Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מיקרוסקופ גרירה משולב עם מיקרופלואידיקה עבור הגירה קולקטיבית כימוטקטיק

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/60415
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1
1Department of Biomedical Sciences, Korea University, 2Department of Mechanical Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3Department of Environmental Health, Harvard T.H. Chan School of Public Health

Summary

הגירה תא קולקטיבי בפיתוח, ריפוי הפצע, וגרורות סרטן מונחה לעתים קרובות על ידי מעברי הצבע של גורמי גדילה או מולקולות איתות. המתואר כאן היא מערכת ניסיונית המשלבת מיקרוסקופ המתיחה עם מערכת microflu, והפגנה של איך לכמת את המכניקה של הגירה קולקטיבית תחת הדרגתי הביוכימי.

Abstract

תאים משנים דפוסי הגירה בתגובה לגירויים כימיים, כולל מעברי הצבע של הגירויים. הגירה סלולרית בכיוון של מעבר הדרגתי כימי, המכונה כימוטקאס, ממלא תפקיד חשוב בפיתוח, התגובה החיסונית, הפצע ריפוי, וגרורות סרטן. בעוד כימוטקסיס מודולים את הגירה של תאים בודדים, כמו גם אוספים של תאים בvivo, במחקר מתורבת מתמקד כימווניות תא יחיד, בחלקו בשל העדר הכלים הניסיוניים הנכונה. כדי למלא את הפער, המתואר כאן הוא מערכת ניסיונית ייחודית המשלבת מיקרופלואידיקה ו מיקרופלנינג כדי להדגים את ההשפעות של מעברי כימיים על הגירה תא קולקטיבי. יתר על כן, מיקרוסקופ המתיחה ומיקרוסקופ הלחץ דופלקס משולבים במערכת כדי לאפיין שינויים בכוח הסלולר על מצע, כמו גם בין תאים שכנים. כהוכחה-of-קונספט, הגירה של האיים העגולים של מיקרותבנית של דין-דארבי כליות הכלב (MDCK) התאים נבדק תחת הדרגתי של גורם הצמיחה hepatocyte (HGF), גורם פיזור ידוע. הוא נמצא כי תאים הממוקמים בקרבת ריכוז גבוה יותר של HGF להגר מהר יותר מאשר אלה בצד הנגדי בתוך האי תא. בתוך אותו האי, המתיחה הסלולר דומה משני הצדדים, אבל הלחץ הבינתאי הוא הרבה יותר נמוך בצד של ריכוז HGF גבוה. מערכת זו הניסיונית הרומן יכול לספק הזדמנויות חדשות ללמוד את המכניקה של הגירה כימוטקטיק ידי הקולקטיבים הסלולריים.

Introduction

הגירה סלולרית במערכות ביולוגיות היא תופעה יסודית הכרוכה בהיווצרות רקמות, התגובה החיסונית, וריפוי הפצע1,2,3. הגירה סלולרית הוא גם תהליך חשוב בכמה מחלות כמו סרטן4. תאים לעיתים קרובות עוברים כקבוצה במקום בנפרד, המכונה העברת תאים קולקטיבית4,5. כדי שתאים יזוזו באופן קולקטיבי, חישת המיקרו-סביבה תהיה חיונית ב-6. למשל, תאים תופסים גירויים פיזיקליים ומגיבים על ידי שינוי תנועתיות, אינטראקציות תאים ואינטראקציות תאים, והתוצאה היא הגירה כיוונית לאורך מעבר צבע כימי7,8, 9,10. בהתבסס על הקשר הזה, נעשו התקדמויות מהירות בטכנולוגיות מעבדה על שבב שיכולות ליצור מיקרוסביבות כימיות מבוקרות היטב כגון הדרגתי של כימוסטנט11,12,13 . בעוד המעבדה-on-a-שבב מבוססי מיקרופלואידיקה שימשו בעבר כדי ללמוד כימוטקוניות של האנסמבל הסלולר או spheroids הסלולר14,15,16,17, הם היו בשימוש בעיקר בהקשר של הגירה תא יחיד18,19,20,21. מנגנונים הנמצאים בבסיס תגובה קולקטיבית הסלולר למעבר מעבר כימי עדיין לא מובנים היטב14,22,23,24,25,26 . לפיכך, פיתוח פלטפורמה המאפשרת השליטה הרקתית הטמפורלית של גורמים מסיסים, כמו גם התבוננות באתרו של תאים ' ביופיזיקלי יסייע לפענח את המנגנונים מאחורי הגירה תא קולקטיבי.

