Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Trækkraft mikroskopi integreret med Microfluidics til kemo-aktisk kollektiv migration

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/60415
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1
1Department of Biomedical Sciences, Korea University, 2Department of Mechanical Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3Department of Environmental Health, Harvard T.H. Chan School of Public Health

Summary

Kollektiv celle migration i udvikling, sårheling, og kræft metastaser er ofte styret af gradienter af vækstfaktorer eller signalering molekyler. Beskrevet her er et eksperimentelt system, der kombinerer trækkraft mikroskopi med et mikrofluidisk-system og en demonstration af, hvordan man kvantificerer mekanik af kollektiv migration under biokemisk gradient.

Abstract

Celler ændre migrationsmønstre som reaktion på kemiske stimuli, herunder gradienter af stimuli. Cellulære migration i retning af en kemisk gradient, kendt som chemotaxis, spiller en vigtig rolle i udviklingen, immunrespons, sårheling, og kræft metastaser. Mens chemotaxis modulerer migrationen af enkeltceller samt samlinger af celler in vivo, in vitro forskning fokuserer på enkelt-celle chemotaxis, dels på grund af manglen på de rette eksperimentelle værktøjer. For at udfylde dette hul, beskrevet her er et unikt eksperimentelt system, der kombinerer mikrofluidics og micropatterning for at demonstrere virkningerne af kemiske gradienter på kollektiv celle migration. Desuden er trækkraft mikroskopi og enkeltlags stress mikroskopi indarbejdet i systemet for at karakterisere ændringer i cellulær kraft på substratet såvel som mellem tilstødende celler. Som proof-of-koncept, migrering af mikromønstrede cirkulære øer af Madin-Darby hunde nyre (mdck) celler testes under en gradient af hepatocyt vækstfaktor (hgf), en kendt spredning faktor. Det er konstateret, at celler placeret nær den højere koncentration af HGF migrere hurtigere end dem på den modsatte side i en celle ø. Inden for samme ø, cellulære trækkraft er ens på begge sider, men intercellulære stress er meget lavere på siden af højere HGF koncentration. Dette nye eksperimentelle system kan give nye muligheder for at studere mekanik af kemo aktisk migration af cellulære kollektiver.

Introduction

Cellulær migration i biologiske systemer er et fundamentalt fænomen involveret i vævs dannelse, immunrespons og sårheling1,2,3. Cellulære migration er også en vigtig proces i nogle sygdomme som kræft4. Celler migrerer ofte som en gruppe i stedet for enkeltvis, hvilket kaldes kollektiv celle overførsel4,5. For at cellerne skal bevæge sig kollektivt, er det vigtigt at registrere mikromiljøet6. For eksempel, celler opfatter fysisk-kemiske stimuli og reagere ved at ændre motilitet, celle-substrat interaktioner, og celle-celle interaktioner, hvilket resulterer i retningsbestemt migration langs en kemisk gradient7,8, 9,10. Baseret på denne forbindelse, hurtige fremskridt er blevet gjort i Lab-on-a-chip-teknologier, der kan skabe velkontrollerede kemiske mikromiljøer såsom gradient af en chemoattraktant11,12,13 . Mens disse Lab-on-a-chip-baserede mikrofluidics tidligere er blevet brugt til at studere kemo taxaer af cellulære ensemble eller cellulære sfæroider14,15,16,17, de har været anvendt mest i forbindelse med enkelt celle migration18,19,20,21. De mekanismer, der ligger til grund for en cellulær kollektiv respons på en kemisk gradient, er stadig ikke velforstået14,22,23,24,25,26 . Således udvikling af en platform, der muliggør spatiotemporale kontrol af opløselige faktorer samt in situ observation af cellernes biofysiske vil bidrage til at opklare mekanismerne bag kollektiv celle migration.

