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Medicine

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस की आंतों की परगम्यता पर बैक्टीरिया और रसायनों के प्रभाव को मापना

Published: December 3, 2019 doi: 10.3791/60419
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1Gangneung Institute of Natural Products, Korea Institute of Science and Technology, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, Korea University of Science and Technology (UST)

Summary

इस प्रोटोकॉल में बताया गया है कि कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंसकी आंतों की परगम्यता को कैसे मापा जाए । यह विधि आंतों के बैक्टीरिया और उनके मेजबान के बीच बातचीत से संबंधित आंतों के स्वास्थ्य पर बुनियादी जैविक अनुसंधान के लिए और टपका हुआ आंत सिंड्रोम और भड़काऊ आंत्र रोगों का इलाज करने के लिए प्रोबायोटिक और रासायनिक एजेंटों की पहचान करने के लिए स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी है।

Abstract

जीवित जीवों में आंतों की हाइपरपरेबिलिटी एक गंभीर लक्षण है जिससे कई भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) हो जाते हैं। कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस एक नॉनमैट्रिशियन एनिमल मॉडल है जिसे व्यापक रूप से अपनी छोटी उम्र, पारदर्शिता, लागत प्रभावशीलता और पशु नैतिकता के मुद्दों की कमी के कारण परख प्रणाली के रूप में उपयोग किया जाता है। इस अध्ययन में, एक उच्च थ्रूपुट छवि विश्लेषण प्रणाली के साथ सी एलिगेंस की आंतों की पारगम्यता पर विभिन्न बैक्टीरिया और 3,3'-डिंडोलिएलमीथेन (डीआईएम) के प्रभावों की जांच करने के लिए एक विधि विकसित की गई थी। कीड़े विभिन्न आंत बैक्टीरिया से संक्रमित थे या 48 एच के लिए मंद के साथ सहउपचारित और फ्लोरोसेइन आइसोथिओसाइनेट (फ़ेसीसी) - dextran रातभर के साथ खिलाया जाता है। फिर, धाराप्रवाह स्थायित्व की जांच की गई, जिसमें फ्लोरेसेंस छवियों और कृमि निकायों के अंदर फ्लोरेसेंस तीव्रता की तुलना की गई थी। इस विधि में प्रोबायोटिक और रोगजनक आंतों के बैक्टीरिया की पहचान करने की क्षमता भी हो सकती है जो पशु मॉडल में आंतों की परगम्यता को प्रभावित करते हैं और आंतों की परगम्यता और आंतों के स्वास्थ्य पर हानिकारक या स्वास्थ्य को बढ़ावा देने वाले रसायनों के प्रभावों की जांच करने के लिए प्रभावी है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में आनुवंशिक स्तर पर कुछ काफी सीमाएं भी हैं, विशेष रूप से यह निर्धारित करने के लिए कि कौन से जीन बीमारी को नियंत्रित करने के लिए बदल दिए जाते हैं, क्योंकि इस विधि का उपयोग ज्यादातर फेनोटाइपिक दृढ़ संकल्प के लिए किया जाता है। इसके अलावा, यह विधि यह निर्धारित करने तक सीमित है कि रोगजनक सब्सट्रेट्स सूजन का कारण बनते हैं या संक्रमण के दौरान कीड़े की आंतों की स्थायित्व में वृद्धि करते हैं। इसलिए, उत्परिवर्ती बैक्टीरिया और सूत्रकृमि के साथ-साथ बैक्टीरिया के रासायनिक घटक विश्लेषण का उपयोग करके आणविक आनुवंशिक तंत्र की जांच सहित और गहराई से अध्ययन, आंतों की पारगम्यता का निर्धारण करने में बैक्टीरिया और रसायनों के कार्य का पूरी तरह से मूल्यांकन करने की आवश्यकता होती है ।

Introduction

आंतों की परगम्यता को आंतों के माइक्रोबायोटा और म्यूकोसल प्रतिरक्षा से संबंधित मुख्य बाधाओं में से एक माना जाता है और आंत माइक्रोबायोटा संशोधनों, विशेषण हानि, या बलगम परत परिवर्तन जैसे कई कारकों से प्रभावित होने की संभावना है। हाल के कागजात प्रभावी प्रोटोकॉल की सूचना दी है आंतों सेल परत2भर में फ्लोरेसेंस प्रवाह दरों का विश्लेषण करके सुसंस्कृत मानव आंतों की कोशिकाओं की आंतों की पारगम्यता को मापने के लिए, लेकिन कम शोध पत्र नेमाटोड में आंत पारगम्यता को मापने के लिए एक उपयुक्त प्रक्रिया पेश करते हैं, विशेष रूप से सी एलिगेंसमें, FITC-dextran धुंधला का उपयोग करके ।

नील लाल3 और एरोग्लोसिन डिसोडियम (या स्मर्फ परख)4,5का उपयोग करके सी एलिगेंस में आंत की परगम्यता को मापने के लिए दो प्रतिनिधि प्रोटोकॉल हैं। इस प्रोटोकॉल में, हमने फिटेक-डीएक्सटन (औसत आणविक वजन 10,000) का उपयोग किया, जिसमें नील लाल (मेगावाट = 318.37) और एरोग्लोसिन डाइसोडियम (मेगावाट = 792.85) की तुलना में बहुत अधिक आणविक वजन है। फिट्सी-ड्ट्रिटन नील लाल या एरोग्लोसिन डाइसोडियम रंगों की तुलना में कार्बोहाइड्रेट जैसे वास्तविक मैक्रोमॉलिक्यूलर पोषक तत्वों के समान है, जो आंतों की परत के माध्यम से अवशोषित होते हैं। एरोग्लोसिन डाइसोडियम (ब्लू स्मर्फ डाइ) से खिलाए गए सी एलिगेंस की आंतों की परगम्यता का बिना फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है। हालांकि, स्मर्फ परख में, मानकीकरण की कमी के कारण आंतों की पारगम्यता का मात्रात्मक विश्लेषण मुश्किल है और मैन्युअल रूप से4,5का मूल्यांकन किया जाना चाहिए। नील लाल परख के मामले में, नील लाल भी कोशिकाओं में लिपिड बूंदों दाग, जो सी elegans6में आंत स्थायित्व के सटीक निर्धारण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । वर्तमान प्रोटोकॉल अविशिष्ट लिपिड धुंधला से बचने के दौरान विभिन्न आंतों के बैक्टीरिया और रसायनों के साथ इलाज सी एलिगेंस में आंतों की पारगम्यता के तेजी से और सटीक मात्रात्मक विश्लेषण को सक्षम करते हैं।