פיתח ותיאר כאן הוא מערכת מיקרופלואידיג multi-מנותבת המאפשרת את הדור של הדרגתי ריכוז של גורמים מסיסים, כי הגירה מודולים של אשכולות תאים בדוגמת. במחקר זה, מקדם צמיחה hepatocyte (HGF) נבחרה כדי לווסת את התנהגות הנדידה של דין-דארבי כליה כליות (MDCK) תאים. Hgf ידוע להחליש את התאים התא התא ולשפר את תנועתיות התאים27,28. במערכת המיקרופלואידיג, מיקרוסקופ המתיחה של פורייה ומיקרוסקופ מונאולייר משולבים גם הם, המאפשר ניתוח של התנועתיות, כוח כריתת הגוף, והמתח הבינתאי הנגרם על ידי התאים המרכיבים בתגובה ל HGF עבר צבע. בתוך האי זהה, תאים הממוקמים בקרבת ריכוז גבוה יותר של hgf להעביר מהר יותר ולהראות נמוך יותר התרבות רמות הלחץ מאשר אלה בצד עם ריכוז hgf נמוך. התוצאות מרמזות על כך שהמערכת הניסיונית החדשה הזאת מתאימה לחקור שאלות אחרות בתחומים הכרוכים בהעברה סלולרית קולקטיבית תחת מעברי מדרגות כימיים של גורמים מסיסים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: ליתוגרפיה של SU-8 תבניות עבור סטנסילים (עובי = 250 μm) ו-microchannel חלקים (עובי = 150 μm), תחריט זכוכית (עומק = 100 μm), וייצור יצוק היו מיקור חוץ על ידי שליחת עיצובים באמצעות תוכנת עיצוב בעזרת מחשב ליצרנים.

1. הייצור של הסטנסיל מיקרומיתיל (PDMS) ו-microchannel

  1. עיצוב המיקרו-תבנית של סטנסיל ומיקרוערוצים.
  2. הרכיבו או מיקור חוץ SU-8 תבניות (עובי של ~ 250 יקרומטר עבור סטנסילים ו ~ 150 יקרומטר עבור מיקרוערוצים) על וופלים סיליקון (4 "קוטר).
  3. הכינו את התערובת PDMS על ידי ערבוב של אלסטומר בסיס וריפוי סוכן ביחס של 10:1.
    1. מקום 15 מ ל של אלסטומר בסיס בצינור 50 mL ולהוסיף 1.5 מ ל של ריפוי סוכן. . הכן שניים כאלה
    2. מערבולת התערובת PDMS עבור 5 דקות. צנטריפוגה את תערובת PDMS ב 196 x g עבור 1 דקות כדי להסיר בועות.
  4. כדי להמציא סטנסיל PDMS, יוצקים ~ 1 מ ל של התערובת PDMS על וופל, תוך הימנעות באזורים בדוגמת SU-8, כך PDMS נוגע בצד של העמודים SU-8 אבל לא החלק העליון של תבנית SU-8.
    1. מניחים את הפרוסת וופל על משטח שטוח למעלה מ -30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לרפא את PDMS בתנור יבש ב 80 ° c עבור מעל 2 h.
    2. בזהירות לקלף את PDMS מ-SU-8 עובש לקצץ את קרום PDMS דק באמצעות אגרוף חלול 14 מ"מ. הסר את האבק על פני החלקים של PDMS באמצעות סרט דביק ולאחר מכן לחיטוי הסטנסילים של PDMS.
  5. כדי להמציא מיקרוערוץ PDMS, יוצקים ~ 30 מ ל של תערובת PDMS על העובש SU-8.
    1. דגה עבור 30 דקות בחדר ואקום ולרפא PDMS בתנור יבש ב 80 ° c עבור מעל 2 h.
    2. בזהירות לקלף את PDMS מ-SU-8 עובש וחותכים את PDMS לגודל של 24 מ"מ x 24 מ"מ. בכל בלוק pdms, ליצור שקע אחד ושלושה אינלטס באמצעות אגרוף ביופסיה 1 מ"מ.

2. הכנת הזכוכית התחתונה עם הג'ל פוליאקרילאמיד (PA)

