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Bioengineering

Microscopie de traction intégrée à la microfluidique pour la migration collective chimiotaxique

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/60415
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1
1Department of Biomedical Sciences, Korea University, 2Department of Mechanical Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3Department of Environmental Health, Harvard T.H. Chan School of Public Health

Summary

La migration collective des cellules dans le développement, la cicatrisation des plaies et la métastes du cancer est souvent guidée par les gradients des facteurs de croissance ou des molécules de signalisation. Décrit ici est un système expérimental combinant la microscopie de traction avec un système microfluidique et une démonstration de la façon de quantifier la mécanique de la migration collective sous gradient biochimique.

Abstract

Les cellules modifient les schémas de migration en réponse aux stimuli chimiques, y compris les gradients des stimuli. La migration cellulaire dans la direction d'un gradient chimique, connu sous le nom de chimiotaxis, joue un rôle important dans le développement, la réponse immunitaire, la cicatrisation des plaies et les métastes cancéreuses. Alors que la chimiotaxie module la migration des cellules individuelles ainsi que des collections de cellules in vivo, la recherche in vitro se concentre sur la chimiotaxie unicellulaire, en partie en raison de l'absence des outils expérimentaux appropriés. Pour combler cette lacune, décrit ici est un système expérimental unique qui combine microfluidique et micropatterning pour démontrer les effets des gradients chimiques sur la migration cellulaire collective. En outre, la microscopie de traction et la microscopie de contrainte de monocouche sont incorporées dans le système pour caractériser des changements dans la force cellulaire sur le substrat aussi bien qu'entre les cellules voisines. Comme preuve de concept, la migration des îles circulaires micropatternées des cellules canines de madin-Darby (MDCK) est testée sous un gradient de facteur de croissance d'hépatocyte (HGF), un facteur de diffusion connu. On constate que les cellules situées près de la concentration plus élevée de HGF migrent plus rapidement que celles du côté opposé à l'intérieur d'une île cellulaire. Dans la même île, la traction cellulaire est similaire des deux côtés, mais le stress intercellulaire est beaucoup plus faible sur le côté de la concentration plus élevée de HGF. Ce nouveau système expérimental peut offrir de nouvelles possibilités d'étudier la mécanique de la migration chimiotaxique par les collectifs cellulaires.

Introduction

La migration cellulaire dans les systèmes biologiques est un phénomène fondamental impliqué dans la formation des tissus, la réponse immunitaire, et la cicatrisation des plaies1,2,3. La migration cellulaire est également un processus important dans certaines maladies comme le cancer4. Les cellules migrent souvent en groupe plutôt qu'individuellement, ce qui est connu sous le nom de migration cellulaire collective4,5. Pour que les cellules se déplacent collectivement, la détection du microenvironnement est essentielle6. Par exemple, les cellules perçoivent les stimuli physicochimiques et réagissent en changeant la motilité, les interactions cellule-substrat et les interactions cellule-cellule, entraînant une migration directionnelle le long d'un gradient chimique7,8, 9,10. Sur la base de cette connexion, des progrès rapides ont été réalisés dans les technologies de laboratoire sur puce qui peuvent créer des microenvironnements chimiques bien contrôlés tels que le gradient d'un chimioattractant11,12,13 . Alors que ces microfluidiques à base de laboratoire sur puce ont déjà été utilisés pour étudier la chimiotaxie de l'ensemble cellulaire ou sphéroïdes cellulaires14,15,16,17, ils ont été utilisés principalement dans le contexte de la migration unicellulaire18,19,20,21. Mécanismes sous-jacents à une réponse collective cellulaire à un gradient chimique n'est toujours pas bien compris14,22,23,24,25,26 . Ainsi, le développement d'une plate-forme qui permet le contrôle spatiotemporel des facteurs solubles ainsi que l'observation in situ de la biophysique des cellules aidera à démêler les mécanismes derrière la migration cellulaire collective.

