Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Traktionsmikroskopi integrerat med mikrofluidik för Chemotactic kollektiv migration

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/60415
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1
1Department of Biomedical Sciences, Korea University, 2Department of Mechanical Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3Department of Environmental Health, Harvard T.H. Chan School of Public Health

Summary

Kollektiv cell migration i utveckling, sårläkning och cancermetastaser styrs ofta av gradienter av tillväxtfaktorer eller signalmolekyler. Här beskrivs ett experimentellt system som kombinerar traktionsmikroskopi med ett microfluidiskt system och en demonstration av hur man kan kvantifiera mekaniken i kollektiv migration under biokemisk gradient.

Abstract

Celler förändrar migrationsmönstren som svar på kemiska stimuli, inklusive lutningar av stimuli. Cellulär migration i riktning mot en kemisk gradient, känd som chemotaxis, spelar en viktig roll i utvecklingen, immunförsvaret, sårläkning, och cancermetastaser. Medan chemotaxis modulerar migration av enskilda celler samt samlingar av celler in vivo, in vitro-forskning fokuserar på encelliga chemotaxis, delvis på grund av avsaknaden av rätt experimentella verktyg. För att fylla denna lucka, beskrivs här är ett unikt experiment system som kombinerar mikrofluidik och micropatterning att demonstrera effekterna av kemiska gradienter på kollektiv cell migration. Dessutom är traktion mikroskopi och enskiktslager stress mikroskopi införlivas i systemet för att karakterisera förändringar i cellulära kraft på underlaget samt mellan angränsande celler. Som proof-of-koncept, migration av mikromönstrade cirkulära öar av Madin-Darby Hundarnas njure (MDCK) celler testas under en gradient av hepatocyte tillväxtfaktor (HGF), en känd spridnings faktor. Det finns att celler som ligger nära den högre koncentrationen av HGF migrerar snabbare än de på motsatt sida inom en cellö. Inom samma ö, cellulära dragkraft är liknande på båda sidor, men intercellulära stress är mycket lägre på sidan av högre HGF koncentration. Detta nya experimentella system kan ge nya möjligheter att studera mekaniken i kemotaktisk migration av cellulära kollektiv.

Introduction

Cellulär migration i biologiska system är ett grundläggande fenomen som är involverade i vävnads bildningen, immunförsvaret och sårläkning1,2,3. Cellulär migration är också en viktig process i vissa sjukdomar som cancer4. Celler migrerar ofta som en grupp snarare än individuellt, vilket kallas kollektiv cellmigrering4,5. För celler att röra sig kollektivt, avkänning av mikromiljön är viktigt6. Till exempel, celler uppfattar fysikalisk-kemiska stimuli och reagera genom att ändra motilitet, cell-substrat interaktioner, och cell-cell interaktioner, vilket resulterar i riktad migration längs en kemisk gradient7,8, 9,10. Baserat på denna anslutning, snabba framsteg har gjorts i Lab-on-a-chip teknik som kan skapa välkontrollerade kemiska mikromiljöer såsom lutningen på en Chemoattractant11,12,13 . Även om dessa Lab-on-a-chip-baserade mikrofluidik har tidigare använts för att studera chemotaxis av den cellulära ensemblen eller cellulära spheroids14,15,16,17, de har använts mest i samband med Single-cell migration18,19,20,21. Mekanismerna bakom ett cellulärt kollektivt svar på en kemisk gradient är fortfarande inte väl förstådda14,22,23,24,25,26 . Utvecklingen av en plattform som möjliggör en rumslig kontroll av lösliga faktorer samt observation av cellernas biofysik bidrar således till att riva upp mekanismerna bakom kollektiv cell migration.

