Summary
Questo protocollo descrive come misurare la permeabilità intestinale di Caenorhabditis elegans. Questo metodo è utile per la ricerca biologica di base sulla salute intestinale relativa all'interazione tra i batteri intestinali e il loro ospite e per lo screening per identificare gli agenti probiotici e chimici per curare la sindrome dell'intestino che perde e le malattie infiammatorie intestinali.
Abstract
Negli organismi viventi, l'iperpermescopibilità intestinale è un sintomo grave che porta a molte malattie infiammatorie intestinali (IBD). Caenorhabditis elegans è un modello animale non mammaliano che è ampiamente utilizzato come sistema di analisi a causa della sua breve durata di vita, trasparenza, convenienza e mancanza di questioni etiche degli animali. In questo studio, è stato sviluppato un metodo per studiare gli effetti di diversi batteri e 3,3'-diindolylmethane (DIM) sulla permeabilità intestinale di C. elegans con un sistema di analisi delle immagini ad alto contenuto di velocità. I vermi sono stati infettati da diversi batteri intestinali o cotrattati con DIM per 48 h e alimentati con fluoresceinisocianate (FITC)-dextran durante la notte. Quindi, la permeabilità intestinale è stata esaminata confrontando le immagini di fluorescenza e l'intensità della fluorescenza all'interno dei corpi del verme. Questo metodo può anche avere il potenziale per identificare i batteri intestinali probiotici e patogeni che influenzano la permeabilità intestinale nel modello animale ed è efficace per esaminare gli effetti di sostanze chimiche dannose o che promuovono la salute sulla permeabilità intestinale e salute intestinale. Tuttavia, questo protocollo ha anche alcune notevoli limitazioni a livello genetico, soprattutto per determinare quali geni vengono modificati per controllare la malattia, perché questo metodo è utilizzato principalmente per la determinazione fenotipica. Inoltre, questo metodo si limita a determinare esattamente quali substrati patogeni causano infiammazione o aumentano la permeabilità dell'intestino dei vermi durante l'infezione. Pertanto, ulteriori studi approfonditi, tra cui lo studio del meccanismo genetico molecolare utilizzando batteri mutanti e nematodi, nonché l'analisi dei componenti chimici dei batteri, sono necessari per valutare completamente la funzione dei batteri e sostanze chimiche nel determinare la permeabilità intestinale.
Introduction
La permeabilità intestinale è considerata come una delle principali barriere legate al microbiota intestinale e all'immunità mucosale ed è probabile che sia influenzata da diversi fattori, come le modifiche del microbiota intestinale, la compromissione epiteliale o le alterazioni dello strato di muco1. Recenti documenti hanno riportato protocolli efficaci per misurare la permeabilità intestinale delle cellule intestinali umane coltivate analizzando i tassi di flusso di fluorescenza attraverso lo strato di cellule intestinali2, ma meno documenti di ricerca presentano una procedura adatta per misurare la permeabilità intestinale nei nematodi, in particolare in C. elegans, utilizzando la colorazione FITC-dextran.
Ci sono due protocolli rappresentativi per misurare la permeabilità intestinale in C. elegans utilizzando il rosso Nilo3 e il disodio erioglaucine (o il saggio del Puffo)4,5. In questo protocollo, abbiamo usato FITC-dextran (peso molecolare medio 10.000), che ha un peso molecolare molto più elevato rispetto al Nilo rosso (MW - 318,37) e al disodico di erioglaucine (MW - 792,85). FITC-dextran è più simile di rosso del Nilo o coloranti disodio erioglaucina ai nutrienti macromolecolari effettivi come i carboidrati, che vengono assorbiti attraverso lo strato intestinale. La permeabilità intestinale di C. elegans alimentati con erioglaucine disodium (colorante Puffo blu) può essere facilmente valutata senza microscopia a fluorescenza. Tuttavia, nel saggio Puffo, l'analisi quantitativa della permeabilità intestinale è difficile a causa della mancanza di standardizzazione e dovrebbe essere valutata manualmente4,5. Nel caso del saggio rosso del Nilo, il rosso del Nilo macchia anche le goccioline lipidiche nelle cellule, che possono interferire con l'esatta determinazione della permeabilità intestinale in C. elegans6. I protocolli attuali consentono un'analisi quantitativa rapida e precisa della permeabilità intestinale in C. elegans trattati con vari batteri intestinali e sostanze chimiche evitando la colorazione lipidica non specifica.
C. elegans è un modello tipico nei campi biologici grazie al suo prezzo accessibile, alla facilità di manipolazione, alle limitate questioni etiche degli animali e alla breve durata della vita, che è vantaggioso per una rapida sperimentazione7. In particolare, dopo la pubblicazione dell'intero genoma di C. elegans, quasi il 40% dei geni nel genoma di C. elegans è risultato ortologo dei geni che causano malattie umane8. Inoltre, il corpo trasparente consente l'osservazione all'interno dell'organismo, che è vantaggioso per la ricerca di eventi cellulari e per le applicazioni di fluorescenza nella biologia cellulare, ad esempio, colorazione delle cellule staminali con DAPI o immunohistochimica9. C. elegans è spesso usato come animale sperimentale per studiare l'interazione tra il microbiota intestinale e l'ospite; inoltre, C. elegans viene utilizzato per lo screening dei batteri probiotici che promuovono la salute10,11,12 così come sostanze chimiche dietetiche promuovere la salute intestinale13,14.
Pseudomonas aeruginosa e Enterococcus faecalis sono batteri intestinali ben noti che influenzano negativamente il sistema gastrointestinale, in particolare le cellule epiteliali coloniche del tratto intestinale15,16. Pertanto, misurare la permeabilità intestinale innescata da questi batteri è necessario per lo screening e lo sviluppo di nuovi farmaci che possono recuperare e ridurre i danni causati da infiammazione batterica e infezione. In questo protocollo, abbiamo testato gli effetti di questi batteri intestinali sulla permeabilità intestinale di C. elegans.
Riportiamo anche un protocollo ottimizzato per testare sostanze chimiche sulla permeabilità intestinale di C. elegans. A questo scopo, abbiamo usato 3,3'-diindolylmethane (DIM) come prodotto chimico modello perché DIM è un composto di metabolita bioattivo derivato da indole-3-carbinolo, che è presente nelle piante alimentari Brassica, ed è stato segnalato per avere effetti terapeutici sull'IBD nei topi17,18. Inoltre, recentemente abbiamo scoperto che DIM migliora la disfunzione della permeabilità intestinale in entrambe le cellule intestinali umane coltivate, così come il modello nematode C. elegans19.
In questo studio, abbiamo usato tre diverse condizioni sperimentali. In primo luogo, abbiamo misurato gli effetti dei diversi batteri, P. aeruginosa ed E. faecalis, sulla permeabilità intestinale (Figura 1). In secondo luogo, abbiamo misurato gli effetti di P. aeruginosa vivo e inattivato dal calore sulla permeabilità intestinale (Figura 2). In terzo luogo, abbiamo misurato gli effetti del DIM (un modello chimico) sulla permeabilità intestinale di C. elegans alimentati con P. aeruginosa (Figura 3).
L'obiettivo di questo studio era quello di sviluppare protocolli ottimizzati che misurano la permeabilità intestinale di C. elegans, che viene modificata dal trattamento con vari batteri intestinali e con sostanze chimiche.
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Protocol
1. Preparazione di P. aeruginosa PAO1 e Escherichia coli OP50 Cultura
- Preparare 500 mL di Luria-Bertani (LB) medio sterilizzato (Tabella 1) e inoculare una singola colonia di P. aeruginosa nel mezzo. Incubare la coltura per 14 a 15 h a 37 gradi centigradi con una velocità di agitazione di 150 giri/min.
- Distribuisci equamente la coltura batterica in due tubi centrifugati da 500 mL e centrifiche i tubi a 3.220 x g a 4 gradi centigradi per 30 min.
- Rimuovere il supernatante fino a quando il volume è di 50 mL (un decimo del volume iniziale) e risospendere il pellet batterico.
- Conservare la coltura batterica concentrata a 4 gradi centigradi fino all'uso. Il periodo di conservazione della coltura P. aeruginosa può essere fino a 1 mese, ma la cultura fresca è meglio per indurre danni intestinali.
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Oltre ai batteri vivi di tutti, il supernatante della coltura batterica può essere utilizzato per testare gli effetti dei batteri intestinali19. - Per preparare E. coli OP50, coltura E. coli OP50 in media DYT (Tabella 1) e quindi applicare passaggi simili a quelli descritti sopra, ma diminuire il volume a un sesto del volume originale. Ad esempio, se il volume iniziale è 500 mL, dopo la rimozione di supernatali, il volume rimanente è di circa 83 mL.
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. Preparazione di Enterococcus faecalis KCTC 3206 Cultura
- Preparare 500 mL di infusione sterile di cuore cerebrale (BHI) brodo(Tabella 1).
- Inoculare una colonia in 500 mL di brodo BHI e incubare la coltura per 14-15 h in un'incubatrice tremante a 37 e 150 giri/m.
- Distribuisci equamente la coltura batterica in due tubi centrifugati da 500 mL e centrifiche i tubi a 3.220 x g a 4 gradi centigradi per 30 min.
- Rimuovere il supernatante fino a quando il volume è di 50 mL (un decimo del volume iniziale) e risospendere il pellet.
- Conservare la coltura batterica concentrata a 4 gradi centigradi fino all'uso. La nuova coltura è migliore per testare gli effetti sulla permeabilità intestinale.
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
3. Preparazione di colture E. coli OP50 e P. aeruginosa PAO1 inattivate dal calore
- Coltura e raccolta dei batteri come descritto sopra (passaggi da 1.1 a 1,3).
- Heat-inattivare la coltura E. coli OP50 o P. aeruginosa PAO1 come descritto in precedenza20,21,22. Per l'inattivazione del calore, incubare i batteri risospesi a 65 gradi centigradi (bagno d'acqua) per 30 minuti.
- Raffreddare la coltura batterica concentrata a temperatura ambiente e conservarla a 4 gradi centigradi fino all'uso. Il periodo di conservazione può essere fino a 1 mese.
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
4. Preparazione di Nematode Growth Medium (NGM) Piastre per testare gli effetti di diversi batteri sulla permeabilità intestinale di C. elegans
- Mettere 1,25 g di peptone, 1,5 g di NaCl, 8,5 g di agar, un stirrer magnetico e 487,5 mL di acqua distillata in una bottiglia di vetro da 500 mL (Tabella 1).
- Mescolare bene la miscela, autoclave la miscela per 15 min a 121 gradi centigradi e raffreddare il composto a 55 gradi centigradi in un bagno d'acqua per 30 min.
- Rimuovere il mezzo dal bagno d'acqua, aggiungere i componenti (0,5 mL di 1 M CaCl2, 0,5 mL di colesterolo, 0,5 mL di MgSO4, 12,5 mL di KPO4) (Tabella 1) al NGM, e mescolare bene.
NOT: Tutti i singoli componenti devono essere autoclati ad eccezione del colesterolo (sciolto in etanolo assoluto), e ogni passo sperimentale deve essere effettuato su una panca pulita. - Distribuire 20 mL di NGM a ogni piatto Petri 90 x 15 mm e lasciare che l'agar si solidifichi su una panca pulita a temperatura ambiente (circa 20 gradi centigradi). Le piastre NGM possono essere conservate fino a un mese a 4 gradi centigradi.
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Le piastre NGM utilizzate per la colorazione FITC-dextran sono state preparate con la stessa procedura (dai passi 4.1–4.3). 10 mL di NGM è stato distribuito a ogni piatto Petri da 60 x 15 mm e ha permesso di solidificare su una panca pulita a temperatura ambiente (circa 20 gradi centigradi). - Togliere accuratamente la coltura batterica dal frigorifero a 4 gradi centigradi e vortice la coltura prima di diffonderla sulle placche NGM.
- Aggiungete un totale di 800 gradi della coltura batterica a ciascuna piastra NGM fresca e lasciate asciugare le piastre in un'incubatrice di 20 gradi centigradi durante la notte.
NOT: Per il primo esperimento (Figura 1), sono state preparate due piastre NGM con E. coli OP50, una piastra NGM con P. aeruginosa PAO1 e una piastra NGM con E. faecalis KCTC3206. Per il secondo esperimento (Figura 2), sono state preparate due placche NGM con E. coli OP50 dal vivo, una piastra NGM con P. aeruginosa PAO1 dal vivo e una piastra NGM con P. aeruginosa PAO1 inattivata dal calore.
5. Preparazione di piastre NGM per testare gli effetti di una sostanza chimica (DIM) sulla permeabilità intestinale della Fed C. elegans con P. aeruginosa
- Aggiungere 0,5 g di peptone, 0,6 g di NaCl, 195 mL di acqua distillata, un agitatore magnetico e 6,8 g di agar a una bottiglia di vetro da 500 mL (agar NGM).
- Aggiungere 0,5 g di peptone, 0,6 g di NaCl, 195 mL di acqua distillata e un agitatore magnetico senza agar a un'altra bottiglia di vetro da 500 ml (brodo NGM).
- Autoclave le due bottiglie (da passi 5.1–5.2), una bottiglia di vetro vuota 100 mL e una bottiglia di vetro vuota da 500 mL per 15 min a 121 gradi centigradi. Quindi, lasciare raffreddare il mezzo contenente bottiglie a 55 gradi centigradi nel bagno dell'acqua per 30 min.
- Aggiungere le sostanze chimiche additive al brodo NGM: 0,4 mL di 1 M CaCl2, 0,4 mL di colesterolo in etanolo (mL), 0,4 mL di 1 M MgSO4 e 10 mL di 1 M KPO4 (tutti questi componenti devono essere sterilizzati a parte il colesterolo nell'etanolo). Quindi, mescolare accuratamente il composto con un miscugliere magnetico a 55 gradi centigradi.
- Etichettare la bottiglia di vetro vuota da 500 mL autoclaved con il solforo dimetile (DMSO) e la bottiglia di vetro vuota da 100 mL autoclava con DIM.
- Trasferire 50 mL di brodo NGM nella bottiglia DA 100 mL con etichetta DIM. Aggiungere nella bottiglia 500 l di 20 mM di brodo DIM e mescolare bene.
NOT: DIM viene disciolto in DMSO (20 mM di azioni DIM). - Rimuovere rapidamente il supporto di agar NGM dal bagno d'acqua, aggiungere 50 mL del mezzo agar NGM nella bottiglia con etichetta di DIM e mescolare accuratamente.
- Mettere una gamma di 20 mL di supporto NGM contenente DIM in ogni piatto Petri da 90 mm x 15 mm. Da questo passaggio possono essere realizzate circa cinque lastre NGM contenenti DIM.
NOT: La concentrazione finale di DIM in ogni piastra NGM sarà di 100 M. - Per preparare la piastra NGM contenente DMSO, trasferire 150 mL di brodo NGM nella bottiglia DMSO-labeled 500 mL. Aggiungere 1,5 mL di DMSO alla bottiglia e mescolare bene.
- Aggiungere 150 mL del supporto NGM agar alla bottiglia con etichetta DMSO e mescolare accuratamente.
- Mettere una aliquota di 20 mL di supporto NGM contenente DMSO in ogni piatto Petri da 90 mm x 15 mm. Da questo passaggio possono essere realizzate circa quindici lastre NGM contenenti DMSO.
NOT: La concentrazione finale di DMSO in ogni piastra NGM sarà dello 0,5%. - Solidificare le piastre a temperatura ambiente per almeno 3 h e conservarle a 4 gradi centigradi fino all'uso.
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. - Togliere la coltura E. coli OP50 o P. aeruginosa PAO1 dal frigorifero 4 sC (dal punto 1.4) e vorticare correttamente la coltura prima di diffondersi sulle piastre NGM.
- Mettete 800 l dell'E. coli OP50 o P. aeruginosa PAO1 sulla piastra di agar NGM fresca e lasciate asciugare le piastre in un'incubatrice di 20 gradi centigradi durante la notte.
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Per il terzo esperimento (Figura 3),sono state preparate due lastre NGM contenenti DMSO rivestite con E. coli OP50 dal vivo, una piastra NGM contenente DMSO rivestita con P. aeruginosa PAO1 dal vivo e una piastra NGM contenente DIM rivestita con P. aeruginosa PAO1 dal vivo.
6. Preparazione di C. elegans sincronizzati in base all'età
- Coltiva i vermi su una piastra SOLIDA NGM e nutrili con E. coli OP50 fino a raggiungere la popolazione desiderata.
- Sincronizzare le uova utilizzando il metodo di deposizione delle uova a tempo o il trattamento della soluzione di sbiancamento come descritto in precedenza20,23,24.
7. Trattamento di batteri o DIM e FITC-dextran Alimentazione
- Incubare le uova sincronizzate per età a 20 gradi centigradi per 64 h su piastre NGM integrate con E. coli OP50 vivo come alimento.
- Lavare la larva L4 sincronizzata in base all'età con S-buffer e trasferirle (più di circa 500 vermi) alle piastre NGM di trattamento contenenti diversi batteri e sostanze chimiche (descritte nella NOTA dopo i passaggi 4.6 e 5.14,). Incubarli a 20 gradi centigradi per 48 ore.
NOT: Il tempo di trattamento può variare da 24 a 72 h, secondo i batteri e le sostanze chimiche utilizzate. L'effetto terapeutico o preventivo di DIM può anche essere valutato pretrattando i vermi con agenti patogeni e quindi trattando i vermi con DIM (l'effetto terapeutico) o pretrattando i vermi con DIM e quindi trattando con agenti patogeni (l'effetto preventivo)19. - Per preparare le piastre integrate FITC-dextran, mescolare 2 mL di E. coli OP50 inattivati dal calore con 4 mg di FITC-dextran. Quindi dividete 100 l del FITC-dextran e della miscela E. coli OP50 in venti piastre di agar NGM fresche (60 mm x 15 mm) e lasciate asciugare le piastre per 1 h su una panca pulita.
NOT: La concentrazione finale di FITC-dextran in ogni piastra NGM sarà di 20 g/mL. - Preparare cinque piastre NGM contenenti E. coli OP50 senza FITC-dextran per il trattamento di controllo del veicolo. A tale scopo, dividere 100 gradi di e. caldo inattivato E. coli OP50 per ogni piastre di agar NGM fresche (60 mm x 15 mm) e lasciare che le piastre si asciughino per 1 h su una panca pulita.
NOT: Per ogni esperimento indipendente, sono necessarie quindici piastre NGM integrate in FITC e cinque piastre NGM senza FITC-dextran. - Dopo 48 h di trattamento (dal punto 7.2), lavare i vermi con S-buffer, trasferire i vermi alle piastre integrate FITC-dextran e alle piastre NGM senza FITC-dextran e incubare le piastre durante la notte (14-15 h).
NOT: Per ogni gruppo di trattamento, sono necessarie 5 repliche di colorazione FITC-dextran (o alimentazione di controllo del veicolo). - Lavare i vermi con S-buffer e lasciarli strisciare nella piastra di agar NGM fresca per 1 h.
NOT: Per ogni esperimento indipendente, sono necessarie un totale di 20 piastre NGM fresche. In questo passaggio, è possibile utilizzare la piastra NGM integrata senza o con E. coli OP50. - Aggiungere 50 l di 4% soluzione di formaldeide ad ogni pozzetto di una piastra nera da 96 piani. Trasferire circa 50 vermi da ogni piastra NGM in ogni pozzo per le misurazioni della fluorescenza. Dopo 1 o 2 min, rimuovere accuratamente tutta la formaldeide da ogni pozzo e aggiungere 100 l di mezzo di montaggio per rivestire i pozzi.
NOT: Soluzione di formaldeide (4%) viene utilizzato per immobilizzare e fissare i vermi. Per ogni gruppo di trattamento, 5 pozze (5 repliche) vengono utilizzati per l'analisi delle immagini.
8. Imaging C. elegans con il sistema di imaging Operetta e determinazione della permeabilità intestinale misurando l'assorbimento della fluorescenza FITC-dextran
NOT: La stereomicroscopia fluorescente può essere utilizzata per l'analisi delle immagini al posto del sistema Operetta.
- Acquisire immagini a fluorescenza e misurare l'intensità della fluorescenza utilizzando il sistema di imaging ad alto contenuto di Operetta e analizzare le immagini con il software Harmony.
- Nel software Harmony, premere l'icona Apri coperchio per aprire il coperchio e mettere la piastra nella macchina.
- Impostare i parametri.
- Fare clic su Imposta, selezionare il tipo di piastra (96-po corning in basso) e aggiungere i canali (canali a campo luminoso e EGFP).
- Regolare il layout. Vai alla selezione Layout, quindi seleziona Traccia e regola i parametri (prima immagine a 1 m, il numero di piani è 10, la distanza è di 1 m).
- Selezionare uno dei pozzi di trattamento e un campo di acquisizione e premere Test per verificare se le immagini sono soddisfacenti nella sezione Esegui esperimento.
- Se le immagini sono soddisfacenti, tornare alla sezione Configura e premere l'icona Ripristina alla fine dello schermo. Quindi, selezionare tutti i pozze di destinazione e un numero adeguato di campi di acquisizione.
- Vai a Esegui di nuovo l'esperimento e inserisci il nome della targa, quindi premi Avvia per iniziare l'elaborazione.
- Per misurare l'intensità della fluorescenza, vai alla sezione di analisi dell'immagine e inserisci l'immagine. Trovare la cella scegliendo il canale EGFP e il metodo B. Regolare la soglia comune a 0,5, l'area in >200 m2, il fattore di divisione a 3,0, la soglia individuale a 0,18 e il contrasto a più di 0,18. Quindi, calcolare le proprietà di intensità e scegliere la media come output. Premere l'icona Applica per salvare la configurazione.
- Passare alla sezione Valutazione per misurare l'intensità ottenendo una mappa termica e una tabella dati. Impostare il parametro Readout su Cells (Intensy Cell EGFP Mean) - Media per Pozzo e avviare la valutazione.
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. - Per estrarre i dati da Operetta, fare clic sul pulsante Impostazione e scegliere Gestione dati.
- Scegliere Scrivi archivio, quindi aprire la finestra di dialogo E selezionare il file.
- Per selezionare il file, fare clic sul piccolo segnale , nell'angolo sinistro, quindi fare clic su Misura e scegliere Nome piastra.
- Selezionare il file e fare clic su OK.
- Selezionare il percorso in cui salvare il file facendo clic sul segnale Sfoglia nel percorso attivo.
- Fare clic su Avvia per salvare il file di dati.
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
9. Analisi statistica della fluorescenza FITC-dextran di C. elegans
- Importare i dati e calcolare la media e la deviazione standard (SD) utilizzando un software di statistiche.
- Analizzare la differenza significativa con l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dal test di confronto multiplo di Tukey.
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Representative Results
Dopo l'incubazione con P. aeruginosa PAO1, C. elegans ha mostrato un aumento significativo della fluorescenza FITC-dextran nel corpo del verme rispetto alla fluorescenza mostrata dopo l'incubazione con gli altri due ceppi batterici (Figura 1). Le intensità di fluorescenza dei vermi alimentati con E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 e E. faecalis KCTC3206 erano rispettivamente 100.0 6.6, 369,7 x 38,9, e 105,6 - 10,6%. I dati sottolineano che P. aeruginosa ha causato danni più vitali alla barriera intestinale epiteliale, e quindi, i vermi hanno mostrato un drammatico aumento della loro permeabilità intestinale. Sulla base di questo risultato, FITC-dextran può facilmente penetrare attraverso lo strato intestinale, quindi P. aeruginosa è stato selezionato come potenziale agente patogeno candidato per lo screening degli effetti del DIM. Anche se E. faecalis è un patogeno intestinale in grado di produrre superossido extracellulare e perossido di idrogeno, che danneggiano il DNA delle cellule epiteliali coloniche15, in alcuni casi, E. faecalis è anche conosciuto come un potenziale batterio probiotico a causa della sua capacità di produrre battericine contro alcuni patogeni25,26. Le funzioni di un probiotico includono l'aderenza alle superfici epiteliali, persistenza nel tratto gastrointestinale umano, stimolazione immunitaria e attività antagonista contro agenti patogeni intestinali26. Pertanto, la permeabilità intestinale dei vermi incubati con E. Faecalis è rimasta invariata rispetto a quella dei vermi di controllo del veicolo. Questo risultato mostra che la quantità dell'infezione può essere studiata dall'aumento dell'intensità della fluorescenza, e P. aeruginosa provoca più permeabilità intestinale rispetto ad altri ceppi.
La figura 2 mostra la differenza tra P. aeruginosa PAO1 dal vivo e inattivo dal calore in base all'intensità della fluorescenza FITC-dextran nel corpo del verme. Sia le immagini a fluorescenza che i dati statistici indicano che l'agente patogeno non poteva attivare alcuna tossicità per i nematodi dopo l'inattivazione del calore. P. aeruginosa può produrre esotossina A - una potente citotossina extracellulare che è letale per molti animali27. L'esotossina A può essere rapidamente abolita riscaldandoa 45 gradi centigradi a 60 . Pertanto, P. aeruginosa inattivata dal calore non è stato in grado di danneggiare la permeabilità dell'epitelia intestinale dei vermi. Il supernatante della coltura P. aeruginosa PAO1 ha danneggiato significativamente la permeabilità intestinale, e quindi, il supernatante di coltura invece di intere cellule P. aeruginosa può essere utilizzato per indurre la disfunzione di permeabilità intestinale19. Il supernatante contiene endotossine, esotossina A e lipopolysaccharides29, e questi componenti sono noti per indurre tossicità cellulare30,31. Pertanto, questi componenti della supernata possono influenzare la permeabilità intestinale, anche se non abbiamo controllato l'effetto diretto di esotossine e lipopolissaccharides sulla permeabilità intestinale in C. elegans.
Il cotrattamento DIM per 48 h ha ridotto significativamente l'intensità della fluorescenza FITC-dextran all'interno delle viscere dei vermi rispetto al trattamento singolo P. aeruginosa (Figura 3C,D). L'analisi statistica per test di confronto multiplo di ANOVA e Tukey ha mostrato che dopo il trattamento con DIM, l'intensità media della fluorescenza è stata significativamente diminuita rispetto all'intensità di fluorescenza del trattamento solo P. aeruginosa. Le intensità di fluorescenza dei vermi trattati con P. aeruginosa-only e P. aeruginosa più DIM erano rispettivamente 486,3 , 41,7 e 414,2 25,0% (Figura 3E). Sulla base di questo risultato, DIM può essere considerato un buon prodotto naturale per curare la disfunzione di permeabilità intestinale causata da infezioni batteriche. Questo risultato ha indicato che DIM può attenuare l'infiammazione cellulare nelle cellule intestinali, che riduce la permeabilità dell'intestino19. Questo risultato è simile ai risultati ottenuti in un modello di topo, in cui DIM ha mostrato una significativa riduzione dell'infiammazione nel colon32.
Figura 1: Gli effetti di diversi batteri sulla permeabilità intestinale di C. elegans. Microscopia immagini dei vermi, tra cui campo luminoso, fluorescenza FITC (canale verde) e immagini unite. Foto microscopiche di vermi da (A) E. coli OP50 senza alimentazione FITC-dextran, (B) E. coli con alimentazione FITC-dextran, (C) P. aeruginosa PAO1 con alimentazione FITC-dextran, e (D ) E. faecalis KCTC3206 con alimentazione FITC-dextran. Barra della scala: 1 mm (bianco) e 200 m (nero). Le larve L4 sincronizzate con età sono state incubate per 48 h in piastre NGM seminate con E. coli (A, B), P. aeruginosa (C) ed E. faecalis (D). Quindi, i vermi sono stati trasferiti su piastre contenenti FITC-dextran (B-D), ad eccezione del controllo del veicolo (A). (E) L'intensità di fluorescenza FITC dei diversi trattamenti batterici. Una percentuale più alta di fluorescenza FITC ha indicato una maggiore permeabilità intestinale. Le colonne e le barre di errore indicano la differenza significativa rispetto al controllo del veicolo. Per differenze significative rispetto ai worm trattati con FITC-dextran, i vermi trattati con P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n - 5). Questo grafico è rappresentativo di due esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Gli effetti di P. aeruginosa PAO1 vivo e inattivato dal calore sulla permeabilità intestinale di C. elegans. Le immagini microscopiche dei vermi da (A) vivono E. coli OP50 senza alimentazione FITC-dextran, (B) vivono E. coli con alimentazione FITC-dextran, (C) P. aeruginosa PAO1 dal vivo con alimentazione FITC-dextran e (D)inattivato dal calore P. aeruginosa con alimentazione FITC-dextra. Barra della scala: 1 mm (bianco) e 200 m (nero). Le larve L4 sincronizzate con età sono state incubate per 48 h in piastre DI semi NGM con E. coli vivo (A, B), P. aeruginosa (C) e P. aeruginosa inattivata dal calore (D). Quindi, i vermi sono stati trasferiti su piastre contenenti FITC-dextran (B-D), ad eccezione del controllo del veicolo (A). (E) Intensità di fluorescenza FITC confrontando P. aeruginosa PAO1 vivo e inattivato dal calore. Le colonne e le barre di errore indicano la media : SD. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Per differenze significative rispetto ai worm trattati con FITC-dextran, i vermi trattati con FITC-dextran sono stati associati a P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n . 5). Questo grafico è rappresentativo di due esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'effetto di DIM sulla permeabilità intestinale di C. elegans alimentato P. aeruginosa. Foto microscopiche di vermi da (A) E. coli OP50 senza alimentazione FITC-dextran, (B) E. coli con alimentazione FITC-dextran, (C) P. aeruginosa PAO1 con alimentazione FITC-dextran, e (D) P. aeruginosa e DIM (100 m) cotreatmentdano con l'alimentazione FITC-dextra. Barra della scala: 1 mm (bianco) e 200 m (nero). Le larve L4 sincronizzate con età sono state incubate per 48 h in piastre NGM seminata con E. coli vivo (A, B), P. aeruginosa (C), vivo P. aeruginosa e DIM (D). Quindi, i vermi sono stati trasferiti su piastre contenenti FITC-dextran (B-D), ad eccezione del controllo del veicolo (A). (E) L'intensità della fluorescenza FITC indica che la permeabilità intestinale di C. elegans è stata influenzata da DIM. Le colonne e le barre di errore indicano la differenza significativa rispetto al controllo del veicolo. P< 0,001 eP < 0,01 per la differenza significativa rispetto ai worm trattati con FITC-dextran alimentati con P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n . 5). Questo grafico è rappresentativo di due esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Utilizzando questo nuovo metodo per determinare la permeabilità intestinale in C. elegans, che combina la microscopia a fluorescenza automatizzata e l'analisi quantitativa delle immagini, le differenze causate da microrganismi intestinali o sostanze chimiche possono essere determinate in vivo, in particolare nell'intestino di C. elegans. Questo protocollo è utile per le indagini sulla permeabilità intestinale e applicabile a molti compiti, come la determinazione reattiva delle specie di ossigeno (ROS) in condizioni di stress ed esami morfologici, a causa della sua convenienza e della sua facile manipolazione. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per determinare gli effetti dei metodi terapeutici e preventivi contro più patogeni in C. elegans. In particolare, può essere un protocollo efficiente per studiare i meccanismi di diversi ceppi batterici, compresi i batteri nocivi e utili. Alcuni patogeni e batteri probiotici con strutture simili esercitano effetti diversi sull'ospite33,34. Questa procedura può aiutare a valutare quale meccanismo i batteri stanno utilizzando e dove i substrati mirati possono essere secreti extracellulare o intracellulare. Inoltre, questo metodo può anche contribuire a rafforzare l'ipotesi che il trattamento termico svolge un ruolo vitale nell'inattivazione dell'agente patogeno.
Tuttavia, ci sono anche alcune difficoltà durante questa procedura. In primo luogo, il numero di vermi in ogni piastra è importante per i risultati statisticamente significativi e il rilevamento di tali vermi robusti, pertanto si raccomanda la confluenza del 70-90% (almeno 50 worm per pozzo). Di conseguenza, devono essere eseguiti esperimenti di prova per ottenere vermi adatti. In secondo luogo, le proprietà della piastra sono uno dei fattori importanti che influenzano la qualità delle immagini e la determinazione dell'intensità, in particolare per il materiale inferiore. In alcuni esperimenti avanzati, un fondo in vetro è l'opzione migliore per la misurazione della fluorescenza grazie alla sua eccellente qualità ottica. Tuttavia, a causa del prezzo elevato, viene spesso utilizzato un fondo in polistirolo, anche se la qualità non è così alta come quella del fondo di vetro. Infine, i metodi di rivestimento della piastra per C. elegans richiedono ottimizzazione. In questo esperimento, è stato applicato un supporto di montaggio fluorescente perché può preservare e migliorare l'etichettatura delle sezioni di tessuto, ma non è in grado di fissare correttamente i vermi sul fondo della piastra.
Questo protocollo ha dei limiti; poiché C. elegans è un nematode, dovrebbero essere eseguiti ulteriori esperimenti, come la valutazione nei monostrati delle cellule intestinali umane e nei mammiferi. In questo metodo, sono stati determinati i cambiamenti fenotipici in C. elegans alimentati da batteri patogeni e sostanze chimiche. Pertanto, i meccanismi molecolari e genetici alla base degli effetti patogeni o probiotici dei batteri intestinali, nonché gli effetti terapeutici delle sostanze chimiche dovrebbero essere ulteriormente chiariti. Percorsi di segnalazione specifici esercitati dall'infezione batterica patogena e dagli effetti terapeutici delle sostanze chimiche possono essere valutati utilizzando sia vari batteri mutanti che vermi mutanti. Inoltre, ulteriori studi approfonditi che identificano i componenti chimici responsabili degli effetti patogeni e probiotici dei batteri intestinali sarebbe utile.
Qui, riportiamo un protocollo sperimentale per misurare la permeabilità intestinale in C. elegans trattati con diversi batteri e sostanze chimiche utilizzando l'alimentazione FITC-dextran. Crediamo che questi protocolli saranno utili per la ricerca biologica di base, come lo studio dell'interazione tra il microbiota intestinale e la salute intestinale, così come per lo sviluppo di probiotici e nutraceutici per la prevenzione e il trattamento dei problemi di salute intestinale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione di ricerca intramurale dell'Istituto coreano di scienza e tecnologia (2E29563).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate - dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
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