में शामिल है, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया , और घाव भरने1,2,3. कैंसर4जैसे कुछ रोगों में सेलुलर प्रवास भी एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है . कोशिकाएं प्रायः अलग-अलग के बजाय समूह के रूप में प्रवास करती हैं, जिसे सामूहिक कोशिका प्रवास4,5के रूप में जाना जाता है . कोशिकाओं के लिए सामूहिक रूप से स्थानांतरित करने के लिए, microenvironment के संवेदन आवश्यकहै 6. उदाहरण के लिए, कोशिकाओं physicochemical उत्तेजनाओं अनुभव और गतिशीलता बदलने के द्वारा प्रतिक्रिया, सेल-सब्सट्रेट बातचीत, और सेल सेल बातचीत, एक रासायनिक ढालकेसाथ दिशात्मक प्रवास में जिसके परिणामस्वरूप7 ,8, 9,10. इस संबंध के आधार पर प्रयोगशाला-ऑन-ए-चिप प्रौद्योगिकियों में तेजी से प्रगति की गई है जो अच्छी तरह से नियंत्रित रासायनिक सूक्ष्म वातावरण बना सकती हैं जैसे कि एक रसायन-उत्कर्ष11,12,13 . जबकि इन प्रयोगशाला पर एक चिप आधारित microfluidics पहले सेलुलर पहनावा या सेलुलर गोलोइड के chemotaxis अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है14,15,16,17, वे ज्यादातर एकल कोशिका प्रवास18,19,20,21के संदर्भ में इस्तेमाल किया गया है . रासायनिक ढाल के लिए एक सेलुलर सामूहिक प्रतिक्रिया अंतर्निहित तंत्र अभी भी अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहा है14,22,23,24,25,26 . इस प्रकार, एक मंच है कि घुलनशील कारकों के spatiotemporal नियंत्रण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं के जैवभौतिक के situ अवलोकन में सक्षम बनाता है के विकास के लिए सामूहिक सेल प्रवास के पीछे तंत्र को जानने में मदद मिलेगी.

विकसित और यहाँ वर्णित एक मल्टी चैनल microfluidic प्रणाली है कि घुलनशील कारकों की एकाग्रता ढाल है कि पैटर्न सेल समूहों के प्रवास modulates की पीढ़ी सक्षम बनाता है. इस अध्ययन में, हेपेटोसाइट विकास कारक (एचजीएफ) को मदिन-डार्बी के गुर्दे (एमडीसीके) कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार को विनियमित करने के लिए चुना जाता है। HGF सेल सेल अखंडता क्षीण और कोशिकाओं की गतिशीलता बढ़ाने के लिए जाना जाता है27,28. microfluidic प्रणाली में, फूरिये रूपांतरण कर्षण माइक्रोस्कोपी और मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी भी शामिल कर रहे हैं, जो गतिशीलता के विश्लेषण की अनुमति देता है, संकुचन बल, और एक HGF के जवाब में घटक कोशिकाओं द्वारा प्रेरित intercellular तनाव ग्रैडिएंट. एक ही द्वीप के भीतर, HGF के उच्च एकाग्रता के पास स्थित कोशिकाओं तेजी से माइग्रेट करें और कम HGF एकाग्रता के साथ पक्ष पर उन लोगों की तुलना में कम intercellular तनाव के स्तर को दिखाने. परिणाम ों का सुझाव है कि इस नई प्रयोगात्मक प्रणाली विभिन्न घुलनशील कारकों के रासायनिक gradients के तहत सामूहिक सेलुलर प्रवास को शामिल क्षेत्रों में अन्य सवालों का पता लगाने के लिए उपयुक्त है.

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Protocol

नोट: स्टेंसिल के लिए एसयू-8 मोल्ड्स की लिथोग्राफी (थिकनेस $ 250 डिग्री मी) और माइक्रोचैनल भागों (थिकनेस $ 150 डिग्री मी), कांच नक्षल (गहराई $ 100 डिग्री मी), और कलाकारों को निर्माताओं को कंप्यूटर-सहायता प्राप्त डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डिजाइन भेजकर आउटसोर्स किया गया था।

1. पॉलीडिमेथिलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) स्टेंसिल और माइक्रोचैनल का निर्माण