Développé et décrit ici est un système microfluidique multicanal qui permet la génération d'un gradient de concentration de facteurs solubles qui module la migration des amas de cellules à motifs. Dans cette étude, le facteur de croissance des hépatocytes (HGF) est choisi pour réguler le comportement migratoire des cellules canines de madin-Darby (MDCK). HGF est connu pour atténuer l'intégrité cellulaire et améliorer la motilité des cellules27,28. Dans le système microfluidique, Fourier transforme la microscopie de traction et la microscopie de contrainte de monocouche sont également incorporées, qui permet d'analyser la motilité, la force contractile, et la tension intercellulaire induite par les cellules constituantes en réponse à un HGF inclinaison. Dans la même île, les cellules situées près de la concentration plus élevée de HGF migrent plus rapidement et montrent des niveaux de stress intercellulaire plus faibles que ceux sur le côté avec une concentration plus faible de HGF. Les résultats suggèrent que ce nouveau système expérimental est approprié pour explorer d'autres questions dans les domaines impliquant la migration cellulaire collective sous des gradients chimiques de divers facteurs solubles.

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Protocol

REMARQUE : Lithographie des moules SU-8 pour pochoirs (épaisseur de 250 m) et des pièces microcanaux (épaisseur de 150 m), gravure en verre (profondeur de 100 m) et fabrication de moulages ont été externalisées en envoyant des dessins à l'aide d'un logiciel de conception assisté par ordinateur aux fabricants.

1. Fabrication de pochoir et microcanal en polydiméthylsiloxane (PDMS)

  1. Concevoir le micromotif du pochoir et du microcanal.
  2. Fabriquer ou externaliser les moules SU-8 (épaisseur de 250 m pour les pochoirs et de 150 m pour les microcanaux) sur des plaquettes de silicium (4 po de diamètre).
  3. Préparer le mélange PDMS en mélangeant l'élastomère de base et l'agent de durcissement à un rapport de 10:1.
    1. Placer 15 ml de l'élastomère de base dans un tube conique de 50 ml et ajouter 1,5 ml d'agent de durcissement. Préparez-en deux.
    2. Vortex le mélange PDMS pendant 5 min. Centrifuger le mélange PDMS à 196 x g pendant 1 min pour enlever les bulles.
  4. Pour fabriquer le pochoir PDMS, versez 1 ml du mélange PDMS sur la plaquette, tout en évitant les régions à motifs SU-8 de sorte que le PDMS touche le côté des piliers SU-8, mais pas le haut du modèle SU-8.
    1. Placer la plaquette sur une surface plane pendant plus de 30 min à température ambiante (RT). Faire le PDMS dans un four sec à 80 oC pendant plus de 2 h.
    2. Épluchez soigneusement le PDMS du moule SU-8 et coupez la fine membrane PDMS à l'aide d'un poinçon creux de 14 mm. Retirez la poussière à la surface des morceaux de PDMS à l'aide de ruban adhésif et autoclavez les pochoirs PDMS.
  5. Pour fabriquer le microcanal PDMS, versez 30 ml de mélange PDMS sur le moule SU-8.
    1. Dégazer pendant 30 min dans une chambre à vide et guérir le PDMS dans un four sec à 80 oC pendant plus de 2 h.
    2. Épluchez soigneusement le PDMS du moule SU-8 et coupez le PDMS à une taille de 24 mm x 24 mm. Dans chaque bloc PDMS, créez une prise et trois entrées à l'aide d'un poinçon de biopsie de 1 mm.