सी elegans अपनी सस्ती कीमत, आसान हेरफेर, सीमित पशु नैतिकता के मुद्दों, और छोटी उम्र है, जो तेजी से प्रयोग7के लिए फायदेमंद है के कारण जैविक क्षेत्रों में एक ठेठ मॉडल है । विशेष रूप से, पूरे सी एलिगेंस जीनोम प्रकाशित होने के बाद, सी एलिगेंस जीनोम में लगभग 40% जीन जीन के लिए ऑर्थोलॉगस पाए गए जो मानव रोगों का कारण बनते हैं8. इसके अलावा, पारदर्शी शरीर जीव के अंदर अवलोकन की अनुमति देता है, जो सेलुलर घटनाओं पर शोध करने के लिए और सेल जीव विज्ञान में फ्लोरेसेंस अनुप्रयोगों के लिए लाभप्रद है, उदाहरण के लिए, स्टेम सेल DAPI या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री9के साथ धुंधला । सी एलिगेंस का उपयोग अक्सर आंत माइक्रोबायोटा और मेजबान के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक जानवर के रूप में किया जाता है; इसके अलावा, सी एलिगाएनएस का उपयोग स्वास्थ्य को बढ़ावा देने वाले प्रोबायोटिक बैक्टीरिया10,11,12 के साथ-साथ आंतों के स्वास्थ्य को बढ़ावा देने वाले आहार रसायनों को स्क्रीन करने के लिए किया जाता है13,14।

स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और एंटोकोकस मलकालिस प्रसिद्ध आंत बैक्टीरिया हैं जो गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल सिस्टम को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं, विशेष रूप से आंतों के पथ15,16की उपनिवेश एपिथेलियल कोशिकाएं। इसलिए, इन बैक्टीरिया द्वारा ट्रिगर आंत स्थायित्व को मापने के स्क्रीनिंग और नई दवाओं के विकास के लिए आवश्यक है कि ठीक हो सकता है और बैक्टीरियल सूजन और संक्रमण की वजह से नुकसान को कम । इस प्रोटोकॉल में, हमने सी एलिगेंसकी आंतों की परगम्यता पर इन आंतों के बैक्टीरिया के प्रभावों का परीक्षण किया।

हम सी एलिगेंस की आंतों की परगम्यता पर रसायनों के परीक्षण के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल की भी रिपोर्ट करते हैं। इस उद्देश्य के लिए, हमने मॉडल रसायन के रूप में 3,3'-डिइंडोलिएलमीथेन (डीआईएम) का उपयोग किया क्योंकि डीआईएम एक बायोएक्टिव मेटाबोलाइट यौगिक है जो इंडोल-3-कार्बिनॉल से प्राप्त होता है, जो ब्रासिका खाद्य पौधों में मौजूद है, औरचूहों 17,18में आईबीडी पर चिकित्सीय प्रभाव होने की सूचना मिली है। इसके अलावा, हमने हाल ही में पता लगाया कि डीआईएम दोनों सुसंस्कृत मानव आंतों की कोशिकाओं के साथ-साथ मॉडल नेमाटोड सी एलिगेंस19में आंतों की परगम्यता में सुधार करता है।

इस अध्ययन में हमने तीन अलग-अलग प्रायोगिक स्थितियों का इस्तेमाल किया। सबसे पहले, हमने आंतों की परगम्यता(चित्रा 1)पर विभिन्न बैक्टीरिया, पी एरुगिनोसा और ई फेकैलिस के प्रभावों को मापा। दूसरा, हमने आंतों की परगम्यता(चित्रा 2)पर लाइव और हीट-इनएक्टिवेटेड पी एरुजिनोसा के प्रभावों को मापा। तीसरा, हमने पी एरुजिनोसा (चित्रा 3)के साथ खिलाए गए सी एलिगेंस की आंतों की परगम्यता पर डीआईएम (एक मॉडल रसायन) के प्रभाव ों को मापा।

इस अध्ययन का उद्देश्य अनुकूलित प्रोटोकॉल विकसित करना था जो सी एलिगेंसकी आंतों की स्थायित्व को मापते हैं, जिसे विभिन्न आंतों के बैक्टीरिया के साथ-साथ रसायनों के साथ उपचार द्वारा बदल दिया जाता है।

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Protocol

1. पी aeruginosa PAO1 और Escherichia कोलाई OP50 संस्कृति की तैयारी

  1. बंध्याकृत लुरिया-बर्टानी (एलबी) माध्यम(तालिका 1)का 500 मीटर तैयार करें और पी एरुजिनोसा की एक कॉलोनी को माध्यम में टीका लगाएं। 150 आरपीएम की हिलती हुई गति के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 14 से 15 घंटे के लिए संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
  2. समान रूप से दो 500 mL अपकेंद्रित्र ट्यूबों में बैक्टीरियल संस्कृति वितरित करें और 30 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,220 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्री करें।
  3. जब तक वॉल्यूम 50 एमसीएल (प्रारंभिक मात्रा का दसवां हिस्सा) न हो जाए तब तक सुपरनेटेंट निकालें और बैक्टीरियल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
  4. उपयोग तक केंद्रित बैक्टीरियल संस्कृति को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। पी aeruginosa संस्कृति के भंडारण की अवधि 1 महीने तक हो सकता है, लेकिन ताजा संस्कृति आंतों की क्षति उत्प्रेरण के लिए बेहतर है ।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल रुका जा सकता है। पूरे जीवित बैक्टीरिया के अलावा, बैक्टीरियल संस्कृति के अधिनेत का उपयोग आंतों के बैक्टीरिया19के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।
  5. ई. कोलाई OP50 तैयार करने के लिए, संस्कृति ई. कोलाई OP50 DYT माध्यम में(तालिका 1)और फिर ऊपर वर्णित उन लोगों के लिए इसी तरह के कदम लागू होते हैं, लेकिन मूल मात्रा के एक छठे करने के लिए मात्रा कम । उदाहरण के लिए, यदि प्रारंभिक मात्रा 500 मीटर है, सुपरनेट हटाने के बाद, शेष मात्रा लगभग 83 मीटर है।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल रुका जा सकता है।