  1. स्टेंसिल और माइक्रोचैनल के माइक्रोपैटर्न को डिज़ाइन करें।
  2. Fabricate या आउटसोर्स SU-8 मोल्ड (stencils के लिए $250 $m की मोटाई और microchannels के लिए $ 150 $m) सिलिकॉन वेफर्स (4 " व्यास) पर.
  3. 10:1 के अनुपात में आधार इलेस्टोमर और इलाज एजेंट को मिलाकर पीडीएमएस मिश्रण तैयार करें।
    1. एक 50 एमएल शंकु नली में बेस इलेस्टोमर के 15 एमएल रखें और 1.5 एमएल का इलाज एजेंट जोड़ें। इनमें से दो को तैयार की।
    2. बुलबुले को दूर करने के लिए 1 मिनट के लिए 196 x ग्राम पर PDMS मिश्रण 5 मिनट के लिए PDMS मिश्रण भंवर.
  4. PDMS स्टेंसिल बनाने के लिए, वेफर पर पीडीएमएस मिश्रण का 1 एमएल डालना, जबकि एसयू-8 पैटर्न वाले क्षेत्रों से परहेज करें ताकि पीडीएमएस एसयू-8 स्तंभों के पक्ष को छू सके, लेकिन एसयू-8 पैटर्न के शीर्ष को नहीं छूता है।
    1. कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट से अधिक के लिए एक फ्लैट सतह पर वेफर रखें। 2 डिग्री से अधिक के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एक सूखी ओवन में PDMS इलाज।
    2. एसयू-8 मोल्ड से पीडीएमएस को सावधानी से छील ें और 14 मिमी खोखले पंच का उपयोग करके पतली पीडीएमएस झिल्ली को ट्रिम करें। चिपचिपा टेप का उपयोग कर PDMS टुकड़े की सतह पर धूल निकालें और PDMS स्टेंसिल ऑटोक्लेव.
  5. PDMS microchannel बनाने के लिए, SU-8 मोल्ड पर PDMS मिश्रण के 30 एमएल डालना.
    1. एक वैक्यूम कक्ष में 30 मिनट के लिए Degas और 2 से अधिक $ 2 एच के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एक सूखी ओवन में PDMS इलाज।
    2. ध्यान से SU-8 मोल्ड से PDMS छील और 24 मिमी x 24 मिमी के आकार के लिए PDMS में कटौती. प्रत्येक PDMS ब्लॉक में, एक 1 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग कर एक दुकान और तीन inlets बनाएँ.

2. polyacrylamide (पीए) जेल के साथ नीचे कांच की तैयारी

  1. उत्पादन या आउटसोर्स आयताकार स्लाइड चश्मा (24 मिमी x 24 मिमी x 1 मिमी) एक आयताकार माइक्रो-वेल के साथ (6 मिमी x 12 मिमी, 100 डिग्री गहराई29) काटने और चश्मे को चने से।
  2. नीचे के काँच की सतह30को सिलाना ।
    1. 200 एमएल deionized पानी (DIW), एसिटिक एसिड के 80 डिग्री एल, और 3 के 50 डिग्री एल (trimethoxysilyl) प्रोपिल मेथाक्रिलेट (TMSPMA) 1 एच के लिए मिश्रण द्वारा एक बाइंड silane समाधान तैयार करें।
      चेतावनी: TMSPMA एक दहनशील तरल है. सामग्री सुरक्षा डेटा शीट में सिफारिशों का पालन करें. केवल एक रासायनिक धूआं हुड में प्रयोग करें।
    2. चिपचिपा टेप द्वारा कांच की सतह से धूल निकालें और कांच को ऑटोक्लेव करें।
    3. बाइंड silane समाधान के 100 $L के साथ नीचे के गिलास के etched सतह कवर और 1 ज के लिए आरटी पर गिलास छोड़ दें।
    4. DIW 3x के साथ कांच कुल्ला और कांच परिवेश हवा के तापमान पर या हवा उड़ाने से सूखी करते हैं।
  3. पीए जेल31के लिए एक जेल समाधान तैयार करें।
    1. DIW के 1 एमएल में एपीएस के 5 मिलीग्राम भंग करके 0.5 % (w/v) अमोनियम persulfate (एपीएस) का एक नया समाधान तैयार करें।
    2. पीए जेल समाधान तैयार करें जिसमें 40% ऐक्रिलमाइड समाधान का 138 डिग्री सेल्सियस, 2% बिस्-ऐक्रिलमाइड समाधान का 101 $L, फ्लोरोसेंट कण समाधान (0.2 डिग्री मी) का 5 डिग्री सेल्सियस, और DIW का 655 डिग्री सेल्सियस शामिल है।
      चेतावनी: Acrylamide और bisacrylamide समाधान विषाक्त कर रहे हैं. सुरक्षात्मक दस्ताने, कपड़े, और आंख संरक्षण पहनें। प्रकाश से फ्लोरोसेंट कणों युक्त पीए जेल समाधान को सुरक्षित रखें।
      नोट: बैच प्रति फ्लोरोसेंट मोती की एक समान संख्या प्राप्त करने के लिए pipeting से पहले फ्लोरोसेंट मनका समाधान भंवर.
    3. एपीएस समाधान के 100 $L और टेट्रामेथिथिलेथिलीनडियामाइन (टीईएमईडी) के 1 $L जोड़ने के बाद, आयताकार माइक्रो-वेल पर मिश्रित जेल समाधान के 10 $L को स्थानांतरित करें, और एक परिपत्र कवरस्लिप (18 मिमी) के शीर्ष पर रखें।
      नोट: बुलबुले के बिना पीए जेल के साथ नीचे कांच को भरने के लिए, नीचे कांच के नाली पर पर्याप्त जेल समाधान रखें, सावधानी से जेल समाधान पर कवरस्लिप स्लाइड करें और किसी भी अतिरिक्त जेल समाधान को हटा दें।
      चेतावनी: जेल धीरे धीरे के बारे में 40 मिनट के लिए ठीक हो जाता है. centrifuging जैल के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए.
    4. कस्टम ग्लास, जेल समाधान, और कवरस्लिप की असेंबली को पलटें, फिर पीए जेल की शीर्ष परत में फ्लोरोसेंट कणों को लाने के लिए 96 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रण।
    5. अपकेंद्रित्र से असेंबली निकालें और इसे नीचे का सामना करना पड़ कवरस्लिप के साथ फ्लैट सतह पर रखें।
      नोट: चरण 2.3.6 के साथ शुरुआत, एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में नमूने संभाल.
    6. 30 मिनट के बाद, विधानसभा फ्लिप और यह एक 35 मिमी पेट्री पकवान में जगह है, DIW के 2 एमएल के साथ भरने के लिए, और (सम्प्स का उपयोग करके) धीरे यह एक तरफ फिसलने से कवरस्लिप हटा दें.
      नोट: Cured PA जेल 1 महीने के लिए DIW में संग्रहीत किया जा सकता है. हालांकि, एक बार कोलेजन पीए जेल पर लेपित है, यह 1 दिन के भीतर एक प्रयोग में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  4. पीए जेल पर कोट कोलेजन.
    1. 1 mg/mL sulfosuccinimidil 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) हेक्सानोएट (सल्फो-सानपाह) को गर्म 50 एम एम हेप्स बफर में भंग करें। जेल की सतह पर समाधान के 200 डिग्री सेल्सियस ड्रॉप और यूवी प्रकाश (365 एनएम तरंगदैर्ध्य) द्वारा 10 मिनट के लिए सक्रिय करें।
      नोट: प्रकाश से सल्फो-सैनपाह को सुरक्षित रखें।
    2. 0.1 M $4-(2-hydroxyethyl)-1-पाइपराज़ीनथेनसल्फोनिक एसिड के साथ जेल कुल्ला; HEPES] बफर 2x और पीबीएस 1x के साथ.
    3. कोलेजन समाधान के साथ पीए जेल कोट (पीबीएस में 100 डिग्री/ अगले दिन, PBS 3x के साथ धो लें.

3. सेल द्वीपों के माइक्रोपैटर्निंग

  1. एफ-127(सामग्री तालिका) समाधान [2% (w/v) PBS में तैयार करें और एफ-127 समाधान में ऑटोक्लेव्ड पीडीएमएस स्टेंसिल को विसर्जित करें। इसे 1 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  2. सेल संस्कृति मीडिया में सेल समाधान (2 x 106 सेल/एमएल) तैयार करें जिसमें शामिल हैं: Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक (एए) के साथ।
  3. पीबीएस 3x के साथ PDMS स्टेंसिल धो लें और दोनों PDMS स्टेंसिल और पीए जेल से तरल निकालें. पीए जेल पर PDMS स्टेंसिल रखें और स्टेंसिल में पीबीएस जोड़ें।
  4. धीरे pipeting द्वारा PDMS स्टेंसिल के छेद में बुलबुले निकालें. बुलबुले को हटाने के बाद, PDMS स्टेंसिल की सतह से पीबीएस निकालें।
  5. PDMS स्टेंसिल पर सेल समाधान के 200 $L डालने के बाद, पीए जेल को 1 ज के लिए एक इन्क्यूबेटर में रखें ताकि कोशिकाएं पीए जेल से संलग्न हो सकें।
  6. सेल कल्चर मीडिया के साथ सेल समाधान को धीरे से धोएं, पीडीएमएस स्टेंसिल को हटा दें, और अधिक सेल संस्कृति मीडिया जोड़ें। एक माइक्रोस्कोप के तहत सेल द्वीपों के गठन की जाँच करें.

4. PDMS microchannel के साथ पीए जेल की विधानसभा

  1. चिपचिपा टेप का उपयोग कर PDMS microchannel पर धूल निकालें, तो autoclave.
  2. 30 s के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा (80 W, 50 kHz) के साथ PDMS microchannel की सतह का इलाज करें.
  3. पीए जेल से भरे नीचे कांच पर किसी भी तरल पदार्थ को हटाने के बाद, नीचे कांच के शीर्ष पर PDMS microchannel जगह है और कस्टम ग्लास धारक पर विधानसभा डाल दिया।
  4. सेल संस्कृति माध्यम के साथ माइक्रोचैनल भरें।
    चेतावनी: धीरे एक पिपेट के साथ गर्म मीडिया flushing द्वारा चैनलों में फंस सभी बुलबुले को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें। इसके अलावा, बुलबुले को हटाने के दौरान, सुनिश्चित करें कि micropaterned सेल द्वीपों को अलग नहीं करें।

5. एकीकृत microfluidic प्रणाली

  1. ट्यूबिंग कनेक्ट करें.
    1. सुइयों की नोक (18 जी) को ट्रिम करके और इसे 90 डिग्री झुकने से कनेक्टर्स तैयार करें।
    2. तीन इनलेट और एक आउटलेट के लिए ट्यूबिंग लाइनें तैयार करें।
      1. इनलेट ट्यूबिंग के लिए, छंटनी की सुई और एक तीन तरह stopcock के साथ एक 30 सेमी मिनी मात्रा लाइन कनेक्ट. इनमें से तीन तैयार की।
      2. आउटलेट ट्यूबिंग के लिए, छंटनी की सुई और एक 3-तरफा स्टॉपकॉक के साथ एक 75 सेमी मिनी मात्रा लाइन कनेक्ट करें। इनमें से एक को तैयार की।
      3. माध्यम है कि 1 एच के लिए preheated किया गया है के साथ ट्यूबिंग लाइनों भरें.
        चेतावनी: धीरे एक सिरिंज के साथ गर्म मीडिया फ्लशिंग द्वारा ट्यूबिंग लाइनों में फंस सभी बुलबुले को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें।
    3. सीरिंज से प्लंजर्स को हटाकर और इनलेट ट्यूबिंग लाइनों को जोड़कर जलाशयतैयार करें।
    4. प्रत्येक ट्यूबिंग लाइन के सुई कनेक्टर्स को तीन इनलेट और माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के एक आउटलेट में प्लग करें।
  2. ताजा मध्यम या वातानुकूलित मध्यम प्रत्येक के 3 एमएल के साथ जलाशयों भरें।
    1. ग्रेडिएंट परीक्षण के लिए, बायीं इनलेट जलाशय को सेल कल्चर मीडियम में 20 एनजी/एमएल एचजीएफ से भरें।
    2. सांद्रता प्रवणता के दृश्य के लिए, बाएं इनलेट जलाशय में 200 ग्राम/एमएल फ्लोरोसेंट डाई (रोडामाइन बी-डेक्सट्रान, 70 केडीए) जोड़ें।
    3. आउटलेट ट्यूबिंग लाइन को सिरिंज पंप से कनेक्ट करें.
      नोट: सिरिंज पंप के ऑपरेटिंग मोड "विरिविड" है। सिरिंज की क्षमता और सिरिंज पंप के संचालन की गति के अनुसार प्रवाह दर में परिवर्तन किया जाता है।
  3. एक पारंपरिक एपिफ्लोरेसेंट माइक्रोस्कोप के चरण पर एकीकृत microfluidic प्रणाली रखें.
    चेतावनी: microfluidic चैनल में HGF की एक कोमल ढाल उत्पन्न करने के लिए, प्रवाह दर के रूप में धीमी गति से के रूप में होना चाहिए 0.1 $L/ यह पर्याप्त रूप से संवेदनशील है ताकि यह 2 ज के लिए स्थिरीकरण की आवश्यकता है, और देखभाल के लिए प्रयोग के दौरान शारीरिक अशांति से बचने के लिए लिया जाना चाहिए.

6. छवि अधिग्रहण

  1. एक इनक्यूबेटर में रखे एक स्वचालित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर के लिए 24 एच अप करने के लिए हर 10 मिनट छवियों ले लो। प्रत्येक समय बिंदु पर, सेल प्रवास कल्पना करने के लिए चरण छवि सहित तीन अलग अलग चैनलों में एक 4x उद्देश्य लेंस का उपयोग कर छवियों का एक सेट ले, हरी फ्लोरोसेंट छवि पीए जेल में एम्बेडेड फ्लोरोसेंट मोती कल्पना करने के लिए, और लाल फ्लोरोसेंट छवि कल्पना करने के लिए किसी रसायन की सांद्रता प्रवणता
  2. समय चूक छवियों लेने के बाद, पीए जेल से कोशिकाओं को अलग करने के लिए microchannels में 0.25% trypsin-EDTA समाधान डालना. जेल से कोशिकाओं को पूरी तरह से हटाने के बाद, कर्षण माइक्रोस्कोपी के लिए एक संदर्भ छवि के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक हरे रंग की फ्लोरोसेंट छवि ले.

7. डेटा विश्लेषण

नोट: डेटा विश्लेषण के लिए एक कस्टम कोड MATLAB का उपयोग कर विकसित किया गया था, और विवरण कहीं और32,33,34,35,36वर्णित किया गया है.

  1. चरण-छवि विश्लेषण के लिए, कण छवि वेलोमिट्री36का उपयोग कर दो लगातार चरण छवियों में विस्थापन की गणना।
  2. फूरिये रूपांतर माइक्रोस्कोपी के लिए, संदर्भ छवि के साथ प्रत्येक हरी फ्लोरोसेंट छवि की तुलना करें और कण छवि velocimetry36का उपयोग कर प्रत्येक छवि में विस्थापन की गणना। विस्थापन से, फूरिये रूपांतर माइक्रोस्कोपी33,34,37का उपयोग कर पीए जेल पर कोशिकाओं द्वारा किए गए कर्षण ठीक हो .
  3. कर्षण डेटा से, परिमित तत्व विधियों32,34,38के आधार पर मोनोलेयर स्ट्रेबल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सेल द्वीप के मोनोलेयर के भीतर तनाव की गणना करें।

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Representative Results

रासायनिक प्रवणता के अंतर्गत सामूहिक प्रवास का अन्वेषण करने के लिए एक माइक्रोफ्लूइडिक प्रणाली को कर्षण माइक्रोस्कोपी के साथ एकीकृत किया गया था (चित्र 1)। एकीकृत प्रणाली का निर्माण करने के लिए, polyacrylamide (पीए) जेल कस्टम कट ग्लास पर डाली गई थी, और MDCK कोशिकाओं micropatterned एक PDMS स्टेंसिल द्वारा किए गए द्वीपों के भीतर बीज थे. इस प्रयोग के लिए, MDCK कोशिकाओं के बारह द्वीपों (तीन कॉलम द्वारा चार पंक्तियाँ, $ 700 डिग्री मी का व्यास) बनाया गया. पीए जैल से जुड़े कोशिकाओं के बाद, सामूहिक माइग्रेशन शुरू करने के लिए PDMS स्टेंसिल को हटा दिया गया था। पूर्व निर्मित माइक्रोफ्लूइडिक चैनल को सेल्युलर द्वीपों के ऊपर माइक्रोफ्लूइडिक चैनल बनाने के लिए पीए जैल के शीर्ष पर रखा गया था (चित्र 1ए)।

फिर microfluidic चैनल के भीतर एक एकाग्रता ढाल स्थापित करने के लिए, बाएँ प्रवेश एक फ्लोरोसेंट डाई समाधान युक्त आपूर्ति जलाशय से जुड़ा था. इसके अतिरिक्त, मध्य और सही inlets केवल मीडिया युक्त आपूर्ति जलाशयों से जुड़े थे. फिर, आउटलेट microfluidic चैनल से तरल पदार्थ को दूर करने के लिए सिरिंज पंप से जुड़ा हुआ था. कस्टम-कट ग्लास और माइक्रोफ्लूइड चैनल का सैंडविच कस्टम-निर्मित माइक्रोस्कोप चरण पर डाला गया था। स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ नमूने लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक इन्क्यूबेटर के भीतर रखा गया था। प्रयोगों के दौरान, कोशिकाओं 5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था। फ्लोरोसेंट डाई की तीव्रता की प्रवणता को शीघ्रता से 0ण्125 - 2 ल्ध प्रति न्यूनतम की प्रवाह दर पर स्थापित किया गया था (चित्र 2क) प्रवणता की ढाल प्रवाह दर पर निर्भर करती थी। उदाहरण के लिए, 0ण्125 र्ल्ध म्ह की प्रवाह दर पर प्रवणता 1ण्5 उउ से अधिक विकसित की गई थी, जो कोशिका द्वीपों का तुलनीय आकार है(चित्र 2ठ)।

इसके बाद, कोशिकाओं के साथ एकीकृत डिवाइस का परीक्षण किया गया था। MDCK कोशिकाओं के द्वीपmicropatterned और ऊपर वर्णित के रूप में microfluidic चैनल के साथ इकट्ठे हुए थे. सबसे पहले, microchannel में किसी भी प्रवाह को लागू करने के बिना, यह सुनिश्चित किया गया था कि सेलुलर द्वीप डिवाइस के भीतर अच्छी तरह से फैल गया. 12 ज अवधि में, द्वीप का विस्तार हुआ और औसत प्रवास की गति $0.1-0.2 m/min थी। जबकि द्वीप के बारे में कितना विस्तार द्वीप के बीच बदलाव थे, सभी कोशिकाओं को नहीं प्रवाह की स्थिति में स्वस्थ लग रहा था. इसके बाद, इन द्वीपों पर प्रवाह लागू किया गया और यह पाया गया कि 0ण्1 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट की प्रवाह दर पर कोशिकीय द्वीप अच्छी तरह से फैल गया और कोशिकाओं ने 12 उ.प्र. तथापि, प्रवाह दर को 0ण्5 डिग्री सेल्सियस प्रति न्यूनतम तक बढ़ाने पर कोशिकाएं अच्छी तरह से नहीं फैलती थीं और औसत प्रवास की गति 0ण्1 उउ/मिनट से कम हो गई। इसके अलावा, कोशिकाओं की आकृति एँ अलग दिखाई दीं और पीए जैल से अलग दिखाई दीं (चित्र 3)। इन आंकड़ों के आधार पर, 0.1 $L/min को निम्नलिखित प्रयोगों के लिए प्रवाह दर के रूप में चुना गया था।

सामूहिक कोशिका प्रवास पर रासायनिक प्रवणता के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए एचजीएफ को32,34चुना गया .  बाएं इनलेट से जुड़ा हुआ था 1) आपूर्ति जलाशय HGF समाधान के साथ सेल संस्कृति मीडिया पकड़े (20 ng/mL) और 2) अन्य 2 inlets सेल संस्कृति मीडिया पकड़े जलाशयों के साथ. 0ण्1 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट की प्रवाह दर के साथ, प्रवासी कोशिका द्वीपों (तीन स्तंभों द्वारा चार पंक्तियाँ) पर प्रवाह 10 ज(चित्र 4) के लिए बनाए रखा गया था। के रूप में एक अलग प्रयोग में दिखाया गया है, HGF एकाग्रता बाएँ स्तंभ पर suppling समाधान की एकाग्रता के करीब था (20 ng/mL), और सही स्तंभ पर, यह शून्य के करीब था. मध्य स्तंभ पर HGF एकाग्रता धीरे-धीरे बाएं आधे से दाएँ आधे से कम हो गई। 10 h के बाद सेल द्वीपों के आकार की तुलना करते समय, दाएँ स्तंभ पर द्वीपों का अधिक विस्तार नहीं हुआ, लेकिन बाएँ स्तंभ पर वाले द्वीप सभी दिशाओं में काफी बड़े और विस्तृत हो गए(चित्र 4क)। द्वीप के आकार में इस प्रकार के परिवर्तन प्रत्येक द्वीप के भीतर कोशिकाओं के त्रासदियों द्वारा समर्थित थे (चित्र 4ठ) । दिलचस्प है, मध्य स्तंभ में द्वीपों सही की ओर विस्तार नहीं किया (जहां HGF एकाग्रता कम था) लेकिन बाईं ओर वरीयता का विस्तार (जहां HGF एकाग्रता उच्च था). जबकि दाएँ स्तंभ में औसत माइग्रेशन गति में थोड़ा परिवर्तन हुआ, बाएँ और मध्य स्तंभों में, औसत माइग्रेशन गति पहले 3 h के लिए धीरे-धीरे बढ़ी, फिर धीरे-धीरे घटी(चित्र 4C)।

संकुचनबल बल और अंतरकोशिकीय तनाव को मापने के लिए कर्षण माइक्रोस्कोपी37,39,40 और मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी को माइक्रोफ्लूइडिक चैनल33,35के साथ संयुक्त किया गया, 38. रासायनिक ढाल के आवेदन के दौरान 10 एच के दौरान, फ्लोरोसेंट कणों की छवियों पीए जैल में लिया गया था, और बल (प्रति इकाई क्षेत्र) सब्सट्रेट पर कोशिकाओं द्वारा लागू किया गया था फूरिये रूपांतरण कर्षण माइक्रोस्कोपीकाउपयोग कर विश्लेषण किया गया था35 , 37. ट्रैक्शन ध्रुवीय निर्देशांकों में प्लॉट किया गया था। ब्लू द्वीप के केंद्र की ओर बल का प्रतिनिधित्व करता है, और लाल केंद्र से दूर बल का प्रतिनिधित्व करता है।

समय शून्य पर, सभी द्वीपों समान कर्षण वितरण दिखाया, किनारे पर मजबूत आवक कर्षण और द्वीप के भीतर अस्थिरता के साथ. यह उतार - चढाव पहले34,35,41के समान था . HGF ग्रेडिएंट लागू करने के 10 एच एच के बाद, जबकि द्वीप विस्तार की डिग्री प्रत्येक कॉलम में अलग था, कर्षण वितरण काफी हद तक समय शून्य के समान थे (चित्र 5ए)। औसत कर्षण 10 ज के लिए परिवर्तित नहीं हुआ (चित्र 5ग) मोनोलेयर तनाव की गणना करते समय, हालांकि, प्रत्येक स्तंभ ने विभिन्न प्रवृत्तियों को दिखाया। सही स्तंभ में (जहां HGF एकाग्रता कम था), द्वीपों के भीतर औसत तनाव के आसपास बनाए रखा गया था 200 पा एक 10 एच अवधि भर में. बाएँ स्तंभ में (जहां HGF एकाग्रता उच्च था), द्वीपों के भीतर औसत तनाव धीरे-धीरे 230 पा से 100 पा 10 एच से कम हो गया, जैसा कि पहले दिखायागया 32,34. मध्य स्तंभ में (जहां HGF एकाग्रता बाएँ आधे पर उच्च और द्वीप के सही आधे पर कम था), औसत तनाव के आसपास बनाए रखा गया था 150 पा.

Figure 1
चित्र 1: एकीकृत डिवाइस तैयारी के Schematic. (ए)एकीकृत उपकरण तैयार करने के लिए, पीए जेल के साथ एक नीचे का गिलास जिस पर एक पीडीएमएस स्टेंसिल का उपयोग करके सेल द्वीपों को पैटर्न किया गया था, एक पीडीएमएस माइक्रोचैनल के साथ कवर किया गया था। (ख)एकीकृत उपकरणों को तरल पदार्थ रिसाव और घटक वियोजन को रोकने के लिए एक कस्टम धारक का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। (सी)बुलबुले के बिना तरल पदार्थ से भरे उपकरण के बाद, जलाशयइनों से जुड़े थे, और एक सिरिंज पंप आउटलेट से जुड़ा हुआ था। सभी प्रयोगात्मक सेट अप एक जीवित सेल इमेजिंग प्रणाली पर रखा गया था. (घ)योजनाबद्ध माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों के डिजाइन और संरचना को दर्शाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सीहेमिकल प्रवणता कीस्थापना। (क)रोडामाइन बी-कंजुटेड डेक्सट्रन (70 केडीए) की फ्लोरोसेंस छवियां 0.125 डिग्री सेल्सियस/न्यूनतम, 0.5 एल/मिनट, और 2 डिग्री एल/मिन के द्रव प्रवाह के अंतर्गत सांद्रता प्रवणता की कल्पना करती हैं। (ख)फ्लोरोसेंट छवि की तीव्रता प्रोफाइल से पता चलता है कि डिवाइस में सांद्रता प्रवणता प्रवाह दर द्वारा समायोज्य थी। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. रंगीन सलाखों पैटर्न सेल द्वीप के स्तंभ पदों से संकेत मिलता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: प्रवाह के अधीन एमडीकेके सेल द्वीपों का प्रवास। (क)प्रत्येक प्रवाह दर पर एमडीसीके सेल द्वीप के 12 ज पर चरण छवियां (0 डिग्री एल/मिनट, 0.1 र्ल/मिनट, और 0.5 डिग्री सेल्सियस प्रति न्यूनतम) यह दर्शाती हैं कि सेल द्वीपों का विस्तार निम्न प्रवाह दर पर हुआ लेकिन उच्च प्रवाह दर पर इसका विस्तार नहीं हुआ। डॉटेड रेखाएँ 0 ज पर सीमाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं (B) प्रत्येक द्वीप के भीतर सेलुलर गति का माध्य और हिस्टोग्राम प्रत्येक 10 मिनट में 12 ज के लिए कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: प्रवाह तथा रासायनिक प्रवणता के अंतर्गत एमडीकेके सेल द्वीपों का प्रवास। (ए) एमडीसीके सेल के 2 ज (बी) चरण छवियों के लिए स्थिरीकरण के बाद प्रत्येक कॉलम में रोडामाइन बी-संयोजित डेक्सट्रान की सापेक्ष तीव्रता रेंज ने एक स्थिर HGF सांद्रता ग्रेडिएंट बनाए रखा । HGF ढाल के तहत द्वीप (बाएं से दाएं: 20-0 ng/mL) पता चलता है कि द्वीप अधिक विस्तार जहां HGF एकाग्रता अधिक था. (ग) एम डी सी सेल द्वीपों में कोशिकाओं के प्रवास पथ (रंग कोडन) की त्रासदियाँ पथ की लंबाई को इंगित करती हैं। डॉटेड रेखाएँ और डैश्ड रेखाएँ क्रमशः 0 h और 10 h पर प्रत्येक सेल द्वीप की सीमाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं. (घ) प्रत्येक द्वीप के भीतर सेलुलर गति का माध्य और हिस्टोग्राम प्रत्येक 10 मिनट में 10 घंटे के लिए कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: MDCK सेल द्वीपों के यांत्रिक बातचीत. (क)एचजीएफ ढाल के अंतर्गत 0 ज और 10 ज पर सेल द्वीपों में कर्षण (सेल-सबस्ट्रेट अन्योन्यक्रिया) के मानचित्र। नक्शे रेडियल समन्वय में साजिश रची गई, गर्म रंग और आवक कर्षण का उपयोग कर बाहर कर्षण के साथ ठंडे रंग का उपयोग कर. (बी)एचजीएफ प्रवणता के अंतर्गत 0 ज और 10 ज पर सेल द्वीपों में मोनोलेयर टेंशन (सेल-सेल अन्योन्यक्रियाओं) के मानचित्र। (ग)एचजीएफ ढाल के अंतर्गत सेल द्वीपों के भीतर औसत कर्षण (ग्रे वर्ग) और तनाव (नीला वृत्त) का आलेख हर 10 मिनट में 10 घंटे के लिए होता है। रंग बैंड मध्य चतुर्थक ($25%-75 %) का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Figure 1
अनुपूरक चित्र S1: कर्षण बल विश्लेषण के दौरान पर्याप्त डेटा गुणवत्ता के लिए उचित मनका वितरण आवश्यक है। सफेद बक्से में बढ़े हुए छवियों के साथ अच्छा (बाएं) और बुरा (दाएं) गुणवत्ता फ्लोरोसेंट मनका छवियों के उदाहरण दिखाए जाते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

घटक कोशिकाओं का सामूहिक प्रवास विकास और पुनर्जनन के दौरान एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है , और प्रवास दिशा अक्सर विकास कारकों4,23के रासायनिक प्रवणता द्वारा निर्देशित होती है . सामूहिक प्रवास के दौरान, कोशिकाओं पड़ोसी कोशिकाओं और अंतर्निहित substrates के साथ बातचीत करते रहते हैं. इस प्रकार के यांत्रिक अन्योन्यक्रियाएं आकस्मिक परिघटनाओं को जन्म देती हैं जैसे डुरोटैक्सिस42, प्लिथोक्क्सिस33और केनोटैक्सिस43. हालांकि, इस शोध के विकास कारकों की एक एकल एकाग्रता का उपयोग किया गया था, भ्रूण गोजातीय सीरम में उन लोगों के रूप में. अंतर को भरने के लिए, यह प्रोटोकॉल एक नया प्रयोगात्मक प्लेटफ़ॉर्म का वर्णन करता है जो रासायनिक प्रवणता के अंतर्गत सामूहिक सेलुलर प्रवास के दौरान यांत्रिक सहभागिताओं को माप सकता है.

नए मंच तीन प्रयोगात्मक प्रणाली है कि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है को जोड़ती है: micropatterning, कर्षण माइक्रोस्कोपी, और microfluidics. सबसे पहले, सामूहिक प्रवास के लिए सेल द्वीपों के micropaterning प्रदर्शन किया गया था. दूसरा, दोनों कर्षण माइक्रोस्कोपी और मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी पलायन कोशिकाओं के यांत्रिक माप के लिए इस्तेमाल किया गया था. अंत में, एक microfluidics मंच पलायन कोशिकाओं पर रासायनिक ढाल स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस प्रयोगात्मक प्रणाली के साथ, यह प्रदर्शन किया गया था कि एक ही द्वीप के भीतर कोशिकाओं को अलग अलग रासायनिक gradients के जवाब में विस्थापित.

जैसा कि चित्र 2में वर्णित है, रासायनिक प्रवणता माइक्रोचैनल के मध्य में केवल 1 उउ की दूरी पर ही होती है। बाएँ स्तंभ में द्वीप अधिकतम एकाग्रता के संपर्क में हो जाते हैं, और सही स्तंभ पर उन न्यूनतम एकाग्रता के संपर्क में हैं. इसके विपरीत, मध्य स्तंभ में द्वीप रासायनिक प्रवणता के संपर्क में हैं। इस प्रकार, सेल द्वीपों की प्रतिक्रिया को एक ही प्रयोग के दौरान एक घुलनशील कारक की सांद्रता की अधिकतम, न्यूनतम और प्रवणता से मापा जाता है। सेल द्वीपों के इस सरणी का उपयोग करना, सेलुलर प्रवास की गति में एक क्रमिक वृद्धि HGF एकाग्रता वृद्धि के रूप में मनाया गया.

उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए, विशेष रूप से ध्यान देने की आवश्यकता है जो प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरण हैं। एक कस्टम ग्लास सब्सट्रेट में पीए जैल फ्लोरोसेंट कणों और कोलेजन की सतह कोटिंग के वितरण के बारे में एकदम सही होना चाहिए। इसका कारण यह है कि उच्च गुणवत्ता पीए जैल के बिना, कर्षण विश्लेषण और मोनोलेयर तनाव विश्लेषण के लिए एक उच्च गुणवत्ता वाले डेटा सेट प्राप्त नहीं किया जा सकता है। उच्च गुणवत्ता वाले मनका छवियों के उदाहरण अनुपूरक चित्र 1में दिखाए गए हैं। microfluidic चैनल बहुत छोटे हैं, और बुलबुले आसानी से उन में फंस रहे हैं. ये बुलबुले न केवल प्रवाह को परेशान करते हैं बल्कि कोशिकाओं को दूर भी स्वीप कर सकते हैं यदि वे प्रवाह के साथ चलना शुरू करते हैं। इसलिए, यह बुलबुले के बिना microfluidic चैनलों को भरने के लिए महत्वपूर्ण है। माइक्रोचैनल के भीतर एक स्थिर ढाल को प्राप्त करने के लिए, तीन इनलेट के भीतर दबाव का संतुलन बहुत महत्वपूर्ण है। उन दोनों के बीच असंतुलन से बचने के लिए, बड़े जलाशयों का उपयोग किया जाना चाहिए ताकि एक प्रयोग की शुरुआत में किसी भी असंतुलन को आसानी से समायोजित किया जा सके। इस नए मंच रासायनिक gradients, जो पुनर्जनन, कैंसर मेटास्टेसिस, और विकास को समझने के लिए महत्वपूर्ण है के तहत सामूहिक सेल प्रवास के यांत्रिकी के आगे अन्वेषण में मदद मिलेगी.

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

यह काम कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) कोरियाई सरकार (MSIP) (नहीं) द्वारा वित्त पोषित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. NRF-2017R1E1A01075103), कोरिया विश्वविद्यालय अनुदान, और बीके 21 प्लस कार्यक्रम. यह भी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY0196) द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
1 M HEPES buffer solution Gibco 15630-056
1 mm Biopsy punch Integra Miltex 33-31AA-P/25
100 mm petri dishes SPL 10100 100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punch ILJIN 124-0571
18 mm Ø Coverslip Marienfeld-Superior 111580 Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solution Bio-Rad 1610142 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) Sigma-Aldrich 440159-500ML
3-way stopcock Hyupsung HS-T-61N CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-30 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dish Corning 430165
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-75 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acid J.T. Baker JT9508-03
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad 1610700
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Bottom glass chip MicroFIT 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tail Corning 354236
Custom glass holder Han-Gug Mechatronics custom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Welgene LM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biowest L0615-500 w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheres Invitrogen F8764 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Sigma-Aldrich H1404-5UG recombinant, human
JuLI stage live cell imaging system NanoEnTek In Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell type II
Oxygen plasma system Femto Science CUTE-MPR
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich R9379-100MG 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 G KOVAX Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape 3M/Scotch 810D 33 m x 19 mm
SU-8 master molds MicroFIT 4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) Thermo Scientific 22589 Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS
Syringe pump Chemyx Inc. model fusion 720 withdraw fluid
Syringes KOVAX 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lamp UVP LLC 95-0248-02 365 nm wavelength

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References

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केमोटेक्टिक सामूहिक प्रवास के लिए माइक्रोफ्लूइडिक्स के साथ एकीकृत ट्रैक्शन माइक्रोस्कोपी
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Jang, H., Kim, J., Shin, J. H., Fredberg, J. J., Park, C. Y., Park, Y. Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration. J. Vis. Exp. (152), e60415, doi:10.3791/60415 (2019).

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