2. Préparation du verre de fond avec le gel de polyacrylamide (PA)

  1. Fabriquer ou externaliser des lunettes à glissière rectangulaire (24 mm x 24 mm x 1 mm) avec un micro-puits rectangulaire (6 mm x 12 mm, 100 m de profondeur29) par des verres de coupe et de gravure.
  2. Silaniser la surface d'un verre de fond30.
    1. Préparer une solution de silane de liaison en mélangeant 200 ml d'eau déionisée (DIW), 80 l d'acide acétique et 50 l de 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate (TMSPMA) pendant 1 h.
      CAUTION: TMSPMA est un liquide combustible. Suivez les recommandations dans les fiches de données sur la sécurité des matériaux. Utiliser uniquement dans une hotte de fumée chimique.
    2. Retirer la poussière de la surface du verre par du ruban adhésif et autoclave le verre.
    3. Couvrir la surface gravée du verre inférieur avec 100 l de la solution de silane de liaison et laisser le verre à RT pendant 1 h.
    4. Rincer le verre avec DIW 3x et laisser sécher le verre à température ambiante ou en soufflant de l'air.
  3. Préparer une solution de gel pour le gel PA31.
    1. Préparer une solution fraîche de 0,5 % (w/v) persulfate d'ammonium (APS) en dissolvant 5 mg d'APS dans 1 ml de DIW.
    2. Préparer la solution de gel PA composée de 138 l de 40 % de solution d'acrylamide, de 101 l de solution bis-acrylamide de 2 %, de 5 l de solution de particules fluorescentes (0,2 m) et de 655 l de DIW.
      CAUTION : Les solutions d'acrylamide et de bisacrylamide sont toxiques. Portez des gants de protection, des vêtements et une protection oculaire. Protégez la solution de gel PA contenant des particules fluorescentes de la lumière.
      REMARQUE : Vortex la solution de perle fluorescente avant le tuyauterie pour obtenir un nombre uniforme de perles fluorescentes par lot.
    3. Après l'ajout de 100 L de la solution APS et de 1 L de tétramethylethylenediamine (TEMED), transférer 10 L de solution de gel mixte sur le micro-puits rectangulaire, et placer sur le dessus un bordereau circulaire (18 mm).
      REMARQUE : Pour remplir le verre inférieur avec du gel PA sans bulles, placez une solution de gel suffisante sur la rainure du verre inférieur, faites glisser soigneusement la glissière de couverture sur la solution de gel et enlevez toute solution de gel excédentaire.
      CAUTION: Le gel est lentement durci pendant environ 40 min. La procédure suivante pour les gels centrifiants doit être effectuée dès que possible.
    4. Retourner l'assemblage du verre personnalisé, la solution de gel, et le bordereau, puis centrifugeuse pendant 10 min à 96 x g pour apporter des particules fluorescentes à la couche supérieure du gel PA.
    5. Retirez l'assemblage de la centrifugeuse et placez-le sur la surface plane avec la couverture vers le bas.
      REMARQUE : En commençant par l'étape 2.3.6, manipulez des échantillons dans une armoire de biosécurité.
    6. Après 30 min, retourner l'assemblage et le placer dans un plat Petri de 35 mm, remplir de 2 ml de DIW, et (à l'aide de forceps) retirer délicatement le bordereau en le glissant d'un côté.
      REMARQUE : Le gel PA durci peut être stocké dans Le DIW pendant 1 mois. Cependant, une fois que le collagène est enduit sur le gel PA, il doit être utilisé dans une expérience dans un délai de 1 jour.
  4. Enrober le collagène sur le gel PA.
    1. Dissoudre 1 mg/mL sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate (sulfo-SANPAH) dans un tampon HEPES chaud de 50 mM. Déposer 200 l de la solution sur la surface du gel et activer par la lumière UV (365 nm longueur d'onde) pendant 10 min.
      REMARQUE : Protégez le sulfo-SANPAH de la lumière.
    2. Rincer le gel avec 0,1 M [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide; HEPES] tampon 2x et avec PBS 1x.
    3. Enrober le gel PA d'une solution de collagène (100 g/mL en PBS, collagène de queue de rat de type I) à 4 oC pendant la nuit. Le lendemain, lavez-vous avec PBS 3x.

3. Micropatterning des îles cellulaires

  1. Préparer la solution F-127(Table of Materials) [2 % (w/v) en PBS] et immerger le pochoir PDMS autoclaved dans la solution F-127. Conservez-le dans un incubateur de 37 oC pendant 1 h.
  2. Préparer la solution cellulaire (2 x 106 cellules/mL) dans les milieux de culture cellulaire composés de : le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % d'antibiotique-antimycotique (AA).
  3. Laver le pochoir PDMS avec PBS 3x et retirer le liquide du pochoir PDMS et du gel PA. Placez le pochoir PDMS sur le gel PA et ajoutez du PBS au pochoir.
  4. Enlever les bulles dans les trous du pochoir PDMS en pipetting doucement. Après avoir enlevé les bulles, retirer le PBS de la surface du pochoir PDMS.
  5. Après avoir mis 200 L de solution cellulaire sur le pochoir PDMS, garder le gel PA dans un incubateur pendant 1 h afin que les cellules se fixent au gel PA.
  6. Lavez doucement la solution cellulaire avec des supports de culture cellulaire, retirez le pochoir PDMS et ajoutez plus de supports de culture cellulaire. Vérifier la formation d'îles cellulaires au microscope.