Utvecklad och beskrivs här är en multi-kanaliseras mikroflödessystem system som möjliggör generering av en koncentration gradient av lösliga faktorer som modulerar migration av mönstrade cell kluster. I denna studie, hepatocyte tillväxtfaktor (HGF) väljs för att reglera migrations beteendet hos Madin-Darby Hundarnas njure (MDCK) celler. HGF är känt för att dämpa cell cellernas integritet och förbättra motiliteten hos cellerna27,28. I mikroflödessystem systemet, Fourier Transform traktion mikroskopi och enskiktslager stress mikroskopi ingår också, vilket möjliggör analys av motilitet, kontraktila kraft, och intercellulära spänningar induceras av konstituerande celler som svar på en HGF Lutning. Inom samma ö, celler som ligger nära den högre koncentrationen av HGF migrera snabbare och Visa lägre intercellulära stressnivåer än de på sidan med lägre HGF koncentration. Resultaten tyder på att detta nya experimentella system är lämpligt att utforska andra frågor inom områden som inbegriper kollektiv cellulär migration under kemiska gradienter av olika lösliga faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Anmärkning: litografi av SU-8 formar för stenciler (tjocklek = 250 μm) och MicroChannel-delar (tjocklek = 150 μm), glas etsning (djup = 100 μm), och gjuten tillverkning lades ut genom att skicka mönster med hjälp av datorstödd designprogramvara till tillverkare.

1. tillverkning av Polydimetylsiloxan (PDMS) stencil och MicroChannel-

  1. Designa mikromönstret av stencil och MicroChannel.
  2. Fabricera eller outsourca SU-8 formar (tjocklek av ~ 250 μm för stenciler och ~ 150 μm för mikrokanaler) på kisel rån (4 "diameter).
  3. Förbered PDMS-blandningen genom att blanda baselastomeren och härdnings medlet med ett förhållande på 10:1.
    1. Placera 15 mL av baselastomeren i ett 50 mL koniskt rör och tillsätt 1,5 mL härdningsmedel. Förbered två av dessa.
    2. Vortex PDMS-blandningen i 5 min. Centrifugera PDMS-blandningen på 196 x g i 1 min för att ta bort bubblor.
  4. Att fabricera PDMS stencil, Häll ~ 1 mL av PDMS blandningen på wafer, samtidigt undvika SU-8 mönstrade områden så att PDMS vidrör sidan av SU-8 pelare men inte toppen av SU-8 mönster.
    1. Placera wafer på en plan yta i över 30 min vid rumstemperatur (RT). Bota PDMS i en torr ugn vid 80 ° c i över 2 h.
    2. Försiktigt dra av PDMS från SU-8 mögel och trimma tunna PDMS membran med en 14 mm ihålig punch. Ta bort damm på ytan av PDMS bitar med tejp och autoklav PDMS stenciler.
  5. Att fabricera PDMS MicroChannel, pour ~ 30 mL PDMS blandning över SU-8 mögel.
    1. Degas i 30 min i en vakuumkammare och bota PDMS i en torr ugn vid 80 ° c i över 2 h.
    2. Dra försiktigt av PDMS från SU-8 mögel och skär PDMS till en storlek på 24 mm x 24 mm. I varje PDMS block, skapa ett utlopp och tre inlopp med en 1 mm biopsi punch.

2. beredning av botten glas med polyakrylamid (PA) gel

  1. Tillverka eller outsourca rektangulära glid glasögon (24 mm x 24 mm x 1 mm) med en rektangulär mikro-brunn (6 mm x 12 mm, 100 μm djup29) genom att skära och etsning glasögon.
  2. Silanize ytan av ett botten glas30.
    1. Bered en bind silan-lösning genom att blanda 200 ml avjoniserat vatten (DIW), 80 μl ättiksyra och 50 μl av 3-(Trimetoxysilyl) propylmetakrylat (tmspma) under 1 h.
      Varning: TMSPMA är en brännbar vätska. Följ rekommendationerna i Materialsäkerhetsdatablad. Använd endast i en kemisk draghuv.
    2. Ta bort dammet från ytan av glaset med klibbigt tejp och autoklav glaset.
    3. Täck den etsade ytan på botten glaset med 100 μl av bind silan-lösningen och låt glaset vara RT i 1 h.
    4. Skölj glaset med DIW 3x och låt glaset torka vid omgivningsluftens temperatur eller genom att blåsa luft.
  3. Bered en gel lösning för PA-gel31.
    1. Bered en ny lösning av 0,5% (w/v) ammoniumpersulfat (APS) genom att lösa 5 mg APS i 1 mL DIW.
    2. Bered den PA gel-lösning som består av 138 μL av 40% akrylamidlösning, 101 μL av 2% bis-akrylamidlösning, 5 μL fluorescerande partikel lösning (0,2 μm) och 655 μL DIW.
      FÖRSIKTIGHET: akrylamid och bisacrylamid-lösningar är giftiga. Använd skyddshandskar, skyddskläder och ögonskydd. Skydda PA gellösningen som innehåller fluorescerande partiklar från ljus.
      Anmärkning: Vortex den fluorescerande pärllösningen före pipettering för att erhålla ett enhetligt antal fluorescerande pärlor per bunt.
    3. Efter tillsats av 100 μL av APS-lösningen och 1 μL tetrametylethylendiamin (TEMED), överför 10 μL blandad gel lösning till den rektangulära mikro-brunnen och placera ovanpå en cirkulär täckslip (18 mm).
      Anmärkning: för att fylla botten glaset med PA gel utan bubblor, placera tillräcklig gel lösning på spåret av botten glaset, försiktigt glida täckglas över gelen lösning och ta bort överflödig gel lösning.
      FÖRSIKTIGHET: gelen är långsamt botas i ca 40 min. Följande förfarande skall utföras för centrifugering av geler så snart som möjligt.
    4. Vänd monteringen av anpassade glas, gel lösning, och täckglas, sedan Centrifugera för 10 min vid 96 x g för att få fluorescerande partiklar till det översta lagret av PA gel.
    5. Ta bort aggregatet från centrifugen och placera det på den plana ytan med täckskiktet vänd nedåt.
      Anmärkning: börjar med steg 2.3.6, hantera prover i ett biosäkerhetsskåp.
    6. Efter 30 min, vänd monteringen och placera den i en 35 mm petriskål, fyll med 2 mL DIW, och (med hjälp av tång) försiktigt bort täckglas genom att skjuta den till en sida.
      Obs: lufttorkad PA gel kan förvaras i DIW för 1 månad. Emellertid, när kollagen är belagd på PA-gel, det bör användas i ett experiment inom 1 dag.
  4. Coat kollagen på PA-gel.
    1. Lös upp 1 mg/mL sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2 '-nitrophenylamino) hexanoat (sulfo-SANPAH) i varm 50 mM HEPES buffert. Släpp 200 μL av lösningen på gelytan och aktivera med UV-ljus (365 nm våglängd) i 10 min.
      Obs: skydda sulfo-SANPAH från ljus.
    2. Skölj gelen med 0,1 M [4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic syra; HEPES] buffert 2x och med PBS 1x.
    3. Täck PA-gelen med kollagen lösning (100 μg/mL i PBS, råtta svans kollagen typ I) vid 4 ° c över natten. Nästa dag, tvätta med PBS 3x.

3. micropatterning av cellöar

  1. Förbered F-127 (tabell över material) lösning [2% (w/v) i PBS] och sänk ned den autoklaverade PDMS-stencilen i F-127-lösningen. Förvara den i en 37 ° c inkubator för 1 h.
  2. Förbered cell lösning (2 x 106 cell/ml) i cell odlingsmedier bestående av: Dulbecco ' s Modified Eagle ' s medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% antibiotika-antimykotisk (AA).
  3. Tvätta PDMS stencil med PBS 3x och ta bort vätska från både PDMS stencil och PA gel. Placera PDMS-stencilen på PA-gelen och Lägg till PBS i stencilen.
  4. Ta bort bubblor i hålen i PDMS-stencilen genom att Pipettera försiktigt. När du har avlägsnat bubblor tar du bort PBS från ytan på PDMS-stencilen.
  5. Efter att 200 μL cell lösning på PDMS stencil, hålla PA gelen i en inkubator för 1 h så att cellerna fäster PA gelen.
  6. Tvätta försiktigt bort cell lösning med cell odlingsmedier, ta bort PDMS-stencilen och Lägg till fler cell odlingsmedier. Kontrollera bildandet av cell öar under ett mikroskop.

