Summary
发育、伤口愈合和癌症转移中的集体细胞迁移通常受生长因子或信号分子梯度的引导。本文介绍了一个实验系统，将牵引显微镜与微流体系统相结合，并演示了如何在生物化学梯度下量化集体迁移的力学。
Abstract
细胞改变迁移模式以响应化学刺激，包括刺激的梯度。细胞向化学梯度方向迁移，称为化学梯度，在发育、免疫反应、伤口愈合和癌症转移中起着重要作用。虽然化学疗法调节单个细胞的迁移以及体内细胞的集合，体外研究侧重于单细胞化疗，部分原因是缺乏适当的实验工具。为了填补这一空白，这里描述的是一个独特的实验系统，它结合了微流体和微模式，以展示化学梯度对集体细胞迁移的影响。此外，牵引显微镜和单层应力显微镜被纳入系统，以表征基基上以及相邻细胞之间的细胞力变化。作为概念证明，在肝细胞生长因子（HGF）的梯度下测试马丁-达比（MDCK）细胞微模式圆形岛屿的迁移。这是一种已知的散射因子。研究发现，位于HGF浓度较高的细胞比细胞岛内另一侧的细胞迁移得更快。在同一岛内，两侧的细胞牵引力相似，但高HGF浓度的一侧细胞间应力要低得多。这一新型实验系统为研究细胞群化学迁移机制提供了新的机会。
Introduction
细胞迁移在生物系统中是一个基本现象，涉及组织形成，免疫反应，伤口愈合1，2，3。细胞迁移也是癌症等某些疾病的重要过程。细胞通常作为一个组而不是单个迁移，这称为集体细胞迁移 4，5。对于细胞集体移动，对微环境的感知至关重要6。例如，细胞感知物理化学刺激，并通过改变运动性、细胞-基质相互作用和细胞-细胞相互作用来做出反应，从而沿着化学梯度7、8发生定向迁移。 9，10.基于这种联系，在片上实验室技术方面取得了迅速的进步，这些技术可以创造出控制良好的化学微环境，如化学吸引剂11、12、13的梯度。.虽然这些基于芯片的实验室微流体学以前曾用于研究细胞团或细胞球体的化学细胞14、15、16、17，但它们主要用于单细胞迁移18，19，20，21。细胞集体对化学梯度反应的机制仍然不太了解14，22，23，24，25，26.因此，开发一个能够对可溶性因子进行时空控制以及对细胞生物物理进行原地观察的平台将有助于解开集体细胞迁移背后的机制。
这里开发和描述的是一个多通道微流体系统，能够产生可溶性因子的浓度梯度，调节模式细胞簇的迁移。在这项研究中，选择肝细胞生长因子（HGF）来调节马丁-达比管肾（MDCK）细胞的迁移行为。HGF已知能衰减细胞完整性，增强细胞的活力27，28。在微流体系统中，傅立叶转换牵引显微镜和单层应力显微镜也进行了整合，从而可以分析组成细胞在响应HGF时引起的运动力、收缩力和细胞间张力梯度。在同一岛内，位于HGF浓度较高的细胞迁移速度更快，细胞间应激水平低于HGF浓度较低的细胞侧。结果表明，这一新的实验系统适用于在各种可溶性因子化学梯度下，在涉及集体细胞迁移的研究领域的其他问题。
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Protocol
注：SU-8模具的平版印刷模具（厚度 = 250 μm）和微通道零件（厚度 = 150 μm）、玻璃蚀刻（深度 = 100 μm）和铸件制造均通过使用计算机辅助设计软件向制造商发送设计进行外包。
1. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具和微通道的制造
- 设计模具和微通道的微模式。
- 在硅晶片（直径 4 英寸）上制造或外包 SU-8 模具（模具厚度为 ±250 μm，微通道为 ±150 μm）。
- 将基弹性体和固化剂混合在10：1的比例，制备PDMS混合物。
- 将15 mL的基质弹性体放入 50 mL 锥形管中，并加入 1.5 mL 的固化剂。准备其中两个。
- 将 PDMS 混合物涡旋 5 分钟，将 PDMS 混合物在 196 x g下移 1 分钟以去除气泡。
- 要制造 PDMS 模具，请将 ±1 mL 的 PDMS 混合物倒在晶圆上，同时避免 SU-8 图案区域，使 PDMS 接触 SU-8 柱的侧面，而不是 SU-8 型板的顶部。
- 在室温 （RT） 下，将晶圆放在平坦的表面上超过 30 分钟。在 80°C 的干燥烤箱中固化 PDMS 超过 2 小时。
- 小心地从 SU-8 模具中剥离 PDMS，并使用 14 mm 空心冲孔修剪薄的 PDMS 膜。使用胶带清除 PDMS 片件表面的灰尘，并用吸尘器清除 PDMS 模具。
- 要制造 PDMS 微通道，在 SU-8 模具上倒入 ±30 mL 的 PDMS 混合物。
- 在真空室中脱气30分钟，在80°C干燥烤箱中固化PDMS超过2小时。
- 小心地从 SU-8 模具中剥离 PDMS，并将 PDMS 切割到 24 mm x 24 mm 的尺寸。在每个 PDMS 块中，使用 1 mm 活检冲孔创建一个出口和三个入口。
2. 用聚丙烯酰胺 （PA） 凝胶制备底玻璃
- 通过切割和蚀刻眼镜制造或外包矩形滑动眼镜（24 毫米 x 24 毫米 x 1 毫米），带矩形微孔（6 毫米 x 12 毫米，100 μm 深度29）。
- 硅化底玻璃的表面30。
- 通过将 200 mL 的脱离子水 （DIW）、80 μL 的醋酸和 50 μL 的 3-（三聚氧基）丙酸丙烯酸酯 （TMSPMA） 混合 1 小时，制备结合硅烷溶液。
注意：TMSPMA是一种可燃液体。按照材料安全数据表中的建议进行操作。只能在化学烟气罩中使用。 - 用胶带和高压灭菌器清除玻璃表面的灰尘。
- 用100 μL的粘结硅烷溶液覆盖底部玻璃的蚀刻表面，并将玻璃留在RT处1小时。
- 用 DIW 3x 冲洗玻璃，让玻璃在环境空气温度下干燥或吹空气。
- 通过将 200 mL 的脱离子水 （DIW）、80 μL 的醋酸和 50 μL 的 3-（三聚氧基）丙酸丙烯酸酯 （TMSPMA） 混合 1 小时，制备结合硅烷溶液。
- 为PA凝胶31准备凝胶溶液。
- 通过在 DIW 的 1 mL 中溶解 5 mg APS，制备 0.5 % （w/v） 百万铵 （APS） 的新溶液。
- 制备由138 μL（40%丙烯酰胺溶液）、101μL2%双丙烯酰胺溶液、5μL荧光颗粒溶液（0.2 μm）和655μLDIW组成的PA凝胶溶液。
注意：丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液是有毒的。戴上防护手套、衣服和护眼。保护含有荧光颗粒的PA凝胶溶液免受光线照射。
注：在移液前，涡旋荧光珠溶液可获得每批统一数量的荧光珠。 - 加入100μL的APS溶液和1μL的四甲基二甲二胺（TEMED）后，将10μL的混合凝胶溶液转移到矩形微孔上，并放置在顶部的圆形盖玻片（18毫米）。
注：要用无气泡的 PA 凝胶填充底部玻璃，请将足够的凝胶溶液放在底部玻璃的凹槽上，小心地将盖玻片滑过凝胶溶液，并去除任何多余的凝胶溶液。
注意：凝胶缓慢固化约40分钟。应尽快执行以下离心凝胶程序。 - 翻转定制玻璃、凝胶溶液和盖玻片的组装，然后在 96 x g下离心 10 分钟，将荧光颗粒带到 PA 凝胶的顶层。
- 从离心机中取出组件，并将其放在平面上，盖玻片朝下。
注：从步骤 2.3.6 开始，在生物安全柜中处理样品。 - 30 分钟后，翻转组件并将其放入 35 mm 培养皿中，填充 2 mL 的 DIW，（使用钳子）通过滑动到一侧轻轻取下盖玻片。
注：固化的PA凝胶可储存在DIW中1个月。然而，一旦胶原蛋白涂在PA凝胶上，它应该在1天内用于实验。
- 在PA凝胶上涂上胶原蛋白。
- 将1mg/mL磺酸酰胺6-（4'-azido-2'-硝基苯甲酸酯）六溴二苯甲酸酯（sulfo-SANPAH）溶解在温暖的50 mM HEPES缓冲液中。将溶液的 200 μL 滴到凝胶表面，由紫外线（365 nm 波长）激活 10 分钟。
注：保护磺酸-SANPAH免受光线照射。 - 用0.1M×4-（2-羟基）-1-烟碱硫酸冲洗凝胶;HEPES+ 缓冲器 2 倍，带 PBS 1x。
- 在4°C过夜4°C时用胶原蛋白溶液（PBS中100微克/mL，大鼠尾部胶原蛋白I型）涂上PA凝胶。第二天，用PBS 3x清洗。
- 将1mg/mL磺酸酰胺6-（4'-azido-2'-硝基苯甲酸酯）六溴二苯甲酸酯（sulfo-SANPAH）溶解在温暖的50 mM HEPES缓冲液中。将溶液的 200 μL 滴到凝胶表面，由紫外线（365 nm 波长）激活 10 分钟。
3. 细胞岛的微观图案
- 在 PBS 中制备 F-127 （材料表） 溶液 [2% （w/v）]，并将高压灭菌的 PDMS 模具浸入 F-127 溶液中。将其保存在37°C的培养箱中1小时。
- 在细胞培养基中制备细胞溶液（2 x 106细胞/mL），包括：Dulbeco的改性Eagle的培养基（DMEM），具有10%的胎儿牛血清（FBS）和1%抗生素抗霉菌（AA）。
- 用 PBS 3x 清洗 PDMS 模具，并从 PDMS 模具和 PA 凝胶中取出液体。将 PDMS 模具放在 PA 凝胶上，并将 PBS 添加到模具中。
- 通过轻轻移液去除 PDMS 模具孔中的气泡。去除气泡后，从 PDMS 模具表面取出 PBS。
- 在 PDMS 模具上加入 200 μL 的细胞溶液后，将 PA 凝胶保存在培养箱中 1 小时，以便细胞附着在 PA 凝胶上。
- 用细胞培养基轻轻冲洗细胞溶液，取出PDMS模具，并添加更多细胞培养基。在显微镜下检查细胞岛的形成。
4. 使用PDMS微通道组装PA凝胶
- 使用胶带清除 PDMS 微通道上的灰尘，然后清除高压灭菌器。
- 使用氧等离子体（80 W、50 kHz）处理 PDMS 微通道表面 30 s。
- 去除 PA 凝胶填充底部玻璃上的任何液体后，将 PDMS 微通道放在底部玻璃顶部，并将组件放在定制玻璃支架上。
- 用细胞培养基填充微通道。
注意：确保用移液器轻轻冲洗加热介质，清除通道中的所有气泡。此外，在移除气泡时，请确保不要分离微模式的细胞孤岛。
5. 集成微流体系统
- 连接油管。
- 通过修剪针头（18 G）并弯曲 90°来准备接头。
- 为三个入口和一个出口准备管道管路。
- 对于进气管，连接修剪过的针头和 30 厘米的微型体积线，带三向止孔。准备其中三个。
- 对于出口管，连接修剪过的针头和 75 厘米的微型体积线，带三向止孔。准备其中一个。
- 用已预热 1 小时的介质填充管路。
注意：确保用注射器轻轻冲洗加热介质，去除管道管管管管管管管管管管管管管管管管管管管管中的所有气泡。
- 通过从注射器中取出柱塞并连接进气管管管管管管管管管管管管管管管，准备储液罐。
- 将每个管线的针接头插入微流体装置的三个入口和一个出口。
- 向储层中填充 3 mL 的新鲜介质或空调介质。
- 对于梯度测试，在细胞培养基中用20纳克/mL HGF填充左进气罐。
- 为了显示浓度梯度，在左进气罐中添加200μg/mL荧光染料（罗达明B-d-dextran，70 kDa）。
- 将出口管管管管管管连接到注射器泵。
注：注射器泵的操作模式为"退出"。流量根据注射器的容量和注射器泵的运行速度而变化。
- 将集成微流体系统放在常规表观显微镜的舞台上。
注意：要在微流体通道中产生微流体通道中微微的HGF温和梯度，流速应慢至0.1 μL/min。这足够敏感，需要稳定2小时，必须小心避免实验期间的身体干扰。
6. 图像采集
- 使用安装在孵化器中的自动显微镜，每 10 分钟拍摄一次图像，长达 24 小时。在每个时间点，在三个不同的通道中使用 4x 物镜拍摄一组图像，包括相位图像以可视化细胞迁移，绿色荧光图像可可视化嵌入 PA 凝胶中的荧光珠，以及用于可视化的红色荧光图像。化学品的浓度梯度。
- 取时移图像后，将0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液注入微通道，从PA凝胶分离细胞。完全去除凝胶中的细胞后，取一个绿色荧光图像，用作牵引显微镜的参考图像。
7. 数据分析
注：使用MATLAB开发了用于数据分析的自定义代码，详细信息已在其他地方描述32、33、34、35、36 。
- 对于相位图像分析，使用粒子图像速度测量36计算两个连续相图像的位移。
- 对于傅立叶变换牵引显微镜，将每个绿色荧光图像与参考图像进行比较，并使用粒子图像速度测量36计算每个图像的位移。从位移中，恢复由细胞在PA凝胶使用傅立叶转换牵引显微镜33，34，37的牵引。
- 从牵引数据中，基于有限元方法32、34、38，使用单层应力显微镜计算细胞岛单层内的应力。
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Representative Results
为了探索化学梯度下的集体迁移，将微流体系统与牵引显微镜集成在一起（图1）。为了构建集成系统，聚丙烯酰胺 （PA） 凝胶被浇在定制切割的玻璃上，MDCK 细胞在由 PDMS 模具制成的微图案岛屿中播种。在本实验中，创建了12个MDCK细胞孤岛（四行乘三列，直径为+700μm）。在附着在PA凝胶上的细胞后，PDMS模具被移除以启动集体迁移。预制造的微流体通道被放置在PA凝胶的顶部，以在细胞岛上方建立微流体通道（图1A）。
然后，为了在微流体通道内建立浓度梯度，左入口连接到含有荧光染料溶液的供应储液。此外，中间和右侧入口连接到仅包含介质的电源储层。然后，出口连接到注射器泵，以去除微流体通道中的液体。定制切割玻璃的三明治和微流体通道入到定制的显微镜舞台上。样品和自动荧光显微镜一起保存在活细胞成像的培养箱内。在整个实验中，细胞保持在5%CO2和37°C。 荧光染料强度的梯度以0.125-2μL/min的流速快速建立（图2A）。梯度的斜率取决于流速。例如，在0.125 μL/min的流速下，梯度在1.5毫米以上形成，这是细胞岛的可比大小（图2B）。
接下来，对集成单元的设备进行了测试。MDCK细胞的孤岛被微模式化，并与上述微流体通道组装。首先，在不在微通道中施加任何流量的情况下，确保细胞岛在器件内广泛传播。在12个小时期间，该岛扩大，平均迁移速度为±0.1~0.2 μm/min。虽然岛屿之间在岛屿扩张程度方面存在差异，但所有细胞在无流动条件下看起来都健康。接下来，在这些岛屿上施加流量，发现在0.1 μL/min的流速下，细胞岛传播良好，细胞在12小时内保持±0.1~0.2μm/分钟的平均迁移速度。然而，当流速增加到0.5μL/min时，细胞传播得不好，平均迁移速度下降到0.1μm/min以下。此外，细胞的形态似乎不同，似乎从PA凝胶分离（图3）。根据这些数据，选择0.1 μL/min作为以下实验的流速。
为了测试化学梯度对集体细胞迁移的影响，选择HGF32，34。 左入口连接到 1） 用 HGF 溶液 （20 ng/mL） 的供气罐保持细胞培养基，2） 其他 2 个入口与储层保持细胞培养基。流速为0.1 μL/min时，在迁移的细胞岛（四行乘三列）的流量保持10小时（图4）。如另一项实验所示，左柱上的HGF浓度接近于分离溶液（20纳克/mL）的浓度，而在右柱上，浓度接近于零。中柱的HGF浓度逐渐从左半部分降至右半部分。在比较10小时后的细胞岛大小时，右柱上的岛屿没有扩大太多，但左柱上的岛屿明显变大，向各个方向扩展（图4A）。岛屿大小的这种变化得到了每个岛屿内细胞轨迹的支持（图4B）。有趣的是，中间柱中的岛屿没有向右扩展（HGF浓度较低），而是优先向左侧扩展（HGF浓度较高）。虽然右列的平均迁移速度变化不大，但在左列和中间列中，平均迁移速度在前 3 小时逐渐增加，然后逐渐降低（图 4C）。
为了测量收缩力和细胞间应力，牵引显微镜37、39、40和单层应力显微镜与微流体通道33、35相结合。 38.在应用化学梯度的10小时过程中，在PA凝胶中拍摄了荧光颗粒的图像，并使用傅立叶变换牵引显微镜35分析基板上细胞施加的力（单位面积）。 37.在极坐标中绘制了牵引力。蓝色表示向岛屿中心的力，红色表示远离中心的力。
在零点时，所有岛屿都表现出相似的牵引力分布，在边缘有强烈的向内牵引力，在岛屿内波动。这种波动与先前显示的34、35、41相似。应用HGF梯度10小时后，虽然每列的岛屿膨胀程度不同，但牵引力分布与时间零大致相似（图5A）。平均牵引力在 10 小时内没有变化 （图 5C）。然而，在计算单层应力时，每列都显示出不同的趋势。在右柱（HGF浓度较低）中，岛屿内的平均张力在10小时内保持在200Pa左右。在左柱（其中HGF浓度高），岛屿内的平均张力逐渐从230帕下降到10个Pa超过10小时，如前所示32，34。在中间柱（HGF浓度在左半部高，在岛右半部低），平均张力保持在150帕左右。
图1：集成设备制备的原理图。（A） 为了制造集成装置，用PDMS模具覆盖一个带有PA凝胶的底层玻璃，上面用PDMS模具图案的细胞岛。（B） 使用定制支架固定集成装置，以防止液体泄漏和部件分离。（C） 在充满无气泡的液体后，储液罐连接到入口，注射器泵连接到出口。所有实验装置都放置在活细胞成像系统上。（D） 原理图显示了微流体通道的设计和组成。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：建立c形梯度。（A） rhodamine B 偶联 dextran （70 kDa） 的荧光图像可视化 0.125 μL/min、0.5 μL/min 和 2 μL/min 的流体流下的浓度梯度。（B） 荧光图像的强度曲线显示，器件中的浓度梯度可按流速调节。误差条表示标准偏差。彩色条表示图案单元格岛的列位置。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：流量下MDCK细胞岛的迁移。（A） MDCK细胞岛12小时处的相位图像以每个流速（0 μL/min、0.1 μL/min和0.5 μL/min）显示，细胞岛以低流速扩张良好，但没有以高流速膨胀。虚线表示0小时（B）时的边界：每10分钟每10分钟一次，每10分钟一次，每12小时，每个岛内的细胞速度的平均值和直方图。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：在流动和化学梯度下MDCK细胞岛迁移。（A） 在 MDCK 细胞的 10 h （虚线 + 细胞岛边界 0 h） 稳定 2小时后，红胺 B-偶联dextran的相对强度范围在每列中保持恒定的HGF浓度梯度。HGF梯度下（从左到右：20~0纳克/mL）的岛屿表明，在HGF浓度较高的地方，岛屿扩张得更多。（C） MDCK细胞孤岛中细胞的迁移路径轨迹（颜色编码表示路径长度）。虚线和虚线分别表示每个细胞岛的边界，分别为 0 小时和 10 小时。（D） 每个岛屿内每10分钟一次的细胞速度平均值和直方图，每10小时。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：MDCK细胞岛的机械相互作用。（A） 在HGF梯度下0小时和10小时在细胞岛的牵引图（细胞基质相互作用）。地图以径向协调绘制，外向牵引使用暖色，向内牵引使用冷色。（B） 在HGF梯度下0小时和10小时细胞岛的单层张力（细胞-细胞相互作用）的图谱。（C） 在 HGF 梯度下单元岛内的平均牵引力（灰色正方形）和张力（蓝色圆）的地块，每 10 分钟一次，以 10 小时进行一次。色带表示中四分位数（±25%~75%）。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图S1：在牵引力分析期间，足够的数据质量需要正确的珠子分布。显示了白色框中图像放大的好（左）和坏（右）质量荧光珠图像的示例。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
组成细胞的集体迁移是发育和再生过程中的一个重要过程，迁移方向往往受生长因子4、23的化学梯度的引导。在集体迁移期间，细胞与相邻细胞和底层基质继续相互作用。这种机械相互作用产生一些紧急现象，如杜罗塔克42、plithot轴33和基轴43。然而，这项研究是使用单一浓度的生长因子进行的，如胎儿牛血清中的那些。为了填补这一空白，该协议描述了一个新的实验平台，它可以在化学梯度下测量集体细胞迁移过程中的机械相互作用。
新平台结合了三个已广泛使用的实验系统：微模式、牵引显微镜和微流体。首先，对用于集体移徙的细胞岛进行了微观模式设计。其次，牵引显微镜和单层应力显微镜都用于迁移细胞的机械测量。最后，利用微流体平台对迁移细胞建立化学梯度。通过这个实验系统，证明单个岛屿内的细胞在响应不同的化学梯度时会以不同的方式迁移。
如图2所示，化学梯度仅在微通道中间1毫米的距离内形成。左柱中的岛屿暴露在最大浓度下，右柱上的岛屿的浓度最低。相反，中间柱中的岛屿暴露于化学梯度中。这样，在同一实验中，细胞岛的响应以最大、最小和可溶性因子的浓度梯度进行测量。使用这一阵列的细胞孤岛，观察到随着HGF浓度的增加细胞迁移速度的逐渐增加。
为了实现高质量的数据，流程中有一些关键步骤需要特别注意。定制玻璃基板中的PA凝胶在荧光颗粒和胶原蛋白表面涂层的分布方面必须完美。这是因为如果没有高质量的 PA 凝胶，则无法获取用于牵引力分析和单层应力分析的高质量数据集。高质量珠子图像的示例显示在补充图 1中。微流体通道非常小，气泡很容易被捕获。这些气泡不仅干扰流动，而且如果细胞开始沿流动移动，也会将细胞扫走。因此，填充无气泡的微流体通道至关重要。为了在微通道内实现稳定的梯度，三个入口内的压力平衡非常重要。为了避免它们之间的不平衡，应该使用大型储层，以便实验开始时的任何不平衡都可以很容易地调整。这个新的平台将有助于进一步探索化学梯度下集体细胞迁移的机制，这是理解再生、癌症转移和发展的关键。
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Disclosures
提交人宣称，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了韩国政府资助的韩国国家研究基金会（NRF）赠款的支持（No.NRF-2017R1E1A1A01075103），韩国大学助学金和BK 21 Plus计划。它还得到了国家卫生研究院（U01CA202123、PO1HL120839、T32HL007118、R01EY019696）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Gibco | 15630-056 | |
| 1 mm Biopsy punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| 100 mm petri dishes | SPL | 10100 | 100 mm diameter, 15 mm height |
| 14 mm hollow punch | ILJIN | 124-0571 | |
| 18 mm Ø Coverslip | Marienfeld-Superior | 111580 | Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| 2% bis-acrylamide solution | Bio-Rad | 1610142 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) | Sigma-Aldrich | 440159-500ML | |
| 3-way stopcock | Hyupsung | HS-T-61N | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 30 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-30 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 75 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-75 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| acetic acid | J.T. Baker | JT9508-03 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Bottom glass chip | MicroFIT | 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm) | |
| Collagen typeI, Rat tail | Corning | 354236 | |
| Custom glass holder | Han-Gug Mechatronics | custom-made | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM 001-11 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | w/o Magnesium, Calcium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| FluoSpheres amine-modified microspheres | Invitrogen | F8764 | 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515) |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Sigma-Aldrich | H1404-5UG | recombinant, human |
| JuLI stage live cell imaging system | NanoEnTek In | Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell | type II | ||
| Oxygen plasma system | Femto Science | CUTE-MPR | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| Rhodamine B isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | R9379-100MG | 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel |
| Steril hypodermic needle 18 G | KOVAX | Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line | |
| Sticky tape | 3M/Scotch | 810D | 33 m x 19 mm |
| SU-8 master molds | MicroFIT | 4” diameter, custom-made | |
| sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 | Store at -20°C. Store protected from moisture and light. |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS | |
| Syringe pump | Chemyx Inc. | model fusion 720 | withdraw fluid |
| Syringes | KOVAX | 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump | |
| tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Ultraviolet (UV) lamp | UVP LLC | 95-0248-02 | 365 nm wavelength |
References
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