4. Assemblage du gel PA avec microcanal PDMS

  1. Retirez la poussière sur le microcanal PDMS à l'aide de ruban adhésif, puis autoclave.
  2. Traiter la surface du microcanal PDMS avec du plasma d'oxygène (80 W, 50 kHz) pendant 30 s.
  3. Après avoir enlevé tout liquide sur le verre de fond rempli de gel PA, placez le microcanal PDMS sur le dessus du verre inférieur et placez l'assemblage sur le support de verre personnalisé.
  4. Remplissez le microcanal avec le milieu de culture cellulaire.
    CAUTION: Assurez-vous d'enlever toutes les bulles emprisonnées dans les canaux en rinçant doucement les médias chauds avec une pipette. En outre, tout en enlevant les bulles, assurez-vous de ne pas détacher les îles de cellules micropatternées.

5. Système microfluidique intégré

  1. Connectez les tubes.
    1. Préparer les connecteurs en coupant la pointe des aiguilles (18 G) et en la pliant à 90 degrés.
    2. Préparer les tubes pour trois entrées et une prise.
      1. Pour les tubes d'inlet, connectez l'aiguille taillée et une ligne de mini-volume de 30 cm à un stopcock à trois voies. Préparez-en trois.
      2. Pour les tubes de sortie, connectez l'aiguille taillée et une ligne de mini-volume de 75 cm avec un stopcock à trois voies. Préparez-en un.
      3. Remplir les tubes avec le milieu qui a été préchauffé pendant 1 h.
        CAUTION: Assurez-vous d'enlever toutes les bulles emprisonnées dans les lignes de tuyauterie en rinçant doucement les médias chauds avec une seringue.
    3. Préparer les réservoirs en enlevant les plongeurs des seringues et en connectant les tubes d'inlet.
    4. Branchez les connecteurs d'aiguilles de chaque ligne de tubes dans les trois entrées et une prise de l'appareil microfluidique.
  2. Remplir les réservoirs de 3 ml de milieu frais ou de milieu conditionné chacun.
    1. Pour l'essai de gradient, remplissez le réservoir d'aneth gauche avec 20 ng/mL HGF dans le milieu de culture cellulaire.
    2. Pour la visualisation du gradient de concentration, ajouter un colorant fluorescent de 200 g/mL (rhodamine B-dextran, 70 kDa) au réservoir d'aneth gauche.
    3. Connectez la ligne de tuyauterie à une pompe à seringues.
      REMARQUE : Le mode de fonctionnement de la pompe à seringues est le « retrait ». Le débit est modifié en fonction de la capacité de la seringue et de la vitesse de fonctionnement de la pompe à seringues.
  3. Placez le système microfluidique intégré sur la scène d'un microscope épifluorescent conventionnel.
    CAUTION: Pour générer un gradient doux de HGF dans le canal microfluidique, le débit doit être aussi lent que 0,1 L/min. Ceci est suffisamment sensible pour qu'il nécessite une stabilisation pendant 2 h, et il faut prendre soin d'éviter les perturbations physiques pendant l'expérience.

6. Acquisition d'images

  1. Prenez des images toutes les 10 min pendant jusqu'à 24 h à l'aide d'un microscope automatisé logé dans un incubateur. À chaque moment, prenez un ensemble d'images à l'aide d'une lentille objective 4x dans trois canaux différents, y compris l'image de phase pour visualiser la migration cellulaire, l'image fluorescente verte pour visualiser les perles fluorescentes incorporées dans le gel PA, et l'image fluorescente rouge pour visualiser le gradient de concentration d'un produit chimique.
  2. Après avoir pris des images en time-lapse, infusez la solution trypsin-EDTA de 0,25 % dans des microcanaux pour détacher les cellules du gel PA. Après avoir complètement retiré les cellules du gel, prendre une image fluorescente verte pour être utilisé comme une image de référence pour la microscopie de traction.

7. Analyse des données

REMARQUE: Un code personnalisé pour l'analyse des données a été développé à l'aide de MATLAB, et les détails ont été décrits ailleurs32,33,34,35,36.

  1. Pour l'analyse de phase-image, calculer les déplacements en deux images de phase consécutives à l'aide de la vélocimétrie d'image de particules36.
  2. Pour fourier transformer la microscopie de traction, comparez chaque image fluorescente verte avec l'image de référence et calculez les déplacements dans chaque image à l'aide de la vélocimétrie d'image de particules36. Des déplacements, récupérer la traction faite par les cellules sur le gel DE PA utilisant la microscopie de traction de transformation Fourier33,34,37.
  3. À partir des données de traction, calculez le stress dans la monocouche de l'île cellulaire à l'aide de la microscopie de stress monocouche basée sur les méthodes d'élément fini32,34,38.

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Representative Results

Pour explorer la migration collective sous un gradient chimique, un système microfluidique a été intégré à la microscopie de traction (Figure 1). Pour construire le système intégré, le gel de polyacrylamide (PA) a été jeté sur le verre fait sur commande, et les cellules de MDCK ont été ensemiées dans les îles micropatterned faites par un pochoir de PDMS. Pour cette expérience, douze îles de cellules MDCK (quatre rangées par trois colonnes, diamètre de 700 m) ont été créées. Après que les cellules attachées aux gels de PA, le pochoir de PDMS ait été enlevé pour initier la migration collective. Le canal microfluidique préfabriqué a été placé au-dessus des gels PA pour construire un canal microfluidique au-dessus des îles cellulaires (Figure 1A).

Pour ensuite établir un gradient de concentration dans le canal microfluidique, l'anse gauche a été reliée au réservoir d'alimentation contenant une solution de colorant fluorescent. En outre, les entrées du milieu et de la droite étaient reliées aux réservoirs d'alimentation contenant uniquement des supports. Ensuite, la prise a été reliée à la pompe à seringues pour enlever le liquide du canal microfluidique. Le sandwich de verre taillé sur mesure et le canal microfluidique a été inséré sur la scène du microscope sur mesure. Les échantillons ainsi que le microscope fluorescent automatisé ont été conservés dans un incubateur pour l'imagerie cellulaire vivante. Tout au long des expériences, les cellules ont été maintenues à 5 % de CO2 et 37 oC. Un gradient de l'intensité du colorant fluorescent a été rapidement établi à un débit de 0,125 - 2 l/min (figure 2A). La pente du gradient dépendait du débit. Par exemple, à un débit de 0,125 L/min, le gradient a été développé sur 1,5 mm, soit la taille comparable des îles cellulaires (figure 2B).

Ensuite, le dispositif intégré avec des cellules a été testé. Les îles des cellules de MDCK ont été micropatterned et assemblés avec le canal microfluidique comme décrit ci-dessus. Tout d'abord, sans appliquer aucun flux dans le microcanal, il a été assuré que l'île cellulaire se propage bien dans l'appareil. Sur une période de 12 h, l'île s'est agrandie, et la vitesse moyenne de migration a été de 0,1 à 0,2 m/min. Bien qu'il y ait des variations entre les îles en ce qui concerne la façon dont l'île s'est étendue, toutes les cellules avaient l'air en bonne santé dans l'état de non-flux. Ensuite, le débit a été appliqué au-dessus de ces îles, et il a été constaté qu'à un débit de 0,1 L/min, l'île cellulaire s'est bien répandue, et les cellules ont maintenu une vitesse de migration moyenne de 0,1 à 0,2 m/min pendant 12 h. Cependant, en augmentant le débit à 0,5 L/min, les cellules ne se sont pas bien propagées, et la vitesse moyenne de migration est tombée à moins de 0,1 m/min. De plus, les morphologies des cellules semblaient différentes et semblaient se détacher des gels PA (Figure 3). Sur la base de ces données, 0,1 L/min a été choisi comme débit pour les expériences suivantes.