Udviklet og beskrevet her er en multi-kanaliseret mikrofluidisk system, der muliggør generering af en koncentration gradient af opløselige faktorer, der modulerer migration af mønstrede celle klynger. I denne undersøgelse, hepatocyt vækstfaktor (HGF) er valgt til at regulere migrationen opførsel af Madin-Darby canine nyre (MDCK) celler. Hgf er kendt for at dæmpe celle celle integritet og øge motilitet af cellerne27,28. I det mikrofluidisk system, Fourier omdanne trækkraft mikroskopi og enkeltlags stress mikroskopi er også indarbejdet, som giver mulighed for analyse af motilitet, kontraktile kraft, og intercellulære spændinger induceret af konstituerende celler som reaktion på en hgf Gradient. Inden for samme ø, celler placeret nær den højere koncentration af HGF migrere hurtigere og vise lavere intercellulære stress niveauer end dem på siden med lavere HGF koncentration. Resultaterne tyder på, at dette nye eksperimentelle system er egnet til at undersøge andre spørgsmål på områder, der involverer kollektiv cellulær migration under kemiske gradienter af forskellige opløselige faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: litografi af SU-8 forme til stencils (tykkelse = 250 μm) og Micro Channel dele (tykkelse = 150 μm), glas ætsning (dybde = 100 μm), og støbt fabrikation blev udliciteret ved at sende designs ved hjælp computer-aided design software til fabrikanter.

1. fabrikation af Polydimethylsiloxan (PDMS) stencil og mikrokanal

  1. Design mikromønsteret af stencil og mikrokanal.
  2. Fabrikere eller outsource Su-8 forme (tykkelse på ~ 250 μm for stencils og ~ 150 μm for mikrokanaler) på silicium wafere (4 "diameter).
  3. Forbered PDMS-blandingen ved at blande base elastomer og Hærdningsmiddel i et forhold på 10:1.
    1. 15 mL af base-elastomer placeres i et 50 mL konisk rør, og der tilsættes 1,5 mL Hærdningsmiddel. Forbered to af disse.
    2. Vortex PDMS blandingen i 5 min. centrifuger PDMS-blandingen ved 196 x g i 1 minut for at fjerne bobler.
  4. At fabrikere PDMS stencil, hæld ~ 1 mL af PDMS blandingen på wafer, samtidig undgå SU-8 mønstrede regioner, så PDMS rører siden af SU-8 søjler, men ikke toppen af SU-8 mønster.
    1. Anbring waferen på en flad overflade i mere end 30 minutter ved stuetemperatur (RT). Du helbreder PDM'ER i en tør ovn ved 80 °C i over 2 timer.
    2. Skræl forsigtigt PDMS fra SU-8 skimmelsvamp og trim den tynde PDMS membran ved hjælp af en 14 mm hule punch. Fjern støvet på overfladen af PDMS stykker ved hjælp af klæbrig tape og autoklave PDMS stencils.
  5. At fabrikere PDMS Micro Channel, hæld ~ 30 mL PDMS blanding over SU-8 skimmelsvamp.
    1. Degas i 30 minutter i et vakuumkammer og hærder PDMS i en tør ovn ved 80 °C i over 2 timer.
    2. Fjern forsigtigt PDMS fra SU-8 skimmelsvamp og skær PDMS til en størrelse på 24 mm x 24 mm. I hver PDMS blok, oprette en stikkontakt og tre indløb ved hjælp af en 1 mm biopsi punch.

2. klargøring af bund glas med polyacrylamid (PA) gel

  1. Fremstille eller outsource rektangulære slide briller (24 mm x 24 mm x 1 mm) med en rektangulær mikro-brønd (6 mm x 12 mm, 100 μm dybde29) ved at skære og ætsning briller.
  2. Silanize overfladen af en nederste glas30.
    1. Der forberedes en binde silan-opløsning ved at blande 200 ml deioniseret vand (DIW), 80 μl eddikesyre og 50 μl 3-(trimethoxysilyl) propylmethacrylat (tmspma) i 1 time.
      Forsigtig: TMSPMA er en brændbar væske. Følg anbefalingerne i materialesikkerhedsdatablade. Brug kun i en kemisk røg hætte.
    2. Fjern støvet fra overfladen af glasset ved klæbrig tape og autoklave glasset.
    3. Dæk den ætsede overflade af det nederste glas med 100 μl af binde silan-opløsningen, og lad glasset stå på rt i 1 time.
    4. Skyl glasset med DIW 3x og lad glasset tørre ved den omgivende lufttemperatur eller ved at blæse luft.
  3. Forbered en gel opløsning til PA gel31.
    1. Tilbered en frisk opløsning på 0,5% (w/v) ammoniumpersulfat (APS) ved at opløse 5 mg APS i 1 mL DIW.
    2. Der fremstilles en PA gel-opløsning bestående af 138 μL 40% acrylamid opløsning, 101 μL 2% bis-acrylamid opløsning, 5 μL fluorescerende partikel opløsning (0,2 μm) og 655 μL DIW.
      Forsigtig: opløsninger af acrylamid og bisacrylamid er giftige. Bær beskyttelseshandsker, beklædning og øjenværn. Beskyt PA gel-opløsningen med fluorescerende partikler fra lys.
      Bemærk: vortex den fluorescerende perle opløsning før pipettering for at opnå et ensartet antal fluorescerende perler pr. parti.
    3. Efter tilsætning af 100 μL af APS-opløsningen og 1 μL tetramethylethylenediamin (TEMED), Overfør 10 μL blandet gel opløsning til den rektangulære mikro-brønd, og Placer på toppen en cirkulær dækseddel (18 mm).
      Bemærk: for at fylde det nederste glas med PA gel uden bobler, skal du placere en tilstrækkelig gel opløsning på rillen af det nederste glas, forsigtigt skubbe dæksedlen over gel opløsningen og fjerne enhver overskydende gel opløsning.
      Forsigtig: gelen helbredes langsomt i ca. 40 min. Der skal så hurtigt som muligt udføres følgende procedure for centrifugering af geler.
    4. Vend samlingen af brugerdefineret glas, gel opløsning og coverslip, og centrifuger derefter i 10 minutter ved 96 x g for at bringe fluorescerende partikler til det øverste lag af PA gel.
    5. Fjern samlingen fra centrifugen, og Placer den på den flade overflade med dæksedlen vendt nedad.
      Bemærk: Begynd med trin 2.3.6, Håndtér prøverne i et biosikkerheds kabinet.
    6. Efter 30 min, flip samlingen og placere den i en 35 mm Petri skål, fyldes med 2 ml DIW, og (ved hjælp af pincet) forsigtigt fjerne dækglas ved at skubbe den til den ene side.
      Bemærk: hærdet PA gel kan opbevares i DIW i 1 måned. Men når kollagen er belagt på PA gel, bør det anvendes i et eksperiment inden for 1 dag.
  4. Coat kollagen på PA gel.
    1. 1 mg/mL sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoat (sulfo-SANPAH) opløses i varm 50 mM HEPES-buffer. Drop 200 μL af opløsningen på gelen overflade og aktiver med UV-lys (365 nm bølgelængde) i 10 min.
      Bemærk: Beskyt sulfo-SANPAH mod lys.
    2. Gelen skylles med 0,1 M [4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethansulfoninsyre; HEPES] buffer 2x og med PBS 1x.
    3. Lag PA gel med kollagen opløsning (100 μg/mL i PBS, Rottehale kollagen type I) ved 4 °C natten over. På den følgende dag vaskes med PBS 3x.

3. micropatterning af celle øerne

  1. Forbered f-127-opløsningen (tabel af materialer) [2% (w/v) i PBS], og sænk stencilen autoklaveres PDMS i F-127-opløsningen. Opbevar den i en 37 °C-inkubator i 1 time.
  2. Forbered celle opløsning (2 x 106 celler/ml) i cellekultur medier bestående af: dulbecco's modificerede eagle's medium (DMEM) med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% antibiotikum-ANTIMYKOTISK (AA).
  3. Vask PDMS-stencilen med PBS 3x, og fjern væsken fra både PDMS-stencilen og PA-gelen. Placer PDMS-stencilen på PA-gelen, og Tilføj PBS til stencilen.
  4. Fjern bobler i hullerne i PDMS stencil ved pipettering forsigtigt. Når du har fjernet bobler, fjernes PBS fra overfladen af PDMS-stencilen.
  5. Efter at have sat 200 μL celle opløsning på PDMS stencil, skal du holde PA gel i en inkubator i 1 h, så cellerne binder sig til PA gel.
  6. Vask forsigtigt celle opløsningen med cellekultur medier, Fjern PDMS-stencilen, og Tilføj flere cellekultur medier. Kontroller dannelsen af celle øerne under et mikroskop.

4. montering af PA gel med PDMS Micro Channel

  1. Fjern støv på PDMS-mikrokanalen ved hjælp af klæbrig tape og derefter autoklave.
  2. Behandl overfladen af PDMS-mikrokanalen med iltplasma (80 W, 50 kHz) i 30 s.
  3. Når du har fjernet enhver væske på det PA-gel fyldte bund glas, Placer PDMS-mikrokanalen oven på det nederste glas og Anbring samlingen på den brugerdefinerede glas holder.
  4. Fyld mikrokanalen med cellekulturmedium.
    Forsigtig: Sørg for at fjerne alle boblerne fanget i kanalerne ved forsigtigt at skylle varme medier med en pipette. Også, mens du fjerner bobler, Sørg for ikke at frigøre mikromønstrede celle øer.

5. integreret mikrofluidisk-system

  1. Tilslut tubingerne.
    1. Forbered stikkene ved at trimme nåle spidsen (18 G) og bøje den 90 °.
    2. Forbered slange linjer til tre indløb og en stikkontakt.
      1. For indløbsslange, Tilslut den trimmede nål og en 30 cm Mini-volumen linje med en tre-vejs stopcock. Forbered tre af disse.
      2. Til udløb slange, Tilslut den trimmede nål og en 75 cm Mini-volumen linje med en tre-vejs stopcock. Forbered en af disse.
      3. Fyld slange linjerne med det medium, der er forvarmet i 1 time.
        Forsigtig: Sørg for at fjerne alle boblerne fanget i slange linjerne ved forsigtigt at skylle varme medier med en sprøjte.
    3. Forbered reservoirer ved at fjerne kaster fra sprøjter og forbinde indløbsslange linjer.
    4. Sæt nåle stikkene på hver slange linje i de tre indløb og en udgang på den mikrofluidisk enhed.
  2. Fyld reservoirer med 3 mL frisk medium eller konditioneret medium hver.
    1. Til gradient testen skal du fylde det venstre indløbs reservoir med 20 ng/mL HGF i cellekultur mediet.
    2. For visualisering af koncentrations gradient tilsættes et 200 μg/mL fluorescerende farvestof (rhodamine B-dextran, 70 kDa) til det venstre indløbs reservoir.
    3. Tilslut udløbs slangen til en sprøjtepumpe.
      Bemærk: sprøjte pumpens driftstilstand er "tilbagetrækning". Strømningshastigheden ændres i henhold til sprøjte pumpens kapacitet og driftshastigheden.
  3. Placer det integrerede mikrofluidisk-system på scenen af et konventionelt epifluorescerende mikroskop.
    Forsigtig: for at generere en blid gradient af HGF i den mikrofluidiske kanal, bør strømningshastigheden være så langsom som 0,1 μL/min. Dette er tilstrækkeligt følsomt, så det kræver stabilisering i 2 timer, og der skal udvises forsigtighed for at undgå fysiske forstyrrelser under forsøget.

6. erhvervelse af billede

  1. Tag billeder hver 10 minutter i op til 24 timer ved hjælp af et automatiseret mikroskop, som er anbragt i en inkubator. På hvert tidspunkt skal du tage et sæt billeder ved hjælp af en 4X objektiv linse i tre forskellige kanaler, herunder fase billede for at visualisere celle migration, grønt fluorescerende billede for at visualisere fluorescerende perler indlejret i PA gel og rødt fluorescerende billede for at visualisere koncentrations gradient af et kemikalie.
  2. Efter at have taget time-lapse-billeder, indgyde 0,25% trypsin-EDTA opløsning i mikrokanaler til at frigøre celler fra PA gel. Efter helt at fjerne celler fra gelen, tage en grøn fluorescerende billede, der skal anvendes som et referencebillede for trækkraft mikroskopi.

7. data analyse

Bemærk: en brugerdefineret kode til dataanalyse blev udviklet ved hjælp af MATLAB, og detaljerne er blevet beskrevet andetsteds32,33,34,35,36.

  1. For fase-image analyse, beregne forskydninger i to på hinanden følgende fase billeder ved hjælp af partikel billede velocimetry36.
  2. For Fourier omdanne Traction mikroskopi, sammenligne hvert grønt fluorescerende billede med Referencebilledet og beregne forskydninger i hvert billede ved hjælp af partikel billede velocimetry36. Fra fordrivelser, genvinde trækkraft lavet af celler på PA gel ved hjælp af Fourier omdanne Traction mikroskopi33,34,37.
  3. Fra trækkraft data, Beregn stress i enkeltlags af cellen øen ved hjælp af enkeltlags stress mikroskopi baseret på finite element metoder32,34,38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at undersøge kollektiv migration under en kemisk gradient blev et mikrofluidisk system integreret med trækkraft mikroskopi (figur 1). For at opbygge det integrerede system blev polyacrylamid (PA) gel støbt på Special skåret glas, og MDCK-celler blev seedet i mikromønstrede øer lavet af en PDMS stencil. Til dette eksperiment blev der oprettet tolv øer af MDCK-celler (fire rækker med tre kolonner, diameter på ~ 700 μm). Efter celler knyttet til PA gels, PDMS stencil blev fjernet for at indlede kollektiv migration. Den præ-fremstillet mikrofluidisk kanal blev placeret på toppen af PA gels til at bygge mikrofluidisk kanal over cellulære øer (figur 1A).

For derefter at etablere en koncentrations gradient inden for den mikrofluidiske kanal, var det venstre indløb forbundet med forsynings beholderen indeholdende en fluorescerende farveopløsning. Derudover var de midterste og de rigtige indløb forbundet med forsynings reservoirer, der kun indeholdt medier. Derefter var stikkontakten forbundet med sprøjtepumpen for at fjerne væske fra den mikrofluidiske kanal. Sandwichen af Special skåret glas og den mikrofluidiske kanal blev indsat på det specialbyggede mikroskop stadie. Prøverne sammen med det automatiserede fluorescerende mikroskop blev holdt i en inkubator for levende celle billeder. I løbet af forsøgene blev cellerne opbevaret ved 5% CO2 og 37 °c. En gradient af intensiteten af det fluorescerende farvestof blev hurtigt fastlagt med en strømningshastighed på 0,125-2 μL/min (figur 2a). Hældningen af gradient afhang af strømningshastigheden. For eksempel, ved en strømningshastighed på 0,125 μL/min, gradient blev udviklet over 1,5 mm, som er den sammenlignelige størrelse af celle øerne (figur 2B).

Dernæst blev den integrerede enhed med celler testet. Øerne MDCK-cellerne var mikromønstrede og samlet med den mikrofluidiske kanal som beskrevet ovenfor. For det første, uden at anvende nogen flow i mikrokanalen, blev det sikret, at den cellulære ø spredes godt inden for enheden. Over en 12 h periode, øen udvidet, og den gennemsnitlige migration hastighed var ~ 0,1-0,2 μm/min. Mens der var variationer blandt øer om, hvor meget øen ekspanderede, alle celler så sundt i no-flow tilstand. Næste, flow blev anvendt over disse øer, og det blev konstateret, at med en strømningshastighed på 0,1 μL/min, den cellulære ø spredt godt, og celler opretholdt en gennemsnitlig migration hastighed på ~ 0,1 – 0,2 μm/min for 12 h. Ved at øge strømningshastigheden til 0,5 μL/min, spredte cellerne sig imidlertid ikke godt, og den gennemsnitlige migrations hastighed faldt til under 0,1 μm/min. Desuden syntes morfologier af cellerne forskellige og syntes at være at løsne sig fra PA gels (figur 3). Baseret på disse data blev 0,1 μL/min valgt som strømningshastighed for følgende eksperimenter.

For at teste virkningerne af en kemisk gradient på kollektiv celle migration, hgf blev valgt32,34.  Den venstre indløb var forbundet til 1) forsynings reservoiret holder cellekultur medier med HGF opløsning (20 ng/mL) og 2) de andre 2 indsugningen med reservoirer bedrift cellekultur medier. Med en strømningshastighed på 0,1 μL/min blev strømmen over migrerende celle øerne (fire rækker med tre kolonner) opretholdt i 10 timer (figur 4). Som vist i et separat eksperiment var HGF-koncentrationen på venstre kolonne tæt på koncentrationen af forløsnings opløsningen (20 ng/mL), og i højre kolonne var dette tæt på nul. HGF koncentrationen på den midterste kolonne gradvist faldt fra venstre halvdel til højre halvdel. Når man sammenligner størrelsen af celle øerne efter 10 h, øerne på højre kolonne ikke ekspandere meget, men dem på venstre kolonne blev betydeligt større og udvidet i alle retninger (figur 4A). Sådanne ændringer i øens størrelse blev understøttet af cellernes forløbskurver inden for hver ø (figur 4B). Interessant, øer i den midterste kolonne ikke ekspandere mod højre (hvor HGF koncentrationen var lav), men udvidet fortrinsvis mod venstre (hvor HGF koncentrationen var høj). Mens der kun var lidt ændring i den gennemsnitlige migrations hastighed i højre kolonne, i venstre og midterste kolonner, steg den gennemsnitlige migrations hastighed gradvist for de første 3 timer og faldt derefter gradvist (figur 4C).

For at måle kontraktile kraft og intercellulære stress, greb mikroskopi37,39,40 og enkeltlags stress mikroskopi blev kombineret med den mikrofluidisk kanal33,35, 38. I løbet af 10 h under anvendelse af den kemiske gradient, billeder af fluorescerende partikler blev taget i PA gels, og den kraft (pr. enhed område) påføres af celler på substratet blev analyseret ved hjælp af Fourier omdanne Traction mikroskopi35, 37. Trækkraft blev plottet i Polar koordinater. Blå repræsenterer kraften mod centrum af øen, og rød repræsenterer kraften væk fra centrum.

På time Zero, alle øer viste lignende trækkraft fordelinger, med stærk indadgående trækkraft på kanten og udsving i øen. Dette udsving svarer til det, der tidligere er blevet vist34,35,41. Efter 10 h af anvendelsen af HGF gradient, mens graden af øen ekspansion var anderledes i hver kolonne, trækkraft fordelinger var stort set svarer til time Zero (figur 5A). Den gennemsnitlige trækkraft ændrede sig ikke i 10 timer (figur 5C). Ved beregning af enkeltlags stress, dog hver kolonne viste forskellige tendenser. I højre kolonne (hvor HGF koncentrationen var lav), den gennemsnitlige spænding i øerne blev opretholdt omkring 200 PA i løbet af en 10 h periode. I venstre kolonne (hvor hgf koncentrationen var høj), den gennemsnitlige spænding inden for øerne gradvist faldt fra 230 PA til 100 PA over 10 h, som tidligere vist32,34. I den midterste kolonne (hvor HGF koncentrationen var høj på venstre halvdel og lav på højre halvdel af øen), den gennemsnitlige spænding blev opretholdt omkring 150 PA.

Figure 1
Figur 1: skematisk af den integrerede enhed forberedelse. (A) for at fremstille den integrerede anordning, et bund glas med PA gel, hvorpå celle øerne blev mønstret ved hjælp af en PDMS stencil var dækket med en PDMS mikrokanal. B) de integrerede anordninger blev fastgjort med en brugerdefineret holder for at forhindre væskelækage og komponent dissociation. (C) efter at anordningen var fyldt med væske uden bobler, var reservoirer forbundet med indløb, og en sprøjtepumpe var sluttet til stikkontakten. Alle eksperimentelle set-ups blev placeret på et live Cell Imaging System. D) skematisk viser de mikrofluidiske kanalers udformning og sammensætning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: oprettelse af chemical gradient. A) fluorescensbilleder af rhodamin B-konjugeret dextran (70 kDa) visualiserer koncentrations gradienten under væskestrømmen på 0,125 μl/min, 0,5 μl/min og 2 μl/min. punkterede cirkler angiver placeringen af de mønstrede celle øer. B) Fluorescens billedets intensitets profil viser, at koncentrations gradienten i anordningen var justerbar af strømningshastigheden. Fejllinjer angiver standardafvigelsen. De farvede bjælker angiver kolonne positionerne for den mønstrede celle ø. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: migrering af mdck-celle øerne under flow. A) de fase billeder på 12 timer af mdck-celle øen ved hver strømningshastighed (0 μl/min, 0,1 μl/min og 0,5 μl/min) viser, at celle øerne ekspanderede godt ved en lav strømningshastighed, men ikke ekspanderede ved en høj strømningshastighed. Punkterede linjer repræsenterer grænserne ved 0 h.B) middelværdien og histogrammet for cellernes hastighed inden for hver ø hver 10 min for 12 h. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: migration af mdck-celle øerne under flow og kemisk gradient. (A) det relative intensitets interval for rhodamin B-konjugeret dextran opretholdt en konstant hgf koncentrations gradient i hver kolonne efter stabilisering i 2 h. (B) fase billeder på 10 h (punkteret linje = Cell Island grænse ved 0 h) af mdck celle ø under HGF gradient (fra venstre mod højre: 20 – 0 ng/mL) viser, at øen udvidet mere, hvor HGF koncentrationen var højere. (C) forløbskurver for migrations stier (farvekodning angiver stilængden) af celler i mdck-celle øerne. Stiplede linjer og stiplede linjer repræsenterer hver celle øens grænser ved henholdsvis 0 og 10 timer. D) middelværdien og histogrammet for cellulær hastighed inden for hver ø hver 10 min for 10 h. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: mekaniske interaktioner mellem mdck-celle øerne. A) kortene overtræk kraft (celle substrat interaktion) på celle øerne ved 0 h og 10 timer under hgf-gradient. Kortene blev plottet i radial koordination, med udadgående trækkraft ved hjælp af varm farve og indadvendt trækkraft ved hjælp af kold farve. (B) kortene over enkeltlags spænding (celle-celle interaktioner) i celle øerne ved 0 h og 10 h under hgf gradient. (C) plottet af gennemsnitlige trækkraft (grå firkant) og spænding (blå cirkel) inden for celle øerne under hgf gradient over tid hver 10 min for 10 h. Farve båndene repræsenterer Mid-kvartil (~ 25% – 75%). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur S1: korrekt perle fordeling kræves for tilstrækkelig datakvalitet under trækkraft analyse. Eksempler på god (venstre) og dårlig (højre) kvalitet fluorescerende perle billeder med forstørrede billeder i de hvide bokse vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kollektiv migration af konstituerende celler er en vigtig proces under udvikling og regenerering, og den migrerende retning styres ofte af den kemiske gradient af vækstfaktorerne4,23. Under kollektiv migration, celler holde interagere med tilstødende celler og underliggende substrater. Sådanne mekaniske interaktioner giver anledning til emergent fænomener som durotaxis42, plithotaxis33og kenotaxis43. Denne forskning blev imidlertid udført ved hjælp af en enkelt koncentration af vækstfaktorer, såsom dem i føtal kvægserum. For at udfylde hullet, denne protokol beskriver en ny eksperimentel platform, der kan måle mekaniske interaktioner under kollektiv cellulære migration under en kemisk gradient.

Den nye platform kombinerer tre eksperimentelle systemer, der er blevet brugt bredt: micropatterning, trækkraft mikroskopi, og microfluidics. For det første blev der udført mikromønstning af celle øerne for kollektiv migration. For det andet, både trækkraft mikroskopi og enkeltlags stress mikroskopi blev brugt til mekaniske målinger af migrerende celler. Endelig blev en mikrofluidics platform brugt til at etablere kemisk gradient over migrerende celler. Med dette eksperimentelle system, blev det påvist, at cellerne i en enkelt ø migrere forskelligt som reaktion på forskellige kemiske gradienter.

Som beskrevet i figur 2danner den kemiske gradient kun en afstand på 1 mm i midten af mikrokanalen. Øer i venstre kolonne bliver udsat for den maksimale koncentration, og dem i højre kolonne er udsat for den mindste koncentration. I modsætning hertil er øer i midtersøjlen udsat for den kemiske gradient. På denne måde måles cellernes respons ved maksimum, minimum og en gradient af koncentrationer af en opløselig faktor under det samme eksperiment. Ved hjælp af denne vifte af celle øer, en gradvis stigning i cellulære migration hastighed blev observeret som HGF koncentration øget.

For at opnå data af høj kvalitet er der vigtige trin i proceduren, der kræver særlig opmærksomhed. PA geler i et brugerdefineret glas substrat skal være perfekt med hensyn til fordelingen af fluorescerende partikler og overfladebelægning af kollagen. Dette skyldes, at uden høj kvalitet PA gels, en høj kvalitet datasæt for trækkraft analyse og enkeltlags stress analyse ikke kan erhverves. Eksempler på højkvalitets perle billeder er vist i det supplerende figur 1. De mikrofluidiske kanaler er meget små, og bobler er let fanget i dem. Disse bobler ikke kun forstyrre strømmen, men kan også feje celler væk, hvis de begynder at bevæge sig langs strømmen. Derfor er det afgørende at fylde de mikrofluidiske kanaler uden bobler. For at opnå en stabil gradient inden for mikrokanalen, er balancen i trykket inden for de tre indløb meget vigtig. For at undgå ubalancer mellem dem bør der anvendes store reservoirer, således at eventuelle ubalancer ved begyndelsen af et eksperiment let kan justeres. Denne nye platform vil hjælpe yderligere udforskning af mekanik af kollektiv celle migration under kemiske gradienter, som er nøglen til forståelse regenerering, kræft metastase, og udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Koreas National Research Foundation (NRF) tilskud finansieret af den koreanske regering (MSIP) (nr. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant og BK 21 Plus-programmet. Det blev også støttet af National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
1 M HEPES buffer solution Gibco 15630-056
1 mm Biopsy punch Integra Miltex 33-31AA-P/25
100 mm petri dishes SPL 10100 100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punch ILJIN 124-0571
18 mm Ø Coverslip Marienfeld-Superior 111580 Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solution Bio-Rad 1610142 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) Sigma-Aldrich 440159-500ML
3-way stopcock Hyupsung HS-T-61N CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-30 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dish Corning 430165
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-75 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acid J.T. Baker JT9508-03
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad 1610700
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Bottom glass chip MicroFIT 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tail Corning 354236
Custom glass holder Han-Gug Mechatronics custom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Welgene LM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biowest L0615-500 w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheres Invitrogen F8764 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Sigma-Aldrich H1404-5UG recombinant, human
JuLI stage live cell imaging system NanoEnTek In Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell type II
Oxygen plasma system Femto Science CUTE-MPR
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich R9379-100MG 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 G KOVAX Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape 3M/Scotch 810D 33 m x 19 mm
SU-8 master molds MicroFIT 4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) Thermo Scientific 22589 Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS
Syringe pump Chemyx Inc. model fusion 720 withdraw fluid
Syringes KOVAX 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lamp UVP LLC 95-0248-02 365 nm wavelength

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  4. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  5. Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
  6. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  7. Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
  8. Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
  9. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  10. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
  11. Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
  12. Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
  13. Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617 (2018).
  14. Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515 (2015).
  15. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  16. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
  17. Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
  18. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
  19. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
  20. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  21. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  22. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  23. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  24. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  25. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  26. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  27. Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
  28. Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 4 Pt 1 041918 (2010).
  30. Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
  31. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  32. Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
  33. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  34. Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
  35. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426 (2009).
  36. Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
  37. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  38. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172 (2013).
  39. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  40. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
  41. Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
  42. Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  43. Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).

Tags

Bioengineering microfluidics trækkraft mikroskopi kollektiv celle migration chemotaxis kemisk gradient mikromønstring
Trækkraft mikroskopi integreret med Microfluidics til kemo-aktisk kollektiv migration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jang, H., Kim, J., Shin, J. H.,… More

Jang, H., Kim, J., Shin, J. H., Fredberg, J. J., Park, C. Y., Park, Y. Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration. J. Vis. Exp. (152), e60415, doi:10.3791/60415 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter