Summary
Denne protokollen beskriver hvordan du kan måle intestinal permeabilitet av Caenorhabditis elegans. Denne metoden er nyttig for grunnleggende biologisk forskning på intestinal helse relatert til samspillet mellom tarmbakterier og deres vert og for screening for å identifisere probiotiske og kjemiske agenter for å kurere leaky gut syndrom og inflammatoriske tarm sykdommer.
Abstract
I levende organismer, intestinal hyperpermeability er et alvorlig symptom som fører til mange inflammatoriske tarm sykdommer (IBDs). Caenorhabditis elegans er en nonmammalian dyr modell som er mye brukt som et analysesystem på grunn av sin korte levetid, åpenhet, kostnadseffektivitet, og mangel på dyreetikk problemer. I denne studien ble en metode utviklet for å undersøke virkningene av ulike bakterier og 3, 3 '-diindolylmethane (DIM) på intestinal permeabilitet av C. elegans med høy gjennomstrømming bildeanalyse system. Ormene var infisert med annerledes tarmen bacteria eller cotreated med svak for 48 h og matet med fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran overnight. Deretter intestinal permeabilitet ble undersøkt ved å sammenligne fluorescens bilder og fluorescens intensitet inne i ormen organer. Denne metoden kan også ha potensial til å identifisere probiotiske og patogene tarmbakterier som påvirker intestinal permeabilitet i dyre modellen og er effektiv for å undersøke virkningene av skadelige eller helsefremmende kjemikalier på intestinal permeabilitet og intestinal helse. Imidlertid har denne protokollen også noen betydelige begrensninger på genetisk nivå, spesielt for å bestemme hvilke gener er endret for å kontrollere sykdom, fordi denne metoden er mest brukt for fenotypiske besluttsomhet. I tillegg er denne metoden begrenset til å bestemme nøyaktig hvilke patogene underlag forårsake betennelse eller øke permeabilitet av ormene tarmen under infeksjon. Derfor, ytterligere grundige studier, inkludert undersøkelse av den molekylære genetiske mekanismen ved hjelp av mutant bakterier og nematoder samt kjemiske komponent analyse av bakterier, er pålagt å fullt ut evaluere funksjonen av bakterier og kjemikalier for å bestemme intestinal permeabilitet.
Introduction
Intestinal permeabilitet regnes som en av de viktigste barrierene knyttet til intestinal bakterieflora og slimhinne immunitet og vil trolig bli påvirket av flere faktorer, for eksempel gut bakterieflora modifikasjoner, epitel verdifall, eller mucus lag endringer1. Aktuelle papirer har rapportert effektive protokoller for å måle intestinal permeabilitet av kultivert menneskelige tarm celler ved å analysere fluorescens Flux priser på tvers av intestinal celle lag2, men færre forskningsartikler presentere en passende prosedyre for å måle tarmen permeabilitet i nematoder, spesielt i C. elegans, ved hjelp av FITC-dextran farging.
Det er to representative protokoller for å måle tarmen permeabilitet i C. elegans bruke Nile Red3 og erioglaucine Disodium (eller Smurf analysen)4,5. I denne protokollen, brukte vi FITC-dextran (gjennomsnittlig molekylvekt 10 000), som har en mye høyere molekylvekt enn Nilen rød (MW = 318,37) og erioglaucine Disodium (MW = 792,85). FITC-dextran er mer likt enn Nilen rød eller erioglaucine Disodium fargestoffer til faktiske makro molekylære næringsstoffer som karbohydrater, som absorberes gjennom intestinal laget. Intestinal permeabilitet av C. elegans matet med erioglaucine Disodium (blå Smurf fargestoff) kan lett evalueres uten fluorescens mikroskopi. Men i Smurf analysen, kvantitativ analyse av intestinal permeabilitet er vanskelig på grunn av mangel på standardisering og bør evalueres manuelt4,5. I tilfelle av Nilen rød analysen, Nilen rød også flekker lipid dråper i celler, noe som kan forstyrre den nøyaktige bestemmelse av gut permeabilitet i C. elegans6. Den nåværende protokoller muliggjør rask og presis kvantitativ analyse av intestinal permeabilitet i C. elegans behandlet med ulike tarmbakterier og kjemikalier samtidig unngå løs lipid farging.
C. elegans er en typisk modell i biologiske felt på grunn av sin rimelige pris, enkel manipulasjon, begrenset dyreetikk problemer, og kortlevetid, noe som er gunstig for rask eksperimentering7. Spesielt etter hele C. elegans Genova ble publisert, nesten 40% av gener i C. elegans Genova ble funnet å være orthologous til gener som forårsaker menneskelige sykdommer8. Videre gjør den gjennomsiktige kroppen observasjon inne i organismen, noe som er fordelaktig for forsker på cellulære hendelser og for fluorescens anvendelser i cellebiologi, for eksempel Stamcelle farging med DAPI eller immunhistokjemi9. C. elegans blir ofte brukt som et eksperimentelt dyr for å studere samspillet mellom tarmen bakterieflora og verten; i tillegg er C. krystalldekorNS brukes til skjermen helsefremmende probiotiske bakterier10,11,12 samt kosttilskudd kjemikalier fremme intestinal helse13,14.
Pseudomonas aeruginosa og Enterococcus faecalis er velkjente gut bakterier som negativt påvirker fordøyelsessystemet, spesielt de colonic epitelceller i tarmkanalen15,16. Derfor, måle tarmen permeabilitet utløst av disse bakteriene er nødvendig for screening og utvikling av nye legemidler som kan gjenopprette og redusere skadene forårsaket av bakteriell betennelse og infeksjon. I denne protokollen, testet vi effekten av disse tarm bakteriene på intestinal permeabilitet av C. elegans.
Vi rapporterer også en optimalisert protokoll for testing kjemikalier på intestinal permeabilitet av C. elegans. For dette formålet, brukte vi 3, 3 '-diindolylmethane (Dim) som en modell kjemisk fordi Dim er en bioaktive metabolitten sammensatte avledet fra indol-3-carbinol, som er til stede i Brassica mat planter, og har blitt rapportert å ha terapeutiske effekter på IBD i mus17,18. I tillegg har vi nylig oppdaget at DIM forbedrer intestinal permeabilitet dysfunksjon i både kultivert menneskelige tarm celler så vel som modellen nematode C. elegans19.
I denne studien, brukte vi tre ulike eksperimentelle forhold. Først målte vi virkningene av de ulike bakteriene, P. aeruginosa og E. faecalis, på intestinal permeabilitet (figur 1). For det andre målte vi effekten av levende og varme-deaktivert P. aeruginosa på intestinal permeabilitet (figur 2). For det tredje målte vi effekten av DIM (en modell kjemisk) på intestinal permeabilitet av C. elegans matet med P. aeruginosa (Figur 3).
Målet med denne studien var å utvikle optimaliserte protokoller som måler intestinal permeabilitet av C. elegans, som er endret ved behandling med ulike tarmbakterier så vel som med kjemikalier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av P. aeruginosa PAO1 og Escherichia coli OP50 kultur
- Forbered 500 mL sterilisert Luria-Bertani (LB) medium (tabell 1) og vaksinere en enkelt koloni av P. aeruginosa inn i mediet. Ruge kulturen i 14 til 15 timer ved 37 ° c med en risting hastighet på 150 RPM.
- Fordel jevnt den bakterielle kulturen i 2 500 mL sentrifugerør og sentrifuger rørene ved 3 220 x g ved 4 ° c i 30 min.
- Fjern supernatanten til volumet er 50 mL (en tiendedel av det første volumet) og resuspend bakteriell pellet.
- Oppbevar den konsentrerte bakterie kulturen ved 4 ° c til den brukes. Lagringsperioden av P. aeruginosa kulturen kan være opp til 1 måned, men fersk kultur er bedre for inducing intestinal skade.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her. Foruten det hele bo bacteria, supernatanten av det bakteriell kulturen kan brukes å test effektene av det intestinal bacteria19. - For å forberede E. coli OP50, kultur E. COLI OP50 i DYT medium (tabell 1) og deretter bruke lignende fremgangsmåte for de som er beskrevet ovenfor, men redusere volumet til en sjette av det opprinnelige volumet. For eksempel, hvis det opprinnelige volumet er 500 mL, etter å ha fjernet supernatanten, er det gjenværende volumet ca. 83 mL.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her.
2. utarbeidelse av Enterococcus faecalis KCTC 3206 kultur
- Forbered 500 mL sterilisert hjerne hjerte infusjon (BHI) buljong (tabell 1).
- Vaksinere en koloni inn i 500 mL BHI buljong og ruge kulturen i 14 – 15 timer i en risting inkubator ved 37 ° c og 150 RPM.
- Fordel jevnt den bakterielle kulturen i 2 500 mL sentrifugerør og sentrifuger rørene ved 3 220 x g ved 4 ° c i 30 min.
- Fjern supernatanten til volumet er 50 mL (en tiendedel av det opprinnelige volumet) og resuspend pellet.
- Oppbevar den konsentrerte bakterie kulturen ved 4 ° c til den brukes. Den friske kulturen er bedre for å teste effektene på intestinal permeabilitet.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her.
3. utarbeidelse av varme-deaktivert E. coli OP50 og varme-deaktivert P. aeruginosa PAO1 kulturer
- Kultur og høste bakteriene som beskrevet ovenfor (trinn 1.1-1.3).
- Heat-deaktivere E. coli OP50 eller P. aeruginosa PAO1 kultur som beskrevet tidligere20,21,22. For varme deaktivering, ruge resuspendert bakterier ved 65 ° c (vannbad) i 30 min.
- Avkjøl konsentrert bakteriell kultur til romtemperatur og oppbevar den ved 4 ° c til bruk. Lagringsperioden kan være opptil 1 måned.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her.
4. utarbeidelse av nematode vekst medium (NGM) plater for testing av effekter av ulike bakterier på intestinal permeabilitet av C. elegans
- Plasser 1,25 g peptone, 1,5 g av NaCl, 8,5 g agar, en magnetisk stirrer og 487,5 mL destillert vann i en 500 mL glass flaske (tabell 1).
- Bland blandingen godt, autoklav blandingen i 15 min ved 121 ° c og Avkjøl blandingen til 55 ° c i et vannbad i 30 min.
- Fjern mediet fra vannbadet, tilsett komponentene (0,5 mL 1 M CaCl2, 0,5 ml kolesterol, 0,5 ml MgSO4, 12,5 ml KPO4) (tabell 1) til NGM, og bland godt.
Merk: Alle de enkelte komponentene må være autoklaveres unntatt kolesterol (oppløst i absolutt etanol), og alle eksperimentelle skritt må utføres på en ren benk. - Fordel 20 mL NGM til hver 90 x 15 mm Petri rett og la agar å stivne på en ren benk ved romtemperatur (ca. 20 ° c). NGM-platene kan oppbevares i opptil en måned ved 4 ° c.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her. NGM-platene som brukes for FITC-dextran farging ble fremstilt ved samme prosedyre (fra trinn 4.1 – 4.3). 10 mL NGM ble distribuert til hver 60 x 15 mm Petri parabol og lov til å stivne på en ren benk ved romtemperatur (ca. 20 ° c). - Fjern bakterie kulturen fra kjøleskapet på 4 ° c og Vortex kulturen grundig før du sprer kulturen til NGM-platene.
- Tilsett totalt 800 μL av bakterie kulturen i hver fersk NGM-plate, og la platene tørke i en 20 ° c inkubator over natten.
Merk: For det første eksperimentet (figur 1), to NGM plater med e. coli OP50, en NGM plate med P. AERUGINOSA PAO1, og en NGM plate med E. faecalis KCTC3206 ble forberedt. For det andre eksperimentet (figur 2), to NGM plater med live E. coli OP50, en NGM plate med live p. AERUGINOSA PAO1, og en NGM plate med varme-deaktivert P. aeruginosa PAO1 ble forberedt.
5. utarbeidelse av NGM plater for testing virkningene av en kjemisk (DIM) på intestinal permeabilitet av C. elegans matet med P. aeruginosa
- Tilsett 0,5 g peptone, 0,6 g NaCl, 195 mL destillert vann, en magnetisk rører, og 6,8 g av agar til en 500 mL glass flaske (NGM agar).
- Tilsett 0,5 g peptone, 0,6 g NaCl, 195 mL destillert vann, og en magnetisk stirrer uten agar til en annen 500 mL glass flaske (NGM buljong).
- Autoklav de to flaskene (fra trinn 5,1 – 5.2), en tom 100 mL glass flaske og en tom 500 mL glass flaske i 15 minutter ved 121 ° c. Deretter, la mediet som inneholder flasker avkjøles til 55 ° c i vannbadet i 30 min. Hold agar medium i vannbad og fjerne flasken inneholder kjøttkraft (fra trinn 5,2) for neste trinn.
- Tilsett tilsetningsstoffene i NGM buljong: 0,4 mL 1 M CaCl2, 0,4 ml kolesterol i etanol (ml), 0,4 ml 1 m MgSO4 og 10 ml 1 m KPO4 (alle disse komponentene må steriliseres bortsett fra kolesterol i etanol). Rør deretter blandingen grundig med en magnetisk rører ved 55 ° c.
- Merk autoklaveres tomme 500 mL glass flaske med dimethyl sulfoxide (DMSO) og autoklaveres tomme 100 mL glass flaske med DIM.
- Transfer 50 mL av NGM buljong inn i DIM-merket 100 mL flaske. Tilsett 500 μL av 20 mM DIM lager i flasken og bland godt.
Merk: DIM er oppløst i DMSO (20 mM DIM lager). - Raskt fjerne NGM agar medium fra vannbad, tilsett 50 mL av NGM agar medium i DIM-merket flasken og bland godt.
- Plasser en 20 mL alikvot av DIM inneholder NGM medium i hver 90 mm x 15 mm Petri parabolen. Omtrent fem DIM-inneholdende NGM plater kan gjøres fra dette trinnet.
Merk: Den endelige konsentrasjonen av DIM i hver NGM plate vil være 100 μM. - For å forberede DMSO-inneholdende NGM plate, overføring 150 mL av NGM buljong i DMSO-merket 500 mL flaske. Tilsett 1,5 mL av DMSO til flasken og bland godt.
- Tilsett 150 mL av NGM agar medium til DMSO-merket flasken og bland godt.
- Plasser en 20 mL alikvot av DMSO-inneholdende NGM-medium i hver 90 mm x 15 mm Petri-rett. Omtrent femten DMSO-inneholdende NGM plater kan gjøres fra dette trinnet.
Merk: Den endelige konsentrasjonen av DMSO i hver NGM plate vil være 0,5%. - Stivne platene i romtemperatur i minst 3 timer og oppbevar dem ved 4 ° c til bruk.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her. - Fjern E. coli OP50 eller P. aeruginosa PAO1-kulturen fra kjøleskapet på 4 ° c (fra trinn 1,4) og Vortex kulturen riktig før den sprer seg til NGM-platene.
- Sett 800 μL av E. coli OP50 eller P. aeruginosa PAO1 bakteriell kultur på hver fersk NGM agar plate og la platene tørke i en 20 ° c inkubator over natten.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her. For det tredje eksperimentet (Figur 3), to DMSO-inneholdende NGM plater belagt med live E. coli OP50, en DMSO-inneholdende NGM plate belagt med live P. AERUGINOSA PAO1, og en Dim inneholder NGM plate belagt med live P. aeruginosa PAO1 var forberedt.
6. utarbeidelse av Age-synkronisert C. elegans
- Dyrke ormer på en solid NGM plate og mate dem med E. coli OP50 inntil ønsket befolkning er nådd.
- Synkroniser eggene ved å bruke enten tidsbestemt egglegging metoden eller bleking løsning behandling som beskrevet tidligere20,23,24.
7. behandling av bakterier eller DIM og FITC-dextran fôring
- Ruge de alders synkroniserte eggene ved 20 ° c for 64 h på NGM-plater supplert med live E. coli OP50 som mat.
- Vask den alders synkroniserte L4-Larven med S-buffer og Overfør dem (mer enn ca. 500 ormer) til behandling NGM-platene som inneholder forskjellige bakterier og kjemikalier (beskrevet i Merk følgende trinn 4,6 og 5,14). Ruge dem ved 20 ° c for 48 h.
Merk: Behandlingstiden kan variere fra 24 til 72 h, i henhold til bakterier og kjemikalier som brukes. Den terapeutiske eller forebyggende effekten av DIM kan også evalueres ved pretreating ormene med patogener og deretter behandle ormer med DIM (den terapeutiske effekten) eller ved pretreating ormene med DIM og deretter behandle med patogener (den forebyggende effekt)19. - For å forberede FITC-dextran-supplert plater, bland 2 mL av varme-deaktivert E. coli OP50 med 4 mg FITC-dextran. Deretter deler 100 μL av FITC-dextran og E. coli OP50 blandingen i TJUE friske NGM agar plater (60 mm x 15 mm) og la platene tørke for 1 time på en ren benk.
Merk: Den endelige konsentrasjonen av FITC-dextran i hver NGM-plate vil være 20 μg/mL. - Forbered fem E. coli OP50-inneholdende NGM plater uten FITC-dextran for kjøretøyets kontroll behandling. For dette formålet, dividere 100 μL varme-deaktivert E. coli OP50 til hver fersk NGM agar plater (60 mm x 15 mm) og la platene tørke i 1 time på en ren benk.
Merk: For hvert uavhengige eksperiment er femten FITC-dextran-supplert NGM-plater og fem NGM-plater uten FITC-dextran nødvendig. - Etter 48 h av behandling (fra trinn 7,2), vaske ormer med S-buffer, overføre ormer til FITC-dextran supplert plater og NGM platene uten FITC-dextran, og ruge platene over natten (14 – 15 h).
Merk: For hver behandlingsgruppe er det nødvendig med 5 replikerer FITC-dextran farging (eller kjøretøy kontroll fôring). - Vask ormer med S-buffer og tillate dem å krype i den friske NGM agar plate for 1 t.
Merk: For hvert uavhengige eksperiment er det behov for totalt 20 friske NGM-plater. I dette trinnet, kan du bruke NGM plate supplert uten eller med E. coli OP50. - Tilsett 50 μL av 4% formaldehyd løsning på hver brønn av en svart 96-brønn flat bunnplate. Overfør ca 50 ormer fra hver NGM plate i hver brønn for fluorescens målinger. Etter 1 til 2 min, grundig fjerne alle formaldehyd fra hver brønn og tilsett 100 μL av montering medium til coat brønnene.
Merk: Formaldehyd løsning (4%) brukes til å nakkens og fikse ormer. For hver behandlingsgruppe brukes 5 brønner (5 replikerer) til bildeanalyse.
8. Imaging C. elegans med operette Imaging system og bestemmelse av intestinal permeabilitet ved å måle FITC-Dextran fluorescens opptak
Merk: Fluorescerende omikroskopi kan brukes til bildeanalyse i stedet for operette-systemet.
- Fang fluorescens bilder og mål fluorescens intensiteten ved hjelp av operette High-Content Imaging system og analyser bildene med Harmony-programvaren.
- I Harmony-programvaren, trykk på ikonet Åpne lokket for å åpne lokket og sette platen inn i maskinen.
- Definer parameterne.
- Klikk Oppsett, Velg platetype (96-brønn Corning flat-Bottom) og legge til kanaler (lyse felt og EGFP kanaler).
- Juster oppsettet. Gå til Oppsett valget, og velg deretter spor og Juster parametrene (første bilde ved 1 μm, antall fly er 10, avstanden er 1 μm).
- Velg ett av behandlings brønnene og ett opptaks felt, og trykk på test for å kontrollere om bildene er tilfredsstillende i delen for kjøring av eksperimentet .
- Hvis bildene er tilfredsstillende, går du tilbake til Oppsett -delen og trykker på reset -ikonet på slutten av skjermen. Deretter velger du alle mål brønnene og et passende antall opptaks felt.
- Gå til Kjør eksperimentet på nytt og skriv inn plate navnet, og trykk deretter på Start for å starte behandlingen.
- For å måle intensiteten i fluorescens, gå til bildeanalyse delen og skriv inn bildet. Finn cellen ved å velge EGFP-kanalen og metode B. Juster felles terskelen til 0,5, areal til > 200 μm2, Split faktor til 3,0, individuell terskel til 0,18 og kontrast til mer enn 0,18. Deretter beregner du egenskapene for intensitet og velger gjennomsnittet som utdata. Trykk på Apply -ikonet for å lagre oppsettet.
- Gå til evaluerings delen for å måle intensiteten ved å skaffe en heatmap og datatabell. Sett avlesning parameter til celler-intensitet Cell EGFP Mean-Mean per brønn og starte evalueringen.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her. - Hvis du vil pakke ut dataene fra operette, klikker du på Innstillinger -knappen og velger databehandling.
- Velg skrive arkiv, og åpne deretter Bla gjennom og velg filen.
- For å velge filen, klikk på det lille + signalet i venstre hjørne, og klikk deretter på måling og velg plate navn.
- Velg filen og klikk OK.
- Velg banen for å lagre filen ved å klikke Bla gjennom -signalet på den aktive banen.
- Klikk Start for å lagre datafilen.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her.
9. statistisk analyse av FITC-dextran fluorescens av C. elegans
- Importer dataene og Beregn gjennomsnittet og standardavviket (SD) ved hjelp av en statistikk programvare.
- Analysere den signifikante forskjellen med enveis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Tukey flere sammenlignings test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter inkubasjons med P. aeruginosa PAO1, C. elegans viste en betydelig økning i FITC-dextran fluorescens i ormen kroppen i forhold til fluorescens vist etter inkubasjons med de to andre bakterielle stammer (figur 1). Den fluorescens intensiteten av ormer matet med e. coli OP50, P. aeruginosa PAO1, og E. faecalis KCTC3206 var 100,0 ± 6,6, 369,7 ± 38,9, og 105,6 ± 10,6%, henholdsvis. Dataene understreker at P. aeruginosa forårsaket mer vitale skader på epitel tarmen barriere, og derfor viste ormer en dramatisk økning i intestinal permeabilitet. Basert på dette resultatet, FITC-dextran kan lett trenge gjennom intestinal laget, så P. aeruginosa ble valgt som en potensiell kandidat patogen for screening VIRKNINGENE av Dim. Selv om E. faecalis er en gut patogen som kan produsere ekstracellulære superoxide og hydrogen peroxide, som skader colonic epitel celleDNA 15, i noen tilfeller, er E. faecalis også kjent som en potensiell probiotiske bakterier på grunn av sin evne til å produsere bacteriocins mot noen patogener25,26. Funksjonene til en probiotiske inkluderer tilslutning til epitel overflater, utholdenhet i den menneskelige mage-tarmkanalen, immun stimulering og fiendtlig aktivitet mot tarm patogener26. Derfor, tarmen permeabilitet av ormer inkubert med E. faecalis forble uendret sammenlignet med at av kjøretøyet kontroll ormer. Dette resultatet viser at mengden av infeksjonen kan bli studert av økningen i fluorescens intensitet, og P. aeruginosa forårsaker mer intestinal permeabilitet enn andre stammer.
Figur 2 viser forskjellen mellom Live og varme-deaktivert P. aeruginosa PAO1 basert på intensiteten av FITC-dextran fluorescens i ormen kroppen. Både fluorescens bilder og statistiske data tyder på at patogen ikke kunne utløse noen toksisitet for nematoder etter varme deaktivering. P. aeruginosa kan produsere exotoxin a-en potent ekstracellulære cytotoxin som er dødelig for mange dyr27. Exotoxin A kan raskt bli avskaffet ved oppvarming ved 45 ° c til 60 ° c28. Derfor, varme-deaktivert P. aeruginosa var ikke i stand til å skade permeabilitet av ormene intestinal prolifererende. Supernatanten av P. aeruginosa PAO1 kultur betydelig skadet intestinal permeabilitet, og derfor kulturen supernatanten i stedet for hele P. aeruginosa celler kan brukes til å indusere intestinal permeabilitet dysfunksjon19. Supernatanten inneholder endotoksiner, exotoxin A og lipopolysaccharides29, og disse komponentene er kjent for å indusere celle toksisitet30,31. Derfor kan disse komponentene i supernatanten påvirke intestinal permeabilitet, selv om vi ikke sjekke direkte effekten av exotoxins og lipopolysaccharides på intestinal permeabilitet i C. elegans.
DIM cotreatment for 48 h signifikant redusert FITC-dextran fluorescens intensitet inne i tarmene til ormer sammenlignet med P. aeruginosa enkelt behandling (Figur 3C, D). Statistisk analyse av enveis ANOVA og Tukey ' s Multiple sammenligning test viste at etter behandling med DIM, gjennomsnittlig fluorescens intensitet ble betydelig redusert i forhold til fluorescens intensiteten av P. aeruginosa-bare behandling. Fluorescens intensitet av ormene behandlet med p. aeruginosa-bare og p. aeruginosa Plus DIM var 486,3 ± 41,7 og 414,2 ± 25,0%, henholdsvis (Figur 3E). Basert på dette resultatet, DIM kan betraktes som et godt naturlig produkt å kurere intestinal permeabilitet dysfunksjon forårsaket av bakterielle infeksjoner. Dette resultatet indikerte at DIM kan dempe celle betennelse i tarm celler, noe som reduserer permeabilitet i tarmen19. Dette resultatet er lik resultatene oppnådd i en musemodell, der DIM viste en betydelig reduksjon i betennelse i kolon32.
Figur 1: effekten av ulike bakterier på intestinal permeabilitet av C. elegans. Mikroskopi bilder av ormene, inkludert lyse felt, FITC fluorescens (grønn kanal), og sammenslåtte bilder. Mikroskopi bilder av ormer fra (A) e. coli OP50 uten FITC-dextran fôring, (B) E. coli med FITC-dextran fôring, (C) P. aeruginosa PAO1 med FITC-dextran fôring, og (D) E. faecalis KCTC3206 med FITC-dextran fôring. Scale bar = 1 mm (hvit), og 200 μm (svart). Alder-synkroniserte L4 larver var inkubert for 48 h i NGM plater seeded med E. coli (A, B), P. aeruginosa (C), og E. faecalis (D). Deretter ble ormer overført til plater som inneholder FITC-dextran (B-D), bortsett fra kjøretøyets kontroll (A). (E) den FITC fluorescens intensiteten av de ulike bakterielle behandlinger. En høyere prosentandel av FITC fluorescens indikerte en høyere gut permeabilitet. Søyler og feilfelt indikerer gjennomsnittlig ± SD. * * *P < 0,001 for signifikant forskjell fra kjøretøyets kontroll. # # #P < 0,001 for signifikant forskjell fra FITC-dextran-behandlede ormer matet med P. aeruginosa PAO1 (Anova, n = 5). Denne grafen er representativt for to uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: effekten av levende og varme-deaktivert P. aeruginosa PAO1 på intestinal permeabilitet av C. elegans. Mikroskopi bilder av ormer fra (A) live e. COLI OP50 uten FITC-Dextran fôring, (B) live e. coli med FITC-dextran fôring, (C) live P. aeruginosa PAO1 med FITC-dextran fôring, og (D) varme-deaktivert P. aeruginosa med FITC-dextran fôring. Scale bar = 1 mm (hvit), og 200 μm (svart). Alder-synkroniserte L4 larver var inkubert for 48 h i NGM plater seeded med live E. coli (A, B), Live p. aeruginosa (C), og varme-deaktivert P. aeruginosa (D). Deretter ble ormer overført til plater som inneholder FITC-dextran (B-D), bortsett fra kjøretøyets kontroll (A). (E) FITC fluorescens intensitet sammenligne Live og varme-deaktivert P. aeruginosa PAO1. Søyler og feilfelt indikerer gjennomsnittlig ± SD. * * *p < 0,001 og * *P < 0,01 for betydelig forskjell fra kjøretøyets kontroll. # # #P < 0,001 for signifikant forskjell fra FITC-dextran-behandlede ormer matet med live P. aeruginosa PAO1 (Anova, n = 5). Denne grafen er representativt for to uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: effekten av DIM på intestinal permeabilitet av C. elegans matet P. aeruginosa. Mikroskopi bilder av ormer fra (A) e. coli OP50 uten FITC-dextran fôring, (B) E. coli med FITC-dextran fôring, (C) p. aeruginosa PAO1 med FITC-dextran fôring, og (D) p. aeruginosa og Dim (100 μM) cotreatment med FITC-dextran fôring. Scale bar = 1 mm (hvit), og 200 μm (svart). Alder-synkroniserte L4 larver ble inkubert for 48 h i NGM plater seeded med live E. coli (A, B), Live p. aeruginosa (C), Live p. aeruginosa og Dim (D). Deretter ble ormer overført til plater som inneholder FITC-dextran (B-D), bortsett fra kjøretøyets kontroll (A). (E) den FITC fluorescens intensitet indikerer at tarmen permeabilitet av C. elegans ble påvirket av Dim. Søyler og feilfelt indikerer gjennomsnittlig ± SD. * * *P < 0,001 for signifikant forskjell fra kjøretøyets kontroll. # # #P < 0,001 og # #p < 0,01 for signifikant forskjell fra FITC-dextran-behandlet Worms Fed med P. aeruginosa PAO1 (Anova, n = 5). Denne grafen er representativt for to uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved å benytte denne nye metoden for å bestemme gut permeabilitet i C. elegans, som kombinerer automatiserte fluorescens mikroskopi og kvantitativ bildeanalyse, forskjellene forårsaket av tarm mikroorganismer eller kjemikalier kan fastsettes i Vivo, spesielt i C. elegans tarmen. Denne protokollen er nyttig for gut permeabilitet undersøkelser og gjelder for mange oppgaver, for eksempel reaktive oksygen arter (ROS) bestemmelse under stress forhold og morfologiske undersøkelser, på grunn av sin bekvemmelighet og enkel manipulasjon. Videre kan denne metoden brukes til å bestemme effekten av terapeutiske og forebyggende metoder mot flere patogener i C. elegans. Spesielt kan det være en effektiv protokoll for å undersøke mekanismene for ulike bakteriestammer, inkludert både skadelige og nyttige bakterier. Noen patogener og probiotiske bakterier med lignende strukturer utøve forskjellige effekter på verten33,34. Denne prosedyren kan bistå i å evaluere hvilken mekanisme bakteriene er å utnytte og hvor målrettede underlag kan skilles ut ekstracellulært eller intracellulært. I tillegg kan denne metoden også bidra til å styrke hypotesen om at varmebehandling spiller en viktig rolle i patogen inaktive.
Men det er også noen vanskeligheter under denne prosedyren. For det første er antall ormer i hver plate viktig for statistisk meningsfulle resultater og robust orm deteksjon, så 70-90% confluency (minst 50 ormer per brønn) anbefales. Følgelig bør prøve eksperimenter utføres for å oppnå egnede ormer. For det andre er plate egenskapene en av de viktige faktorene som påvirker kvaliteten på bildene og intensiteten besluttsomhet, spesielt for bunn materialet. I noen avanserte eksperimenter, er et glassbunn det beste alternativet for måling av fluorescens på grunn av sin gode optiske kvalitet. Men på grunn av den høye prisen, en polystyren bunnen er ofte brukt, selv om kvaliteten er ikke så høy som den av glasset bunnen. Til slutt, platen belegg metoder for C. elegans krever optimalisering. I dette eksperimentet, ble fluorescerende montering medium brukt fordi det kan bevare og forbedre merking av vev seksjoner, men det er ikke i stand til å fikse ormer på tallerkenen bunnen riktig.
Denne protokollen har begrensninger. som C. elegans er en nematode, videre eksperimenter, slik som evaluering i humant intestinal celle monolagere og pattedyr, bør utføres. I denne metoden, fenotypiske endringer i C. elegans matet patogene bakterier og kjemikalier ble bestemt. Derfor bør den molekylære og genetiske mekanismer underliggende patogene eller probiotiske effekter av tarmbakterier samt terapeutiske effekter av kjemikalier være ytterligere belyst. Spesifikke signalering veier utøves av sykdomsfremkallende bakteriell infeksjon og terapeutiske effekter av kjemikalier kan evalueres ved hjelp av både ulike mutant bakterier og mutant ormer. I tillegg vil ytterligere grundige studier som identifiserer de kjemiske komponentene som er ansvarlige for patogene og probiotiske effekter av tarmbakterier være fordelaktig.
Her rapporterer vi en eksperimentell protokoll for måling intestinal permeabilitet i C. elegans behandlet med ulike bakterier og kjemikalier ved hjelp FITC-dextran fôring. Vi tror at disse protokollene vil være nyttig for grunnleggende biologisk forskning, slik som å studere samspillet mellom intestinal bakterieflora og gut helse, samt for utvikling av probiotika og nutraceuticals for forebygging og behandling av intestinal helseproblemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av en Korea Institute of Science and Technology intramural forskningsstipend (2E29563).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate - dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
References
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
- Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
- Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).
- Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).
- Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
- Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441 (2018).
- Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).
- Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
- Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
- Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
- Huang, Z., et al. 3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
- Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
- Kim, J. Y., et al. 3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
- Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).
- Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).
- Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 5 979-984 (1983).
- Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
- Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
- Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
- Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
- Kim, Y. H., et al. 3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
- Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
- Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).