Pour tester les effets d'un gradient chimique sur la migration collective des cellules, HGF a été choisi32,34.  L'anse gauche a été reliée à 1) le réservoir d'approvisionnement tenant le support de culture cellulaire avec la solution HGF (20 ng/mL) et 2) les 2 autres entrées avec des réservoirs détenant des médias de culture cellulaire. Avec un débit de 0,1 L/min, le débit au-dessus des îles cellulaires en migration (quatre rangées par trois colonnes) a été maintenu pendant 10 h (figure 4). Comme le montre une expérience distincte, la concentration de HGF sur la colonne de gauche était proche de la concentration de la solution de suppling (20 ng/mL), et sur la colonne de droite, celle-ci était proche de zéro. La concentration de HGF sur la colonne moyenne a graduellement diminué de la moitié gauche à la moitié droite. En comparant la taille des îles cellulaires après 10 h, les îles de la colonne de droite ne se sont pas beaucoup étendues, mais celles de la colonne de gauche sont devenues significativement plus grandes et élargies dans toutes les directions (Figure 4A). Ces changements dans la taille de l'île ont été soutenus par les trajectoires des cellules dans chaque île (Figure 4B). Fait intéressant, les îles de la colonne centrale ne se sont pas étendues vers la droite (où la concentration de HGF était faible) mais se sont étendues préférentiellement vers la gauche (où la concentration de HGF était élevée). Bien qu'il y ait eu peu de changement dans la vitesse moyenne de migration dans la colonne de droite, dans les colonnes gauche et moyenne, la vitesse moyenne de migration a augmenté progressivement pour les 3 premiers h, puis a diminué progressivement (Figure 4C).

Pour mesurer la force contractile et le stress intercellulaire, la microscopie de traction37,39,40 et la microscopie de contrainte de monocouche ont été combinées avec le canal microfluidique33,35, 38. Au cours de 10 h pendant l'application du gradient chimique, des images de particules fluorescentes ont été prises dans les gels PA, et la force (par unité) appliquée par les cellules sur le substrat a été analysée à l'aide de la microscopie de traction de transformation Fourier35, 37. La traction a été tracée dans les coordonnées polaires. Le bleu représente la force vers le centre de l'île, et le rouge représente la force loin du centre.

À zéro, toutes les îles ont montré des distributions de traction similaires, avec une forte traction vers l'intérieur sur le bord et la fluctuation au sein de l'île. Cette fluctuation était similaire à ce qui a été précédemment montré34,35,41. Après 10 h d'application du gradient HGF, alors que le degré d'expansion de l'île était différent dans chaque colonne, les distributions de traction étaient en grande partie semblables au temps zéro (Figure 5A). La traction moyenne n'a pas changé pendant 10 h (figure 5C). Lors du calcul du stress monocouche, cependant, chaque colonne a montré des tendances différentes. Dans la colonne de droite (où la concentration de HGF était faible), la tension moyenne dans les îles a été maintenue autour de 200 Pa tout au long d'une période de 10 h. Dans la colonne de gauche (où la concentration de HGF était élevée), la tension moyenne dans les îles a graduellement diminué de 230 Pa à 100 Pa plus de 10 h, comme indiqué précédemment32,34. Dans la colonne du milieu (où la concentration de HGF était élevée sur la moitié gauche et basse sur la moitié droite de l'île), la tension moyenne a été maintenue autour de 150 Pa.

Figure 1
Figure 1: Schéma de la préparation intégrée de l'appareil. (A) Pour fabriquer l'appareil intégré, un verre de fond avec gel DE PA sur lequel les îles cellulaires ont été modelées à l'aide d'un pochoir PDMS a été recouvert d'un microcanal PDMS. (B) Les dispositifs intégrés ont été fixés à l'aide d'un support personnalisé pour prévenir les fuites de liquide et la dissociation des composants. (C) Après que l'appareil a rempli de liquide sans bulles, les réservoirs ont été connectés aux entrées, et une pompe à seringues a été connectée à la prise. Toutes les installations expérimentales ont été placées sur un système d'imagerie cellulaire en direct. (D) Le schéma montre la conception et la composition des canaux microfluidiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Établissement du gradienthémique c. (A) Les images de fluorescence du dextran conjugué à la rhodamine B (70 kDa) visualisent le gradient de concentration sous le flux de fluide de 0,125 L/min, 0,5 L/min, et de 2 degrés L/min. Les cercles pointillés indiquent la position des îles cellulaires à motifs. (B) Le profil d'intensité de l'image de fluorescence montre que le gradient de concentration dans l'appareil était réglable par le débit. Les barres d'erreur indiquent l'écart type. Les barres colorées indiquent les positions de colonne de l'île à cellules à motifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3: Migration des îles cellulaires MDCK en cours d'écoulement. (A) Les images de phase à 12 h de l'île cellulaire MDCK à chaque débit (0 l/min, 0,1 l/min et 0,5 oL/min) montrent que les îles cellulaires se sont bien développées à un faible débit, mais n'ont pas augmenté à un débit élevé. Les lignes pointillées représentent les limites à 0 h. (B) La moyenne et l'histogramme de la vitesse cellulaire dans chaque île toutes les 10 minutes pendant 12 h. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Migration des îles cellulaires MDCK sous flux et gradient chimique. (A) La plage d'intensité relative du dextran conjugué à la rhodamine B a maintenu un gradient constant de concentration de HGF dans chaque colonne après stabilisation pendant 2 h. (B) Images de phase à 10 h (ligne pointillée - limite d'île cellulaire à 0 h) de la cellule de MDCK l'île sous le gradient de HGF (de gauche à droite : 20-0 ng/mL) montrent que l'île s'est étendue plus où la concentration de HGF était plus élevée. (C) Les trajectoires des chemins de migration (codage des couleurs indique la longueur du chemin) des cellules dans les îles cellulaires MDCK. Les lignes pointillées et les lignes pointillées représentent les limites de chaque île cellulaire à 0 h et 10 h, respectivement. (D) La moyenne et l'histogramme de la vitesse cellulaire dans chaque île toutes les 10 minutes pendant 10 h. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5: Interactions mécaniques des îles cellulaires MDCK. (A) Les cartes de traction (interaction cellule-substrat) dans les îles cellulaires à 0 h et 10 h sous le gradient HGF. Les cartes ont été tracées en coordination radiale, avec traction extérieure utilisant la couleur chaude et la traction intérieure utilisant la couleur froide. (B) Les cartes de la tension monocouche (interactions cellules-cellules) dans les îles cellulaires à 0 h et 10 h sous le gradient HGF. (C) La parcelle de traction moyenne (carré gris) et la tension (cercle bleu) dans les îles cellulaires sous le gradient HGF au fil du temps toutes les 10 min pendant 10 h. Les bandes de couleur représentent le milieu du quartile (25 % à 75 %). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplementary Figure 1
Figure supplémentaire S1 : Une bonne distribution de perles est nécessaire pour une qualité suffisante des données lors de l'analyse de la force de traction. Des exemples de bonnes (gauche) et de mauvaises (droite) images de perles fluorescentes de qualité avec des images agrandies dans les boîtes blanches sont montrés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La migration collective des cellules constituantes est un processus important pendant le développement et la régénération, et la direction de migration est souvent guidée par le gradient chimique des facteurs de croissance4,23. Pendant la migration collective, les cellules continuent d'interagir avec les cellules voisines et les substrats sous-jacents. De telles interactions mécaniques donnent lieu à des phénomènes émergents tels que le durotaxis42, la plithotaxis33, et la kenotaxis43. Cependant, cette recherche a été effectuée en utilisant une seule concentration de facteurs de croissance, tels que ceux dans le sérum bovin foetal. Pour combler cette lacune, ce protocole décrit une nouvelle plate-forme expérimentale qui peut mesurer les interactions mécaniques lors de la migration cellulaire collective sous un gradient chimique.

La nouvelle plate-forme combine trois systèmes expérimentaux qui ont été largement utilisés : la micro-patterning, la microscopie de traction et la microfluidique. Tout d'abord, le micropatterning des îles cellulaires pour la migration collective a été effectué. Deuxièmement, la microscopie de traction et la microscopie de contrainte de monocouche ont été employées pour des mesures mécaniques des cellules migrantes. Enfin, une plate-forme microfluidique a été utilisée pour établir le gradient chimique sur les cellules migratrices. Avec ce système expérimental, il a été démontré que les cellules d'une seule île migrent différemment en réponse à différents gradients chimiques.

Tel que décrit dans la figure 2, le gradient chimique ne se forme que sur une distance de 1 mm au milieu du microcanal. Les îles de la colonne de gauche sont exposées à la concentration maximale, et celles de la colonne de droite sont exposées à la concentration minimale. En revanche, les îles de la colonne centrale sont exposées au gradient chimique. De cette façon, la réponse des îles cellulaires est mesurée au maximum, au minimum, et un gradient de concentrations d'un facteur soluble au cours de la même expérience. À l'aide de ce réseau d'îles cellulaires, on a observé une augmentation graduelle de la vitesse de migration cellulaire à mesure que la concentration de HGF augmentait.

Pour obtenir des données de haute qualité, il y a des étapes clés dans la procédure qui nécessitent une attention particulière. Les gels PA dans un substrat en verre personnalisé doivent être parfaits en ce qui concerne la distribution des particules fluorescentes et le revêtement de surface du collagène. C'est parce que sans gels PA de haute qualité, un ensemble de données de haute qualité pour l'analyse de traction et l'analyse du stress monocouche ne peut pas être acquise. Des exemples d'images perlées de haute qualité sont présentés dans la figure 1 supplémentaire. Les canaux microfluidiques sont très petits, et les bulles sont facilement emprisonnées en eux. Ces bulles non seulement perturber le flux, mais peut également balayer les cellules s'ils commencent à se déplacer le long du flux. Par conséquent, il est crucial de remplir les canaux microfluidiques sans bulles. Pour obtenir un gradient stable dans le microcanal, l'équilibre de la pression dans les trois entrées est très important. Pour éviter les déséquilibres entre eux, de grands réservoirs doivent être utilisés de sorte que les déséquilibres au début d'une expérience puissent facilement être ajustés. Cette nouvelle plate-forme permettra d'explorer davantage la mécanique de la migration collective des cellules sous des gradients chimiques, ce qui est essentiel pour comprendre la régénération, les métastes cancéreuses et le développement.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIP) (No. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant et le programme BK 21 Plus. Il a également été soutenu par les National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
1 M HEPES buffer solution Gibco 15630-056
1 mm Biopsy punch Integra Miltex 33-31AA-P/25
100 mm petri dishes SPL 10100 100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punch ILJIN 124-0571
18 mm Ø Coverslip Marienfeld-Superior 111580 Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solution Bio-Rad 1610142 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) Sigma-Aldrich 440159-500ML
3-way stopcock Hyupsung HS-T-61N CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-30 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dish Corning 430165
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-75 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acid J.T. Baker JT9508-03
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad 1610700
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Bottom glass chip MicroFIT 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tail Corning 354236
Custom glass holder Han-Gug Mechatronics custom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Welgene LM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biowest L0615-500 w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheres Invitrogen F8764 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Sigma-Aldrich H1404-5UG recombinant, human
JuLI stage live cell imaging system NanoEnTek In Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell type II
Oxygen plasma system Femto Science CUTE-MPR
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich R9379-100MG 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 G KOVAX Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape 3M/Scotch 810D 33 m x 19 mm
SU-8 master molds MicroFIT 4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) Thermo Scientific 22589 Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS
Syringe pump Chemyx Inc. model fusion 720 withdraw fluid
Syringes KOVAX 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lamp UVP LLC 95-0248-02 365 nm wavelength

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References

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Bioingénierie Numéro 152 microfluidique microscopie de traction migration collective des cellules chimiotaxis gradient chimique micropatterning
Microscopie de traction intégrée à la microfluidique pour la migration collective chimiotaxique
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Jang, H., Kim, J., Shin, J. H.,… More

Jang, H., Kim, J., Shin, J. H., Fredberg, J. J., Park, C. Y., Park, Y. Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration. J. Vis. Exp. (152), e60415, doi:10.3791/60415 (2019).

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