2. एंटोकोकस फेकलिस केसीटीटीसी 3206 संस्कृति की तैयारी

  1. निष्फल मस्तिष्क हृदय जलसेक (BHI) शोरबा(तालिका 1)के 500 मीटर तैयार करें।
  2. एक कॉलोनी को भीनी शोरबा के 500 मिलीएल में इनोक्यूलेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस और 150 आरपीएम पर मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 14-15 घंटे के लिए संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
  3. समान रूप से दो 500 mL अपकेंद्रित्र ट्यूबों में बैक्टीरियल संस्कृति वितरित करें और 30 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,220 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्री करें।
  4. जब तक वॉल्यूम 50 एमसीएल (प्रारंभिक मात्रा का दसवां हिस्सा) न हो जाए तब तक सुपरनेटेंट निकालें और गोली को फिर से निलंबित करें।
  5. उपयोग तक केंद्रित बैक्टीरियल संस्कृति को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। ताजा संस्कृति आंतों की परगम्यता पर प्रभाव का परीक्षण करने के लिए बेहतर है।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल रुका जा सकता है।

3. हीट-इनएक्टिवेटेड ई. कोलाई OP50 और हीट-इनएक्टिवेटेड पी aeruginosa PAO1 संस्कृतियों की तैयारी

  1. ऊपर वर्णित बैक्टीरिया (चरण 1.1-1.3) के रूप में संस्कृति और फसल।
  2. हीट-निष्क्रिय ई. कोलाई OP50 या पी aeruginoसा PAO1 संस्कृति के रूप में पहले20,21,22वर्णित है । गर्मी निष्क्रियता के लिए, 30 00 के लिए 65 डिग्री सेल्सियस (पानी स्नान) पर पुनः निलंबित बैक्टीरिया को इनक्यूबेट करें।
  3. ध्यान केंद्रित बैक्टीरियल संस्कृति को कमरे के तापमान तक ठंडा करें और उपयोग तक इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। भंडारण अवधि 1 महीने तक हो सकती है।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल रुका जा सकता है।

4. सी एलिगेंस की आंतों की परगम्यता पर विभिन्न बैक्टीरिया के प्रभावों के परीक्षण के लिए नेमाटोड ग्रोथ मीडियम (एनजीएम) प्लेटों की तैयारी

  1. 1.25 ग्राम पेप्टोन, 1.5 ग्राम नासीएल, 8.5 ग्राम आगर, एक चुंबकीय उभारक और 487.5 मिलीग्राम आसुत पानी को 500 मीटर ग्लास बोतल(टेबल 1)में रखें।
  2. मिश्रण को अच्छी तरह मिलाएं, 15 मिन के लिए मिश्रण को 121 डिग्री सेल्सियस पर स्वचालित करें और मिश्रण को 30 टन के लिए पानी के स्नान में 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  3. पानी के स्नान से माध्यम निकालें, घटकों (1 एम CaCl2के 0.5 mL, कोलेस्ट्रॉल के 0.5 मिलील, MgSO4के 0.5 mL, KPO4के 12.5 mL)(तालिका 1)एनजीएम के लिए जोड़ें, और अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: कोलेस्ट्रॉल (पूर्ण इथेनॉल में भंग) को छोड़कर सभी व्यक्तिगत घटकों को स्वचालित किया जाना चाहिए, और हर प्रयोगात्मक कदम एक साफ बेंच पर किया जाना चाहिए।
  4. प्रत्येक 90 x 15 मिमी पेट्री डिश को एनजीएम के 20 mL वितरित करें और आगर को कमरे के तापमान (लगभग 20 डिग्री सेल्सियस) पर एक साफ बेंच पर जमना करने की अनुमति दें। एनजीएम प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने तक स्टोर किया जा सकता है।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल रुका जा सकता है। जीवाईटीसी-डीएक्सटीन धुंधला के लिए उपयोग की जाने वाली एनजीएम प्लेटें एक ही प्रक्रिया (चरण 4.1-4.3 से) द्वारा तैयार की गई थीं। एनजीएम के 10 mL प्रत्येक 60 x 15 मिमी पेट्री डिश को वितरित किया गया था और कमरे के तापमान (लगभग 20 डिग्री सेल्सियस) पर एक साफ बेंच पर जमना करने की अनुमति दी गई थी।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से बैक्टीरियल संस्कृति को हटा दें और एनजीएम प्लेटों पर संस्कृति को अच्छी तरह से फैलाने से पहले संस्कृति को भंवर करें।
  6. प्रत्येक ताजा एनजीएम प्लेट में बैक्टीरियल संस्कृति के कुल 800 माइक्रोन जोड़ें, और प्लेटों को रात भर 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सूखने दें।
    नोट: पहले प्रयोग(चित्रा 1),ई कोलाई OP50 के साथ दो एनजीएम प्लेट, पी aeruginosa PAO1 के साथ एक NGM प्लेट, और ई faecalis KCTC3206 के साथ एक NGM प्लेट तैयार किए गए थे । दूसरे प्रयोग(चित्रा 2),लाइव ई. कोलाई OP50 के साथ दो NGM प्लेटें, लाइव पी aeruginosa PAO1 के साथ एक NGM प्लेट, और गर्मी के साथ एक NGM प्लेट-निष्क्रिय पी aeruginosa PAO1 तैयार किए गए थे ।

5. पी एरुजिनोसा के साथ सी एलिगेंस फेड की आंतों की परगम्यता पर एक रासायनिक (DIM) के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए NGM प्लेटों की तैयारी

  1. 0.5 ग्राम पेप्टोन, एनसीएल के 0.6 ग्राम, आसुत पानी के 1 9 5 मिलीग्राम, एक चुंबकीय उभारक, और 6.8 ग्राम आगर को 500 मिलीग्राम ग्लास बोतल (एनजीएम आगर) में जोड़ें।
  2. 0.5 ग्राम पेप्टोन, 0.6 ग्राम नैल, 1 9 5 मिलीग्राम आसुत पानी, और एक चुंबकीय रकनर को आगर के बिना एक और 500 मिलीग्राम ग्लास बोतल (एनजीएम शोरबा) में जोड़ें।
  3. ऑटोक्लेव दो बोतलें (चरण 5.1-5.2 से), एक खाली 100 मीटर कांच की बोतल, और 15 मीटर के लिए एक खाली 500 मीटर कांच की बोतल 121 डिग्री सेल्सियस पर। फिर, 30 किमी के लिए पानी के स्नान में 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने के लिए बोतलयुक्त माध्यम की अनुमति दें। अगले चरण के लिए आगर माध्यम को पानी के स्नान में रखें और बगलो (चरण 5.2 से) युक्त बोतल को हटा दें।
  4. एनजीएम शोरबा में योजक रसायन जोड़ें: 1 एम सीएसीएल2का 0.4 मिलीएल, इथेनॉल (एमएल) में कोलेस्ट्रॉल का 0.4 मिलीएल, 1 एमएमजीएसओ4 का 0.4 मिलीएल और 1 एम केपीओ4 का 10 एमएल (इन सभी घटकों को इथेनॉल में कोलेस्ट्रॉल के अलावा स्टरलाइज्ड किया जाना चाहिए)। फिर, मिश्रण को 55 डिग्री सेल्सियस पर चुंबकीय उभारने वाले के साथ अच्छी तरह से हिलाएं।
  5. डाइमेथिल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) के साथ ऑटोक्लेव खाली 500 मीटर ग्लास बोतल लेबल करें और डीआईएम के साथ ऑटोक्लेव खाली 100 मीटर ग्लास बोतल।
  6. डीआईएम लेबल वाली 100 मिलीएल बोतल में एनजीएम शोरबा के 50 मिलीएल को स्थानांतरित करें। बोतल में 20 एमएम डीआईएम स्टॉक के 500 माइक्रोन जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: डीआईएम डीएमएसओ (20 एमएम डीआईएम स्टॉक) में भंग हो जाता है।
  7. जल स्नान से एनजीएम आगर माध्यम को जल्दी से हटा दें, डीआईएम लेबल वाली बोतल में एनजीएम आगर माध्यम का 50 मिलील जोड़ें और अच्छी तरह मिला एं।
  8. प्रत्येक 90 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में डीआईएम युक्त एनजीएम माध्यम का 20 मीटर का एलिकोट रखें। लगभग पांच डीआईएम युक्त एनजीएम प्लेटें इस कदम से बनाई जा सकती हैं।
    नोट: प्रत्येक एनजीएम प्लेट में डीआईएम की अंतिम एकाग्रता 100 माइक्रोन होगी।
  9. डीएमएसओ युक्त एनजीएम प्लेट तैयार करने के लिए एनजीएम शोरबा के 150 मिलीएल को डीएमएसओ लेबल वाली 500 मिलीएल बोतल में ट्रांसफर करें। बोतल में डीएमएसओ का 1.5 मिलील जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
  10. डीएमएसओ लेबल वाली बोतल में एनजीएम आगर मीडियम का 150 मिलीएल डालें और अच्छी तरह मिला लें।
  11. प्रत्येक 90 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में डीएमएसओ युक्त एनजीएम माध्यम का 20 एमएल एलिकोट रखें। लगभग पंद्रह डीएमएसओ युक्त एनजीएम प्लेटें इस कदम से बनाई जा सकती हैं।
    नोट: प्रत्येक एनजीएम प्लेट में डीएमएसओ की अंतिम एकाग्रता 05% होगी।
  12. कमरे के तापमान पर प्लेटों को कम से कम 3 घंटे के लिए जमना और उपयोग तक उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल रुका जा सकता है।
  13. ई. कोलाई OP50 या पी aeruginosa PAO1 संस्कृति 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से निकालें (चरण १.४ से) और भंवर एनजीएम प्लेटों पर फैलने से पहले संस्कृति ठीक से ।
  14. प्रत्येक ताजा NGM आगर प्लेट पर ई कोलाई OP50 या पी aeruginosa PAO1 जीवाणु संस्कृति के ८०० μL रखो और प्लेटों एक 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर सूखने के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल रुका जा सकता है। तीसरे प्रयोग के लिए(चित्रा 3),दो DMSO युक्त NGM प्लेटें लाइव ई. कोलाई OP50 के साथ लेपित, एक DMSO युक्त NGM प्लेट लाइव पी aeruginosa PAO1 के साथ लेपित, और एक मंद युक्त NGM प्लेट लाइव पी aeruginosa PAO1 के साथ लेपित तैयार किए गए थे ।

6. आयु-सिंक्रोनाइज्ड सी एलिगेंस की तैयारी

  1. एक ठोस एनजीएम प्लेट पर कीड़े उगाएं और वांछित आबादी तक पहुंचने तक उन्हें ई कोलाई OP50 के साथ खिलाएं।
  2. अंडे को समय पर अंडे बिछाने की विधि या ब्लीचिंग समाधान उपचार का उपयोग करके सिंक्रोनाइज़ करें जैसा कि पहले20,23,24वर्णित है ।

7. बैक्टीरिया या डीआईएम और फिटेन फीडिंग का उपचार

  1. भोजन के रूप में लाइव ई. कोलाई OP50 के साथ पूरक एनजीएम प्लेटों पर 64 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर उम्र सिंक्रोनाइज्ड अंडे इनक्यूबेट करें।
  2. एस-बफर के साथ आयु-सिंक्रोनाइज्ड एल4 लार्वा को धोएं और उन्हें (लगभग 500 कीड़े से अधिक) उपचार एनजीएम प्लेटों में स्थानांतरित करें जिसमें विभिन्न बैक्टीरिया और रसायन (नोट में वर्णित चरण 4.6 और 5.14)। उन्हें 48 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस्तेमाल किए गए बैक्टीरिया और केमिकल्स के मुताबिक ट्रीटमेंट टाइम 24 से ७२ घंटे तक हो सकता है । डीआईएम के चिकित्सीय या निवारक प्रभाव का मूल्यांकन रोगजनकों के साथ कीड़े को पूर्वनिर्धारित करके और फिर डीआईएम (चिकित्सीय प्रभाव) के साथ कीड़े का इलाज करके या डीआईएम के साथ कीड़े का पूर्वइलाज करके और फिर रोगजनकों (निवारक प्रभाव)19के साथ इलाज करके किया जा सकता है।
  3. फिटेक-डीट्रान-सप्लीमेंट्ड प्लेट्स तैयार करने के लिए 4 मिलीग्राम फिटिक-डीट्राटिन के साथ हीट-इनएक्टिवेटेड ई कोलाई OP50 का 2 मिलीग्राम मिक्स करें । फिर, एफईसी-dextran और ई. कोलाई OP50 मिश्रण के 100 μL को बीस ताजा एनजीएम आगर प्लेटों (60 मिमी x 15 मिमी) में विभाजित करें और प्लेटों को एक साफ बेंच पर 1 घंटे के लिए सूखने की अनुमति दें।
    नोट: प्रत्येक एनजीएम प्लेट में फिटेक-डीएक्सटीन की अंतिम एकाग्रता 20 μg/mL होगी ।
  4. वाहन नियंत्रण उपचार के लिए फिटेक-डीएक्सटीएन के बिना पांच ई कोलाई OP50 युक्त एनजीएम प्लेटें तैयार करें। इस उद्देश्य के लिए, प्रत्येक ताजा एनजीएम आगर प्लेटों (60 मिमी x 15 मिमी) के लिए 100 माइक्रोन हीट-निष्क्रिय ई कोलाई OP50 को विभाजित करें और प्लेटों को एक साफ बेंच पर 1 घंटे के लिए सूखने की अनुमति दें।
    नोट: प्रत्येक स्वतंत्र प्रयोग के लिए, पंद्रह फिटेक-dextran-पूरक एनजीएम प्लेटों और पांच एनजीएम प्लेटों के बिना FITC-dextran की आवश्यकता है ।
  5. 48 एच के उपचार के बाद (चरण 7.2 से), कीड़े को एस-बफर से धोएं, कीड़े को फिट्सी-डीडीट्रान पूरक प्लेटों और एनजीएम प्लेटों को फिटेक-डीएक्सटीन के बिना स्थानांतरित करें, और प्लेटों को रात भर (14-15 घंटे) में शामिल करें।
    नोट: प्रत्येक उपचार समूह के लिए, फिटेक-dextran धुंधला (या वाहन नियंत्रण खिला) के 5 प्रतिकृति की आवश्यकता है ।
  6. कीड़े को एस-बफर से धोएं और उन्हें 1 घंटे के लिए ताजा एनजीएम आगर प्लेट में क्रॉल करने की अनुमति दें।
    नोट: प्रत्येक स्वतंत्र प्रयोग के लिए कुल 20 ताजा एनजीएम प्लेटों की जरूरत होती है । इस चरण में, आप ई कोलाई OP50 के बिना या साथ पूरक एनजीएम प्लेट का उपयोग कर सकते हैं।
  7. एक काले 96-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट के प्रत्येक कुएं में 4% फॉर्मलडिहाइड समाधान के 50 माइक्रोन जोड़ें। फ्लोरेसेंस मापन के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से प्रत्येक एनजीएम प्लेट से लगभग 50 कीड़े स्थानांतरित करें। 1 से 2 किमी के बाद, प्रत्येक कुएं से सभी फॉर्मलडिहाइड को अच्छी तरह से हटा दें और कुओं को कोट करने के लिए बढ़ते माध्यम के 100 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: फॉर्मलडिहाइड समाधान (4%) कीड़े को स्थिर करने और ठीक करने के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रत्येक उपचार समूह के लिए, छवि विश्लेषण के लिए 5 कुओं (5 प्रतिकृति) का उपयोग किया जाता है।

8. ओपेरेटा इमेजिंग सिस्टम के साथ इमेजिंग सी एलिगेंस और फिटेक-ड्डेट्रान फ्लोरेसेंस अपटेक को मापने के द्वारा आंतों की परगम्यता का निर्धारण

नोट: फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोपी का उपयोग ओपेरेटा सिस्टम के बजाय छवि विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

  1. फ्लोरेसेंस छवियों पर कब्जा करें और ओपेरेटा उच्च-सामग्री इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें और सद्भाव सॉफ्टवेयर के साथ छवियों का विश्लेषण करें।
  2. सद्भाव सॉफ्टवेयर में, ढक्कन खोलने के लिए और मशीन में प्लेट डालने के लिए आइकन ओपन ढक्कन दबाएं।
  3. मापदंडों को स्थापित करें।
  4. सेट अपपर क्लिक करें, प्लेट प्रकार (96-अच्छी तरह से कॉर्निंग फ्लैट-बॉटम) का चयन करें और चैनल (उज्ज्वल-फ़ील्ड और ईजीएफपी चैनल) जोड़ें.
  5. लेआउट को समायोजित करें। लेआउट चयनपर जाएं, और फिर ट्रैक का चयन करें और मापदंडों को समायोजित करें (1 माइक्रोन पर पहली तस्वीर, विमानों की संख्या 10 है, दूरी 1 माइक्रोन है)।
  6. उपचार कुओं में से एक का चयन करें और एक पर कब्जा क्षेत्र और प्रेस परीक्षण की जांच करने के लिए कि क्या चित्र चलाने के प्रयोग अनुभाग में संतोषजनक हैं ।
  7. यदि चित्र संतोषजनक हैं, तो सेट अप अनुभाग पर लौटें और स्क्रीन के अंत में रीसेट आइकन दबाएं। फिर, सभी लक्ष्य कुओं और कब्जा क्षेत्रों की एक उपयुक्त संख्या का चयन करें।
  8. फिर से प्रयोग चलाने के लिए जाओ और प्लेट का नाम दर्ज करें, तो प्रसंस्करण शुरू करने के लिए शुरू प्रेस ।
  9. फ्लोरेसेंस की तीव्रता को मापने के लिए, छवि विश्लेषण अनुभाग में जाएं और छवि को इनपुट करें। ईजीएफपी चैनल और विधि बी का चयन करके सेल का पता लगाएं। सामान्य सीमा को 0.5, क्षेत्र को और 200 माइक्रोन2,स्प्लिट फैक्टर को 3.0, व्यक्तिगत सीमा 0.18 और 0.18 से अधिक के विपरीत समायोजित करें। फिर, तीव्रता गुणों की गणना करें और आउटपुट के रूप में मतलब चुनें। सेटअप को बचाने के लिए लागू आइकन दबाएं।
  10. हीटमैप और डेटा टेबल प्राप्त करके तीव्रता को मापने के लिए मूल्यांकन अनुभाग में जाएं। कोशिकाओं के लिए Readout पैरामीटर सेट- तीव्रता सेल EGFP मतलब - अच्छी तरह से मतलब है और मूल्यांकन शुरू करते हैं।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल रुका जा सकता है।
  11. ओपेरेटा से डेटा निकालने के लिए, सेटिंग बटन पर क्लिक करें और डेटा प्रबंधनचुनें।
  12. संग्रह लिखें,और फिर ब्राउज़ खोलें और फ़ाइल का चयन करें।
  13. फ़ाइल का चयन करने के लिए, बाएं कोने पर छोटे + सिग्नल पर क्लिक करें, और फिर माप पर क्लिक करें और प्लेट नामचुनें।
  14. फ़ाइल का चयन करें और OKपर क्लिक करें।
  15. सक्रिय पथ पर ब्राउज़ सिग्नल पर क्लिक करके फ़ाइल को बचाने के लिए पथ का चयन करें।
  16. डेटा फ़ाइल को सहेजने के लिए प्रारंभ पर क्लिक करें।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल रुका जा सकता है।

9. सी एलिगेंस के एफईसी-डीएक्सट्रान फ्लोरेसेंस का सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. डेटा आयात करें और सांख्यिकी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके औसत और मानक विचलन (एसडी) की गणना करें।
  2. विचरण (ANOVA) के एक तरह से विश्लेषण के साथ महत्वपूर्ण अंतर का विश्लेषण करें और उसके बाद तुकी के कई तुलना परीक्षण।

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Representative Results

पी aeruginosa PAO1 के साथ ऊष्मायन के बाद, सी elegans अन्य दो जीवाणु उपभेदों(चित्रा 1)के साथ ऊष्मायन के बाद दिखाया गया फ्लोरेसेंस की तुलना में कृमि शरीर में FITC-dextran फ्लोरेसेंस में एक महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई । ई. कोलाई OP50, पी aeruginosa PAO1, और ई faecalis KCTC3206 के साथ खिलाया कीड़े की फ्लोरेसेंस तीव्रता क्रमशः 100.0 ± 6.6, 369.7 ± 38.9, और 105.6 ± 10.6% थे। डेटा इस बात पर जोर देते हैं कि पी एरुजिनोसा ने एपिथेलियल आंत बाधा को अधिक महत्वपूर्ण क्षति पहुंचाई, और इसलिए, कीड़े ने अपनी आंतों की स्थायित्व में नाटकीय वृद्धि का प्रदर्शन किया। इस परिणाम के आधार पर, एफईसी-डीएक्सटन आसानी से आंतों की परत के माध्यम से प्रवेश कर सकता है, इसलिए डीआईएम के प्रभावों की स्क्रीनिंग के लिए पी एरुजिनोसा को संभावित उम्मीदवार रोगजनक के रूप में चुना गया था। हालांकि ई फेकलिस एक आंत रोगजनक है जो बाह्य सुपरऑक्साइड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उत्पादन कर सकता है, जो उपनिवेशीय एपिथेलियल सेल डीएनए15को नुकसान पहुंचाता है, कुछ मामलों में, ई फेकैलिस को कुछ रोगजनकों25, 26के खिलाफ बैक्टीरियोसिन का उत्पादन करने की क्षमता के कारण एक संभावित प्रोबायोटिक बैक्टीरिया के रूप में भी जाना जाता है। प्रोबायोटिक के कार्यों में एपिथेलियल सतहों का पालन, मानव गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में हठ, प्रतिरक्षा उत्तेजना और आंतों के रोगजनकों के खिलाफ विरोधी गतिविधिशामिल है। इसलिए, ई. मल के साथ इनक्यूबेटेड कीड़े की आंत पारगम्यता वाहन नियंत्रण कीड़े की तुलना में अपरिवर्तित रही। इस परिणाम से पता चलता है कि संक्रमण की मात्रा फ्लोरेसेंस तीव्रता में वृद्धि से अध्ययन किया जा सकता है, और पी aeruginosa अन्य उपभेदों की तुलना में अधिक आंतों की परगम्यता का कारण बनता है।

चित्रा 2 कृमि शरीर में फिटेसी-ड्डेट्राफ्लोरेंस की तीव्रता के आधार पर लाइव और हीट-इनएक्टिवेटेड पी एरुजिनोसा PAO1 के बीच का अंतर दिखाता है। फ्लोरेसेंस छवियों और सांख्यिकीय आंकड़ों से संकेत मिलता है कि रोगजनक गर्मी निष्क्रियता के बाद सूत्रकृमि के लिए किसी भी विषाक्तता को ट्रिगर नहीं कर सका । पी aeruginosa exotoxin ए का उत्पादन कर सकते हैं - एक शक्तिशाली एक्स्ट्रासेलुलर साइटोटॉक्सिन जो27जानवरों के लिए घातक है। एक्सोटॉक्सिन ए को 45 डिग्री सेल्सियस से 60 डिग्री सेल्सियस28पर गर्म करके तेजी से समाप्त किया जा सकता है । इसलिए, हीट-निष्क्रिय पी एरुजिनोसा कीड़े आंतों के एपिथेलिया की स्थायित्व को नुकसान पहुंचाने में असमर्थ था। पी aeruginosa PAO1 संस्कृति के अलौकिक काफी आंतों पारगम्यता क्षतिग्रस्त है, और इसलिए, संस्कृति के बजाय पूरे पी aeruginosa कोशिकाओं को आंतों पारगम्यता दोष19प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अधिष्णक्य में एंडोटॉक्सिन, एक्सोक्सिन ए और लिपोपॉलीसैकराइड्स29होते हैं, और इन घटकों को सेल विषाक्तता30,31को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है। इसलिए, अधिष्णक के ये घटक आंतों की परगम्यता को प्रभावित कर सकते हैं, हालांकि हमने सी एलिगेंसमें आंतों की परगम्यता पर एक्सोक्सिन और लिपोपॉलीसैकराइड्स के प्रत्यक्ष प्रभाव की जांच नहीं की।

48 एच के लिए मंद सहउपचार ने पी एरुजिनोसा एकल उपचार(चित्रा 3सी, डी)की तुलना में कीड़े की हिम्मत के अंदर फिटसी-ड्ट्रिडन फ्लोरेसेंस तीव्रता को काफी कम कर दिया। एक तरह से ANOVA और Tukey के कई तुलना परीक्षण द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चला है कि मंद के साथ उपचार के बाद, मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता पी aeruginosaकी फ्लोरेसेंस तीव्रता के साथ तुलना में काफी कमी आई थी-केवल उपचार । पी aeruginosaके साथ इलाज कीड़े की फ्लोरेसेंस तीव्रता -केवल और पी aeruginosa प्लस मंद ४८६.३ ± ४१.७ और ४१४.२ ± २५.०%, क्रमशः(चित्रा 3ई)थे । इस परिणाम के आधार पर, मंद बैक्टीरियल संक्रमण के कारण आंतों की परगम्यता रोग का इलाज करने के लिए एक अच्छा प्राकृतिक उत्पाद माना जा सकता है। इस परिणाम से संकेत मिलता है कि डीआईएम आंत कोशिकाओं में कोशिका सूजन को क्षीण कर सकता है, जो आंत19की स्थायित्व को कम करता है। यह परिणाम माउस मॉडल में प्राप्त परिणामों के समान है, जिसमें डीआईएम ने पेट32में सूजन में उल्लेखनीय कमी दिखाई।

Figure 1
चित्रा 1: सी एलिगेंस की आंतों की स्थायित्व पर विभिन्न बैक्टीरिया का प्रभाव। उज्ज्वल क्षेत्र, FITC फ्लोरेसेंस (ग्रीन चैनल), और विलय छवियों सहित कीड़े की माइक्रोस्कोपी छवियां। फिटेक-डीएक्सटॉर्न फीडिंग के बिना कीड़े की माइक्रोस्कोपी छवियां,(बी) ई. कोलाई फिटेक-डीएक्सटीन फीडिंग के साथ,(सी) पी एरुजिनोसा पाओ1 फिटेक-डीएक्सटॉर्न फीडिंग के साथ, और(डी) ई फेकलिस KCTC3206 फिटेक-dextran खिला के साथ। स्केल बार = 1 मिमी (सफेद), और 200 माइक्रोन (काला)। ई कोलाई (ए, बी), पी एरुजिनोसा (सी),और ई फेकालिस (डी)के साथ वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेटों में आयु-सिंक्रोनाइज्ड एल4 लार्वा को 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। फिर, कीड़े को वाहन नियंत्रण(ए)को छोड़कर, फिटसी-डीएक्सटीन(बी-डी)वाली प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया गया था। (ई)विभिन्न जीवाणु उपचारों की फिसीसी फ्लोरेसेंस तीव्रता। FITC फ्लोरेसेंस का एक उच्च प्रतिशत एक उच्च आंत स्थायित्व का संकेत दिया । कॉलम और त्रुटि बार वाहन नियंत्रण से महत्वपूर्ण अंतर के लिए मतलब ± एसडी. ***पी एंड एलटी; 0.001 का संकेत देते हैं। ###पी एंड एलटी; 0.001 पी. एरुजिनोसा PAO1 (ANOVA, n = 5) के साथ खिलाया फ़ीसीसी-dextran-इलाज कीड़े से महत्वपूर्ण अंतर के लिए । यह ग्राफ दो स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधि है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सी एलिगेंसकी आंतों की पारगम्यता पर लाइव और हीट-इनएक्टिवेटेड पी एरुजिनोसा PAO1 का प्रभाव । से कीड़े की माइक्रोस्कोपी छवियां(ए)से कीड़े की माइक्रोस्कोपी छवियां फिटेक-dextran खिला के बिना ई. कोलाई OP50 रहते हैं,(बी)FITC-dextran खिला के साथ ई. कोलाई रहते हैं,(सी)फिटेक-dextran खिला के साथ पी aeruginosa PAO1 रहते हैं, और(डी)हीट-निष्क्रिय पी aeruginosa FITC-dextran खिला के साथ । स्केल बार = 1 मिमी (सफेद), और 200 माइक्रोन (काला)। आयु-सिंक्रोनाइज्ड एल4 लार्वा को एनजीएम प्लेटों में 48 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया गया था, जिसमें लाइव ई कोलाई (ए, बी),लाइव पी एरुजिनोसा (सी),और हीट-इनएक्टिवेटेड पी एरुजिनोसा (डी)के साथ वरीयता प्राप्त थी। फिर, कीड़े को वाहन नियंत्रण(ए)को छोड़कर, फिटसी-डीएक्सटीन(बी-डी)वाली प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया गया था। (ई)जीईसी फ्लोरेसेंस तीव्रता लाइव और हीट-इनएक्टिवेटेड पी एरुजिनोसा पीएओ1 की तुलना करती है । कॉलम और त्रुटि बार वाहन नियंत्रण से महत्वपूर्ण अंतर के लिए मतलब ± एसडी* * *पी एंड एलटी; 0.001 और **पी एंड एलटी; 0.01 का संकेत देते हैं। ###पी एंड एलटी; 0.001 फिटसी-dextran से महत्वपूर्ण अंतर के लिए-इलाज कीड़े लाइव पी aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5) के साथ खिलाया । यह ग्राफ दो स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधि है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सी एलिगेंस की आंतों की परगम्यता पर मंद का प्रभाव पी एरुजिनोसाखिलाया । से कीड़े की माइक्रोस्कोपी छवियां(ए) ई. कोलाई OP50 FITC-dextran खिला के बिना,(बी)ई. FITC-dextran खिला के साथ ई. कोलाई, (सी) पी aeruginosa PAO1 FITC-dextran खिला के साथ, और(डी) पी aeruginosa और DIM (१०० μM) FITC-dextran खिला के साथ उपचार । स्केल बार = 1 मिमी (सफेद), और 200 माइक्रोन (काला)। आयु-सिंक्रोनाइज्ड एल4 लार्वा को एनजीएम प्लेटों में 48 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया गया था, जिसमें लाइव ई कोलाई (ए, बी),लाइव पी एरुजिनोसा (सी),लाइव पी एरुजिनोसा और डी(डी)के साथ वरीयता प्राप्त थी। फिर, कीड़े को वाहन नियंत्रण(ए)को छोड़कर, फिटसी-डीएक्सटीन(बी-डी)वाली प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया गया था। (ई)फिथ फ्लोरेसेंस तीव्रता इंगित करती है कि सी एलिगेंस की आंत स्थायित्व मंद से प्रभावित थी । कॉलम और त्रुटि बार वाहन नियंत्रण से महत्वपूर्ण अंतर के लिए मतलब ± एसडी. ***पी एंड एलटी; 0.001 का संकेत देते हैं। ###पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.001 और ##पी एंड एलटी; 0.01 पी.एरुजिनोसा PAO1 (ANOVA, n = 5) के साथ खिलाया फ़ेसीसी-dextran-इलाज कीड़े से महत्वपूर्ण अंतर के लिए । यह ग्राफ दो स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधि है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

सी एलिगेंस में आंत पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए इस नई विधि का उपयोग करके, जो स्वचालित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और मात्रात्मक छवि विश्लेषण को जोड़ती है, आंतों के सूक्ष्मजीवों या रसायनों के कारण होने वाले अंतर को वीवो में निर्धारित किया जा सकता है, विशेष रूप से सी एलिगेंस आंत में। यह प्रोटोकॉल आंत सामर्थ्य जांच के लिए उपयोगी है और अपनी सुविधा और आसान हेरफेर के कारण तनाव की स्थिति और रूपात्मक परीक्षाओं के तहत प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) निर्धारण जैसे कई कार्यों पर लागू होता है। इसके अलावा, इस विधि का उपयोग सी एलिगेंस में कई रोगजनकों के खिलाफ चिकित्सीय और निवारक तरीकों के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, यह हानिकारक और उपयोगी दोनों बैक्टीरिया सहित विभिन्न जीवाणु उपभेदों के तंत्र की जांच करने के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल हो सकता है। इसी तरह की संरचनाओं वाले कुछ रोगजनक और प्रोबायोटिक बैक्टीरिया मेजबान33,34पर अलग - अलग प्रभाव डालते हैं . यह प्रक्रिया यह मूल्यांकन करने में सहायता कर सकती है कि बैक्टीरिया किस तंत्र का उपयोग कर रहे हैं और जहां लक्षित सब्सट्रेट्स को बाह्युलर या इंट्रासेलर रूप से स्रावित किया जा सकता है। इसके अलावा, यह विधि इस परिकल्पना को मजबूत करने में भी मदद कर सकती है कि गर्मी उपचार रोगजनक निष्क्रियता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

हालांकि इस प्रक्रिया के दौरान कुछ दिक्कतें भी हैं। सबसे पहले, प्रत्येक प्लेट में कीड़े की संख्या सांख्यिकीय सार्थक परिणामों और मजबूत कृमि का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए 70-90% कन्फ्लनरी (कम से कम 50 कीड़े प्रति अच्छी तरह से) की सिफारिश की जाती है। तदनुसार, उपयुक्त कीड़े प्राप्त करने के लिए परीक्षण प्रयोग किए जाने चाहिए। दूसरा, प्लेट गुण उन महत्वपूर्ण कारकों में से एक हैं जो विशेष रूप से नीचे की सामग्री के लिए छवियों और तीव्रता निर्धारण की गुणवत्ता को प्रभावित करते हैं। कुछ उन्नत प्रयोगों में, एक ग्लास बॉटम अपनी उत्कृष्ट ऑप्टिकल गुणवत्ता के कारण फ्लोरेसेंस की माप के लिए सबसे अच्छा विकल्प है। हालांकि, उच्च कीमत के कारण, एक पॉलीस्टीरिन बॉटम का उपयोग अक्सर किया जाता है, हालांकि गुणवत्ता ग्लास बॉटम जितनी अधिक नहीं होती है। अंत में, सी एलिगन्स के लिए प्लेट कोटिंग विधियों को अनुकूलन की आवश्यकता होती है। इस प्रयोग में फ्लोरोसेंट बढ़ते माध्यम को लागू किया गया था क्योंकि यह ऊतक वर्गों की लेबलिंग को संरक्षित और बढ़ा सकता है, लेकिन यह प्लेट के नीचे कीड़े को ठीक से ठीक करने में असमर्थ है।

इस प्रोटोकॉल की सीमाएं हैं; चूंकि सी एलिगेंस एक सूत्रकृमि है, इसलिए आगे के प्रयोग, जैसे मानव आंतों की कोशिका मोनोलेयर में मूल्यांकन और स्तनधारियों में, प्रदर्शन किया जाना चाहिए। इस विधि में, सी एलिगेंस फेड रोगजनक बैक्टीरिया और रसायनों में फेनोटाइपिक परिवर्तन निर्धारित किए गए थे। इसलिए, आंतों के बैक्टीरिया के रोगजनक या प्रोबायोटिक प्रभावों के साथ-साथ रसायनों के चिकित्सीय प्रभावों को अंतर्निहित आणविक और आनुवंशिक तंत्र को और स्पष्ट किया जाना चाहिए। रोगजनक जीवाणु संक्रमण और रसायनों के चिकित्सीय प्रभावों द्वारा लगाए गए विशिष्ट सिग्नलिंग रास्तों का मूल्यांकन विभिन्न उत्परिवर्ती बैक्टीरिया और उत्परिवर्ती कीड़े दोनों का उपयोग करके किया जा सकता है। इसके अलावा, आंतों के बैक्टीरिया के रोगजनक और प्रोबायोटिक प्रभावों के लिए जिम्मेदार रासायनिक घटकों की पहचान करने वाले आगे गहराई से अध्ययन फायदेमंद होंगे।

यहां, हम सी एलिगेंस में आंतों की परगम्यता को मापने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं, जो फिटसी-ड्डेट्रान फीडिंग का उपयोग करके विभिन्न बैक्टीरिया और रसायनों के साथ इलाज किया जाता है। हमारा मानना है कि ये प्रोटोकॉल बुनियादी जैविक अनुसंधान के लिए मददगार होंगे, जैसे आंतों के माइक्रोबायोटा और आंत स्वास्थ्य के बीच बातचीत का अध्ययन करना, साथ ही आंतों की स्वास्थ्य समस्याओं की रोकथाम और उपचार के लिए प्रोबायोटिक्स और न्यूट्रास्यूटिक्स के विकास के लिए ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को कोरिया इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी इंट्राम्यूरल रिसर्च ग्रांट (2E29563) ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3’-diindolylmethane  Sigma D9568
90×15 mm Petri dishes SPL Life Sciences, South Korea 10090
60×15 mm Petri dishes SPL Life Sciences, South Korea 10060
Bactor Agar Beckton Dickinson REF. 214010
Formaldehyde solution  Sigma F1635
Brain Heart Infusion (BHI)  Becton Dickinson REF. 237500
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Wild type 
Cholesterol Sigma C3045
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene Corning Incorporated REF. 3631
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Enterococcus faecalis KCTC 3206 Korean Collection for Type Culture KCTC NO. 3206 Falcutative anaerobic
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - dextran Sigma FD10S
Harmony software  PerkinElmer verson 3.5
Luria-Bertani LB medium Merck VM743185 626  1.10285.5000
Magnesium sulfate heptahydrate  Fisher Bioreagents BP2213-1
Fluoromount aqueous mounting medium Sigma F4680
Operetta CLS High-Content Analysis System PerkinElmer  HH16000000
Peptone Merck EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01 Korean Collection for Type Culture KCTC NO. 1637
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-1
Stereo Microscope Nikon, Japan SMZ800N
Yeast extract Becton Dickinson REF. 212750

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References

  1. Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).
  2. Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
  3. Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).
  4. Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
  5. Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).
  6. Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).
  7. Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
  8. Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
  9. Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
  10. Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441 (2018).
  11. Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
  12. Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
  13. Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).
  14. Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
  15. Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
  16. Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
  17. Huang, Z., et al. 3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
  18. Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
  19. Kim, J. Y., et al. 3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
  20. Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).
  21. Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
  22. Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
  23. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  24. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  25. Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).
  26. Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).
  27. Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 5 979-984 (1983).
  28. Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
  29. Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
  30. Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
  31. Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
  32. Kim, Y. H., et al. 3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
  33. Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
  34. Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).

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