Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/60415

Summary

Gelişimkolektif hücre göçü, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı genellikle büyüme faktörleri veya sinyal moleküllerinin gradyanları tarafından yönlendirilir. Burada açıklanan bir mikroakışkan sistem ve biyokimyasal gradyan altında kolektif göç mekaniği ölçmek için nasıl bir gösteri ile çekiş mikroskobu birleştiren deneysel bir sistemdir.

Abstract

Hücreler kimyasal uyaranlara yanıt olarak göç desenlerini değiştirirler, uyaranların degradeleri de dahil olmak üzere. Kemotaksis olarak bilinen kimyasal degrade yönünde hücresel göç, gelişiminde önemli bir rol oynar, bağışıklık yanıtı, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı. Kemotaksis tek hücre göçünün yanı sıra in vivo hücre koleksiyonlarını modüle ederken, in vitro araştırma kısmen uygun deneysel araçların eksikliği nedeniyle, tek hücreli kemotaksis üzerinde duruluyor. Bu boşluğu doldurmak için, burada açıklanan kolektif hücre göçü üzerinde kimyasal degradelerin etkilerini göstermek için mikroakışkan ve mikro desenleme birleştiren benzersiz bir deneysel sistemdir. Ayrıca, traksiyon mikroskobu ve monolayer stres mikroskobu, substrattaki ve komşu hücreler arasındaki hücresel kuvvet değişikliklerini karakterize etmek için sisteme dahil edilmiştir. Kavram kanıtı olarak, Madin-Darby köpek böbrek (MDCK) hücrelerinin mikro desenli dairesel adaların göçü, bilinen bir saçılma faktörü olan hepatosit büyüme faktörü (HGF) gradyanı altında test edilir. HGF'nin yüksek konsantrasyonuna yakın hücreler, bir hücre adası içinde karşı taraftakihücrelerden daha hızlı göç eder. Aynı ada içinde, hücresel çekiş her iki tarafta benzer, ancak hücreler arası stres yüksek HGF konsantrasyonu tarafında çok daha düşüktür. Bu yeni deneysel sistem hücresel kolektifler tarafından kemotaktik göç mekaniği çalışma için yeni fırsatlar sağlayabilir.

Introduction

Biyolojik sistemlerde hücresel göç doku oluşumunda yer alan temel bir olgudur, bağışıklık yanıtı, ve yara iyileşmesi1,2,3. Hücresel göç de kanser gibi bazı hastalıklarda önemli bir süreçtir4. Hücreler genellikle toplu hücre geçişi4,5olarak bilinen tek tek yerine bir grup olarak göç. Hücrelerin kolektif olarak hareket edilebisolması için mikroortamın algılanması6esastır. Örneğin, hücreler fizyokimyasal uyaranları algılar lar ve hareketliliği, hücre-substrat etkileşimlerini ve hücre-hücre etkileşimlerini değiştirerek yanıt verirler, bu da kimyasal bir degrade boyunca yön göçüne neden olur7,8, 9,10. Bu bağlantıya dayanarak, hızlı gelişmeler bir chemoattractant11,12,13 gradyanı gibi iyi kontrollü kimyasal mikroortamlar oluşturabilirsiniz lab-on-a-chip teknolojilerinde yapılmıştır . Bu laboratuvar-on-a-çip tabanlı mikroakışkanlar daha önce hücresel topluluk veya hücresel küresel ler14,15,16,17kemotaksis çalışma için kullanılmış olsa da, onlar çoğunlukla tek hücreli geçiş bağlamında kullanılmıştır18,19,20,21. Kimyasal degradeye hücresel kolektif yanıtın altında yatan mekanizmalar hala iyi anlaşılamamıştır14,22,23,24,25,26 . Böylece, çözünen faktörlerin spatiotemporal kontrolü sağlayan bir platform geliştirilmesi yanı sıra hücrelerin biyofiziksel yerinde gözlem kolektif hücre göçü arkasındaki mekanizmaları çözmek için yardımcı olacaktır.

Burada geliştirilen ve açıklanan desenli hücre kümelerinin göç modüle çözünür faktörlerin bir konsantrasyon gradyanı üretimi sağlayan çok kanallı mikroakışkan bir sistemdir. Bu çalışmada Madin-Darby kan böbrek (MDCK) hücrelerinin göç davranışını düzenlemek için hepatosit büyüme faktörü (HGF) seçilmiştir. HGF hücre-hücre bütünlüğünü zayıflatmak ve hücrelerin hareketliliğini artırmak bilinmektedir27,28. Mikroakışkan sistemde, Fourier transform traksiyon mikroskobu ve monolayer stres mikroskobu da dahil edilmiştir, bu da bir HGF'ye yanıt olarak kurucu hücreler tarafından indüklenen hareketlilik, kontraktil kuvvet ve hücreler arası gerilimin analizine olanak sağlar. Degrade. Aynı ada içinde, HGF yüksek konsantrasyonyakınında bulunan hücreler daha hızlı göç ve düşük HGF konsantrasyonu ile tarafında daha düşük hücreler arası stres düzeyleri göstermektedir. Sonuçlar, bu yeni deneysel sistemin çeşitli çözünür faktörlerin kimyasal degradeleri altında kolektif hücresel göçü içeren alanlardaki diğer soruları araştırmak için uygun olduğunu göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Şablonlar (kalınlık = 250 μm) ve mikrokanal parçaları (kalınlık = 150 μm), cam gravür (derinlik = 100 μm) ve döküm imalatı için SU-8 kalıplarının litografisi, üreticilere bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanılarak tasarımlar gönderilerek dış kaynak tanyapılmıştır.

1. Polidimethylsiloxane (PDMS) şablon ve mikrokanal imalatı

  1. Şablon ve mikrokanalın mikro deseni tasarla.
  2. Silikon gofretler (4" çap) üzerinde SU-8 kalıpları (şablonlar için ~250 μm kalınlık ve mikrokanallar için ~150 μm) imalatı veya dış kaynak.
  3. BAZ elastomerve kür ajanını 10:1 oranında karıştırarak PDMS karışımını hazırlayın.
    1. Baz elastomerin 15 mL'ini 50 mL konik bir tüpe yerleştirin ve 1,5 mL kürleme maddesi ekleyin. Bunlardan iki tane hazırla.
    2. Girdap PDMS karışımı için 5 dk. Centrifuge PDMS karışımı 196 x g 1 dk kabarcıklar kaldırmak için.
  4. PDMS şablonu imal etmek için, PDMS'nin SU-8 sütunlarının kenarına değmesi için SU-8 desenli bölgelerden kaçınırken, pdms karışımının ~1 mL'sini gofrete dökün, ancak SU-8 deseninin üst tarafına değmesin.
    1. Gofret oda sıcaklığında (RT) 30 dakikadan fazla düz bir yüzeye yerleştirin. PDMS'yi 80 °C'de kuru fırında 2 saatin üzerinde bir süre için tedavi edin.
    2. SU-8 kalıbından PDMS'yi dikkatlice soyup 14 mm'lik içi boş bir zımba kullanarak ince PDMS membranını kırpın. Yapışkan bant kullanarak PDMS parçalarının yüzeyindeki tozu çıkarın ve PDMS şablonlarını otoklavlayın.
  5. PDMS mikrokanalını imal etmek için SU-8 kalıbına ~30 mL PDMS karışımı dökün.
    1. Bir vakum odasında 30 dakika için Gaz ve 2 saat üzerinde 80 °C'de kuru bir fırında PDMS tedavi.
    2. PDMS'yi SU-8 kalıbından dikkatlice soyun ve PDMS'yi 24 mm x 24 mm boyutuna kadar kesin. Her PDMS bloğunda, 1 mm biyopsi zımbakullanarak bir çıkış ve üç giriş oluşturun.

2. Poliakrilamid (PA) jel ile alt cam hazırlanması

  1. Dikdörtgen saklı camların (24 mm x 24 mm x 1 mm) dikdörtgen mikro kuyulu (6 mm x 12 mm, 100 μm derinlik29)kesme ve gravür lüzumlu camlarının kesilmesi ve gravürle üretilmesi veya dış kaynak üretilmesi.
  2. Bir alt cam yüzeyi Silanize30.
    1. 200 mL deiyonize su (DIW), 80 μL asetik asit ve 50 μL 3-(trimethoxysilyl) propil metakrit (TMSPMA) 1 saat karıştırarak bir bağlama silane çözeltisi hazırlayın.
      DİkKAT: TMSPMA yanıcı bir sıvıdır. Malzeme güvenliği veri sayfalarındaki önerileri uygulayın. Sadece kimyasal duman kaputunda kullanın.
    2. Yapışkan bant ile cam yüzeyinden toz çıkarın ve cam otoklav.
    3. Alt camın kazınmış yüzeyini 100 μL'lik bağlama çözeltisi ile kapatın ve camı RT'de 1 saat bekletin.
    4. DIW 3x ile camı durulayın ve camın ortam havası sıcaklığında veya hava üfleyerek kurumasına izin verin.
  3. PA jel31için bir jel çözeltisi hazırlayın.
    1. % 0.5 (w/v) amonyum persülfat (APS) taze bir çözelti hazırlayın DIW 1 mL IÇINDE 5 mg APS eriterek.
    2. 138 μL %40 akrilamid çözeltisi, 101 μL %2 bis-akrilamid çözeltisi, 5 μL floresan partikül çözeltisi (0,2 μm) ve 655°L DIW'den oluşan PA jel çözeltisini hazırlayın.
      DİkKAT: Akrilamid ve bisakrrilamid çözeltileri toksiktir. Koruyucu eldiven, giysi ve göz koruması giyin. Floresan parçacıklar içeren PA jel çözeltisini ışıktan koruyun.
      NOT: Girdap floresan boncuk çözeltisi toplu başına floresan boncuk tek tip bir sayı elde etmek için pipetting önce.
    3. APS çözeltisinin 100 μL'si ve 1 μL tetrametiletilendiamin (TEMED) ekledikten sonra, 10 μL karışık jel çözeltisini dikdörtgen mikro kuyuya aktarın ve üzerine dairesel bir kapak kaydırığa (18 mm) yerleştirin.
      NOT: Kabarcıklar olmadan PA jel ile alt cam doldurmak için, alt cam oluk yeterli jel çözeltisi yerleştirin, dikkatle jel çözeltisi üzerinde coverslip slayt ve herhangi bir aşırı jel çözeltisi kaldırın.
      DİkKAT: Jel yavaş yavaş yaklaşık 40 dakika boyunca tedavi edilir. Santrifüj jelleri için aşağıdaki prosedür mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdır.
    4. PA jel üst tabakasına floresan parçacıklar getirmek için 96 x g 10 dakika için özel cam, jel çözeltisi ve coverslip montaj çevirin.
    5. Tertibatı santrifüjden çıkarın ve kapak kayması aşağı bakacak şekilde düz yüzeye yerleştirin.
      NOT: Adım 2.3.6 ile başlayarak, numuneleri biyogüvenlik kabininde ele alın.
    6. 30 dakika sonra, montajı çevirin ve 35 mm'lik petri kabına yerleştirin, 2 mL DIW ile doldurun ve (forceps kullanarak) bir tarafa kaydırarak kapağı hafifçe çıkarın.
      NOT: Kürlü PA jel 1 ay DIW saklanabilir. Ancak, kollajen PA jel kaplı bir kez, 1 gün içinde bir deneyde kullanılmalıdır.
  4. PA jel üzerinde Coat kollajen.
    1. 1 mg/mL sulfosuccinimidil 6-(4'-azido-2'-nitrofenilmino) hekzanoat (sulfo-SANPAH) sıcak 50 mM HEPES tamponunda çözün. Çözeltinin 200 μL'sini jel yüzeyine bırakın ve 10 dakika uv ışığı (365 nm dalga boyu) ile etkinleştirin.
      NOT: Sulfo-SANPAH'ı ışıktan koruyun.
    2. Jeli 0,1 M [4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetanesülfonik asitle durula; HEPES] tampon 2x ve PBS 1x ile.
    3. Bir gecede 4 °C'de kollajen solüsyonu (PBS'de 100 μg/mL, sıçan kuyruğu kollajen tip I) ile PA jeli kaplayın. Ertesi gün PBS 3x ile yıkayın.

3. Hücre adalarının mikro desenlemi

  1. PBS'de F-127(Malzeme Tablosu)çözeltisini [%2 (w/v) hazırlayın ve otoklavlı PDMS şablonunu F-127 çözeltisindeki batırın. 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 1 saat bekletin.
  2. Hücre çözeltisi (2 x 106 hücre/mL) hücre kültürü medyada: Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamı (DMEM) %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 antibiyotik antimikotik (AA) ile hazırlayın.
  3. PDMS şablonunu PBS 3x ile yıkayın ve hem PDMS şablonundan hem de PA jelden sıvı çıkarın. PDMS şablonunu PA jelin üzerine yerleştirin ve şablona PBS ekleyin.
  4. PDMS şablonundaki kabarcıkları yavaşça borulayarak çıkarın. Kabarcıkları çıkardıktan sonra PBS'yi PDMS şablonunun yüzeyinden çıkarın.
  5. PDMS şablonuna 200 μL hücre çözeltisi koyduktan sonra, hücrelerin PA jele bağlanması için PA jeli 1 saat boyunca bir kuvözde tutun.
  6. Hücre çözümcã1/4nÃ1/4 hücre kÃ1/4ltÃ1/4r çã¶zÃ1/4mÃ1/4nÃ1/4 hücre kızıntısı ile hafifçe temizle, PDMS şablonunu kaldırın ve daha fazla hücre kà Bir mikroskop altında hücre adalarının oluşumunu kontrol edin.

4. PDMS mikrokanal ile PA jel montajı

  1. Yapışkan bant kullanarak PDMS mikrokanalındaki tozu çıkarın, ardından otoklav.
  2. PDMS mikrokanalının yüzeyini 30 s oksijen plazması (80 W, 50 kHz) ile tedavi edin.
  3. PA jel dolu alt cam üzerinde herhangi bir sıvı çıkardıktan sonra, alt cam üstüne PDMS mikrokanal yerleştirin ve özel cam tutucu montaj koymak.
  4. Mikro kanalı hücre kültürü ortamıyla doldurun.
    DİkKAT: Sıcak ortamı pipetle hafifçe yıkarak kanallarda sıkışıp kalan tüm kabarcıkları çıkardıktan emin olun. Ayrıca, kabarcıklar kaldırırken, mikro desenli hücre adaları ayırmak için değil emin olun.

5. Entegre mikroakışkan sistem

  1. Boruları bağlayın.
    1. İğnelerin ucunu (18 G) kırparak ve 90° bükerek konektörleri hazırlayın.
    2. Üç giriş ve bir çıkış için boru hatları hazırlayın.
      1. Giriş boruları için, kesilmiş iğneyi ve 30 cm'lik mini hacimli hattı üç yönlü stopcock ile bağlayın. Bunlardan üç tane hazırla.
      2. Çıkış borusu için, kesilmiş iğneyi ve 75 cm'lik mini hacimli hattı üç yönlü stopcock ile bağlayın. Bunlardan birini hazırla.
      3. Boru hatlarını önceden ısıtılmış ortamla doldurun.
        DİkKAT: Sıcak ortamı şırınga ile hafifçe yıkarak boru hatlarında sıkışmış tüm kabarcıkları çıkardıktan emin olun.
    3. Şırıngalardan dalan ve giriş boru hatlarını birbirine bağlayarak rezervuarları hazırlayın.
    4. Her boru hattının iğne konektörlerini üç girişe ve mikroakışkan cihazın bir çıkışına takın.
  2. Rezervuarları her biri 3 mL taze orta veya şartlı orta ile doldurun.
    1. Degrade testi için, hücre kültürü ortamında sol giriş haznesini 20 ng/mL HGF ile doldurun.
    2. Konsantrasyon gradyanının görselleştirilmesi için sol giriş haznesine 200 μg/mL floresan boya (rhodamine B-dextran, 70 kDa) ekleyin.
    3. Çıkış boru hattını şırınga pompasına bağlayın.
      NOT: Şırınga pompasının çalışma modu "çekilme"dir. Şırınganın kapasitesine ve şırınga pompasının çalışma hızına göre akış hızı değiştirilir.
  3. Entegre mikroakışkan sistemi geleneksel epifloresan mikroskobun sahnesine yerleştirin.
    DİkKAT: Mikroakışkan kanalda yumuşak bir HGF degradesi oluşturmak için akış hızı 0,1 μL/dk kadar yavaş olmalıdır. Bu, 2 saat stabilizasyon gerektirmesi için yeterince hassastır ve deney sırasında fiziksel bozulmayı önlemek için dikkatli olunmalıdır.

6. Görüntü edinimi

  1. Bir kuluçka makinesinde bulunan otomatik bir mikroskop kullanarak 24 saate kadar her 10 dakikada bir görüntü alın. Her zaman diliminde, hücre göçünü görselleştirmek için faz görüntüsü, PA jel'e gömülü floresan boncukları görselleştirmek için yeşil floresan görüntü ve görselleştirmek için kırmızı floresan görüntü dahil olmak üzere üç farklı kanalda 4x nesnel lens kullanarak bir dizi görüntü alın bir kimyasalın konsantrasyon gradyanı.
  2. Hızlandırılmış görüntüler aldıktan sonra, PA jel hücreleri ayırmak için mikrokanallar içine% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi infüzyon. Jel hücreleri tamamen çıkardıktan sonra, çekiş mikroskopisi için bir referans görüntü olarak kullanılmak üzere yeşil floresan görüntü almak.

7. Veri analizi

NOT: Veri analizi için özel bir kod MATLAB kullanılarak geliştirilmiştir ve ayrıntılar başka bir yerde32,33,34,35,36olarak tanımlanmıştır.

  1. Faz-görüntü analizi için, parçacık görüntü velocimetry36kullanarak iki ardışık faz görüntüleri deplasmanları hesaplamak.
  2. Fourier transform trtroskopi için, her yeşil floresan görüntüyü referans görüntüsüyle karşılaştırın ve parçacık görüntüsü velocimetry36kullanarak her görüntüdeki yer değiştirmeleri hesaplayın. Deplasmanlardan, Fourier transform traksiyon mikroskobu kullanarak PA jel üzerinde hücreler tarafından yapılan çekiş kurtarmak33,34,37.
  3. Çekiş verilerinden, sonlu elemanlaryöntemlerinedayalı monolayer stres mikroskobu kullanarak hücre adasının monolayer içinde stres hesaplamak 32,34,38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kimyasal bir degrade altında kolektif göçü araştırmak için, mikroakışkan bir sistem çekiş mikroskobu ile bütünleşmiştir(Şekil 1). Entegre sistemi oluşturmak için, poliakrilamid (PA) jel özel kesim cam üzerine atıldı ve MDCK hücreleri bir PDMS şablon tarafından yapılan mikro desenli adalar içinde tohumlu edildi. Bu deney için, MDCK hücrelerinden oluşan on iki ada (üç sütuna dört sıra, çapı ~700 μm) oluşturuldu. PA jellere bağlı hücrelerden sonra, toplu göç başlatmak için PDMS şablonu kaldırıldı. Önceden yapılmış mikroakışkan kanal hücresel adaların üzerinde mikroakışkan kanal oluşturmak için PA jellerin üstüne yerleştirildi(Şekil 1A).

Daha sonra mikroakışkan kanal içinde bir konsantrasyon gradyanı oluşturmak için, sol giriş floresan boya çözeltisi içeren besleme rezervuarına bağlandı. Ayrıca, orta ve sağ girişleri sadece medya içeren besleme rezervuarları bağlıydı. Daha sonra, çıkış mikroakışkan kanaldan sıvı kaldırmak için şırınga pompası na bağlandı. Özel kesim cam ve mikroakışkan kanal sandviç özel olarak inşa mikroskop aşamasına yerleştirildi. Örnekler otomatik floresan mikroskop la birlikte canlı hücre görüntülemesi için bir kuvöz içinde tutuldu. Deneyler boyunca hücreler %5 CO2 ve 37 °C'de tutuldu. Floresan boyanın yoğunluğunun bir degradesi 0,125 - 2 μL/dk(Şekil 2A)akış hızında hızlı bir şekilde kurulmuştur. Degradenin eğimi akış hızına bağlı. Örneğin, 0,125 μL/dk akış hızında, degrade 1,5 mm üzerinde geliştirilmiştir, bu da hücre adalarının karşılaştırılabilir boyutudur(Şekil 2B).

Daha sonra, hücreleri ile entegre cihaz test edildi. MDCK hücrelerinin adaları mikro desenli ve yukarıda açıklandığı gibi mikroakışkan kanal ile monte edildi. İlk olarak, mikrokanalda herhangi bir akış uygulanmadan, hücresel adanın cihazın içinde iyi yayılması sağlandı. 12 saat boyunca ada genişledi ve ortalama göç hızı ~0.1-0.2 μm/dk idi. Adalar arasında adanın ne kadar genişledigi konusunda farklılıklar olsa da, tüm hücreler akışsız durumda sağlıklı görünüyordu. Daha sonra, bu adalar üzerinde akış uygulandı ve 0.1 μL/dk akış hızında hücresel adanın iyi yayıldığı ve hücrelerin 12 saat boyunca ortalama ~0.1-0.2 m/dk göç hızını koruduğu tespit edildi. Ancak, akış hızı 0,5 μL/dk'ya yükseltilen hücreler iyi yayılmadı ve ortalama göç hızı 0,1 μm/dk'nın altına düştü. Ayrıca, hücrelerin morfolojileri farklı göründü ve PA jelleri ayırAn olduğu ortaya çıktı (Şekil 3). Bu verilere dayanarak, aşağıdaki deneylerin akış hızı olarak 0.1 μL/dk seçilmiştir.

Bir kimyasal degradenin kolektif hücre göçü üzerindeki etkilerini test etmek içinHGF 32,34olarak seçilmiştir.  Sol giriş 1) hgf çözeltisi (20 ng/mL) ve 2) hücre kültürü medya tutan rezervuar hücre kültürü medya tutan diğer 2 girişleri bağlıydı. 0,1 μL/dk'lık bir akış hızı yla, göç eden hücre adaları nın üzerinden akış (üç sütuna dört sıra) 10 saat boyunca muhafaza edilmiştir(Şekil 4). Ayrı bir deneyde gösterildiği gibi, sol kolondaki HGF konsantrasyonu suppling çözeltisinin konsantrasyonuna (20 ng/mL) yakındı ve sağ sütunda bu sıfıra yakındı. Orta kolondaki HGF konsantrasyonu yavaş yavaş sol yarısından sağa doğru azaldı. 10 saat sonra hücre adalarının boyutunu karşılaştırırken, sağ sütundaki adalar çok genişlemedi, ancak sol sütundakiler önemli ölçüde daha büyük oldu ve her yöne doğru genişledi(Şekil 4A). Ada boyutundaki bu tür değişiklikler her adadaki hücrelerin yörüngeleri tarafından desteklenmiştir(Şekil 4B). İlginçtir, orta sütunda adalar sağa doğru genişlemedi (HGF konsantrasyonu düşük olduğu) ama tercihen sola doğru genişledi (HGF konsantrasyonu yüksek olduğu). Sağ sütunda, sol ve orta sütunlarda ortalama geçiş hızında çok az değişiklik olsa da, ilk 3 saat için ortalama geçiş hızı kademeli olarak artmış, daha sonra kademeli olarak azalmıştır(Şekil 4C).

Kontraktil kuvvet ve hücreler arası stresi ölçmek için traksiyon mikroskobu37,39,40 ve monolayer stres mikroskobu mikroakışkan kanal33,35, 38'e kadar. Kimyasal degradenin uygulanması sırasında 10 saat boyunca, floresan parçacıkların görüntüleri PA jelleri alınmıştır ve kuvvet (birim alan başına) substrat üzerinde hücreler tarafından uygulanan Fourier transform traksiyon mikroskopisi kullanılarak analiz edildi35, 37'ye kadar. Çekiş, kutupsal koordinatlarda çizildi. Mavi adanın merkezine doğru kuvveti temsil eder, kırmızı ise merkezden uzak olan kuvveti temsil eder.

Zaman sıfır, tüm adalar benzer çekiş dağılımları gösterdi, kenarında güçlü içe çekiş ve ada içinde dalgalanma ile. Bu dalgalanma daha önce34,35,41gösterilmiştir ne benzerdi. HGF degradesi uygulandıktan sonra, ada genişletme derecesi her sütunda farklı iken, çekiş dağılımları büyük ölçüde zaman sıfır benzer(Şekil 5A). Ortalama çekiş 10 saat boyunca değişmedi (Şekil 5C). Ancak, tek katmanlı stres hesaplanırken, her sütun farklı eğilimler gösterdi. Sağ kolonda (HGF konsantrasyonu düşüktü), adalar içinde ortalama gerginlik 10 saat boyunca 200 Pa civarında muhafaza edildi. Sol sütunda (HGF konsantrasyonu yüksek olduğu), adalar içinde ortalama gerginlik yavaş yavaş 230 Pa 100 Pa 10 saat üzerinde, daha önce gösterildiği gibiazaldı 32,34. Orta kolonda (HGF konsantrasyonunun sol yarısında yüksek ve adanın sağ yarısında düşük olduğu) ortalama gerilim 150 Pa civarında tutuldu.

Figure 1
Şekil 1: Entegre cihaz hazırlama şeması. (A)Entegre cihazı imal etmek için, hücre adalarının PDMS şablonu kullanılarak desenlendiği PA jelli bir alt cam PDMS mikrokanalı ile kaplandı. (B) Entegre cihazlar, sıvı sızıntısını ve bileşen ayrışmasını önlemek için özel bir tutucu kullanılarak sabitlendi. (C) Cihaz kabarcıksız sıvı yla dolduktan sonra, rezervuarlar girişlere bağlandı ve şırınga pompası çıkışa bağlandı. Tüm deneysel kurulumlar canlı hücre görüntüleme sistemine yerleştirildi. (D) Şema, mikroakışkan kanalların tasarım ve bileşimini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Chemigradyon kurulması. (A) Rhodamine B-konjuge dekstran floresan görüntüleri (70 kDa) 0.125 μL/dk sıvı akışı altında konsantrasyon gradyanı görselleştirmek, 0.5 μL/dk, ve 2 μL/dk. Noktalı daireler desenli hücre adalarının konumunu gösterir. (B) Floresan görüntüsünün yoğunluk profili, cihazdaki konsantrasyon gradyanının akış hızına göre ayarlanabildiğini gösterir. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Renkli çubuklar desenli hücre adasının sütun konumlarını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: MDCK hücre adalarının akış altında göçü. (A) MDCK hücre adasının 12 saatinde her akış hızında (0 μL/dk, 0,1 μL/dk ve 0,5 μL/dk) faz görüntüleri, hücre adalarının düşük akış hızında iyi genişlediğini, ancak yüksek akış hızında genişlemediğini göstermektedir. Noktalı çizgiler 0 h. (B) Her ada içinde hücresel hız ortalama ve histogram her 10 dakika 12 saat için sınırları temsil eder.

Figure 4
Şekil 4: MDCK hücre adalarının akış ve kimyasal degrade altında göçü. (A) Rhodamine B konjuge dekstran göreli yoğunluk aralığı 2 h. (B) Faz görüntüleri 10 h (noktalı çizgi = 0 h) için stabilize sonra her sütunda sabit bir HGF konsantrasyon gradyanı muhafaza MDCK hücre HGF gradyanı altında ada (soldan sağa: 20-0 ng/mL) adanın HGF konsantrasyonu daha yüksek olduğu daha fazla genişletti göstermektedir. (C) MDCK hücre adalarındaki hücrelerin geçiş yollarının yörüngeleri (renk kodlaması yol uzunluğunu gösterir). Noktalı çizgiler ve kesik çizgiler, sırasıyla 0 saat ve 10 saat olarak her hücre adasının sınırlarını temsil eder. (D) Her ada içindeki hücresel hızın ortalama ve histogramı her 10 dakika 10 saat boyunca lütfen bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: MDCK hücre adalarının mekanik etkileşimleri. (A) HGF degradesi altında 0 saat ve 10 saat hücre adalarında çekiş haritaları (hücre-substrat etkileşimi). Haritalar radyal koordinasyon içinde çizilmiştir, sıcak renk ve soğuk renk kullanılarak içe çekiş dışa çekiş ile. (B) HGF degradesi altında 0 saat ve 10 saat hücre adalarında monolayer gerilim (hücre-hücre etkileşimleri) haritaları. (C) HGF degradesi altında hücre adaları içinde ortalama çekiş (gri kare) ve gerilim (mavi daire) arsa zaman içinde her 10 dakika 10 saat. Renk bantları orta dörtte birlik (%~25-%75) temsil ediyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Supplementary Figure 1
Ek Şekil S1: Çekiş kuvveti analizi sırasında yeterli veri kalitesi için gerekli uygun boncuk dağılımı. Beyaz kutularda genişlemiş görüntüler ile iyi (sol) ve kötü (sağ) kaliteli floresan boncuk görüntüleri örnekleri gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kurucu hücrelerin kolektif göçü geliştirme ve rejenerasyon sırasında önemli bir süreçtir ve göç yönü genellikle büyüme faktörlerinin kimyasal degrade tarafından yönlendirilir4,23. Toplu geçiş sırasında hücreler komşu hücrelerle ve altta yatan alt tabakalarla etkileşime devam eder. Bu tür mekanik etkileşimler durotaksis42, plithotaxis33ve kenotaxis43gibi acil fenomenlere yol açar. Ancak bu araştırma fetal büyükbaş hayvan serumu gibi tek bir büyüme faktörü konsantrasyonu kullanılarak yapılmıştır. Boşluğu doldurmak için, bu protokol kimyasal bir degrade altında toplu hücresel göç sırasında mekanik etkileşimleri ölçebilen yeni bir deneysel platformu açıklar.

Yeni platform yaygın olarak kullanılan üç deneysel sistemi bir araya getiriyor: mikrodesenleme, traksiyon mikroskobu ve mikroakışkanlar. İlk olarak, kolektif göç için hücre adalarının mikro desenleme yapıldı. İkinci olarak, göç eden hücrelerin mekanik ölçümleri için hem traksiyon mikroskobu hem de monolayer stres mikroskobu kullanılmıştır. Son olarak, bir mikroakışkan platformu göç hücreleri üzerinde kimyasal gradyan kurmak için kullanılmıştır. Bu deneysel sistemle, tek bir adadaki hücrelerin farklı kimyasal degradelere tepki olarak farklı göç ettiği gösterilmiştir.

Şekil 2'deaçıklandığı gibi, kimyasal degrade mikrokanalın ortasında sadece 1 mm'lik bir mesafede oluşur. Sol sütundaki adalar maksimum konsantrasyona maruz kalır, sağ sütundakiler ise minimum konsantrasyona maruz kalır. Buna karşılık, orta sütundaki adalar kimyasal degradeye maruz kalırlar. Bu şekilde, hücre adalarının tepkisi maksimum, minimum ve aynı deney sırasında çözünür bir faktörün konsantrasyonlarının bir degrade ölçülür. Hücre adaları bu dizi kullanılarak, hücresel göç hızında kademeli bir artış HGF konsantrasyonu arttıkça gözlenmiştir.

Yüksek kaliteli veri elde etmek için, özellikle dikkat gerektiren yordamda önemli adımlar vardır. Özel cam substrat PA jeller floresan parçacıkların dağılımı ve kollajen yüzey kaplama ile ilgili mükemmel olmalıdır. Bunun nedeni, yüksek kaliteli PA jeller olmadan, çekiş analizi ve monolayer stres analizi için yüksek kaliteli bir veri seti elde edilemez olmasıdır. Yüksek kaliteli boncuk resimleriörnekleri Ek Şekil 1'degösterilmiştir. Mikroakışkan kanallar çok küçük, ve kabarcıklar kolayca onları sıkışıp kalırlar. Bu kabarcıklar sadece akışı rahatsız değil, aynı zamanda akış boyunca hareket etmeye başlarsanız uzak hücreleri süpürebilirsiniz. Bu nedenle, kabarcıklar olmadan mikroakışkan kanalları doldurmak için çok önemlidir. Mikrokanal içinde kararlı bir degrade elde etmek için, üç giriş içindeki basınç dengesi çok önemlidir. Aralarındaki dengesizlikleri önlemek için, büyük rezervuarlar, denemenin başındaki dengesizliklerin kolayca ayarlanabilmesi için kullanılmalıdır. Bu yeni platform, rejenerasyon, kanser metastazı ve gelişimi anlamanın anahtarı olan kimyasal degradeler altında kolektif hücre göçünün mekaniğinin daha fazla araştırılmasına yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Acknowledgments

Bu çalışma Kore Hükümeti (MSIP) (No) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NMG) hibe tarafından desteklenmiştir. NRF-2017R1E1A1A01075103), Kore Üniversitesi Hibeve BK 21 Plus programı. Ayrıca Ulusal Sağlık Enstitüleri (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
1 M HEPES buffer solution Gibco 15630-056
1 mm Biopsy punch Integra Miltex 33-31AA-P/25
100 mm petri dishes SPL 10100 100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punch ILJIN 124-0571
18 mm Ø Coverslip Marienfeld-Superior 111580 Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solution Bio-Rad 1610142 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) Sigma-Aldrich 440159-500ML
3-way stopcock Hyupsung HS-T-61N CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-30 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dish Corning 430165
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-75 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acid J.T. Baker JT9508-03
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad 1610700
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Bottom glass chip MicroFIT 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tail Corning 354236
Custom glass holder Han-Gug Mechatronics custom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Welgene LM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biowest L0615-500 w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheres Invitrogen F8764 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Sigma-Aldrich H1404-5UG recombinant, human
JuLI stage live cell imaging system NanoEnTek In Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell type II
Oxygen plasma system Femto Science CUTE-MPR
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich R9379-100MG 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 G KOVAX Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape 3M/Scotch 810D 33 m x 19 mm
SU-8 master molds MicroFIT 4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) Thermo Scientific 22589 Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS
Syringe pump Chemyx Inc. model fusion 720 withdraw fluid
Syringes KOVAX 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lamp UVP LLC 95-0248-02 365 nm wavelength

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  4. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  5. Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
  6. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  7. Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
  8. Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
  9. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  10. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
  11. Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
  12. Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
  13. Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617 (2018).
  14. Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515 (2015).
  15. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  16. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
  17. Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
  18. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
  19. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
  20. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  21. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  22. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  23. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  24. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  25. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  26. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  27. Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
  28. Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 4 Pt 1 041918 (2010).
  30. Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
  31. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  32. Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
  33. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  34. Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
  35. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426 (2009).
  36. Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
  37. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  38. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172 (2013).
  39. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  40. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
  41. Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
  42. Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  43. Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).

Tags

Biyomühendislik Sayı 152 mikroakışkanlar traksiyon mikroskobu kolektif hücre göçü kemotaksis kimyasal gradyan mikrodesen
Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jang, H., Kim, J., Shin, J. H.,More

Jang, H., Kim, J., Shin, J. H., Fredberg, J. J., Park, C. Y., Park, Y. Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration. J. Vis. Exp. (152), e60415, doi:10.3791/60415 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter