Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man måler tarm permeabilitet af Caenorhabditis elegans. Denne metode er nyttigt for grundlæggende biologisk forskning på tarm sundhed relateret til samspillet mellem tarm bakterier og deres vært og til screening for at identificere probiotiske og kemiske agenser til at helbrede utætte tarm syndrom og inflammatoriske tarmsygdomme.
Abstract
I levende organismer, intestinal hyperpermeabilitet er et alvorligt symptom, der fører til mange inflammatoriske tarmsygdomme (IBDs). Caenorhabditis elegans er en nonmammalian dyremodel, der er almindeligt anvendt som en analyse system på grund af sin korte levetid, gennemsigtighed, omkostningseffektivitet, og mangel på dyreetiske spørgsmål. I denne undersøgelse, en metode blev udviklet til at undersøge virkningerne af forskellige bakterier og 3, 3 '-diindolylmethane (DIM) på tarm permeabilitet af C. elegans med et højt gennemløb billedanalyse system. Ormene blev inficeret med forskellige tarm bakterier eller cobehandlet med DIM for 48 h og fodret med fluorescein isothiocyanat (FITC)-dextran natten over. Derefter blev intestinal permeabilitet undersøgt ved at sammenligne fluorescensbilleder og fluorescens intensiteten inde i orme organerne. Denne metode kan også have potentiale til at identificere probiotiske og patogene tarm bakterier, der påvirker tarm permeabilitet i dyremodellen og er effektiv til at undersøge virkningerne af skadelige eller sundhedsfremmende kemikalier på intestinal permeabilitet og tarm sundhed. Men denne protokol har også nogle betydelige begrænsninger på det genetiske niveau, især for at bestemme, hvilke gener der er ændret til at kontrollere sygdom, fordi denne metode er for det meste anvendes til fænotypiske bestemmelse. Desuden er denne metode begrænset til at bestemme præcis, hvilke sygdomsfremkaldende substrater forårsager betændelse eller øge permeabilitet af orme tarme under infektion. Derfor er yderligere dybtgående undersøgelser, herunder undersøgelse af den molekylære genetiske mekanisme ved hjælp af mutant bakterier og nematoder samt kemisk komponent analyse af bakterier, forpligtet til fuldt ud at evaluere funktionen af bakterier og kemikalier til bestemmelse af tarm permeabilitet.
Introduction
Intestinal permeabilitet betragtes som en af de vigtigste barrierer i forbindelse med den intestinale mikrobiota og slimhinde immunitet og vil sandsynligvis blive påvirket af flere faktorer, såsom Gut mikrobiota modifikationer, epitelial svækkelse, eller slim Layer ændringer1. Nylige papirer har rapporteret effektive protokoller til at måle tarm permeabilitet af dyrkede humane tarmceller ved at analysere fluorescens flux satser på tværs af tarm celle lag2, men færre forskningspapirer præsentere en passende procedure til måling af tarm permeabilitet i nematodes, især i C. elegans, ved hjælp af FITC-dextran farvning.
Der er to repræsentative protokoller til måling af tarm permeabilitet i C. elegans ved hjælp af Nile Red3 og erioglaucin dinatrium (eller Smurf assay)4,5. I denne protokol brugte vi FITC-dextran (gennemsnitlig molekylvægt 10.000), som har en meget højere molekylvægt end Nilen rød (MW = 318,37) og erioglaucindinatrium (MW = 792,85). FITC-dextran er mere ens end Nilen rød eller erioglaucin dinatrium farvestoffer til faktiske makromolekylære næringsstoffer såsom kulhydrater, som absorberes gennem tarm laget. Den intestinale permeabilitet af C. elegans fodret med erioglaucindinatrium (blåt Smurf farvestof) kan let evalueres uden Fluorescens mikroskopi. I Smurf-analysen er kvantitativ analyse af intestinal permeabilitet imidlertid vanskelig på grund af manglende standardisering og bør evalueres manuelt4,5. I tilfælde af Nilen rød analyse, også Nile Red pletter lipid dråber i celler, som kan forstyrre den nøjagtige bestemmelse af tarm permeabilitet i C. elegans6. De nuværende protokoller muliggør en hurtig og præcis kvantitativ analyse af tarm permeabilitet i C. elegans behandlet med forskellige tarm bakterier og kemikalier, samtidig med at uspecifik lipid farvning undgås.
C. elegans er en typisk model i biologiske felter på grund af sin overkommelige pris, nem manipulation, begrænset dyreetiske spørgsmål, og kort levetid, som er gavnlig for hurtige eksperimenter7. Især, efter at hele c. elegans genom blev offentliggjort, næsten 40% af gener i C. elegans genom blev fundet at være orthologous til gener, der forårsager sygdomme hos mennesker8. Desuden giver det gennemsigtige organ observation inde i organismen, hvilket er fordelagtigt for at forske i cellulære hændelser og for fluorescens applikationer i cellebiologi, for eksempel stamcelle farvning med DAPI eller immunhistochemistry9. C. elegans bruges ofte som forsøgsdyr til at studere interaktionen mellem Gut mikrobiota og værten; Desuden, C. elegaNS bruges til at screene sundhedsfremmende probiotiske bakterier10,11,12 samt kosten kemikalier fremme tarm sundhed13,14.
Pseudomonas aeruginosa og Enterococcus fæalis er velkendte tarm bakterier, der påvirker mave-tarmsystemet negativt, især de koloniske epiteliale celler i tarmkanalen15,16. Derfor er måling af tarm permeabilitet udløst af disse bakterier er nødvendig for screening og udvikling af nye lægemidler, der kan genvinde og reducere skaderne forårsaget af bakteriel inflammation og infektion. I denne protokol, vi testede virkningerne af disse tarm bakterier på tarm permeabilitet af C. elegans.
Vi rapporterer også en optimeret protokol til afprøvning af kemikalier på tarm permeabilitet af C. elegans. Til dette formål brugte vi 3, 3 '-diindolylmethane (Dim) som en model kemikalie, fordi Dim er en Bioaktiv metabolit sammensatte afledt af indol-3-carbinol, som er til stede i Brassica fødevarer planter, og er blevet rapporteret at have terapeutiske virkninger på IBD i mus17,18. Desuden har vi for nylig opdaget, at DIM forbedrer tarm permeabilitet dysfunktion i både dyrkede humane tarmceller samt model fyrretræsnematoden C. elegans19.
I denne undersøgelse, vi brugte tre forskellige eksperimentelle betingelser. For det første målte vi virkningerne af de forskellige bakterier, P. aeruginosa og E. fæalis, på intestinal permeabilitet (figur 1). For det andet målte vi virkningerne af levende og varme inaktiverede P. aeruginosa på intestinal permeabilitet (figur 2). For det tredje målte vi virkningerne af DIM (et model kemikalie) på tarm permeabiliteten af C. elegans fodret med P. aeruginosa (figur 3).
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle optimerede protokoller, der måler intestinal permeabilitet af C. elegans, som er ændret ved behandling med forskellige tarm bakterier samt med kemikalier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring af P. aeruginosa PAO1 og Escherichia coli OP50 kultur
- Forbered 500 mL steriliseret Luria-Bertani (LB) medium (tabel 1) og inokulere en enkelt koloni af P. aeruginosa i mediet. Inkubatér kulturen i 14 til 15 timer ved 37 °C med en ryste hastighed på 150 rpm.
- Den bakterielle kultur fordeles ligeligt i 2 500 mL centrifugeglas, og rørene centrifugeres ved 3.220 x g ved 4 °c i 30 minutter.
- Supernatanten fjernes, indtil volumenet er 50 mL (en tiendedel af det oprindelige volumen) og resuspension af bakterie pellet.
- Den koncentrerede bakteriekultur opbevares ved 4 °C, indtil den anvendes. Opbevaringsperioden for P. aeruginosa kultur kan være op til 1 måned, men frisk kultur er bedre til inducerende tarmskader.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her. Ud over hele levende bakterier, supernatanten af den bakterielle kultur kan bruges til at teste virkningerne af tarm bakterier19. - For at forberede e. coli OP50, kultur e. coli OP50 i dyt medium (tabel 1) og derefter anvende lignende trin til dem, der er beskrevet ovenfor, men reducere lydstyrken til en sjettedel af den oprindelige volumen. For eksempel, hvis den oprindelige volumen er 500 mL, efter fjernelse supernatant, den resterende volumen er ca 83 mL.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her.
2. klargøring af Enterococcus fæalis kctc 3206 kultur
- Forbered 500 mL steriliseret hjernehjerte infusion (BHI) bouillon (tabel 1).
- Inokulere en koloni til 500 mL BHI bouillon og inkubere kulturen i 14 – 15 timer i en ryste inkubator ved 37 °C og 150 rpm.
- Den bakterielle kultur fordeles ligeligt i 2 500 mL centrifugeglas, og rørene centrifugeres ved 3.220 x g ved 4 °c i 30 minutter.
- Fjern supernatanten, indtil volumenet er 50 mL (en tiendedel af det oprindelige volumen) og resuspension af pellet.
- Den koncentrerede bakteriekultur opbevares ved 4 °C, indtil den anvendes. Den friske kultur er bedre til at teste virkningerne på tarm permeabilitet.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her.
3. fremstilling af varme inaktiverede E. coli OP50 og varme-inaktiverede P. aeruginosa PAO1 kulturer
- Og høst bakterierne som beskrevet ovenfor (trin 1.1-1.3).
- Varme-inaktivere E. coli OP50 eller P. aeruginoSA PAO1 kultur som beskrevet tidligere20,21,22. Ved varme inaktivering Inkuber de resuspenderede bakterier ved 65 °C (vandbad) i 30 minutter.
- Afkøl den koncentrerede bakteriekultur til stuetemperatur og opbevar den ved 4 °C indtil brug. Opbevaringsperioden kan være op til 1 måned.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her.
4. klargøring af nematode vækst medium (NGM) plader til afprøvning af virkningerne af forskellige bakterier på tarm permeabilitet af C. elegans
- Placer 1,25 g pepton, 1,5 g NaCl, 8,5 g agar, en magnetisk omrører og 487,5 mL destilleret vand i en 500 mL glas flaske (tabel 1).
- Bland blandingen godt, autoklave blandingen i 15 min ved 121 °C og Afkøl blandingen til 55 °C i et vandbad i 30 minutter.
- Fjern mediet fra vandbad, tilsæt komponenterne (0,5 mL 1 M CaCl2, 0,5 ml kolesterol, 0,5 ml mgso4, 12,5 ml KPO4) (tabel 1) til NGM, og bland godt.
Bemærk: Alle de enkelte komponenter skal være autoklave undtagen for kolesterol (opløst i absolut ethanol), og hvert eksperimentelt trin skal udføres på en ren bænk. - 20 mL NGM fordeles til hver 90 x 15 mm Petri skål, og agar kan størkne på en ren bænk ved stuetemperatur (ca. 20 °C). NGM-pladerne kan opbevares i op til en måned ved 4 °C.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her. NGM-pladerne, der anvendes til FITC-dextran-farvning, er fremstillet efter samme procedure (fra trin 4.1 – 4.3). 10 mL NGM blev distribueret til hver 60 x 15 mm Petri skål og fik lov til at størkne på en ren bænk ved stuetemperatur (ca. 20 °C). - Fjern bakterie kulturen fra 4 °C-køleskabet og vortex kulturen grundigt, inden du spreder kulturen på NGM-pladerne.
- Tilsæt i alt 800 μL bakterie kulturen til hver frisk NGM-plade, og lad pladerne tørre i en 20 °C inkubator natten over.
Bemærk: For det første eksperiment (figur 1) blev der fremstillet to NGM-plader med e. coli OP50, en NGM-plade med P. aeruginosa PAO1 og en NGM-plade med e. fæalis KCTC3206. For det andet eksperiment (figur 2), to NGM plader med Live E. coli OP50, en NGM plade med levende P. aeruginosa PAO1, og en NGM plade med varme-inaktiverede P. aeruginosa PAO1 blev forberedt.
5. klargøring af NGM plader til afprøvning af virkningerne af et kemikalie (DIM) på tarm permeabilitet af C. elegans fodret med P. aeruginosa
- Der tilsættes 0,5 g pepton, 0,6 g NaCl, 195 mL destilleret vand, en magnetisk omrører og 6,8 g agar til en 500 mL glas flaske (NGM agar).
- Der tilsættes 0,5 g pepton, 0,6 g NaCl, 195 mL destilleret vand og en magnetisk omrører uden agar til en anden 500 mL glas flaske (NGM bouillon).
- Autoclave de to flasker (fra trin 5.1 – 5.2), en tom 100 mL glas flaske og en tom 500 mL glas flaske i 15 min ved 121 °C. Lad derefter de medium, der indeholder flasker, køle af til 55 °C i vandbad i 30 min. Opbevar agar mediet i vandbad og fjern flasken med bouillon (fra trin 5,2) til næste trin.
- Tilsæt additiv kemikalierne til NGM bouillon: 0,4 mL 1 M CaCl2, 0,4 ml kolesterol i ethanol (ml), 0,4 ml 1 m mgso4 og 10 ml 1 m KPO4 (alle disse komponenter skal steriliseres bortset fra kolesterol i ethanol). Rør derefter blandingen grundigt med en magnetisk omrører ved 55 °C.
- Etiketten den autoklaverede tomme 500 mL glas flaske med dimethylsulfoxid (DMSO) og den autoklaverede tomme 100 mL glas flaske med DIM.
- Overfør 50 mL NGM bouillon til den svagt mærkede 100 mL flaske. Tilsæt 500 μL af 20 mM DIM Stock i flasken og bland godt.
Bemærk: DIM opløses i DMSO (20 mM DIM Stock). - Fjern hurtigt NGM agar-mediet fra vandbad, tilsæt 50 mL NGM agar-mediet til den svagt mærkede flaske og bland grundigt.
- Placer en 20 mL alikvot DIM-holdige NGM-medium i hver 90 mm x 15 mm Petri skål. Der kan laves ca. fem DIM-holdige NGM-plader fra dette trin.
Bemærk: Den endelige koncentration af DIM i hver NGM-plade vil være 100 μM. - For at tilberede den DMSO-holdige NGM-plade, Overfør 150 mL NGM bouillon til den DMSO-mærkede 500 mL flaske. Tilsæt 1,5 mL DMSO til flasken og bland godt.
- Tilsæt 150 mL NGM agar-mediet til den DMSO-mærkede flaske og bland grundigt.
- En 20 mL alikvot DMSO-indeholdende NGM-medium placeres i hver 90 mm x 15 mm Petri skål. Ca. femten DMSO-holdige NGM-plader kan laves fra dette trin.
Bemærk: Den endelige koncentration af DMSO i hver NGM-plade vil være 0,5%. - Pladerne størkner ved stuetemperatur i mindst 3 timer og opbevares ved 4 °C indtil brug.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her. - Fjern E. coli OP50 eller P. aeruginosa PAO1 kulturen fra 4 °c-køleskabet (fra trin 1,4), og vortex kulturen korrekt, inden den spredes på NGM-pladerne.
- Sæt 800 μL af E. coli OP50 eller P. aeruginosa PAO1 bakteriel kultur på hver frisk NGM agar plade og lad pladerne tørre i en 20 °c inkubator natten over.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her. For det tredje eksperiment (figur 3) blev to DMSO-holdige NGM-plader belagt med levende E. coli OP50, en DMSO-indeholdende NGM-plade belagt med levende p. aeruginosa PAO1 og en svagt indeholdende NGM-plade belagt med levende p. aeruginosa PAO1 udarbejdet.
6. forberedelse af alders synkroniseret C. elegans
- Vokse orme på en solid NGM plade og fodre dem med E. coli OP50 indtil den ønskede population er nået.
- Synkroniser æggene ved hjælp af enten den tidsindstillede æglægnings metode eller blegning opløsning behandling som beskrevet tidligere20,23,24.
7. behandling af bakterier eller DIM og FITC-dextran fodring
- De alders synkroniserede æg inkubates ved 20 °C i 64 h på NGM-plader suppleret med Live E. coli OP50 som fødevarer.
- Den alders synkroniserede L4 larve vaskes med S-buffer og overføres (mere end ca. 500 orme) til NGM-pladerne med forskellige bakterier og kemikalier (beskrevet i note efter trin 4,6 og 5,14). Inkuber dem ved 20 °C i 48 h.
Bemærk: Behandlingstiden kan variere fra 24 til 72 h, ifølge de anvendte bakterier og kemikalier. Den terapeutiske eller forebyggende virkning af DIM kan også evalueres ved at forbehandle orme med patogener og derefter behandle orme med DIM (den terapeutiske effekt) eller ved at forbehandle orme med DIM og derefter behandle med patogener (den forebyggende effekt)19. - For at tilberede de FITC-dextran-supplerede plader blandes 2 mL varme inaktiveret E. coli OP50 med 4 mg FITC-dextran. Derefter divideres 100 μL af FITC-dextran og E. coli OP50 blandingen til tyve friske NGM agar plader (60 mm x 15 mm) og lad pladerne tørre i 1 time på en ren bænk.
Bemærk: Den endelige koncentration af FITC-dextran i hver NGM-plade vil være 20 μg/mL. - Forbered fem E. coli OP50-holdige NGM-plader uden FITC-dextran til køretøjets kontrol behandling. Til dette formål divideres 100 μL varme inaktiveret E. coli OP50 til hver frisk NGM agar plader (60 mm x 15 mm) og lad pladerne tørre i 1 h på en ren bænk.
Bemærk: For hvert selvstændigt eksperiment kræves femten FITC-dextran-supplerede NGM-plader og fem NGM-plader uden FITC-dextran. - Efter 48 h behandling (fra trin 7,2), vask orme med S-buffer, overføre orme til FITC-dextran suppleret plader og NGM plader uden FITC-dextran, og inkubere pladerne natten (14 – 15 h).
Bemærk: For hver behandlingsgruppe kræves 5 replikater af FITC-dextran-farvning (eller køretøjets kontrol fodring). - Skyl ormene med S-buffer og lad dem kravle i den friske NGM agar plade i 1 time.
Bemærk: For hvert selvstændigt eksperiment er der behov for i alt 20 friske NGM plader. I dette trin kan du bruge NGM-pladen suppleret uden eller med E. coli OP50. - Tilsæt 50 μL af 4% formaldehyd opløsning til hver brønd af en sort 96-godt flad bundplade. Overfør ca. 50 orme fra hver NGM-plade til hver brønd for fluorescens målinger. Efter 1 til 2 min, grundigt fjerne alle formaldehyd fra hver brønd og tilsæt 100 μL af monterings medium til at belægge brøndene.
Bemærk: Formaldehyd opløsning (4%) bruges til at immobilisere og reparere orme. For hver behandlingsgruppe anvendes 5 brønde (5 replikater) til billedanalyse.
8. billeddannelse C. elegans med Operetta-billedbehandlings systemet og bestemmelse af intestinal permeabilitet ved at måle den FITC-dextran fluorescens optagelse
Bemærk: Fluorescerende stereomicroskopi kan anvendes til billedanalyse i stedet for Operetta-systemet.
- Capture fluorescensbilleder og måle fluorescens intensitet ved hjælp af Operetta High-Content Imaging System og analysere billederne med Harmony software.
- I Harmony-softwaren skal du trykke på ikonet Åbn låg for at åbne låget og sætte pladen i maskinen.
- Konfigurer parametrene.
- Klik på Konfigurer, Vælg plade type (96-brønd Corning flad bund) og Tilføj kanalerne (Bright-Field og egfp kanaler).
- Juster layoutet. Gå til layout valg, og vælg derefter spor og justere parametrene (første billede ved 1 μm, antal fly er 10, afstand er 1 μm).
- Vælg en af behandlings brøndene og et Capture-felt, og tryk på test for at kontrollere, om billederne er tilfredsstillende i afsnittet Kør eksperiment .
- Hvis billederne er tilfredsstillende, skal du vende tilbage til afsnittet Opsætning og trykke på nulstillings ikonet i slutningen af skærmen. Vælg derefter alle målbrønde og et passende antal Capture-felter.
- Gå til Kør eksperiment igen, og Indtast plade navnet, og tryk derefter på Start for at begynde behandlingen.
- For at måle intensiteten af fluorescensen skal du gå til afsnittet billedanalyse og indtaste billedet. Find cellen ved at vælge EGFP-kanalen og metode B. Juster den fælles tærskel til 0,5, område til > 200 μm2, split faktor til 3,0, individuel tærskel til 0,18 og kontrast til mere end 0,18. Beregn derefter intensitets egenskaberne, og vælg middelværdien som output. Tryk på ikonet Anvend for at gemme opsætningen.
- Gå til afsnittet evaluering for at måle intensiteten ved at få en heatmap og datatabel. Indstil udlæsningen til cellerne-INTENSITETS cellen egfp Mean-Mean per Well og start evalueringen.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her. - Hvis du vil udtrække data fra operette, skal du klikke på knappen indstilling og vælge datastyring.
- Vælg Skriv Arkiv, og Åbn derefter Gennemse, og vælg filen.
- Hvis du vil vælge filen, skal du klikke på det lille +- signal i venstre hjørne og derefter klikke på måling og vælge plade navn.
- Vælg filen, og klik på OK.
- Vælg stien for at gemme filen ved at klikke på gennemsyns signalet på den aktive sti.
- Klik på Start for at gemme datafilen.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her.
9. statistisk analyse af den FITC-dextran fluorescens af C. elegans
- Importer dataene, og Beregn middelværdien og standardafvigelsen (SD) ved hjælp af en statistisk software.
- Analysér den signifikante forskel med envejs analyse af variansen (ANOVA) efterfulgt af Tukey's multiple sammenligningstest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter inkubation med P. aeruginosa PAO1 viste C. elegans en signifikant stigning i FITC-dextran fluorescens i orme legemet sammenlignet med den fluorescens, der blev vist efter inkubation med de to andre bakteriestammer (figur 1). Fluorescens intensiteter for orme fodret med e. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 og e. fæalis KCTC3206 var henholdsvis 100,0 ± 6,6, 369,7 ± 38,9 og 105,6 ± 10,6%. Dataene understreger, at P. aeruginosa forårsagede mere vitale skader på epitelial tarm barrieren, og derfor udviste ormene en dramatisk stigning i deres tarm permeabilitet. Baseret på dette resultat, FITC-dextran kan nemt trænge gennem tarm laget, så P. aeruginosa blev valgt som en potentiel kandidat patogen for screening virkningerne af dim. Selv om e. fækale er et tarm patogen, der kan producere ekstracellulære superoxid og hydrogenperoxid, som beskadiger Colon epitel celle DNA15, i nogle tilfælde , E. fækale er også kendt som en potentiel probiotiske bakterier på grund af dens evne til at producere bakteriociner mod nogle patogener25,26. Funktionerne af en probiotiske omfatter overholdelse af epiteliale overflader, persistens i den menneskelige mave-tarmkanalen, immun stimulation og antagonistisk aktivitet mod tarm patogener26. Derfor forblev tarm permeabiliteten af orme inkuberet med E. fæalis uændret sammenlignet med køretøjets kontrol orme. Dette resultat viser, at mængden af infektionen kan undersøgt af stigningen i fluorescens intensitet, og P. aeruginosa forårsager mere intestinal permeabilitet end andre stammer.
Figur 2 viser forskellen mellem levende og varme inaktiveret P. aeruginosa PAO1 baseret på intensiteten af FITC-dextran fluorescens i orm kroppen. Både fluorescensbilleder og statistiske data indikerer, at patogenet ikke kunne udløse nogen toksicitet for nematoder efter varme inaktivering. P. aeruginosa kan producere exotoksin a — en potent ekstracellulær cytotoksin, der er dødelig for mange dyr27. Exotoxin A kan hurtigt afskaffes ved opvarmning ved 45 °C til 60 °C28. Derfor var varme inaktiverede P. aeruginosa ikke i stand til at beskadige permeabiliteten af orme tarmens epithelia. Supernatanten af p. aeruginosa PAO1 kultur signifikant beskadiget intestinal permeabilitet, og derfor, kulturen supernatanten i stedet for hele p. aeruginosa celler kan bruges til at fremkalde intestinal permeabilitet dysfunktion19. Supernatanten indeholder endotoksiner, exotoksin A og lipopolysaccharider29, og disse komponenter er kendt for at inducere celletoksicitet30,31. Derfor kan disse komponenter i supernatanten påvirke intestinal permeabilitet, selv om vi ikke kontrollere den direkte virkning af exotoksiner og lipopolysaccharider på intestinal permeabilitet i C. elegans.
DIM cotreatment for 48 h reducerede kraftigt FITC-dextran fluorescens intensitet inde i orme tarmene sammenlignet med enkelt behandlingen med P. aeruginosa (figur 3C, D). Statistisk analyse af enkelt-vejs ANOVA og Tukey's multiple sammenligningstest viste, at den gennemsnitlige fluorescens intensitet efter behandling med DIM var signifikant nedsat i sammenligning med fluorescens intensiteten af den eneste behandling med P. aeruginosa. Fluorescens intensiteter for de orme, der blev behandlet med p. aeruginosa-only og p. aeruginosa plus DIM, var henholdsvis 486,3 ± 41,7 og 414,2 ± 25,0% (figur 3E). Baseret på dette resultat, DIM kan betragtes som et godt naturprodukt til at helbrede intestinal permeabilitet dysfunktion forårsaget af bakterielle infektioner. Dette resultat indikerede, at DIM kan dæmpe celle betændelse i tarmceller, hvilket reducerer permeabiliteten af tarmen19. Dette resultat svarer til de opnåede resultater i en musemodel, hvor DIM viste en signifikant reduktion i inflammation i tyktarmen32.
Figur 1: virkningerne af forskellige bakterier på tarm permeabilitet af C. elegans. Mikroskopi billeder af orme, herunder lyse-felt, FITC fluorescens (grøn kanal), og fusionerede billeder. Mikroskopi billeder af orme fra (A) e. coli OP50 uden FITC-dextran fodring, (B) e. coli med FITC-dextran fodring, (C) P. aeruginosa PAO1 med FITC-dextran fodring, og (D) e. fæalis KCTC3206 med FITC-dextran fodring. Scale bar = 1 mm (hvid) og 200 μm (sort). Den alders synkroniserede L4 larver blev inkuberet i 48 h i NGM-pladerseedetmed e. coli (A, B), P. aeruginosa (C) og e. fæalis (D). Derefter blev ormene overført til plader, der indeholder FITC-dextran (B-D), bortset fra køretøjets kontrol (A). E) den FITC fluorescens intensitet af de forskellige bakterie behandlinger. En højere procentdel af FITC fluorescens indikerede en højere tarm permeabilitet. Kolonner og fejllinjer angiver middelværdien ± SD. * * *P < 0,001 for signifikant forskel fra køretøjets betjeningspanel. # ##P < 0,001 for signifikant forskel fra de FITC-dextran-behandlede orme, som blev fodret med P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Denne graf er repræsentativ for to uafhængige eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: virkningerne af levende og varme-inaktiveret P. aeruginosa PAO1 på intestinal permeabilitet af C. elegans. Mikroskopi billeder af orme fra (A) Live E. coli OP50 uden FITC-dextran fodring, (B) levende E. coli med FITC-dextran fodring, (C) levende P. aeruginosa PAO1 med FITC-dextran fodring, og (D) varme inaktiveret P. aeruginosa med FITC-dextran fodring. Scale bar = 1 mm (hvid) og 200 μm (sort). Den alders synkroniserede L4 larver blev inkuberet i 48 h i NGM-pladerseedetmed Live E. coli (A, B), Live P. aeruginosa (C) og varme inaktiveret P. aeruginosa (D). Derefter blev ormene overført til plader, der indeholder FITC-dextran (B-D), bortset fra køretøjets kontrol (A). E) FITC fluorescens intensitet, som sammenligner levende og varme inaktiverede P. aeruginosa PAO1. Kolonner og fejllinjer angiver middelværdien ± SD. * * *p < 0,001 og * *P < 0,01 for signifikant forskel fra køretøjets betjeningspanel. # ##P < 0,001 for signifikant forskel fra de FITC-dextran-behandlede orme fodret med levende P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Denne graf er repræsentativ for to uafhængige eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: effekten af DIM på intestinal permeabilitet af C. elegans fodret P. aeruginosa. Mikroskopi billeder af orme fra (A) E. coli OP50 uden FITC-dextran fodring, (B) E. coli med FITC-dextran fodring, (C) p. aeruginosa PAO1 med FITC-dextran fodring, og (D) p. aeruginosa og Dim (100 μM) cobehandling med FITC-dextran fodring. Scale bar = 1 mm (hvid) og 200 μm (sort). Den alders synkroniserede L4 larver blev inkuberet i 48 h i NGM-plader, der sås med Live E. coli (A, B), Live p. aeruginosa (C), Live p. aeruginosa og Dim (D). Derefter blev ormene overført til plader, der indeholder FITC-dextran (B-D), bortset fra køretøjets kontrol (A). E) den FITC fluorescens intensitet indikerer, at tarm permeabiliteten af C. elegans var påvirket af dim. Kolonner og fejllinjer angiver middelværdien ± SD. * * *P < 0,001 for signifikant forskel fra køretøjets betjeningspanel. ## #P < 0,001 og # #P < 0,01 for signifikant forskel fra de FITC-dextran-behandlede orme, som blev fodret med P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Denne graf er repræsentativ for to uafhængige eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved at udnytte denne nye metode til bestemmelse af tarm permeabilitet i C. elegans, som kombinerer automatiseret Fluorescens mikroskopi og kvantitativ billedanalyse, kan forskellene forårsaget af intestinale mikroorganismer eller kemikalier bestemmes in vivo, specifikt i C. elegans tarmen. Denne protokol er nyttig for tarm permeabilitet undersøgelser og gælder for mange opgaver, såsom reaktive ilt arter (ROS) bestemmelse under stress betingelser og morfologiske undersøgelser, på grund af sin bekvemmelighed og nem manipulation. Desuden kan denne metode anvendes til at bestemme virkningerne af terapeutiske og forebyggende metoder mod flere patogener i C. elegans. Især kan det være en effektiv protokol til at undersøge mekanismerne i forskellige bakteriestammer, herunder både skadelige og nyttige bakterier. Nogle patogener og probiotiske bakterier med lignende strukturer udøver forskellige virkninger på værten33,34. Denne procedure kan hjælpe med at evaluere, hvilken mekanisme bakterierne udnytter, og hvor de målrettede substrater kan udskilles ekstrellulært eller intracellulært. Desuden kan denne metode også bidrage til at styrke hypotesen om, at varmebehandling spiller en afgørende rolle i patogen inaktivering.
Der er imidlertid også visse vanskeligheder i forbindelse med denne procedure. For det første er antallet af orme i hver plade vigtigt for statistisk meningsfulde resultater og robust orm detektion, så 70-90% konfluency (mindst 50 orme per brønd) anbefales. I overensstemmelse hermed bør forsøg udføres for at opnå egnede orme. For det andet, pladen egenskaber er en af de vigtige faktorer, der påvirker kvaliteten af billeder og intensitet beslutsomhed, især for det nederste materiale. I nogle avancerede eksperimenter er en glasbund den bedste mulighed for måling af fluorescens på grund af dens fremragende optiske kvalitet. Men på grund af den høje pris, er en polystyren bund ofte brugt, selv om kvaliteten ikke er så høj som i glasbunden. Endelig, pladen belægning metoder til C. elegans kræver optimering. I dette eksperiment, fluorescerende monterings medium blev anvendt, fordi det kan bevare og forbedre mærkningen af vævs sektioner, men det er ikke i stand til at fastsætte orme på pladen bunden ordentligt.
Denne protokol har begrænsninger; Da C. elegans er en nematode, bør der udføres yderligere eksperimenter, såsom evaluering i humane tarm celle monolag og i pattedyr. I denne metode, de fænotypiske ændringer i C. elegans fodret patogene bakterier og kemikalier blev bestemt. Derfor bør de molekylære og genetiske mekanismer, der underliggende de sygdomsfremkaldende eller probiotiske virkninger af tarm bakterier samt de terapeutiske virkninger af kemikalier, yderligere belyses. Specifikke signalveje, der udøves af patogene bakterieinfektioner og terapeutiske virkninger af kemikalier, kan evalueres ved hjælp af både forskellige mutante bakterier og mutant orme. Derudover vil yderligere dybtgående undersøgelser, der identificerer de kemiske komponenter, der er ansvarlige for de sygdomsfremkaldende og probiotiske virkninger af tarm bakterier, være gavnlige.
Her rapporterer vi en forsøgsprotokol til måling af intestinal permeabilitet i C. elegans behandlet med forskellige bakterier og kemikalier ved hjælp af FITC-dextran fodring. Vi mener, at disse protokoller vil være nyttige for grundlæggende biologisk forskning, såsom at studere samspillet mellem tarm mikrobiota og tarm sundhed, samt for udviklingen af probiotika og nutraceuticals til forebyggelse og behandling af tarm sundhedsmæssige problemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af en Korea Institute of Science and Technology murene Research Grant (2e29563).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate - dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
References
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
- Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
- Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).
- Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).
- Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
- Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441 (2018).
- Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).
- Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
- Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
- Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
- Huang, Z., et al. 3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
- Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
- Kim, J. Y., et al. 3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
- Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).
- Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).
- Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 5 979-984 (1983).
- Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
- Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
- Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
- Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
- Kim, Y. H., et al. 3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
- Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
- Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).
