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Bioengineering

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/60415

Summary

Kollektive Zellmigration in Entwicklung, Wundheilung und Krebsmetastasierung wird oft von den Gradienten von Wachstumsfaktoren oder Signalmolekülen geleitet. Hier wird ein experimentelles System beschrieben, das Traktionsmikroskopie mit einem mikrofluidischen System kombiniert und demonstriert, wie die Mechanik der kollektiven Migration unter biochemischen Gradienten quantifiziert werden kann.

Abstract

Zellen verändern Migrationsmuster als Reaktion auf chemische Reize, einschließlich der Gradienten der Reize. Die zelluläre Migration in Richtung eines chemischen Gradienten, bekannt als Chemotaxis, spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung, der Immunantwort, der Wundheilung und der Krebsmetastasierung. Während Chemotaxis die Migration einzelner Zellen sowie der Sammlungen von Zellen in vivo modulieren, konzentriert sich die In-vitro-Forschung auf einzellige Chemotaxis, teilweise aufgrund des Fehlens der richtigen experimentellen Werkzeuge. Um diese Lücke zu schließen, wird hier ein einzigartiges experimentelles System beschrieben, das Mikrofluidik und Mikromuster kombiniert, um die Auswirkungen chemischer Gradienten auf die kollektive Zellmigration zu demonstrieren. Darüber hinaus werden Traktionsmikroskopie und Monolayer-Stressmikroskopie in das System integriert, um Veränderungen der Zellkraft auf dem Substrat sowie zwischen benachbarten Zellen zu charakterisieren. Als Proof-of-Concept wird die Migration von mikrogemusterten kreisförmigen Inseln von Madin-Darby-Canine-Kidney-Zellen (MDCK) unter einem Gradienten des Hepatozytenwachstumsfaktors (HGF), einem bekannten Streufaktor, getestet. Es wird festgestellt, dass Zellen, die sich in der Nähe der höheren Konzentration von HGF befinden, schneller migrieren als zellennahe Zellen auf der gegenüberliegenden Seite innerhalb einer Zellinsel. Innerhalb der gleichen Insel ist die zelluläre Traktion auf beiden Seiten ähnlich, aber die interzelluläre Belastung ist auf der Seite einer höheren HGF-Konzentration viel geringer. Dieses neuartige experimentelle System kann neue Möglichkeiten bieten, die Mechanik der chemotaktischen Migration durch zelluläre Kollektive zu untersuchen.

Introduction

Die zelluläre Migration in biologischen Systemen ist ein grundlegendes Phänomen, das an der Gewebebildung, der Immunantwort und der Wundheilung beteiligt ist1,2,3. Zelluläre Migration ist auch ein wichtiger Prozess bei einigen Krankheiten wie Krebs4. Zellen werden oft als Gruppe und nicht als Einzeln migriert, was als kollektive Zellmigration4,5bezeichnet wird. Damit sich Zellen kollektiv bewegen können, ist die Erfassung der Mikroumgebung unerlässlich6. Zum Beispiel nehmen Zellen physikalisch-chemische Reize wahr und reagieren durch Veränderung der Beweglichkeit, Zell-Substrat-Wechselwirkungen und Zell-Zell-Wechselwirkungen, was zu einer Richtungsmigration entlang eines chemischen Gradienten7,8, 9,10. Basierend auf dieser Verbindung wurden schnelle Fortschritte in Lab-on-a-Chip-Technologien gemacht, die gut kontrollierte chemische Mikroumgebungen wie den Gradienten eines Chemoattractanten11,12,13 erzeugen können. . Während diese Lab-on-a-Chip-basierte Mikrofluidik bisher verwendet wurden, um Chemotaxis des Zellensembles oder zelluläre Sphäroide14,15,16,17zu studieren, wurden hauptsächlich im Zusammenhang mit der Einzelzellmigration18,19,20,21verwendet. Mechanismen, die einer zellulären kollektiven Reaktion auf einen chemischen Gradienten zugrunde liegen, sind immer noch nicht gut verstanden14,22,23,24,25,26 . So wird die Entwicklung einer Plattform, die die raumzeitliche Kontrolle von löslichen Faktoren sowie die in-situ-Beobachtung der biophysikalischen Zellen ermöglicht, dazu beitragen, die Mechanismen hinter der kollektiven Zellmigration zu entwirren.

Entwickelt und beschrieben ist hier ein mehrkanaliges mikrofluidisches System, das die Erzeugung eines Konzentrationsgradienten von löslichen Faktoren ermöglicht, der die Migration von gemusterten Zellclustern moduliert. In dieser Studie, Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) wird gewählt, um das Migrationsverhalten von Madin-Darby Canine Nieren (MDCK) Zellen zu regulieren. HGF ist dafür bekannt, die Zell-Zell-Integrität zu dämpfen und die Beweglichkeit der Zellen27,28zu verbessern. Im mikrofluidischen System sind fourier transform traktionsmikroskopie und Monolayer-Stressmikroskopie integriert, die eine Analyse der Beweglichkeit, Kontraktilenkraft und interzellulären Spannung ermöglicht, die von konstituierenden Zellen als Reaktion auf ein HGF induziert werden. gefälle. Innerhalb derselben Insel wandern Zellen, die sich in der Nähe der höheren Konzentration von HGF befinden, schneller und weisen niedrigere interzelluläre Belastungen auf als zellenübergreifende Belastungen als zellennahe Mit geringerer HGF-Konzentration. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses neue experimentelle System geeignet ist, andere Fragen in Bereichen zu untersuchen, die eine kollektive zelluläre Migration unter chemischen Gradienten verschiedener löslicher Faktoren beinhalten.

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Protocol

ANMERKUNG: Die Lithographie von SU-8-Formen für Schablonen (Dicke = 250 m) und Mikrokanalteile (Dicke = 150 m), Glasätzung (Tiefe = 100 m) und Gussfertigung wurden durch den Versand von Konstruktionen mit computergestützter Konstruktionssoftware an Hersteller ausgelagert.

1. Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) Schablone und Mikrokanal

  1. Entwerfen Sie das Mikromuster von Schablone und Mikrokanal.
  2. Herstellung oder Auslagerung von SU-8-Formen (Dicke von 250 m für Schablonen und 150 m für Mikrokanäle) auf Siliziumwafern (4" Durchmesser).
  3. Bereiten Sie die PDMS-Mischung vor, indem Sie das Basiselastomer und das Härtungsmittel im Verhältnis 10:1 mischen.
    1. 15 ml des Basiselastomers in ein 50 ml kegelförmiges Rohr geben und 1,5 ml Härtungsmittel hinzufügen. Bereiten Sie zwei davon vor.
    2. Wirbel die PDMS-Mischung für 5 min. Zentrifugieren Sie die PDMS-Mischung bei 196 x g für 1 min, um Blasen zu entfernen.
  4. Um die PDMS-Schablone herzustellen, gießen Sie 1 ml der PDMS-Mischung auf den Wafer, während SU-8-gemusterte Bereiche vermieden werden, so dass das PDMS die Seite der SU-8-Säulen berührt, aber nicht die Oberseite des SU-8-Musters.
    1. Legen Sie den Wafer auf eine flache Oberfläche über 30 min bei Raumtemperatur (RT). Das PDMS im Trockenofen bei 80 °C über 2 h aushärten.
    2. Ziehen Sie das PDMS vorsichtig von der SU-8-Form ab und trimmen Sie die dünne PDMS-Membran mit einem 14 mm Hohlstanz. Entfernen Sie den Staub auf der Oberfläche der PDMS-Stücke mit Klebeband und autoklavieren Sie die PDMS-Schablonen.
  5. Um PDMS-Mikrokanal herzustellen, gießen Sie 30 ml PDMS-Mischung über die SU-8-Form.
    1. 30 min in einer Vakuumkammer abgasen und das PDMS im Trockenofen bei 80 °C über 2 h aushärten.
    2. Ziehen Sie das PDMS vorsichtig von der SU-8-Form ab und schneiden Sie das PDMS auf eine Größe von 24 mm x 24 mm. Erstellen Sie in jedem PDMS-Block einen Auslass und drei Einlässe mit einem 1 mm Biopsie-Punch.

2. Herstellung von Bodenglas mit Polyacrylamid (PA) Gel

  1. Herstellung oder Auslagerung von rechteckigen Gleitgläsern (24 mm x 24 mm x 1 mm) mit rechteckigem Mikrobrunnen (6 mm x 12 mm, 100 m Tiefe29) durch Schneiden und Ätzen von Gläsern.
  2. Silanize die Oberfläche eines unterenGlases 30.
    1. Bereiten Sie eine Bindungsilanlösung vor, indem Sie 200 ml deionisiertes Wasser (DIW), 80 l Essigsäure und 50 l 3-(Trimethoxysilyl)-Propylmethacrylat (TMSPMA) für 1 h mischen.
      VORSICHT: TMSPMA ist eine brennbare Flüssigkeit. Befolgen Sie die Empfehlungen in den Sicherheitsdatenblättern. Nur in einer chemischen Dunstabzugshaube verwenden.
    2. Entfernen Sie den Staub von der Oberfläche des Glases durch Klebeband und autoklavieren Sie das Glas.
    3. Bedecken Sie die geätzte Oberfläche des Bodenglases mit 100 l der Bindesilanlösung und lassen Sie das Glas bei RT für 1 h.
    4. Spülen Sie das Glas mit DIW 3x und lassen Sie das Glas bei Umgebungslufttemperatur oder durch Blasen von Luft trocknen.
  3. Bereiten Sie eine Gellösung für das PA-Gel31vor.
    1. Bereiten Sie eine frische Lösung von 0,5 % (w/v) Ammoniumpersulfat (APS) vor, indem Sie 5 mg APS in 1 ml DIW auflösen.
    2. Bereiten Sie die PA-Gellösung vor, die aus einer 138-L-Acrylamidlösung, einer 101-L-Lösung mit 2 % Bis-Acrylamid-Lösung, einer fluoreszierenden Partikellösung (0,2 m) und 655 l DIW besteht.
      VORSICHT: Acrylamid- und Bisacrylamidlösungen sind giftig. Tragen Sie Schutzhandschuhe, Kleidung und Augenschutz. Schützen Sie die PA-Gellösung, die fluoreszierende Partikel enthält, vor Licht.
      HINWEIS: Wirbel die fluoreszierende Perlenlösung vor dem Pipetieren, um eine einheitliche Anzahl von fluoreszierenden Perlen pro Charge zu erhalten.
    3. Nach Zugabe von 100 l der APS-Lösung und 1 l Tetramethylethylendiamin (TEMED) 10 l Mischgellösung auf den rechteckigen Mikrobrunnen übertragen und einen kreisförmigen Abdeckschlupf (18 mm) darüber legen.
      HINWEIS: Um das untere Glas ohne Blasen mit PA-Gel zu füllen, legen Sie eine ausreichende Gellösung auf die Nut des Unteren Glases, schieben Sie den Deckelrutsch vorsichtig über die Gellösung und entfernen Sie überschüssige Gellösung.
      VORSICHT: Das Gel wird langsam für ca. 40 min ausgehärtet. Das folgende Verfahren für Zentrifugierende Gele sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden.
    4. Drehen Sie die Montage von kundenspezifischem Glas, Gel-Lösung und Deckelschlappe, dann Zentrifuge für 10 min bei 96 x g, um fluoreszierende Partikel auf die oberste Schicht von PA-Gel zu bringen.
    5. Entfernen Sie die Baugruppe aus der Zentrifuge und legen Sie sie auf die flache Oberfläche mit dem Deckelrutsch nach unten.
      HINWEIS: Ab Schritt 2.3.6 werden Proben in einem Biosicherheitsschrank behandelt.
    6. Nach 30 min die Baugruppe umdrehen und in eine 35 mm Petrischale legen, mit 2 ml DIW füllen und (mit Zangen) den Deckelrutsch vorsichtig entfernen, indem man ihn zur Seite schiebt.
      HINWEIS: Gehärtetes PA-Gel kann 1 Monat lang im DIW gelagert werden. Sobald jedoch Kollagen auf dem PA-Gel beschichtet ist, sollte es in einem Experiment innerhalb von 1 Tag verwendet werden.
  4. Mantel Kollagen auf dem PA-Gel.
    1. 1 mg/ml Sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) Hexanoat (Sulfo-SANPAH) in warmen 50 mM HEPES Puffer auflösen. Lassen Sie 200 l der Lösung auf die Geloberfläche fallen und durch UV-Licht (365 nm Wellenlänge) für 10 min aktivieren.
      HINWEIS: Schützen Sie den Sulfo-SANPAH vor Licht.
    2. Spülen Sie das Gel mit 0,1 M [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure; HEPES] Puffer 2x und mit PBS 1x.
    3. Beschichten Sie das PA-Gel mit Kollagenlösung (100 g/ml in PBS, Rattenschwanzkollagen Typ I) bei 4 °C über Nacht. Am nächsten Tag mit PBS 3x waschen.

3. Mikromusterung von Zellinseln

  1. Bereiten Sie die F-127 -Tabelle der Materialien) Lösung [2% (w/v) in PBS] vor und tauchen Sie die autoklavierte PDMS-Schablone in die F-127-Lösung ein. Halten Sie es 1 h in einem 37 °C Inkubator auf.
  2. Bereiten Sie Zelllösung (2 x 106 Zelle/ml) in Zellkulturmedien vor, bestehend aus: Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Antimykotikum (AA).
  3. Waschen Sie die PDMS-Schablone mit PBS 3x und entfernen Sie Flüssigkeit aus der PDMS-Schablone und dem PA-Gel. Legen Sie die PDMS-Schablone auf das PA-Gel und fügen Sie pbS zur Schablone hinzu.
  4. Entfernen Sie Blasen in den Löchern der PDMS-Schablone, indem Sie sanft pipetieren. Entfernen Sie nach dem Entfernen von Blasen PBS von der Oberfläche der PDMS-Schablone.
  5. Nachdem Sie 200 l Zelllösung auf die PDMS-Schablone gelegt haben, bewahren Sie das PA-Gel 1 h lang in einem Inkubator auf, damit sich die Zellen an das PA-Gel anheften.
  6. Waschen Sie die Zelllösung mit Zellkulturmedien vorsichtig ab, entfernen Sie die PDMS-Schablone, und fügen Sie weitere Zellkulturmedien hinzu. Überprüfen Sie die Bildung von Zellinseln unter dem Mikroskop.

4. Montage von PA-Gel mit PDMS-Mikrokanal

  1. Entfernen Sie Staub auf dem PDMS-Mikrokanal mit Klebeband, dann Autoklav.
  2. Behandeln Sie die Oberfläche des PDMS-Mikrokanals mit Sauerstoffplasma (80 W, 50 kHz) für 30 s.
  3. Nach dem Entfernen von Flüssigkeit auf dem PA-Gel-gefüllten Bodenglas, legen Sie den PDMS Mikrokanal auf das Unterglas und legen Sie die Baugruppe auf den benutzerdefinierten Glashalter.
  4. Füllen Sie den Mikrokanal mit zellkulturmedium.
    VORSICHT: Achten Sie darauf, alle Blasen in den Kanälen gefangen zu entfernen, indem Sie sanft warme Medien mit einer Pipette spülen. Achten Sie beim Entfernen von Blasen auch darauf, dass sie keine mikrogemusterten Zellinseln lösen.

5. Integriertes mikrofluidisches System

  1. Schließen Sie die Schläuche an.
    1. Bereiten Sie Die Verbinder vor, indem Sie die Nadelspitze (18 G) beschneiden und um 90° biegen.
    2. Bereiten Sie Schlauchleitungen für drei Einlässe und einen Auslass vor.
      1. Für Einlassschläuche die getrimmte Nadel und eine 30 cm große Mini-Volumenlinie mit einem Drei-Wege-Hahn verbinden. Bereiten Sie drei davon vor.
      2. Für Auslassschläuche die getrimmte Nadel und eine 75 cm große Mini-Volumenlinie mit einem Drei-Wege-Hahn verbinden. Bereiten Sie eine davon vor.
      3. Füllen Sie die Schlauchlinien mit dem Medium, das für 1 h vorgeheizt wurde.
        VORSICHT: Achten Sie darauf, alle Blasen, die in den Schlauchlinien gefangen sind, zu entfernen, indem Sie warme Medien vorsichtig mit einer Spritze spülen.
    3. Bereiten Sie Reservoirs vor, indem Sie Kolben aus Spritzen entfernen und Einlassschläuche anschließen.
    4. Stecken Sie die Nadelanschlüsse jeder Schlauchleitung in die drei Einlässe und einen Auslass des mikrofluidischen Geräts.
  2. Füllen Sie die Reservoirs mit jeweils 3 ml frischem Medium oder konditioniertem Medium.
    1. Füllen Sie für den Gradiententest das linke Einlassreservoir mit 20 ng/mL HGF im Zellkulturmedium.
    2. Zur Visualisierung des Konzentrationsgradienten fügen Sie dem linken Einlassreservoir einen Fluoreszenzfarbstoff (Rhodamine B-Dextran, 70 kDa) hinzu.
    3. Schließen Sie die Auslassschlauchleitung an eine Spritzenpumpe an.
      HINWEIS: Die Betriebsart der Spritzenpumpe ist "Entzug". Die Durchflussmenge wird entsprechend der Kapazität der Spritze und der Betriebsgeschwindigkeit der Spritzenpumpe geändert.
  3. Stellen Sie das integrierte mikrofluidische System auf die Bühne eines herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskops.
    VORSICHT: Um einen sanften HGF-Gradienten im mikrofluidischen Kanal zu erzeugen, sollte die Durchflussrate so langsam wie 0,1 l/min sein. Dies ist ausreichend empfindlich, so dass es eine Stabilisierung für 2 h erfordert, und es muss darauf geachtet werden, körperliche Störungen während des Experiments zu vermeiden.

6. Bildaufnahme

  1. Nehmen Sie Bilder alle 10 min für bis zu 24 h mit einem automatisierten Mikroskop in einem Inkubator untergebracht. Nehmen Sie zu jedem Zeitpunkt eine Reihe von Bildern mit einer 4x Objektivlinse in drei verschiedenen Kanälen, einschließlich Phasenbild zur Visualisierung der Zellmigration, grünes Fluoreszenzbild zur Visualisierung von in PA-Gel eingebetteten Fluoreszenzperlen und rotem Fluoreszenzbild, um das Konzentrationsgradienten einer Chemikalie.
  2. Nach der Aufnahme von Zeitrafferbildern, infundieren Sie 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung in Mikrokanäle, um Zellen vom PA-Gel zu lösen. Nachdem Sie Zellen vollständig aus dem Gel entfernt haben, nehmen Sie ein grünes fluoreszierendes Bild, das als Referenzbild für die Traktionsmikroskopie verwendet werden soll.

7. Datenanalyse

HINWEIS: Ein benutzerdefinierter Code für die Datenanalyse wurde mit MATLAB entwickelt, und Details wurden an anderer Stelle beschrieben32,33,34,35,36.

  1. Für die Phasenbildanalyse berechnen Sie Verschiebungen in zwei aufeinander folgenden Phasenbildern mit Derpartikelbild-Velocimetrie36.
  2. Vergleichen Sie für Fourier die Traktionsmikroskopie mit dem Referenzbild und berechnen Sie die Verschiebungen in jedem Bild mithilfe der Partikelbild-Velocimetrie36. Von den Verschiebungen, erholen Traktion von Zellen auf PA-Gel mit Fourier transform Traktion skopie33,34,37.
  3. Aus den Traktionsdaten berechnen Sie die Spannung innerhalb der Monoschicht der Zellinsel mittels monoschichter Spannungsmikroskopie auf Basis der Finite-Elemente-Methoden32,34,38.

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Representative Results

Um die kollektive Migration unter einem chemischen Gradienten zu erforschen, wurde ein mikrofluidisches System mit Traktionsmikroskopie integriert (Abbildung 1). Um das integrierte System zu bauen, wurde Polyacrylamid (PA) Gel auf maßgefertigtes Glas gegossen, und MDCK-Zellen wurden innerhalb von mikrogemusterten Inseln aus einer PDMS-Schablone gesät. Für dieses Experiment wurden zwölf Inseln von MDCK-Zellen (vier Reihen durch drei Spalten, Durchmesser von 700 m) geschaffen. Nach Zellen, die an PA-Gels angeschlossen wurden, wurde die PDMS-Schablone entfernt, um eine kollektive Migration zu initiieren. Der vorgefertigte mikrofluidische Kanal wurde auf die PA-Gelgelegt, um einen mikrofluidischen Kanal über zellulären Inseln zu bauen (Abbildung 1A).

Um dann einen Konzentrationsgradienten innerhalb des mikrofluidischen Kanals zu ermitteln, wurde der linke Einlass mit dem Versorgungsreservoir verbunden, das eine fluoreszierende Farbstofflösung enthält. Zusätzlich wurden die mittleren und rechten Einlässe an die Versorgungsbehälter angeschlossen, die nur Medien enthielten. Anschließend wurde der Auslass an die Spritzenpumpe angeschlossen, um Flüssigkeit aus dem mikrofluidischen Kanal zu entfernen. Das Sandwich aus kundenspezifisch geschnittenem Glas und der mikrofluidische Kanal wurde auf die kundenspezifische Mikroskopbühne eingeführt. Die Proben zusammen mit dem automatisierten Fluoreszenzmikroskop wurden in einem Inkubator für die Live-Zell-Bildgebung aufbewahrt. Während der Experimente wurden die Zellen bei 5%CO2 und 37 °C gehalten. Ein Gradient der Intensität des Fluoreszenzfarbstoffs wurde schnell bei einer Durchflussrate von 0,125 - 2 l/min festgestellt (Abbildung 2A). Die Neigung des Gefälles hing von der Durchflussrate ab. So wurde z. B. bei einer Durchflussrate von 0,125 l/min der Gradient über 1,5 mm entwickelt, was der vergleichbaren Größe von Zellinseln entspricht(Abbildung 2B).

Als nächstes wurde das integrierte Gerät mit Zellen getestet. Die Inseln der MDCK-Zellen wurden mikrogemustert und mit dem mikrofluidischen Kanal wie oben beschrieben zusammengesetzt. Erstens wurde sichergestellt, dass sich die Zellinsel innerhalb des Geräts gut ausbreitete, ohne einen Fluss im Mikrokanal anzuwenden. Über einen Zeitraum von 12 stunden wuchs die Insel, und die durchschnittliche Migrationsgeschwindigkeit betrug 0,1 bis 0,2 m/min. Während es Unterschiede zwischen den Inseln gab, wie stark sich die Insel ausdehnte, sahen alle Zellen im No-Flow-Zustand gesund aus. Als nächstes wurde der Fluss über diese Inseln angewendet, und es wurde festgestellt, dass sich die Zellinsel bei einer Durchflussrate von 0,1 l/min gut ausbreitete und die Zellen eine durchschnittliche Migrationsgeschwindigkeit von 0,1 bis 0,2 m/min für 12 h beihielten. Bei einer Erhöhung der Durchflussrate auf 0,5 l/min breiteten sich die Zellen jedoch nicht gut aus, und die durchschnittliche Migrationsgeschwindigkeit verringerte sich auf unter 0,1 m/min. Darüber hinaus erschienen morphologien der Zellen anders und schienen sich von den PA-Gelen zu lösen (Abbildung 3). Basierend auf diesen Daten wurde als Durchflussrate für die folgenden Experimente 0,1 l/min gewählt.

Um die Auswirkungen eines chemischen Gradienten auf die kollektive Zellmigration zu testen, wurde HGF32,34ausgewählt.  Der linke Einlass wurde mit 1) dem Versorgungsreservoir verbunden, das Zellkulturmedien mit HGF-Lösung (20 ng/ml) und 2) die anderen 2 Einlässe mit Reservoirs mit Zellkulturmedien hält. Mit einer Durchflussrate von 0,1 l/min wurde der Durchfluss über die wandernden Zellinseln (vier Zeilen x drei Spalten) für 10 h beibehalten (Abbildung 4). Wie in einem separaten Experiment gezeigt, lag die HGF-Konzentration in der linken Spalte nahe an der Konzentration der Spaltlösung (20 ng/ml), und in der rechten Spalte lag diese nahe Null. Die HGF-Konzentration auf der mittleren Säule verringerte sich allmählich von der linken Hälfte auf die rechte Hälfte. Beim Vergleich der Größe der Zellinseln nach 10 h haben sich die Inseln auf der rechten Spalte nicht viel erweitert, aber die Inseln auf der linken Spalte wurden deutlich größer und in alle Richtungen erweitert (Abbildung 4A). Solche Veränderungen in der Inselgröße wurden durch die Flugbahnen der Zellen innerhalb jeder Insel unterstützt (Abbildung 4B). Interessanterweise dehnten sich die Inseln in der mittleren Spalte nicht nach rechts aus (wo die HGF-Konzentration niedrig war), sondern dehnten sich bevorzugt nach links aus (wo die HGF-Konzentration hoch war). Während sich die durchschnittliche Migrationsgeschwindigkeit in der rechten Spalte kaum änderte, stieg die durchschnittliche Migrationsgeschwindigkeit in der linken und mittleren Spalte allmählich für die ersten 3 h an und verringerte sich dann allmählich (Abbildung 4C).

Zur Messung der Kontraktilkraft und interzellulären Spannung wurden Traktionsmikroskopie37,39,40 und Monolayer-Stressmikroskopie mit dem mikrofluidischen Kanal33,35, 38. Im Laufe von 10 h während der Anwendung des chemischen Gradienten wurden Bilder von fluoreszierenden Partikeln in PA-Gelen aufgenommen und die Kraft (pro Flächeneinheit), die von Zellen auf dem Substrat angewendet wurde, mit Fourier-Transformations-Traktionsmikroskopie35analysiert. 37. Die Traktion wurde in Polarkoordinaten dargestellt. Blau stellt die Kraft in Richtung der Mitte der Insel dar, und Rot stellt die Kraft weg vom Zentrum dar.

Zur Zeit Null zeigten alle Inseln ähnliche Traktionsverteilungen, mit starker Zugkraft nach innen am Rand und Fluktuation innerhalb der Insel. Diese Fluktuation ähnelte dem zuvor gezeigten34,35,41. Nach 10 h der Anwendung des HGF-Gradienten, während der Grad der Inselausdehnung in jeder Spalte unterschiedlich war, waren die Traktionsverteilungen weitgehend ähnlich wie Zeit Null(Abbildung 5A). Die durchschnittliche Traktion änderte sich nicht für 10 h (Abbildung 5C). Bei der Berechnung der Monolayer-Spannung zeigte jedoch jede Spalte unterschiedliche Trends. In der rechten Spalte (wo die HGF-Konzentration niedrig war) wurde die durchschnittliche Spannung innerhalb der Inseln um 200 Pa über einen Zeitraum von 10 h aufrechterhalten. In der linken Spalte (wo die HGF-Konzentration hoch war) verringerte sich die durchschnittliche Spannung innerhalb der Inseln allmählich von 230 Pa auf 100 Pa über 10 h, wie zuvor32,34gezeigt. In der mittleren Säule (wo die HGF-Konzentration in der linken Hälfte hoch und in der rechten Hälfte der Insel niedrig war) wurde die durchschnittliche Spannung um 150 Pa gehalten.

Figure 1
Abbildung 1:Schemader der integrierten Gerätevorbereitung. (A) Um das integrierte Gerät herzustellen, wurde ein Bodenglas mit PA-Gel, auf dem Zellinseln mit einer PDMS-Schablone gemustert wurden, mit einem PDMS-Mikrokanal überzogen. (B) Die integrierten Geräte wurden mit einem benutzerdefinierten Halter fixiert, um Flüssigkeitslecks und Komponententrennung zu verhindern. (C) Nachdem das Gerät mit Flüssigkeit ohne Blasen gefüllt war, wurden Reservoirs an die Einlässe angeschlossen und eine Spritzenpumpe an den Auslass angeschlossen. Alle Versuchs-Setups wurden auf einem Live-Zell-Bildgebungssystem platziert. (D) Der Schaltplan zeigt das Design und die Zusammensetzung der mikrofluidischen Kanäle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2:Ermittlung des chemischen Gradienten. (A) Fluoreszenzbilder von Rhodamin B-konjugiertem Dextran (70 kDa) visualisieren den Konzentrationsgradienten unter dem Flüssigkeitsstrom von 0,125 l/min, 0,5 l/min und 2 l/min. Gepunktete Kreise zeigen die Position der gemusterten Zellinseln an. (B) Das Intensitätsprofil des Fluoreszenzbildes zeigt, dass der Konzentrationsgradient im Gerät durch die Durchflussrate einstellbar war. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Die farbigen Balken geben die Spaltenpositionen der gemusterten Zellinsel an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3:Migration von MDCK-Zellinseln unter Fluss. (A) Die Phasenbilder bei 12 h der MDCK-Zellinsel bei jeder Durchflussrate (0 l/min, 0,1 l/min und 0,5 l/min) zeigen, dass sich Zellinseln bei geringer Durchflussrate gut ausdehnten, aber nicht mit einer hohen Durchflussrate ausdehnten. Gepunktete Linien stellen die Grenzen bei 0 h dar. (B) Der Mittelwert und das Histogramm der Mobilfunkgeschwindigkeit innerhalb jeder Insel alle 10 min für 12 h. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4:Migration von MDCK-Zellinseln unter Strömung und chemischem Gradienten. (A) Der relative Intensitätsbereich von Rhodamin B-konjugiertem Dextran hielt in jeder Spalte nach Stabilisierung für 2 h einen konstanten HGF-Konzentrationsgradienten bei. (B) Phasenbilder bei 10 h (gepunktete Linie = Zellinselgrenze bei 0 h) der MDCK-Zelle Insel unter dem HGF-Gradienten (v.l.n.r.: 20–0 ng/ml) zeigt, dass sich die Insel dort, wo die HGF-Konzentration höher war, stärker ausdehnte. (C) Die Flugbahnen von Migrationspfaden (Farbcodierung gibt die Pfadlänge) von Zellen in den MDCK-Zellinseln an. Gepunktete Linien und gestrichelte Linien stellen die Grenzen jeder Zellinsel bei 0 h bzw. 10 h dar. (D) Der Mittelwert und das Histogramm der Mobilfunkgeschwindigkeit innerhalb jeder Insel alle 10 min für 10 h. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5:Mechanische Wechselwirkungen von MDCK-Zellinseln. (A) Die Karten der Traktion (Zell-Substrat-Interaktion) in den Zellinseln bei 0 h und 10 h unter dem HGF-Gradienten. Die Karten wurden in radialer Koordination dargestellt, wobei die Zugkraft nach außen mit warmer Farbe und die nach innen gerichtete Traktion mit kalter Farbe verwendet wurde. (B) Die Karten der Monolayer-Spannung (Zell-Zell-Wechselwirkungen) in den Zellinseln bei 0 h und 10 h unter HGF-Gradienten. (C) Die Darstellung der durchschnittlichen Traktion (graues Quadrat) und Spannung (blauer Kreis) innerhalb der Zellinseln unter HGF Gradient im Laufe der Zeit alle 10 min für 10 h. Die Farbbänder stellen das Mittelquartil dar (25 %–75 %). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 1
Ergänzende Abbildung S1: Richtige Perlenverteilung für ausreichende Datenqualität bei der Traktionskraftanalyse erforderlich. Beispiele für gute (links) und schlechte (rechte) Fluoreszenz-Perlenbilder mit vergrößerten Bildern in den weißen Boxen werden gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die kollektive Migration von Zellbestandteilen ist ein wichtiger Prozess während der Entwicklung und Regeneration, und die Migrationsrichtung wird oft durch den chemischen Gradienten der Wachstumsfaktoren4,23geleitet. Während der kollektiven Migration interagieren Zellen weiterhin mit benachbarten Zellen und zugrunde liegenden Substraten. Solche mechanischen Wechselwirkungen führen zu auftauchenden Phänomenen wie Durotaxis42, plithotaxis33und Kenotaxis43. Jedoch, Diese Forschung wurde mit einer einzigen Konzentration von Wachstumsfaktoren durchgeführt, wie die in fetalen Rinderserum. Um diese Lücke zu schließen, beschreibt dieses Protokoll eine neue experimentelle Plattform, die mechanische Wechselwirkungen während der kollektiven Zellmigration unter einem chemischen Gradienten messen kann.

Die neue Plattform kombiniert drei experimentelle Systeme, die weit verbreitet sind: Mikromusterung, Traktionsmikroskopie und Mikrofluidik. Zunächst wurde eine Mikromusterung von Zellinseln für die kollektive Migration durchgeführt. Zweitens wurde sowohl die Traktionsmikroskopie als auch die Monolayer-Stressmikroskopie für mechanische Messungen wandernder Zellen verwendet. Schließlich wurde eine Mikrofluidik-Plattform verwendet, um chemische Gradienten über wandernde Zellen zu bestimmen. Mit diesem experimentellen System wurde gezeigt, dass Zellen innerhalb einer einzigen Insel als Reaktion auf unterschiedliche chemische Gradienten unterschiedlich wandern.

Wie in Abbildung 2beschrieben, bildet sich der chemische Gradient nur über einen Abstand von 1 mm in der Mitte des Mikrokanals. Inseln in der linken Spalte werden der maximalen Konzentration ausgesetzt, und die Inseln auf der rechten Säule sind der minimalen Konzentration ausgesetzt. Im Gegensatz dazu sind Inseln in der mittleren Säule dem chemischen Gradienten ausgesetzt. Auf diese Weise wird die Reaktion von Zellinseln bei einem Maximum, Minimum und einem Gradienten der Konzentrationen eines löslichen Faktors während desselben Experiments gemessen. Mit diesem Array von Zellinseln wurde eine allmähliche Zunahme der zellulären Migrationsgeschwindigkeit beobachtet, als die HGF-Konzentration zunahm.

Um qualitativ hochwertige Daten zu erreichen, gibt es wichtige Schritte in dem Verfahren, die besondere Aufmerksamkeit erfordern. Die PA-Gele in einem kundenspezifischen Glassubstrat müssen in Bezug auf die Verteilung von fluoreszierenden Partikeln und die Oberflächenbeschichtung von Kollagen perfekt sein. Denn ohne hochwertige PA-Gele kann kein hochwertiger Datensatz für Traktionsanalyse und Monolayer-Spannungsanalyse erfasst werden. Beispiele für hochwertige Perlenbilder sind in der Ergänzenden Abbildung 1dargestellt. Die mikrofluidischen Kanäle sind sehr klein, und Blasen sind leicht in ihnen gefangen. Diese Blasen stören nicht nur den Fluss, sondern können auch Zellen wegfegen, wenn sie beginnen, sich entlang des Flusses zu bewegen. Daher ist es wichtig, die mikrofluidischen Kanäle ohne Blasen zu füllen. Um einen stabilen Gradienten innerhalb des Mikrokanals zu erreichen, ist das Druckgleichgewicht innerhalb der drei Einlässe sehr wichtig. Um Ungleichgewichte zwischen ihnen zu vermeiden, sollten große Reservoirs verwendet werden, damit ungleichgewichte zu Beginn eines Experiments leicht angepasst werden können. Diese neue Plattform wird dazu beitragen, die Mechanik der kollektiven Zellmigration unter chemischen Gradienten weiter zu erforschen, was für das Verständnis von Regeneration, Krebsmetastasierung und Entwicklung von entscheidender Bedeutung ist.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, das von der koreanischen Regierung (MSIP) (Nr. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant und das BK 21 Plus Programm. Es wurde auch von den National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
1 M HEPES buffer solution Gibco 15630-056
1 mm Biopsy punch Integra Miltex 33-31AA-P/25
100 mm petri dishes SPL 10100 100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punch ILJIN 124-0571
18 mm Ø Coverslip Marienfeld-Superior 111580 Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solution Bio-Rad 1610142 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) Sigma-Aldrich 440159-500ML
3-way stopcock Hyupsung HS-T-61N CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-30 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dish Corning 430165
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-75 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acid J.T. Baker JT9508-03
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad 1610700
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Bottom glass chip MicroFIT 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tail Corning 354236
Custom glass holder Han-Gug Mechatronics custom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Welgene LM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biowest L0615-500 w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheres Invitrogen F8764 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Sigma-Aldrich H1404-5UG recombinant, human
JuLI stage live cell imaging system NanoEnTek In Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell type II
Oxygen plasma system Femto Science CUTE-MPR
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich R9379-100MG 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 G KOVAX Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape 3M/Scotch 810D 33 m x 19 mm
SU-8 master molds MicroFIT 4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) Thermo Scientific 22589 Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS
Syringe pump Chemyx Inc. model fusion 720 withdraw fluid
Syringes KOVAX 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lamp UVP LLC 95-0248-02 365 nm wavelength

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References

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Bioengineering Ausgabe 152 Mikrofluidik Traktionsmikroskopie kollektive Zellmigration Chemotaxis chemischer Gradient Mikromusterung
Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration
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Jang, H., Kim, J., Shin, J. H.,More

Jang, H., Kim, J., Shin, J. H., Fredberg, J. J., Park, C. Y., Park, Y. Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration. J. Vis. Exp. (152), e60415, doi:10.3791/60415 (2019).

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