4. montering av PA gel med PDMS MicroChannel-

  1. Ta bort damm på PDMS MicroChannel-med klibbigt band, sedan autoklav.
  2. Behandla ytan av PDMS MicroChannel-med syre plasma (80 W, 50 kHz) för 30 s.
  3. Efter avlägsnande av vätska på PA gel-fyllda botten glaset, placera PDMS MicroChannel-på toppen av botten glaset och sätta församlingen på den anpassade glas hållaren.
  4. Fyll mikrokanalen med cell odlingsmediet.
    FÖRSIKTIGHET: se till att ta bort alla bubblor fångade i kanalerna genom att försiktigt spola varma medier med en pipett. Också, samtidigt ta bort bubblor, se till att inte lossa mikromönstrade cell öar.

5. integrerat mikroflödessystem system

  1. Anslut tubningarna.
    1. Förbered kontakterna genom att trimma spetsen på nålar (18 G) och böja den 90 °.
    2. Förbered slangledningar för tre inlopp och ett utlopp.
      1. För inloppsrör, Anslut den trimmade nålen och en 30 cm mini-volymlinje med en trevägsstopcock. Förbered tre av dessa.
      2. För utloppsslangen, Anslut den trimmade nålen och en 75 cm mini-volymlinje med en trevägsstopcock. Förbered en av dessa.
      3. Fyll slangen linjer med mediet som har förvärmd för 1 h.
        Varning: se till att ta bort alla bubblor fångade i slangen linjer genom att försiktigt spola varma medier med en spruta.
    3. Förbered reservoarer genom att ta bort pistörer från sprutor och ansluta inloppsrör ledningar.
    4. Anslut nålkontakterna på varje slang linje till de tre inlopp och ett utlopp på mikroflödessystem enheten.
  2. Fyll reservoarerna med 3 mL färskt medium eller konditionerade medium vardera.
    1. För gradientprovet, fyll den vänstra inlopps behållaren med 20 ng/mL HGF i cell odlingsmediet.
    2. För visualisering av koncentrationgradienten, tillsätt en 200 μg/mL fluorescerande färgämne (rhodamine B-dextran, 70 kDa) till den vänstra inlopps behållaren.
    3. Anslut utloppsslangen till en sprutpump.
      Obs: sprutpumpens driftläge är "uttag". Flödeshastigheten ändras i enlighet med sprutpumpens kapacitet och arbetshastighet.
  3. Placera det integrerade mikroflödessystem-systemet på scenen i ett konventionellt epifluorescerande Mikroskop.
    FÖRSIKTIGHET: för att generera en mild gradient av HGF i den mikrofluidiska kanalen ska flödet vara så långsamt som 0,1 μL/min. Detta är tillräckligt känsligt så att det kräver stabilisering för 2 h, och försiktighet måste iakttas för att undvika fysiska störningar under experimentet.

6. bild förvärv

  1. Ta bilder var 10 min i upp till 24 timmar med hjälp av ett automatiserat Mikroskop inrymt i en inkubator. Vid varje timepoint, ta en uppsättning bilder med en 4x objektiv i tre olika kanaler, inklusive fas bild för att visualisera cell migration, grön fluorescerande bild för att visualisera fluorescerande pärlor inbäddade i PA gel, och röd fluorescerande bild för att visualisera koncentrationsgradient av en kemikalie.
  2. Efter att ha tagit Time-lapse bilder, ingjuta 0,25% trypsin-EDTA lösning i mikrokanaler att lossa celler från PA gel. Efter att helt ta bort celler från gelen, ta en grön fluorescerande bild som ska användas som en referensbild för traktionsmikroskopi.

7. analys av data

En anpassad kod för dataanalys utvecklades med hjälp av MATLAB, och detaljer har beskrivits någon annanstans32,33,34,35,36.

  1. För fas bilds analys, beräkna förskjutningar i två på varandra följande fas bilder med partikel bild Velocimetry36.
  2. För Fourier Transform traktion mikroskopi, jämföra varje grön fluorescerande bild med referensbilden och beräkna förskjutningar i varje bild med hjälp av partikel bild Velocimetry36. Från förskjutningarna, återvinna dragkraft som görs av celler på PA gel med hjälp av Fourier Transform traktion mikroskopi33,34,37.
  3. Från dragkrafts data, beräkna stress inom enskiktslager av cellön med hjälp av enskiktslager stressmikroskopi baserat på finita elementmetoder32,34,38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att utforska kollektiv migration under en kemisk gradient integrerades ett microfluidiskt system med traktionsmikroskopi (figur 1). För att bygga det integrerade systemet, polyakrylamid (PA) gel var gjuten på Specialskurna glas, och MDCK celler var seedade inom mikromönstrade öar som gjorts av en PDMS stencil. För detta experiment skapades tolv öar av MDCK-celler (fyra ror vid tre kolonner, diameter av ~ 700 μm). Efter celler som är kopplade till PA Gels togs PDMS-stencilen bort för att initiera kollektiv migrering. Den färdiga mikroflödessystem kanalen placerades ovanpå pa Gels att bygga mikroflödessystem kanal ovan cellulära öar (figur 1A).

För att sedan upprätta en koncentrations lutning i mikrofluidic-kanalen, var den vänstra inloppet ansluten till försörjnings behållaren med en fluorescerande färg lösning. Dessutom var den mellersta och den högra vikar ansluten till försörjningen reservoarer som endast innehåller Media. Sedan var utloppet ansluten till sprutpumpen för att ta bort vätska från mikroflödessystem kanalen. Smörgåsen av Specialskurna glas och mikroflödessystem kanal sattes in på specialbyggda Mikroskop skede. Proverna tillsammans med det automatiserade fluorescerande mikroskopet hölls i en inkubator för levande cell avbildning. Under experimenten hölls cellerna vid 5% CO2 och 37 ° c. En gradient av intensiteten i det fluorescerande färgämnet fastställdes snabbt med en flödeshastighet av 0,125-2 μL/min (figur 2a). Lutningen på lutningen berodde på flödeshastigheten. Till exempel, vid en flödeshastighet av 0,125 μL/min, lutningen utvecklades över 1,5 mm, vilket är den jämförbara storleken på cellöar (figur 2B).

Därefter testades den integrerade enheten med celler. Öarna MDCK celler var mikromönstrade och monteras med mikroflödessystem kanal som beskrivs ovan. Först, utan att tillämpa något flöde i mikrokanalen, det säkerställdes att den cellulära ön spred sig väl inom enheten. Under en period på 12 timmar expanderade ön och den genomsnittliga migrations hastigheten var ~ 0,1 – 0,2 μm/min. Även om det fanns variationer bland öar om hur mycket ön expanderade, alla celler såg friska i No-Flow skick. Därefter var flödet appliceras över dessa öar, och det konstaterades att vid en flödeshastighet av 0,1 μL/min, den cellulära ön spred sig väl, och celler upprätthöll en genomsnittlig migrations hastighet på ~ 0,1-0,2 μm/min för 12 h. När flödet ökas till 0,5 μL/min, spreds dock inte cellerna väl, och den genomsnittliga migrations hastigheten minskade till under 0,1 μm/min. Dessutom verkade morfologier av cellerna annorlunda och verkade vara lossas från PA Gels (figur 3). Baserat på dessa data valdes 0,1 μL/min som flödeshastighet för följande experiment.

För att testa effekterna av en kemisk gradient på kollektiv cell migration valdes HGF till32,34.  Den vänstra inloppet var ansluten till 1) tillförselen reservoaren hålla cellkultur media med HGF lösning (20 ng/mL) och 2) de andra 2 vikar med reservoarer som innehar cell odlingsmedier. Med en flödeshastighet på 0,1 μL/min, flöt över de flyttande cellöar (fyra rader med tre kolumner) upprätthölls för 10 h (figur 4). Som framgår av ett separat experiment var HGF-koncentrationen i den vänstra kolumnen nära koncentrationen av kompletterande-lösningen (20 ng/ml), och på den högra kolumnen var detta nära noll. HGF-koncentrationen på mittkolonnen minskade gradvis från den vänstra halvan till den högra halvan. När man jämför storleken på cellöar efter 10 h, öarna i den högra kolumnen inte expandera mycket, men de på den vänstra kolumnen blev betydligt större och expanderade i alla riktningar (figur 4A). Sådana förändringar i öns storlek stöddes av trajectorier av celler inom varje ö (figur 4B). Intressant, öar i mitten kolumnen inte expandera mot höger (där HGF koncentrationen var låg) men expanderade företrädesvis mot vänster (där HGF koncentrationen var hög). Även om det fanns liten förändring i den genomsnittliga migrations hastigheten i den högra kolumnen, i vänster och mellersta kolumner, ökade den genomsnittliga migrations hastigheten gradvis för de första 3 h, sedan gradvis minskat (figur 4C).

För att mäta kontraktila kraft och intercellulära stress, var traktionsmikroskopi37,39,40 och enskiktslager stress mikroskopi kombineras med mikroflödessystem kanal33,35, 38. Under loppet av 10 h under applicering av den kemiska gradienten, bilder av fluorescerande partiklar togs i PA Gels, och kraften (per enhet område) appliceras av celler på substratet analyserades med hjälp av Fourier Transform traktion mikroskopi35, 37. Dragkraft plottas i polära koordinater. Blått föreställer styrkan in mot centrera av ön, och rött föreställer styrkan bort från centrera.

Vid Time Zero, alla öar visade liknande dragning fördelningar, med stark inåt dragning på kanten och fluktuation inom ön. Denna fluktuation liknade vad som tidigare visats34,35,41. Efter 10 h att tillämpa HGF-gradienten, medan graden av öexpansion var olika i varje kolumn, var dragkrafts fördelningarna till stor del likartade med Time Zero (figur 5A). Den genomsnittliga dragkraften ändrades inte för 10 h (figur 5C). Vid beräkning av enskiktslager stress, men varje kolumn visade olika trender. I den högra kolumnen (där HGF koncentrationen var låg), den genomsnittliga spänningen inom öar upprätthölls runt 200 pa under en 10 h period. I den vänstra kolumnen (där HGF koncentrationen var hög), den genomsnittliga spänningen inom öar minskade gradvis från 230 pa till 100 PA över 10 h, som tidigare visat32,34. I den mellersta kolumnen (där HGF koncentrationen var hög på den vänstra halvan och låg på den högra halvan av ön), den genomsnittliga spänningen upprätthölls runt 150 Pa.

Figure 1
Figur 1: Schematisk förberedelse av den integrerade anordningen. (A) för att tillverka den integrerade enheten, ett botten glas med PA gel på vilken cell öar mönstrade med hjälp av en PDMS stencil täcktes med en PDMS MicroChannel. B) de integrerade anordningarna fastställdes med hjälp av en anpassad hållare för att förhindra läckage av vätska och komponent dissociation. (C) när enheten är fylld med vätska utan bubblor, var reservoarer anslutna till inlopp, och en sprutpump var ansluten till utloppet. Alla experimentella uppställningar placerades på ett levande cell avbildningssystem. (D) den schematiska visar utformningen och sammansättningen av mikroflödessystem kanaler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: upprättande av c-hemical gradient. A) fluorescensbilder av rodamin B-konjugerat dextran (70 kDa) visualiserar koncentrationens gradient under vätskeflödet på 0,125 μl/min, 0,5 μl/min och 2 μl/min. prickig cirklar indikerar positionen av de mönstrade cellöar. B) fluorescensbildens intensitetsprofil visar att koncentrationens lutning i anordningen var justerbar genom flödet. Felstaplar indikerar standardavvikelse. De färgade staplarna anger kolumn positionerna för den mönstrade cellön. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: migrering av MDCK-cellöar underflöde. (A) fas bilderna vid 12 h av MDCK-cellön vid varje flöde (0 μl/min, 0,1 μl/min och 0,5 μl/min) visar att cellöar har expanderat bra till ett lågt flöde men inte expanderar med Högflödes hastighet. Prickade linjer representerar gränserna vid 0 h. (B) medelvärdet och histogrammet för den cellulära hastigheten inom varje ö varje 10 min för 12 h. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: migration av cell öar i MDCK underflöde och kemisk gradient. (A) det relativa intensitetsintervallet för rodamin B-konjugerat dextran upprätthöll en konstant gradient i HGF-koncentration i varje kolumn efter stabilisering för 2 h. (B) fas bilder vid 10 h (prickad linje = cell öns gräns vid 0 h) i MDCK-cellen ön under HGF-gradienten (från vänster till höger: 20 – 0 ng/mL) visar att ön expanderade mer där HGF-koncentrationen var högre. (C) banor för migrationsvägar (färgkodning anger banans längd) för celler i MDCK-cellöar. Prickade linjer och streckade linjer representerar varje cellöns gränser vid 0 h respektive 10 h. (D) medelvärdet och histogrammet för den cellulära hastigheten inom varje ö varje 10 min för 10 h. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: mekaniska interaktioner mellan MDCK-cellöar. (A) kartorna över dragkraft (cell-substrat interaktion) i cellöarna vid 0 h och 10 h under HGF-gradienten. Kartorna plottas i radiell koordination, med passiv dragning med varm färg och inåt dragkraft med hjälp av kall färg. (B) kartor över enskiktslager spänning (cell-cell interaktioner) i cellöarna vid 0 h och 10 h under HGF gradient. (C) handlingen i genomsnitt dragning (grå kvadrat) och spänning (blå cirkel) inom cellöarna under HGF gradient över tiden varje 10 min för 10 h. Färgbanden representerar Mid-kvartilen (~ 25% – 75%). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 1
Tilläggs figur S1: korrekt pärlfördelning krävs för tillräcklig datakvalitet vid dragkrafts analys. Exempel på bra (vänster) och dålig (höger) kvalitet fluorescerande pärla bilder med förstorade bilder i de vita rutorna visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kollektiv migration av konstituerande celler är en viktig process under utveckling och förnyelse, och migrations riktningen styrs ofta av tillväxtfaktorernas kemiska lutning4,23. Under kollektiv migration, celler hålla interagera med angränsande celler och underliggande substrat. Sådana mekaniska interaktioner ger upphov till framväxande fenomen som durotaxis42, plithotaxis33, och kenotaxis43. Emellertid, denna forskning utfördes görs med hjälp av en enda koncentration av tillväxtfaktorer, såsom de i Foster bovint serum. För att fylla gapet, beskriver detta protokoll en ny experimentell plattform som kan mäta mekaniska interaktioner under kollektiv cellulär migration under en kemisk gradient.

Den nya plattformen kombinerar tre experimentella system som har använts i stor utsträckning: micropatterning, traktionsmikroskopi och mikrofluidik. För det första genomfördes mikromönkning av cell öar för kollektiv migration. För det andra användes både traktionsmikroskopi och enskiktslager-stressmikroskopi för mekaniska mätningar av flytt av celler. Slutligen användes en mikrofluidik plattform för att etablera kemisk gradient över migrera celler. Med detta experimentella system, det visades att celler inom en enda ö migrera olika som svar på olika kemiska gradienter.

Som beskrivits i figur 2bildas den kemiska gradienten endast på ett avstånd av 1 mm mitt i mikrokanalen. Öar i den vänstra kolumnen utsätts för den maximala koncentrationen, och de på den högra kolumnen utsätts för den lägsta koncentrationen. Öar i Mittkolumnen utsätts däremot för den kemiska gradienten. På så sätt mäts reaktionen från cellöar vid maximal, minimal, och en gradient av koncentrationer av en löslig faktor under samma experiment. Med hjälp av denna matris av cell öar, observerades en gradvis ökning av cellulära migration hastighet som HGF koncentration ökade.

För att uppnå data av hög kvalitet finns det viktiga steg i det förfarande som kräver särskild uppmärksamhet. PA Gels i ett specialglas substrat måste vara perfekt när det gäller distribution av fluorescerande partiklar och ytbeläggning av kollagen. Detta beror på att utan hög kvalitet pa Gels, en högkvalitativ datauppsättning för dragning analys och enskiktslager stress analys kan inte förvärvas. Exempel på pärlbilder av hög kvalitet visas i tilläggs figur 1. De mikroflödessystem kanalerna är mycket små, och bubblor är lätt fångade i dem. Dessa bubblor stör inte bara flödet utan kan också sopa bort celler om de börjar röra sig längs med flödet. Därför är det viktigt att fylla mikroflödessystem kanaler utan bubblor. För att uppnå en stabil gradient inom mikrokanalen, är balansen mellan tryck inom de tre inlopp mycket viktigt. För att undvika obalans mellan dem bör stora reservoarer användas så att eventuella obalanser i början av ett experiment enkelt kan justeras. Denna nya plattform kommer att bidra till ytterligare utforskning av mekaniken i kollektiv cell migration under kemiska gradienter, som är nyckeln till förståelse förnyelse, cancermetastaser, och utveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Research Foundation of Korea (NRF) bidrag finansieras av den koreanska regeringen (MSIP) (No. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant och BK 21 plus-programmet. Det stöddes också av National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
1 M HEPES buffer solution Gibco 15630-056
1 mm Biopsy punch Integra Miltex 33-31AA-P/25
100 mm petri dishes SPL 10100 100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punch ILJIN 124-0571
18 mm Ø Coverslip Marienfeld-Superior 111580 Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solution Bio-Rad 1610142 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) Sigma-Aldrich 440159-500ML
3-way stopcock Hyupsung HS-T-61N CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-30 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dish Corning 430165
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-75 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acid J.T. Baker JT9508-03
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad 1610700
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Bottom glass chip MicroFIT 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tail Corning 354236
Custom glass holder Han-Gug Mechatronics custom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Welgene LM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biowest L0615-500 w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheres Invitrogen F8764 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Sigma-Aldrich H1404-5UG recombinant, human
JuLI stage live cell imaging system NanoEnTek In Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell type II
Oxygen plasma system Femto Science CUTE-MPR
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich R9379-100MG 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 G KOVAX Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape 3M/Scotch 810D 33 m x 19 mm
SU-8 master molds MicroFIT 4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) Thermo Scientific 22589 Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS
Syringe pump Chemyx Inc. model fusion 720 withdraw fluid
Syringes KOVAX 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lamp UVP LLC 95-0248-02 365 nm wavelength

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  4. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  5. Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
  6. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  7. Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
  8. Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
  9. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  10. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
  11. Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
  12. Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
  13. Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617 (2018).
  14. Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515 (2015).
  15. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  16. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
  17. Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
  18. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
  19. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
  20. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  21. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  22. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  23. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  24. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  25. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  26. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  27. Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
  28. Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 4 Pt 1 041918 (2010).
  30. Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
  31. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  32. Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
  33. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  34. Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
  35. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426 (2009).
  36. Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
  37. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  38. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172 (2013).
  39. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  40. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
  41. Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
  42. Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  43. Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).

Tags

Bioteknik fråga 152 mikrofluidik traktionsmikroskopi kollektiv cell migration chemotaxis kemisk gradient micropatterning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jang, H., Kim, J., Shin, J. H.,… More

Jang, H., Kim, J., Shin, J. H., Fredberg, J. J., Park, C. Y., Park, Y. Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration. J. Vis. Exp. (152), e60415, doi:10.3791/60415 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter