Summary
La migración celular colectiva en el desarrollo, la cicatrización de heridas y la metástasis del cáncer a menudo se guía por los gradientes de los factores de crecimiento o moléculas de señalización. Aquí se describe un sistema experimental que combina la microscopía de tracción con un sistema microfluídico y una demostración de cómo cuantificar la mecánica de la migración colectiva bajo gradiente bioquímico.
Abstract
Las células cambian los patrones de migración en respuesta a los estímulos químicos, incluidos los gradientes de los estímulos. La migración celular en la dirección de un gradiente químico, conocido como quimiotaxis, desempeña un papel importante en el desarrollo, la respuesta inmune, la cicatrización de heridas y la metástasis del cáncer. Mientras que la quimiotaxis modula la migración de células individuales, así como las colecciones de células in vivo, la investigación in vitro se centra en la quimiotaxis de una sola célula, en parte debido a la falta de las herramientas experimentales adecuadas. Para llenar ese vacío, descrito aquí es un sistema experimental único que combina microfluídicos y micropatrones para demostrar los efectos de los gradientes químicos en la migración de células colectivas. Además, la microscopía de tracción y la microscopía de tensión monocapa se incorporan al sistema para caracterizar los cambios en la fuerza celular en el sustrato, así como entre las células vecinas. Como prueba de concepto, la migración de islas circulares micropatrónizadas de células renales caninas de Madin-Darby (MDCK) se prueba bajo un gradiente de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un factor de dispersión conocido. Se encuentra que las células ubicadas cerca de la mayor concentración de HGF migran más rápido que las del lado opuesto dentro de una isla celular. Dentro de la misma isla, la tracción celular es similar en ambos lados, pero el estrés intercelular es mucho menor en el lado de una mayor concentración de HGF. Este novedoso sistema experimental puede proporcionar nuevas oportunidades para estudiar la mecánica de la migración quimiotáctica por colectivos celulares.
Introduction
La migración celular en sistemas biológicos es un fenómeno fundamental implicado en la formación de tejidos, la respuesta inmune y la cicatrización de heridas1,2,3. La migración celular también es un proceso importante en algunas enfermedades como el cáncer4. Las celdas a menudo se migran como un grupo en lugar de individualmente, lo que se conoce como migración de celdas colectivas4,5. Para que las células se muevan colectivamente, la notorencia del microambiente es esencial6. Por ejemplo, las células perciben estímulos fisicoquímicos y responden cambiando la motilidad, las interacciones célula-sustrato e interacciones célula-célula, lo que resulta en una migración direccional a lo largo de un gradiente químico7,8, 9,10. Sobre la base de esta conexión, se han realizado rápidos avances en tecnologías de laboratorio en chip que pueden crear microambientes químicos bien controlados, como el gradiente de un quimioatractor11,12,13 . Mientras que estos microfluídicos basados en laboratorio en un chip se han utilizado previamente para estudiar quimiotaxis del conjunto celular o esferoides celulares14,15,16,17, se han utilizado principalmente en el contexto de la migración de una sola célula18,19,20,21. Mecanismos subyacentes a una respuesta colectiva celular a un gradiente químico todavía no se entiende bien14,22,23,24,25,26 . Así, el desarrollo de una plataforma que permita el control espaciotemporal de factores solubles, así como la observación in situ de la biofísica de las células, ayudará a desentrañar los mecanismos detrás de la migración celular colectiva.
Desarrollado y descrito aquí es un sistema microfluídico multicanal que permite la generación de un gradiente de concentración de factores solubles que modula la migración de clústeres de células con patrones. En este estudio, el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) se elige para regular el comportamiento migratorio de las células del riñón canino de Madin-Darby (MDCK). HGF es conocido por atenuar la integridad celular y mejorar la motilidad de las células27,28. En el sistema microfluídico, también se incorporan la microscopía de tracción de transformación de Fourier y la microscopía de tensión monocapa, que permite el análisis de la motilidad, la fuerza contráctil y la tensión intercelular inducida por las células constituyentes en respuesta a un HGF Gradiente. Dentro de la misma isla, las células ubicadas cerca de la mayor concentración de HGF migran más rápido y muestran niveles de estrés intercelular más bajos que aquellos en el lado con menor concentración de HGF. Los resultados sugieren que este nuevo sistema experimental es adecuado para explorar otras cuestiones en campos que implican la migración celular colectiva bajo gradientes químicos de diversos factores solubles.
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Protocol
NOTA: La litografía de los moldes SU-8 para plantillas (espesor de 250 m) y piezas de microcanal (espesor de 150 m), grabado de vidrio (profundidad de 100 m) y fabricación de moldes se externalizaron mediante el envío de diseños utilizando software de diseño asistido por ordenador a los fabricantes.
1. Fabricación de plantilla de polidimetilsiloxano (PDMS) y microcanal
- Diseñar el micropatrón de la plantilla y el microcanal.
- Fabricar o externalizar moldes SU-8 (espesor de 250 m para plantillas y 150 m para microcanales) en obleas de silicio (4" de diámetro).
- Prepare la mezcla pdmS mezclando el elastómero base y el agente de curado en una proporción de 10:1.
- Colocar 15 ml del elastómero base en un tubo cónico de 50 ml y añadir 1,5 ml de agente de curado. Prepara dos de estos.
- Vortex la mezcla PDMS durante 5 min. Centrifuge la mezcla PDMS a 196 x g durante 1 min para eliminar burbujas.
- Para fabricar plantillas PDMS, vierta 1 ml de la mezcla pdmS en la oblea, evitando las regiones con patrón SU-8 para que pdmS toque el lado de los pilares SU-8, pero no la parte superior del patrón SU-8.
- Coloque la oblea sobre una superficie plana durante más de 30 minutos a temperatura ambiente (RT). Curar el PDMS en un horno seco a 80 oC durante más de 2 h.
- Retire cuidadosamente el PDMS del molde SU-8 y recorte la membrana delgada de PDMS con un punzón hueco de 14 mm. Retire el polvo en la superficie de las piezas de PDMS utilizando cinta adhesiva y autoclave las plantillas PDMS.
- Para fabricar el microcanal PDMS, vierta 30 ml de mezcla PDMS sobre el molde SU-8.
- Desgasifique durante 30 minutos en una cámara de vacío y cure el PDMS en un horno seco a 80oC durante más de 2 h.
- Despega con cuidado el PDMS del molde SU-8 y corta el PDMS a un tamaño de 24 mm x 24 mm. En cada bloque PDMS, cree una salida y tres entradas utilizando un punzón de biopsia de 1 mm.
2. Preparación del vidrio inferior con gel de poliacrilamida (PA)
- Fabricación o externalización de gafas correderas rectangulares (24 mm x 24 mm x 1 mm) con un micropozo rectangular (6 mm x 12 mm, 100 mm de profundidad29) cortando y grabando vasos.
- Silanize la superficie de un vidrio inferior30.
- Preparar una solución de silano de unión mezclando 200 ml de agua desionizada (DIW), 80 ml de ácido acético y 50 s de 3-(trimetoxisilyl) de metacrilato de propilo (TMSPMA) durante 1 h.
ADVERTENCIA: TMSPMA es un líquido combustible. Siga las recomendaciones en las fichas de datos de seguridad de materiales. Utilícelo sólo en una campana de humo sorquímico. - Retire el polvo de la superficie del vidrio con cinta adhesiva y autoclave el vidrio.
- Cubra la superficie grabada del vidrio inferior con 100 ml de la solución de silano de unión y deje el vidrio en RT durante 1 h.
- Enjuague el vidrio con DIW 3x y deje que el vidrio se seque a temperatura ambiente o soplando aire.
- Preparar una solución de silano de unión mezclando 200 ml de agua desionizada (DIW), 80 ml de ácido acético y 50 s de 3-(trimetoxisilyl) de metacrilato de propilo (TMSPMA) durante 1 h.
- Preparar una solución de gel para el gel PA31.
- Preparar una solución fresca de 0,5 % (p/v) de persulfato de amonio (APS) disolviendo 5 mg de APS en 1 ml de DIW.
- Preparar la solución de gel pa que consiste en 138 ml de solución de acrilamida al 40%, 101 ml de solución de biscrilamida al 2%, 5 l de solución de partículas fluorescentes (0,2 m) y 655 ml de DIW.
ADVERTENCIA: Las soluciones de acrilamida y bisacrilamida son tóxicas. Use guantes de protección, ropa y protección para los ojos. Proteja la solución de gel PA que contiene partículas fluorescentes de la luz.
NOTA: Vortex la solución de perlas fluorescentes antes de pipetear para obtener un número uniforme de cuentas fluorescentes por lote. - Después de añadir 100 l de la solución APS y 1 l de tetrametiletilendiamina (TEMED), transfiera 10 ml de solución de gel mezclado al micropozo rectangular y coloque sobre un cubreobjetos circular (18 mm).
NOTA: Para llenar el vaso inferior con gel PA sin burbujas, coloque suficiente solución de gel en la ranura del vidrio inferior, deslice cuidadosamente el cubreobjetos sobre la solución de gel y retire cualquier solución de gel en exceso.
ADVERTENCIA: El gel se cura lentamente durante unos 40 minutos. El siguiente procedimiento para la centrifugación de geles debe llevarse a cabo tan pronto como sea posible. - Voltear el conjunto de vidrio personalizado, solución de gel, y cubreobjetos, a continuación, centrífuga durante 10 minutos a 96 x g para llevar partículas fluorescentes a la capa superior de gel PA.
- Retire el conjunto de la centrífuga y colóquelo sobre la superficie plana con el revestimiento hacia abajo.
NOTA: A partir del paso 2.3.6, manipule las muestras en un gabinete de bioseguridad. - Después de 30 min, voltee el conjunto y colóquelo en una placa Petri de 35 mm, llene con 2 ml de DIW y (usando fórceps) retire suavemente el cubreobjetos deslizándolo hacia un lado.
NOTA: El gel PA curado se puede almacenar en DIW durante 1 mes. Sin embargo, una vez que el colágeno se recubre en el gel PA, se debe utilizar en un experimento dentro de 1 día.
- Recubrir colágeno en el gel PA.
- Disolver 1 mg/ml de sulfosuccinimidil 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoato (sulfo-SANPAH) en un tampón HEPES cálido de 50 mM. Dejar caer 200 l de la solución sobre la superficie del gel y activarla por luz UV (365 nm de longitud de onda) durante 10 min.
NOTA: Proteja el sulfo-SANPAH de la luz. - Enjuagar el gel con 0.1 M [4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesácido ácido; BÚFER HEPES] 2x y con PBS 1x.
- Recubrir el gel pa con solución de colágeno (100 g/ml en PBS, colágeno de cola de rata tipo I) a 4 oC durante la noche. Al día siguiente, lavar con PBS 3x.
- Disolver 1 mg/ml de sulfosuccinimidil 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoato (sulfo-SANPAH) en un tampón HEPES cálido de 50 mM. Dejar caer 200 l de la solución sobre la superficie del gel y activarla por luz UV (365 nm de longitud de onda) durante 10 min.
3. Micropatrón de islas celulares
- Prepare la solución F-127(Tabla de materiales) [2% (w/v) en PBS] y sumerja la plantilla PDMS autoclaved en la solución F-127. Mantenerla en una incubadora de 37oC durante 1 h.
- Preparar la solución celular (2 x 106 células/ml) en medios de cultivo celular que consisten en: Medio de águila modificado (DMEM) modificado de Dulbecco con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% antibiótico-antimicótico (AA).
- Lave la plantilla PDMS con PBS 3x y retire el líquido de la plantilla PDMS y del gel PA. Coloque la plantilla PDMS en el gel PA y agregue PBS a la galería de símbolos.
- Elimine las burbujas en los orificios de la plantilla PDMS pipeteando suavemente. Después de eliminar burbujas, elimine PBS de la superficie de la galería de símbolos PDMS.
- Después de poner 200 l de solución celular en la plantilla PDMS, mantenga el gel PA en una incubadora durante 1 h para que las células se adhieran al gel PA.
- Lave suavemente la solución celular con medios de cultivo celular, quite la galería de símbolos PDMS y agregue más medios de cultivo celular. Compruebe la formación de islas celulares bajo un microscopio.
4. Montaje de gel PA con microcanal PDMS
- Retire el polvo del microcanal PDMS con cinta adhesiva y, a continuación, autoclave.
- Tratar la superficie del microcanal PDMS con plasma de oxígeno (80 W, 50 kHz) durante 30 s.
- Después de retirar cualquier fluido en el vidrio inferior lleno de gel PA, coloque el microcanal PDMS en la parte superior del cristal inferior y coloque el conjunto en el soporte de vidrio personalizado.
- Llene el microcanal con medio de cultivo celular.
ADVERTENCIA: Asegúrese de eliminar todas las burbujas atrapadas en los canales lavando suavemente los medios calientes con una pipeta. Además, mientras eliminas las burbujas, asegúrate de no separar las islas celulares micropatrónadas.
5. Sistema microfluídico integrado
- Conecte los tubos.
- Prepare los conectores recortando la punta de las agujas (18 G) y doblándola 90o.
- Prepare las líneas de tubos para tres entradas y una salida.
- Para tubos de entrada, conecte la aguja recortada y una línea de minivolumen de 30 cm con una caja de tres vías. Preparen tres de estos.
- Para tubos de salida, conecte la aguja recortada y una línea de minivolumen de 75 cm con una caja de tres vías. Prepara uno de estos.
- Llene las líneas de tubo con el medio que ha sido precalentado durante 1 h.
ADVERTENCIA: Asegúrese de eliminar todas las burbujas atrapadas en las líneas de tubería lavando suavemente los medios calientes con una jeringa.
- Prepare los depósitos retirando los émbolos de las jeringas y conectando las líneas de tubos de entrada.
- Enchufe los conectores de la aguja de cada línea de tubería en las tres entradas y una salida del dispositivo microfluídico.
- Llenar los depósitos con 3 ml de medio fresco o acondicionado cada uno.
- Para la prueba de gradiente, rellene el depósito de entrada izquierdo con 20 ng/ml HGF en el medio de cultivo celular.
- Para la visualización del gradiente de concentración, agregue un tinte fluorescente de 200 g/ml (rhodamina B-dextran, 70 kDa) al depósito de entrada izquierdo.
- Conecte la línea de tubos de salida a una bomba de jeringa.
NOTA: El modo de funcionamiento de la bomba de jeringa es "retirada". El caudal se cambia según la capacidad de la jeringa y la velocidad de funcionamiento de la bomba de jeringa.
- Coloque el sistema microfluídico integrado en el escenario de un microscopio epifluorescente convencional.
ADVERTENCIA: Para generar un gradiente suave de HGF en el canal microfluídico, el caudal debe ser tan lento como 0,1 l/min. Esto es lo suficientemente sensible para que requiera estabilización durante 2 h, y se debe tener cuidado para evitar perturbaciones físicas durante el experimento.
6. Adquisición de imágenes
- Tome imágenes cada 10 minutos durante un máximo de 24 horas utilizando un microscopio automatizado alojado en una incubadora. En cada punto de tiempo, tome un conjunto de imágenes utilizando una lente objetivo 4x en tres canales diferentes, incluyendo la imagen de fase para visualizar la migración celular, la imagen fluorescente verde para visualizar las cuentas fluorescentes incrustadas en el gel PA, y la imagen fluorescente roja para visualizar la imagen fluorescente roja para visualizar la gradiente de concentración de un producto químico.
- Después de tomar imágenes de lapso de tiempo, infundir 0.25% solución trypsin-EDTA en microcanales para separar las células del gel PA. Después de eliminar completamente las células del gel, tome una imagen fluorescente verde para ser utilizada como imagen de referencia para la microscopía de tracción.
7. Análisis de datos
NOTA: Se desarrolló un código personalizado para el análisis de datos utilizando MATLAB, y los detalles se han descrito en otros lugares32,33,34,35,36.
- Para el análisis de imágenes de fase, calcule los desplazamientos en dos imágenes de fase consecutiva utilizando la velocimetría de imagen departículas 36.
- Para la microscopía de tracción de transformación de Fourier, compare cada imagen fluorescente verde con la imagen de referencia y calcule los desplazamientos en cada imagen utilizando la velocimetría de imagen departículas 36. A partir de los desplazamientos, recuperar la tracción realizada por las células en gel PA utilizando la microscopía de tracción de transformación Fourier33,34,37.
- A partir de los datos de tracción, calcular la tensión dentro de la monocapa de la isla celular utilizando microscopía de tensión monocapa basada en los métodos de elementos finitos32,34,38.
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Representative Results
Para explorar la migración colectiva bajo un gradiente químico, se integró un sistema microfluídico con microscopía de tracción(Figura 1). Para construir el sistema integrado, el gel de poliacrilamida (PA) se fundó en vidrio cortado a medida, y las células MDCK fueron sembradas dentro de islas micropatrónizadas hechas por una plantilla PDMS. Para este experimento, se crearon doce islas de células MDCK (cuatro filas por tres columnas, diámetro de 700 m). Después de las células unidas a geles PA, se eliminó la plantilla PDMS para iniciar la migración colectiva. El canal microfluídico prefabricado se colocó encima de los geles pa para construir un canal microfluídico por encima de las islas celulares(Figura 1A).
Para establecer un gradiente de concentración dentro del canal microfluídico, la entrada izquierda se conectó al depósito de suministro que contenía una solución de tinte fluorescente. Además, las entradas intermedias y correctas estaban conectadas únicamente a los depósitos de suministro que contenían medios. A continuación, la salida se conectó a la bomba de la jeringa para extraer el líquido del canal microfluídico. El sándwich de vidrio cortado a medida y el canal microfluídico se insertó en la etapa de microscopio hecha a medida. Las muestras junto con el microscopio fluorescente automatizado se mantuvieron dentro de una incubadora para imágenes de células vivas. A lo largo de los experimentos, las células se mantuvieron en el 5% deCO2 y 37 oC. Rápidamente se estableció un gradiente de la intensidad del tinte fluorescente a un caudal de 0,125 - 2 l/min(Figura 2A). La pendiente del gradiente dependía del caudal. Por ejemplo, a un caudal de 0,125 l/min, el gradiente se desarrolló en más de 1,5 mm, que es el tamaño comparable de las islas celulares(Figura 2B).
A continuación, se probó el dispositivo integrado con celdas. Las islas de las células MDCK fueron micropatrónadas y ensambladas con el canal microfluídico como se describió anteriormente. En primer lugar, sin aplicar ningún flujo en el microcanal, se aseguró que la isla celular se extendió bien dentro del dispositivo. Durante un período de 12 h, la isla se expandió, y la velocidad media de migración fue de 0,1 a 0,2 m/min. Si bien hubo variaciones entre las islas con respecto a cuánto se expandió la isla, todas las células parecían saludables en la condición de no flujo. A continuación, se aplicó el flujo sobre estas islas, y se encontró que a un caudal de 0,1 l/min, la isla celular se extendió bien y las células mantuvieron una velocidad media de migración de 0,1 a 0,2 m/min durante 12 horas. Sin embargo, al aumentar el caudal a 0,5 l/min, las células no se extendieron bien, y la velocidad media de migración disminuyó a menos de 0,1 m/min. Además, las morfologías de las células parecían diferentes y parecían estar desprendándose de los geles de PA(Figura 3). Sobre la base de estos datos, se eligió 0,1 l/min como caudal para los siguientes experimentos.
Para probar los efectos de un gradiente químico en la migración de células colectivas, HGF fue elegido32,34. La entrada izquierda se conectó a 1) el depósito de suministro que contiene medios de cultivo celular con solución HGF (20 ng/ml) y 2) las otras 2 entradas con reservorios que contienen medios de cultivo celular. Con un caudal de 0,1 l/min, se mantuvo el flujo sobre las islas celulares migratorias (cuatro filas por tres columnas) durante 10 h(Figura 4). Como se muestra en un experimento separado, la concentración de HGF en la columna izquierda estaba cerca de la concentración de la solución de supplo (20 ng/ml), y en la columna derecha, esto estaba cerca de cero. La concentración de HGF en la columna central disminuyó gradualmente de la mitad izquierda a la mitad derecha. Al comparar el tamaño de las islas celulares después de 10 h, las islas en la columna derecha no se expandieron mucho, pero las de la columna izquierda se hicieron significativamente más grandes y se expandieron en todas las direcciones(Figura 4A). Estos cambios en el tamaño de la isla fueron apoyados por las trayectorias de las células dentro de cada isla(Figura 4B). Curiosamente, las islas en la columna central no se expandieron hacia la derecha (donde la concentración de HGF era baja) sino que se expandieron preferentemente hacia la izquierda (donde la concentración de HGF era alta). Si bien hubo pocos cambios en la velocidad media de migración en la columna derecha, en las columnas izquierda y media, la velocidad media de migración aumentó gradualmente durante las primeras 3 h, luego disminuyó gradualmente(Figura 4C).
Para medir la fuerza contráctilela y la tensión intercelular, la microscopía de tracción37,39,40 y la microscopía de tensión monocapa se combinaron con el canal microfluídico33,35, 38. En el transcurso de 10 h durante la aplicación del gradiente químico, se tomaron imágenes de partículas fluorescentes en geles PA, y la fuerza (por unidad de área) aplicada por las células en el sustrato se analizó utilizando la microscopía de tracción de transformación de Fourier35, 37. La tracción se trazaba en coordenadas polares. El azul representa la fuerza hacia el centro de la isla, y el rojo representa la fuerza lejos del centro.
En el momento cero, todas las islas mostraron distribuciones de tracción similares, con una fuerte tracción interna en el borde y fluctuaciones dentro de la isla. Esta fluctuación fue similar a la que se ha mostrado anteriormente34,35,41. Después de 10 h de aplicar el gradiente HGF, mientras que el grado de expansión de la isla fue diferente en cada columna, las distribuciones de tracción fueron en gran medida similares al tiempo cero(Figura 5A). La tracción media no cambió durante 10 h(Figura 5C). Sin embargo, al calcular la tensión monocapa, cada columna mostraba tendencias diferentes. En la columna derecha (donde la concentración de HGF era baja), la tensión media dentro de las islas se mantuvo alrededor de 200 Pa durante un período de 10 h. En la columna izquierda (donde la concentración de HGF era alta), la tensión media dentro de las islas disminuyó gradualmente de 230 Pa a 100 Pa sobre 10 h, como se ha mostrado anteriormente32,34. En la columna central (donde la concentración de HGF era alta en la mitad izquierda y baja en la mitad derecha de la isla), la tensión promedio se mantuvo alrededor de 150 Pa.
Figura 1: Esquema de la preparación del dispositivo integrado. (A) Para fabricar el dispositivo integrado, se cubrió con un microcanal PDMS un vaso inferior con gel PA en el que se estandaron islas celulares utilizando una plantilla PDMS. (B) Los dispositivos integrados se fijaron utilizando un soporte personalizado para evitar fugas de fluidos y disociación de componentes. (C) Después de que el dispositivo se llenó de líquido sin burbujas, se conectaron depósitos a las entradas y se conectó una bomba de jeringa a la salida. Todas las configuraciones experimentales se colocaron en un sistema de imágenes de células vivas. (D) El esquema muestra el diseño y la composición de los canales microfluídicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Establecimiento del gradiente c hemical. (A) Las imágenes de fluorescencia de la rodamina B-conjugada dextran (70 kDa) visualizan el gradiente de concentración bajo el flujo de fluido de 0,125 l/min, 0,5 l/min y 2 círculos de puntos de tamaño indican la posición de las islas celulares con patrón. (B) El perfil de intensidad de la imagen de fluorescencia muestra que el gradiente de concentración en el dispositivo era ajustable por el caudal. Las barras de error indican la desviación estándar. Las barras de color indican las posiciones de columna de la isla celular con patrón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Migración de islas celulares MDCK bajo flujo. (A) Las imágenes de fase a 12 h de la isla celular MDCK a cada caudal (0 l/min, 0,1 l/min y 0,5 l/min) muestran que las islas celulares se expandieron bien a un caudal bajo, pero no se expandieron a un caudal alto. Las líneas de puntos representan los límites a 0 h. (B) La media y el histograma de la velocidad celular dentro de cada isla cada 10 minutos durante 12 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Migración de islas celulares MDCK bajo flujo y gradiente químico. (A) El rango de intensidad relativa de la deextran conjugada conjugada con rhodamine B mantuvo un gradiente de concentración de HGF constante en cada columna después de la estabilización durante 2 h. (B) Imágenes de fase a 10 h (línea de puntos ) límite de isla celular a 0 h) de la célula MDCK isla bajo el gradiente HGF (de izquierda a derecha: 20-0 ng/mL) muestran que la isla se expandió más donde la concentración de HGF era mayor. (C) Las trayectorias de las rutas de migración (la codificación de color indica la longitud de la ruta) de las celdas en las islas celulares MDCK. Las líneas de puntos y las líneas discontinuas representan los límites de cada isla de celda en 0 h y 10 h, respectivamente. (D) La media y el histograma de la velocidad celular dentro de cada isla cada 10 minutos durante 10 h. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Interacciones mecánicas de las islas celulares MDCK. (A) Los mapas de tracción (interacción célula-sustrato) en las islas celulares a 0 h y 10 h bajo el gradiente HGF. Los mapas se trazaron en coordinación radial, con tracción exterior utilizando color cálido y tracción interior utilizando color frío. (B) Los mapas de tensión monocapa (interacciones célula-célula) en las islas celulares a 0 h y 10 h bajo gradiente HGF. (C) La gráfica de tracción media (cuadrado gris) y tensión (círculo azul) dentro de las islas celulares bajo gradiente HGF a lo largo del tiempo cada 10 min durante 10 h. Las bandas de color representan el cuartil medio (25%–75 %). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria S1: Se requiere una distribución adecuada del cordón para una calidad de datos suficiente durante el análisis de la fuerza de tracción. Se muestran ejemplos de imágenes de perlas fluorescentes de buena (izquierda) y mala (derecha) con imágenes ampliadas en las cajas blancas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La migración colectiva de células constituyentes es un proceso importante durante el desarrollo y la regeneración, y la dirección migratoria a menudo se guía por el gradiente químico de los factores de crecimiento4,23. Durante la migración colectiva, las células siguen interactuando con las células vecinas y sustratos subyacentes. Tales interacciones mecánicas dan lugar a fenómenos emergentes como durotaxis42, plithotaxis33y kenotaxis43. Sin embargo, esta investigación se realizó utilizando una sola concentración de factores de crecimiento, como los del suero bovino fetal. Para llenar el vacío, este protocolo describe una nueva plataforma experimental que puede medir las interacciones mecánicas durante la migración celular colectiva bajo un gradiente químico.
La nueva plataforma combina tres sistemas experimentales que se han utilizado ampliamente: micropatrones, microscopía de tracción y microfluidos. En primer lugar, se realizó el micropatrón de las islas celulares para la migración colectiva. En segundo lugar, tanto la microscopía de tracción como la microscopía de tensión monocapa se utilizaron para mediciones mecánicas de células migratorias. Finalmente, se utilizó una plataforma de microfluidos para establecer gradientes químicos sobre las células migratorias. Con este sistema experimental, se demostró que las células dentro de una sola isla migran de manera diferente en respuesta a diferentes gradientes químicos.
Como se describe en la Figura 2,el gradiente químico se forma sólo a lo largo de una distancia de 1 mm en el centro del microcanal. Las islas de la columna izquierda se exponen a la concentración máxima, y las de la columna derecha se exponen a la concentración mínima. Por el contrario, las islas de la columna central se exponen al gradiente químico. De esta manera, la respuesta de las islas celulares se mide al máximo, mínimo y un gradiente de concentraciones de un factor soluble durante el mismo experimento. Usando esta matriz de islas celulares, se observó un aumento gradual en la velocidad de migración celular a medida que aumentaba la concentración de HGF.
Para lograr datos de alta calidad, hay pasos clave en el procedimiento que requieren una atención especial. Los geles PA en un sustrato de vidrio personalizado deben ser perfectos con respecto a la distribución de partículas fluorescentes y recubrimiento superficial de colágeno. Esto se debe a que sin geles PA de alta calidad, no se puede adquirir un conjunto de datos de alta calidad para el análisis de tracción y el análisis de tensión monocapa. En la Figura suplementaria 1se muestran ejemplos de imágenes de cuentas de alta calidad. Los canales microfluídicos son muy pequeños, y las burbujas se atrapan fácilmente en ellos. Estas burbujas no sólo perturban el flujo, sino que también pueden barrer las celdas si comienzan a moverse a lo largo del flujo. Por lo tanto, es crucial llenar los canales microfluídicos sin burbujas. Para lograr un gradiente estable dentro del microcanal, el equilibrio de presión dentro de las tres entradas es muy importante. Para evitar desequilibrios entre ellos, se deben utilizar grandes reservorios para que los desequilibrios al principio de un experimento se puedan ajustar fácilmente. Esta nueva plataforma ayudará a explorar aún más la mecánica de la migración de células colectivas bajo gradientes químicos, que es clave para entender la regeneración, la metástasis del cáncer y el desarrollo.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano (MSIP) (No. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant y el programa BK 21 Plus. También fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Gibco | 15630-056 | |
| 1 mm Biopsy punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| 100 mm petri dishes | SPL | 10100 | 100 mm diameter, 15 mm height |
| 14 mm hollow punch | ILJIN | 124-0571 | |
| 18 mm Ø Coverslip | Marienfeld-Superior | 111580 | Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| 2% bis-acrylamide solution | Bio-Rad | 1610142 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) | Sigma-Aldrich | 440159-500ML | |
| 3-way stopcock | Hyupsung | HS-T-61N | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 30 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-30 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 75 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-75 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| acetic acid | J.T. Baker | JT9508-03 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Bottom glass chip | MicroFIT | 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm) | |
| Collagen typeI, Rat tail | Corning | 354236 | |
| Custom glass holder | Han-Gug Mechatronics | custom-made | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM 001-11 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | w/o Magnesium, Calcium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| FluoSpheres amine-modified microspheres | Invitrogen | F8764 | 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515) |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Sigma-Aldrich | H1404-5UG | recombinant, human |
| JuLI stage live cell imaging system | NanoEnTek In | Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell | type II | ||
| Oxygen plasma system | Femto Science | CUTE-MPR | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| Rhodamine B isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | R9379-100MG | 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel |
| Steril hypodermic needle 18 G | KOVAX | Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line | |
| Sticky tape | 3M/Scotch | 810D | 33 m x 19 mm |
| SU-8 master molds | MicroFIT | 4” diameter, custom-made | |
| sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 | Store at -20°C. Store protected from moisture and light. |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS | |
| Syringe pump | Chemyx Inc. | model fusion 720 | withdraw fluid |
| Syringes | KOVAX | 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump | |
| tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Ultraviolet (UV) lamp | UVP LLC | 95-0248-02 | 365 nm wavelength |
References
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