  1. ייצור או מיקור חוץ מלבני משקפיים השקופית (24 מ"מ x 24 מ"מ x 1 מ"מ) עם מיקרו מלבני (6 מ"מ x 12 מ"מ, 100 יקרומטר עומק29) על ידי גזירה וחריטה משקפיים.
  2. Silanize המשטח של הזכוכית התחתונה30.
    1. להכין פתרון silane לאגד על ידי ערבוב 200 מ ל של מים מיועמים (DIW), 80 μL של חומצה אצטית, ו 50 μL של 3-(trimethoxysilyl) פרופיל מתיונין (TMSPMA) עבור 1 h.
      התראה: TMSPMA הוא נוזל דליק. בצע את ההמלצות בגיליונות נתונים של בטיחות חומרים. . תשתמש רק בתרכובת כימית
    2. להסיר את האבק מפני השטח של הזכוכית על ידי דבק דביק ולנקות את הזכוכית.
    3. לכסות את המשטח החרוט של הזכוכית התחתונה עם 100 μL של הפתרון bind silane ולהשאיר את הזכוכית ב-RT עבור 1 h.
    4. שטפו את הזכוכית בעזרת DIW 3x והרשו לזכוכית להתייבש בטמפרטורת האוויר הסביבתי או בניפוח אוויר.
  3. הכינו תמיסת ג'ל לג'ל הרשות הפלשתינית31.
    1. הכינו פתרון טרי של 0.5% (w/v) אמוניום פרסולפט (APS) על ידי המסת 5 מ"ג של APS ב 1 מ ל של DIW.
    2. הכינו את הפתרון הרשות הפלסטינית המורכב מ-138 μL של 40% אקרילאמיד פתרון, 101 μL של 2% bis-אקרילאמיד פתרון, 5 μL של פתרון חלקיקים פלורסנט (0.2 μm), ו-655 μL של DIW.
      התראה: הפתרונות אקרילאמיד וביסאקרילאמיד רעילים. לובשים כפפות מגן, ביגוד והגנה מפני עיניים. הגן על פתרון ג'ל הרשות הפלשתינית המכיל חלקיקי פלורסנט מהאור.
      הערה: מערבולת הפתרון חרוז פלורסנט לפני ליטוף כדי לקבל מספר אחיד של חרוזי פלורסנט לכל אצווה.
    3. לאחר הוספת 100 μL של הפתרון APS ו 1 μL של טטרמתיונין (TEMED), העברה 10 μL של פתרון ג'ל מעורב אל המיקרו-באר מלבני, והמקום על גבי coverslip עגול (18 מ"מ).
      הערה: כדי למלא את הזכוכית התחתונה עם ג'ל הרשות ללא בועות, המקום פתרון ג'ל מספיק על החריץ של הזכוכית התחתונה, להחליק בזהירות את הכיסויים על הפתרון ג'ל ולהסיר כל פתרון העודפים ג'ל.
      התראה: הג נרפא באיטיות במשך כ-40 דקות. ההליך הבא עבור ג'לים תפרידו צריך להתבצע בהקדם האפשרי.
    4. להעיף את ההרכבה של זכוכית אישית, הפתרון ג'ל, ואת coverslip, ואז צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 96 x g כדי להביא חלקיקי פלורסנט לשכבה העליונה של ג'ל הרשות.
    5. הסירו את ההרכבה מהצנטריפוגה והניחו אותה על המשטח השטוח עם הכיסויים הפונים כלפי מטה.
      הערה: החל משלב 2.3.6, טפל בדגימות בארון בטיחות.
    6. לאחר 30 דקות, להפוך את ההרכבה ולמקם אותו בצלחת פטרי 35 מ"מ, למלא עם 2 מ ל DIW, ו (באמצעות מלקחיים) בעדינות להסיר את הכיסויים על ידי הזזת אותו לצד אחד.
      הערה: ג'ל נרפא הרשות ניתן לאחסן DIW עבור 1 חודש. עם זאת, הקולגן מצופה על ג'ל הרשות הפלסטינית, יש להשתמש בו בניסוי בתוך יום אחד.
  4. . מעיל קולגן על ג'ל הרשות הפלשתינית
    1. התמוססות 1 מ"ג/mL sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2'-ניטרופניאמינו) הקסאנואט (sulfo-SANPAH תוך) חם 50 mM מאגר HEPES. ירידה 200 μL של הפתרון על פני השטח ג'ל ולהפעיל על ידי אור UV (365 באורך גל ננומטר) עבור 10 דקות.
      הערה: הגנה על הסולפו-סאח מהאור.
    2. לשטוף את הג עם 0.1 M [4-(2-הידרוקסיל) -1-piperazinefonic חומצה; HEPES] מאגר 2x ו-PBS 1x.
    3. המעיל הרשות הפלסטינית עם פתרון קולגן (100 μg/mL ב PBS, עכברוש זנב החולדה סוג I) ב 4 ° c הלילה. , ביום שלמחרת. תשטוף עם הערוץ השלישי

3. מיקרופנינג של איי התאים

  1. הכינו F-127 (טבלת חומרים) פתרון [2% (w/v) ב PBS] ולטבול את הסטנסיל האוטומטי pdms ב-f-127 פתרון. שמור אותו באינקובטור 37. מעלות צלזיוס במשך 1 שעות
  2. הכנת פתרון תא (2 x 106 תאים/mL) בתקשורת התרבות תאים המורכב: בינונית של הנשר שונה של Dulbecco (dmem) עם 10% סרום של שור עוברי (fbs) ו 1% אנטיביוטי-ANTIMYCOTIC (AA).
  3. שטוף את הסטנסיל PDMS עם PBS 3x ולהסיר נוזל הן סטנסיל PDMS ו-ג'ל הרשות הפלסטינית. הצב את סטנסיל PDMS על ג'ל הרשות הפלסטינית והוסף את ה-PBS לסטנסיל.
  4. הסר בועות בחורים של סטנסיל PDMS על ידי ליטוף בעדינות. לאחר הסרת בועות, הסר את ה-PBS מהמשטח של הסטנסיל PDMS.
  5. לאחר הצבת 200 μL של פתרון התא על סטנסיל PDMS, לשמור על ג'ל הרשות הפלסטינית בחממה עבור 1 h כך תאים לצרף את ג'ל הרשות הפלסטינית.
  6. שטוף בעדינות את פתרון התא עם מדיית תרבות התא, הסר את סטנסיל PDMS והוסף עוד מדיית תרבות תאים. תבדקו את היווצרות איי התאים. מתחת למיקרוסקופ

4. הרכבה של ג'ל הרשות הפלסטינית עם מיקרוערוץ PDMS

  1. להסיר אבק על מיקרוערוץ PDMS באמצעות סרט דביק, ולאחר מכן החיטוי.
  2. לטפל במשטח של מיקרוערוץ PDMS עם פלזמה חמצן (80 W, 50 kHz) עבור 30 s.
  3. לאחר הסרת כל נוזל על הזכוכית התחתונה מלא ג'ל ממולא, למקם את מיקרוערוץ PDMS על גבי הזכוכית התחתונה ולשים את ההרכבה על מחזיק הזכוכית המותאמת אישית.
  4. מלא את המיקרו-ערוץ עם מדיום תרבות התאים.
    התראה: הקפד להסיר את כל הבועות הלכודים בערוצים על ידי שטיפה בעדינות מדיה חמה עם פיפטה. כמו כן, תוך הסרת בועות, הקפד לא לנתק את האיים התא מיקרותבנית.

5. מערכת מיקרופלואידיג משולבת

  1. חבר את הטאבוליגים.
    1. הכן מחברים על-ידי גזיזת קצה המחטים (18 גר') וכיפוף אותו 90 °.
    2. הכינו קווי אבובים לשלוש מבוא ולשקע אחד.
      1. עבור אבובים מפרץ, לחבר את המחט גזוז ו 30 ס מ מיני קו הכרך עם stopcock לושה כיוון. . הכינו שלושה כאלה
      2. עבור אבובים לשקע, לחבר את המחט גזוז ו-75 ס מ מיני קו הכרך עם stopcock לושה כיוון. . תכין אחד מאלה
      3. מלא את קווי האבובים עם המדיום שחומם מראש במשך 1 שעות.
        התראה: הקפד להסיר את כל הבועות לכודים בקווים אבובים על ידי שטיפה בעדינות מדיה חמה עם מזרק.
    3. להכין מאגרים על ידי הסרת הפלאנגרים מזרקים וחיבור קווים צינור מפרץ.
    4. חבר את מחברי המחט של כל קו אבובים לתוך שלוש אינלטס ומשקע אחד של המכשיר microfluidic.
  2. ממלאים את המאגרים עם 3 מ ל של בינוני טרי או ממוזג כל אחד.
    1. עבור הבדיקה מעבר צבע, למלא את מאגר המים השמאלי עם 20 ng/mL HGF במדיום תרבות התא.
    2. עבור ויזואליזציה של מעבר ריכוז, הוסף צבע פלורסנט 200 μg/mL (rhodamine B-dextran, 70 kDa) אל מאגר המים השמאלי.
    3. חבר את קו צינורות השקע למשאבת מזרק.
      הערה: מצב הפעולה של משאבת המזרק הוא "נסיגה". קצב הזרימה משתנה בהתאם לקיבולת המזרק ומהירות ההפעלה של משאבת המזרק.
  3. מניחים את מערכת microfluidic משולבת על הבמה של מיקרוסקופ אפיפלוראני קונבנציונאלי.
    התראה: כדי ליצור מעבר עדין של HGF בערוץ microflu, שיעור הזרימה צריך להיות איטי כמו 0.1 μL/min. זה רגיש מספיק כדי שיהיה צורך בייצוב עבור 2 שעות, והטיפול חייב להילקח כדי למנוע הפרעה פיזית במהלך הניסוי.

6. רכישת תמונה

  1. לקחת תמונות כל 10 דקות עד 24 שעות באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי שוכנו בחממה. בכל פעם, לקחת קבוצה של תמונות באמצעות עדשת המטרה 4x בשלושה ערוצים שונים, כולל תמונת שלב כדי להמחיש הגירה התא, תמונת פלורסנט ירוק להמחיש חרוזים פלורסנט מוטבע ג'ל הרשות, ותמונת פלורסנט אדום כדי להמחיש את ה ריכוז של כימיקל.
  2. לאחר נטילת תמונות בזמן, להחדיר 0.25% טריפסין-EDTA פתרון למיקרו ערוצים כדי לנתק את התאים מהג הרשות הפלסטינית. לאחר הסרת לחלוטין תאים מהג, לקחת תמונת פלורסנט ירוק לשמש כתמונת ייחוס עבור מיקרוסקופ המתיחה.

7. ניתוח נתונים

הערה: קוד מותאם אישית לניתוח נתונים פותח באמצעות MATLAB, ופרטים תוארו במקומות אחרים32,33,34,35,36.

  1. לניתוח התמונה הפאזה, לחשב displacements בשני תמונות בשלב רציף באמצעות ולוסימטריה תמונה חלקיק36.
  2. לצורך המתיחה פורייה מיקרוסקופ, להשוות כל תמונת פלורסנט ירוק עם תמונת הייחוס ולחשב את displacements בכל תמונה באמצעות ולוסימטריה התמונה חלקיקים36. מ displacements, לשחזר המתיחה שנעשו על ידי תאים על האבא ג'ל באמצעות שינוי פורייההמתיחהמיקרוסקופ 33,34,37.
  3. מתוך נתוני המתיחה, לחשב מתח בתוך המונאולייר של האי תא באמצעות מיקרוסקופ מונאולייר לחץ מבוסס על שיטות האלמנט הסופי32,34,38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לחקור הגירה קולקטיבית תחת מעבר הדרגתי כימי, מערכת microfluidic שולבו עם מיקרוסקופ המתיחה (איור 1). כדי לבנות את המערכת המשולבת, אלקטרופורזה (PA) ג'ל היה יצוק על זכוכית מותאמת אישית, ו-mdck תאים הופרה בתוך האיים מיקרותבנית שנעשו על ידי סטנסיל pdms. עבור ניסוי זה, 12 איים של תאים MDCK (ארבע שורות על ידי שלוש עמודות, קוטר של ~ 700 μm) נוצרו. לאחר שתאים המחוברים ל-ג'לים של PA, סטנסיל PDMS הוסר כדי ליזום העברה קולקטיבית. הערוץ המיקרו-פלואידיסי שנוצר מראש הוצב על גבי ג'ל הרשות הפלשתינית כדי לבנות ערוץ microfluidic מעל האייםהסלולריים(איור 1א).

לאחר מכן להקים מעבר ריכוז בתוך הערוץ microflu, c שמאל היה מחובר למאגר האספקה המכיל פתרון צבע פלורסנט. בנוסף, האמצעי והקשר הנכון היו מחוברים למאגרים המספקים המכילים מדיה בלבד. לאחר מכן, השקע היה מחובר משאבת המזרק כדי להסיר נוזל מערוץ microfluidic. הכריך של זכוכית מותאמת אישית וערוץ microflu, c הוכנס לשלב מיקרוסקופ בנוי בהתאמה אישית. הדגימות יחד עם מיקרוסקופ פלורסנט אוטומטי נשמר בתוך חממה לדימות תאים חיים. במהלך הניסויים, התאים נשמרו ב 5% CO2 ו 37 ° c. הדרגה של עוצמת צבע הפלורסנט הוקמה במהירות בקצב הזרימה של 0.125-2 μL/min (איור 2א). השיפוע של מעבר הצבע תלוי בקצב הזרימה. לדוגמה, בקצב הזרימה של 0.125 μL/min, הדרגתי פותחה מעל 1.5 מ"מ, שהוא הגודל הדומה של איי התאים (איור 2ב).

לאחר מכן, ההתקן המשולב עם התאים נבדק. האיים של התאים MDCK היו מיקרותבנית והתאספו עם ערוץ microflu, כמתואר לעיל. ראשית, מבלי להחיל כל זרימה במיקרו-ערוץ, הבטיחו שהאי הסלולארי יתפשט היטב בתוך המכשיר. במשך תקופה של 12 שעות, האי התרחב, ואת מהירות ההגירה הממוצעת הייתה ~ 0.1 – 0.2 μm/min. בעוד היו וריאציות בין האיים לגבי כמה האי התרחב, כל התאים נראו בריאים במצב ללא זרימה. לאחר מכן, זרימה הוחל על האיים האלה, והוא נמצא כי בקצב הזרימה של 0.1 μL/min, האי הסלולר התפשטה היטב, תאים שמרו על מהירות הגירה ממוצעת של ~ 0.1 – 0.2 μm/min עבור 12 h. עם זאת, עם הגדלת קצב הזרימה ל 0.5 μL/min, תאים לא התפשטו היטב, ואת מהירות ההגירה הממוצעת ירדה למטה 0.1 μm/min. יתר על כן, מורפולוגיות של התאים הופיעו שונה ונראה להתנתק ג'לים הרשות הפלסטינית (איור 3). בהתבסס על נתונים אלה, 0.1 μL/min נבחרה כקצב הזרימה של הניסויים הבאים.

כדי לבדוק את ההשפעות של מעבר כימי על הגירה של תאים קיבוציים, hgf נבחר32,34.  מפרץ שמאל היה מחובר 1) מאגר האספקה מחזיק מדיה תרבות התא עם הפתרון hgf (20 ng/mL) ו 2) אחרים 2 אינלטס עם מאגרי מחזיק מדיה תרבות התא. עם קצב זרימה ב-0.1 μL/min, זרימת האיים הניידים הנודדים (ארבע שורות בשלוש עמודות) נשמרה במשך 10 שעות (איור 4). כפי שמוצג בניסוי נפרד, הריכוז HGF בעמודה השמאלית היה קרוב לריכוז הפתרון של הספילינג (20 ng/mL), ובטור הימני, זה היה קרוב לאפס. הריכוז HGF בעמודה האמצעית ירד בהדרגה מהחצי השמאלי לחצי הנכון. בעת השוואת גודל איי התא לאחר 10 שעות, האיים בעמודה השמאלית לא הרחיבו הרבה, אך אלה שבעמודה השמאלית הפכו לגדולים באופן משמעותי והורחבו בכל הכיוונים (איור 4א). שינויים כאלה בגודל האי נתמכים על ידי מסלולי התאים בתוך כל אי (איור 4ב'). מעניין, האיים בעמודה האמצעית לא התפשט לכיוון הזכות (שם ריכוז HGF היה נמוך) אבל הרחיב מעדיפים לכיוון שמאל (שם ריכוז HGF היה גבוה). בזמן שהיה שינוי קטן במהירות ההעברה הממוצעת בעמודה השמאלית, בעמודות השמאלית והאמצעית, מהירות ההעברה הממוצעת הוגדלה בהדרגה ב-3 ה-h הראשון, ולאחר מכן ירדה בהדרגה (איור 4ג).

כדי למדוד את כוח המשיכה והלחץ הבין-סלולארי, מיקרוסקופ המתיחה37,39,40 ומיקרוסקופ הלחץ דופלקס בשילוב עם ערוץ microfluidic33,35, 38. במהלך 10 h במהלך היישום של הדרגתי כימי, תמונות של חלקיקי פלורסנט נלקחו ב-ג'לים הרשות הפלסטינית, ואת הכוח (לכל יחידה) שהוחלו על ידי תאים על מצע נותחו באמצעות המתיחה פורייה להפוך מיקרוסקופ35, 37. . המתיחה הותווה בקואורדינטות קוטביות הכחול מייצג את הכוח כלפי מרכז האי, והאדום מייצג את הכוח הרחק מהמרכז.

בזמן אפס, כל האיים הראו הפצות המתיחה דומה, עם המתיחה חזקה פנימה על הקצה ותנודות בתוך האי. תנודות זה היה דומה למה שהוצג בעבר34,35,41. לאחר 10 שעות של החלת הדרגתי HGF, בעוד מידת התרחבות האי היתה שונה בכל עמודה, הפצות המתיחה היו בעיקר דומה לזמן אפס (איור 5א). המתיחה הממוצעת לא השתנה עבור 10 h (איור 5ג). עם זאת, בעת חישוב המתח המונאולייר, כל עמודה מראה מגמות שונות. בטור הימני (שבו ריכוז HGF היה נמוך), המתח הממוצע בתוך האיים היה מתוחזק סביב 200 Pa במשך 10 שעות. בעמודה השמאלית (שם ריכוז hgf היה גבוה), המתח הממוצע בתוך האיים ירד בהדרגה מ 230 pa ל 100 pa מעל 10 h, כפי שהוצג בעבר32,34. בעמודה האמצעית (שם ריכוז HGF היה גבוה על החצי השמאלי ונמוך על החצי הימני של האי), המתח הממוצע נשמר סביב 150 Pa.

Figure 1
איור 1: סכמטית של הכנת המכשיר המשולב. (א) כדי להמציא את המכשיר המשולב, זכוכית תחתונה עם ג'ל הרשות הפלסטינית שבה איי התא היו בדוגמת בסטנסיל pdms היה מכוסה במיקרוערוץ pdms. (ב) המכשירים המשולבים תוקנו באמצעות בעל מותאם אישית כדי למנוע דליפת נוזלים ודיסוציאציה של רכיבים. (ג) לאחר המכשיר מתמלא נוזל ללא בועות, מאגרים היו מחוברים הinlets, ומשאבת מזרק היה מחובר לשקע. כל המערכות הנסיוניות הונחו במערכת הדמיה של תא חי. (ד) התרשים מציג את העיצוב והקומפוזיציה של הערוצים microfluidic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הקמת מעבר הדרגתי של c. (א) תמונות הזריחה של rhodamine ב-תוספי (70 kda) להמחיש את מעבר הריכוז מתחת לזרימת הנוזלים של 0.125 μl/min, 0.5 μl/min, ו 2 μl/min. עיגולים מנוקדים מציינים את המיקום של איי התא בדוגמת מילוי. (ב) פרופיל האינטנסיביות של התמונה הפלואורסצנטית מראה כי מעבר הריכוז במכשיר היה מתכוונן על ידי קצב הזרימה. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. הפסים הצבעוניים מציינים את מיקומי העמודות של האי התאים בתבנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הגירה של איי התאים mdck תחת זרם. (A) התמונות בשלב 12 h של אי התאים mdck בכל קצב זרימה (0 μl/min, 0.1 μl/min, ו-0.5 μl/min) מראים שאיי התא התרחבו היטב בקצב זרימה נמוך אך לא התרחב בקצב זרימה גבוה. קווים מנוקדים מייצגים את הגבולות ב 0 h. (ב) ממוצע והיסטוגרמה של מהירות הסלולר בתוך כל אי כל 10 דקות עבור 12 h. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הגירה של איי התאים mdck תחת זרימה כימית הדרגתי. (א) טווח האינטנסיביות היחסי של rhodamine B-מצובית דטרן שמרו על מילוי מדרגה קבוע של ריכוז hgf בכל עמודה לאחר ייצוב עבור 2 h. (ב) שלב תמונות ב 10 h (קו מנוקד = גבול האי תא ב 0 h) של תא mdck אי תחת הדרגתי HGF (משמאל לימין: 20-0 ng/mL) מראים כי האי התרחב יותר כאשר ריכוז HGF היה גבוה יותר. (ג) מסלולי נתיבי הגירה (קידוד צבע מציינים את אורך הנתיב) של תאים באיי תא mdck. קווים מנוקדים וקווים מקווקווים מייצגים את הגבולות של כל אי תא ב-0 h ו-10 שעות, בהתאמה. (ד) ממוצע והיסטוגרמה של מהירות הסלולר בתוך כל אי כל 10 דקות עבור 10 h. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: אינטראקציות מכניות של איי התאים mdck. (A) מפות של המתיחה (אינטראקציה תא המצע) באיי התא ב 0 h ו 10 h תחת הדרגתי hgf. המפות הותוו בתיאום רדיאלי, עם המתיחה החוצה באמצעות צבע חם המתיחה פנימה באמצעות צבע קר. (ב) מפות של מתח מונאולייר (אינטראקציות תא תא) באיי התא ב-0 h ו -10 שעות תחת הדרגתי hgf. (ג) העלילה של המתיחה הממוצעת (ריבוע אפור) ומתח (מעגל כחול) בתוך איי התא תחת hgf הדרגתי לאורך זמן כל 10 דקות עבור 10 h. להקות הצבעים מייצגות את אמצע הרביעון (~ 25%-75%). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplementary Figure 1
איור משלים S1: התפלגות חרוז נכונה נדרש עבור איכות נתונים מספקת במהלך ניתוח כוח המתיחה. דוגמאות של טוב (משמאל) ושגוי (מימין) תמונות באיכות פלורסנט עם תמונות מוגדלות בתיבות לבן מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הגירה קולקטיבית של תאים בוחרים הוא תהליך חשוב במהלך פיתוח והתחדשות, וכיוון הנדידה מודרך לעתים קרובות על ידי הדרגה הכימית של גורמי גדילה4,23. במהלך הגירה קולקטיבית, התאים ממשיכים לקיים אינטראקציה עם תאים שכנים ומצעים המשמשים כבסיס. אינטראקציות מכניות כאלה מעלות לתופעות מתהווה כגון: durotaxis42, פליטומוניות33, וקנואומוניות43. עם זאת, מחקר זה נעשה באמצעות ריכוז אחד של גורמי גדילה, כמו אלה בסרום העוברי העובר. כדי למלא את הפער, פרוטוקול זה מתאר פלטפורמה ניסיונית חדשה שיכולה למדוד אינטראקציות מכניות במהלך הגירה סלולרית קולקטיבית תחת מעבר צבע כימי.

הפלטפורמה החדשה משלבת שלוש מערכות נסיוניות שבהן נעשה שימוש נרחב: מיקרופנינג, מיקרוסקופ המתיחה ומיקרופלואידיקה. ראשית, בוצע מיקרופנינג של איי תא להעברה קולקטיבית. שנית, הן מיקרוסקופ המתיחה והן מיקרוסקופ הלחץ דופלקס שימש למדידות מכניות של תאים נודדים. לבסוף, פלטפורמת מיקרופלואידיקה שימש להקמת מעבר כימי על התאים הנודדים. עם מערכת ניסיונית זו, הוכח כי תאים בתוך אי יחיד להעביר באופן שונה בתגובה למעברי צבע כימיים שונים.

כפי שמתואר באיור 2, צורות מעבר הצבע הכימי מהווה רק מעל מרחק של 1 מ"מ באמצע המיקרו-ערוץ. האיים בעמודה השמאלית נחשפים לריכוז המקסימלי, ואלה בעמודה השמאלית חשופים לריכוז המינימלי. לעומת זאת, איים בעמודה האמצעית חשופים למעבר הצבע הכימי. בדרך זו, התגובה של איי התא נמדדת במקסימום, מינימום, והדרגתי של ריכוזים של גורם מסיס במהלך אותו ניסוי. שימוש במערך זה של איי התא, עלייה הדרגתית במהירות הגירה הסלולר נצפתה כמו ריכוז HGF גדל.

כדי להשיג נתונים באיכות גבוהה, קיימים שלבי מפתח בשגרה הדורשים תשומת לב מיוחדת. ג'לים הרשות הפלסטינית במצע זכוכית מותאמת אישית חייב להיות מושלם לגבי הפצת חלקיקי פלורסנט וציפוי פני השטח של קולגן. הסיבה לכך היא ללא באיכות גבוהה ג'לים הרשות, מערכת נתונים באיכות גבוהה עבור ניתוח המתיחה וניתוח הלחץ דופלקס לא ניתן לרכוש. דוגמאות לתמונות מחרוזים באיכות גבוהה מוצגות באיור המשלים 1. הערוצים המיקרופלואידים קטנים מאוד, ובועות הן בקלות לכודים בהן. בועות אלה לא רק להפריע את הזרימה, אבל יכול גם לטאטא תאים משם אם הם מתחילים לנוע לאורך הזרימה. לכן, חיוני למלא את הערוצים microfluidic ללא בועות. כדי להשיג מעבר יציב בתוך המיקרוערוץ, מאזן הלחץ בתוך שלושת האינטטים חשוב מאוד. כדי למנוע חוסר איזון ביניהם, יש להשתמש במאגרים גדולים כך שניתן יהיה לכוונן כל חוסר איזון בתחילת הניסוי. פלטפורמה חדשה זו תסייע לחקירה נוספת של המכניקה של הגירה התא הקולקטיבי תחת הדרגתיים כימיים, אשר הוא המפתח להבנת התחדשות, סרטן גרורות, ופיתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF) המענק ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP) (לא. NRF-2017R1A1A01075103), מענק אוניברסיטת קוריאה, ותוכנית BK 21 פלוס. זה היה גם נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
1 M HEPES buffer solution Gibco 15630-056
1 mm Biopsy punch Integra Miltex 33-31AA-P/25
100 mm petri dishes SPL 10100 100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punch ILJIN 124-0571
18 mm Ø Coverslip Marienfeld-Superior 111580 Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solution Bio-Rad 1610142 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) Sigma-Aldrich 440159-500ML
3-way stopcock Hyupsung HS-T-61N CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-30 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dish Corning 430165
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-75 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acid J.T. Baker JT9508-03
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad 1610700
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Bottom glass chip MicroFIT 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tail Corning 354236
Custom glass holder Han-Gug Mechatronics custom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Welgene LM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biowest L0615-500 w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheres Invitrogen F8764 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Sigma-Aldrich H1404-5UG recombinant, human
JuLI stage live cell imaging system NanoEnTek In Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell type II
Oxygen plasma system Femto Science CUTE-MPR
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich R9379-100MG 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 G KOVAX Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape 3M/Scotch 810D 33 m x 19 mm
SU-8 master molds MicroFIT 4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) Thermo Scientific 22589 Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS
Syringe pump Chemyx Inc. model fusion 720 withdraw fluid
Syringes KOVAX 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lamp UVP LLC 95-0248-02 365 nm wavelength

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  4. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  5. Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
  6. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  7. Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
  8. Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
  9. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  10. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
  11. Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
  12. Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
  13. Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617 (2018).
  14. Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515 (2015).
  15. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  16. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
  17. Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
  18. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
  19. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
  20. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  21. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  22. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  23. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  24. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  25. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  26. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  27. Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
  28. Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 4 Pt 1 041918 (2010).
  30. Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
  31. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  32. Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
  33. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  34. Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
  35. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426 (2009).
  36. Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
  37. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  38. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172 (2013).
  39. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  40. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
  41. Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
  42. Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  43. Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).

Tags

Bioהנדסאים סוגיה 152 מיקרופלואידיקה מיקרוסקופ המתיחה הגירה של תאים קיבוציים כימוטקסיס מעבר כימי מיקרופלנינג
מיקרוסקופ גרירה משולב עם מיקרופלואידיקה עבור הגירה קולקטיבית כימוטקטיק
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jang, H., Kim, J., Shin, J. H.,… More

Jang, H., Kim, J., Shin, J. H., Fredberg, J. J., Park, C. Y., Park, Y. Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration. J. Vis. Exp. (152), e60415, doi:10.3791/60415 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter