Summary
Hier presenteren we een protocol om de isolatie en uitbreiding van perifere bloedmononucleaire cellen-afgeleide cytokine-geïnduceerde CD3+CD56+ killer cellen uit te voeren en hun cytotoxiciteitseffect tegen hematologische en vaste kankercellen te illustreren met behulp van een in vitro diagnosestroom cytometriesysteem.
Abstract
Adoptieve cellulaire immunotherapie richt zich op het herstellen van kankerherkenning via het immuunsysteem en verbetert effectieve tumorceldoden. Cytokine-geïnduceerde moordenaar (CIK) T-celtherapie is gemeld dat aanzienlijke cytotoxische effecten uit te oefenen tegen kankercellen en om de nadelige effecten van chirurgie, bestraling en chemotherapie in kanker behandelingen te verminderen. CIK kan worden afgeleid uit perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's), beenmerg en navelstrengbloed. CIK-cellen zijn een heterogene subpopulatie van T-cellen met CD3+CD56+ en natuurlijke killer (NK) fenotypische kenmerken die belangrijke histocompatibiliteitscomplex (MHC)-onbeperkte antitumoractiviteit omvatten. Deze studie beschrijft een gekwalificeerde, klinisch toepasbare, flow cytometrie gebaseerde methode voor de kwantificering van het cytolytische vermogen van PBMC-afgeleide CIK-cellen tegen hematologische en vaste kankercellen. In de cytolytische test worden CIK-cellen gecoöpteerd bij verschillende verhoudingen met vooraf bereikte doeltumorcellen. Na de incubatietijd wordt het aantal doelcellen bepaald door een nucleïnezuurbindende vlek om dode cellen te detecteren. Deze methode is van toepassing op zowel onderzoeks- als diagnostische toepassingen. CIK cellen bezitten krachtige cytotoxiciteit die kan worden onderzocht als een alternatieve strategie voor de behandeling van kanker bij de preklinische evaluatie door een cytometer setup and tracking (CS & T)-gebaseerde flow cytometrie systeem.
Introduction
Cytotoxische T lymfocyten zijn een specifieke immuuneffector celpopulatie die immuunreacties tegen kanker bemiddelt. Verschillende effector celpopulaties, waaronder lymfoomgeactiveerde killer (LAK) cellen, tumor-infiltrerende lymfocyten (TILs), natuurlijke killer (NK) cellen, γδ T cellen, en cytokine-geïnduceerde killer (CIK) cellen zijn ontwikkeld voor adoptief T celtherapie (ACT) doeleinden1. Er is een groeiende belangstelling voor CIK-cellen, omdat ze een mengsel vertegenwoordigen van cytokine-geïnduceerde cytotoxische celpopulaties die zijn uitgebreid van autologe perifere bloedmononucleaire cellen (PMBC's)2.
De ongecontroleerde groei van lymfoïde voorlopercellen, myeloblasten en lymfoblasten leidt tot drie belangrijke vormen van bloedkanker (d.w.z. leukemie, lymfoom en myeloom), vaste tumoren, waaronder carcinoom (bijvoorbeeld longkanker, maagkanker, baarmoederhalskanker) en sarcomen, onder andere kankers3. CIK-cellen zijn een mengsel van celpopulaties die een breed scala aan belangrijke histocompatibiliteitscomplex (MHC)-onbeperkte antitumoractiviteit vertonen en dus belofte houden voor de behandeling van hematologische en gevorderde tumoren4,5,6,7. CIK-cellen bestaan uit een combinatie van cellen, waaronder T-cellen (CD3+CD56−), NK-T-cellen (CD3+CD56+), en NK-cellen (CD3–CD56+). Optimalisatie van het CIK-inductieprotocol door gebruik te maken van een vast schema voor de toevoeging van IFN-γ, anti-CD3-antilichaam en IL-2 resulteert in de uitbreiding van CIK-cellen8. Het cytotoxische vermogen van CIK-cellen tegen kankercellen hangt voornamelijk af van de betrokkenheid van NK groep 2 lid D (een lid van de C-type lectin-achtige receptor familie) NKG2D ligands op tumorcellen, en op perforin-gemedieerde trajecten9. De resultaten van een preklinische studie toonden aan dat IL-15-gestimuleerde CIK-cellen krachtige cytotoxiciteit tegen primaire en acute myeloïde leukemiecellijnen in vitro veroorzaakten en een lagere alloreactiviteit vertoonden tegen normale PBMC's en fibroblasten9. Onlangs werd de uitkomst van eenmalige gezonde donor-afgeleide CIK (1 x 108/kg CD3+ cellen) infusie als consolidatie na nonmyeloablative allogene transplantatie voor myeloïde neoplasma's behandeling in een fase II klinische studie gepubliceerd10.
In deze studie ontwikkelden we een geoptimaliseerde celkweekformule bestaande uit IFN-γ, IL-1α, anti-CD3-antilichaam en IL-2 toegevoegd aan het hematopoietische celmedium om de CIK-productie te verhogen en onderzochten we het cytotoxische effect van CIK-cellen tegen menselijke chronische myeloïde leukemie (K562) cellen en eierstokkanker (OC-3) cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het klinische protocol werd uitgevoerd en goedgekeurd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Review Board van de China Medical University and Hospital Research Ethics Committee. Perifere bloedmonsters werden geoogst van gezonde vrijwilligers met hun geïnformeerde toestemming.
1. Bereiding van materialen
- Bewaar reagentia, antilichamen en chemicaliën zoals weergegeven in het Materiaalveiligheidsinformatieblad (MSDS). Los de geneesmiddelen of cytokinen op in oplosmiddelen als voorraadoplossingen en vervolgens aliquot voor opslag bij -20 °C of -80 °C.
OPMERKING: Gedetailleerde informatie over materiaalbereiding wordt vermeld in de Materiaaltabel.
2. PBMC-isolatie
- Verwarm de gradiëntoplossing van de dichtheid (Materiaaltabel) voor gebruik tot 18-20 °C. Keer de oplossingsfles meerdere malen om te zorgen voor een grondige menging.
- Verzamel 3−5 mL menselijk veneuze bloedmonster in een gehesen flesje en meng goed door de buis meerdere keren zachtjes om te keren.
- Bereid 4 mL dichtheidgradiëntoplossing voor in een sterielbuis van 15 mL.
- Voorzichtig laag 1 mL van het bloedmonster op de dichtheid gradiënt oplossing.
- Centrifugeer bij 400 x g gedurende 30 min bij 18−20 °C (zet de pauze uit).
- Voorzichtig en onmiddellijk aanzuigen van de buffy laag van mononucleaire cellen (ongeveer 1 mL) in een keer om te voorkomen dat verstoring van de lagen aan een steriele 15 mL buis met behulp van een 1 mL steriele pipet.
- Voeg ten minste 3 volumes (~ 3 mL) fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan de buffy-laag in de centrifugebuis. Hang de cellen op door ze voorzichtig op en neer te stampen ten minste 3x met een steriele pipet.
- Centrifugeer bij 400 x g gedurende 10 min bij 18−20 °C. Aanzuigen van de supernatant.
- Hang de celpellet op met 5 mL basale medium(Tabel van materialen)en breng over in een kolf. Kweek de cellen in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
3. CIK inductie en uitbreiding
- Op dag 0 cultuur de PBMC's (1 x 106) in vers basale medium met 1.000 IU/mL IFN-γ voor 24 uur in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Ververs op dag 1 het medium met een fris basale medium met 50 ng/mL anti-CD3 antilichaam, 1 ng/mL rh IL-1α en 1.000 U/mL rh IL-2. Ververs het medium om de 3 dagen.
- Ververs op dag 7 het medium met een fris basale medium met 1.000 U/mL rh IL-2. Ververs het medium om de 3 dagen tot het einde van de celuitzetting (dag 14).
4. Immunofenfetypering voor de beoordeling van CIK-cellen
- Was de CIK-cellen met 10 mL steriel PBS. Centrifugeer gedurende 10 min bij 300 x g en 18−20 °C, zuig de supernatant aan en brep de cellen opnieuw met 10 mL PBS. Tel het celnummer en test cel levensvatbaarheid met behulp van de trypan blauwe uitsluiting test.
- Aliquot de CIK cellen in zes steriele 1,5 mL buizen met een dichtheid van ~ 5-10 x 105 cellen / mL PBS. Etikettuur en behandelen als volgt: Tube 1, Blank (geen antilichaam); Tube 2, voeg 20 μL isotype IgG1-FITC toe; Buis 3, voeg 20 μL isotype IgG1-APC mAbs toe; Buis 4, voeg 20 μL CD3-FITC toe; Buis 5, voeg 20 μL CD56-APC mAbs toe; en Tube 6, voeg 20 μL CD3-FITC en 20 μL CD56-APC mAbs toe.
- Meng de CIK-cellen voorzichtig met de antilichamen door ze voorzichtig op en neer te stampen ten minste 3x met een steriel pipet van 1 mL en vervolgens 30 min bij kamertemperatuur in het donker uitbroeden.
- Centrifugeer de buizen gedurende 10 min bij 300 x g en 18−20 °C. Aanzuigen van de supernatant en schorsen de cel pellet een keer met 1 mL pbs. Voorzichtig pipet ze op en neer ten minste 3x met een 1 mL steriele pipet.
- Herhaal stap 4.4.
- Laat de buizen in het donker voordat de stroom cytometrische analyse.
5. Cd-markeringsherkenning
- Breng de celvering over op een steriele 5 mL polystyreenronde bodembuis met een celstrainerdop (100 μm mesh) door zachtjes door de dop te paien. Zet de buizen op de carrousel in orde.
- Open de flow cytometrieanalysesoftware en maak een experimentele map. Klik op de knop Nieuw specimen om een exemplaar en buis aan het experiment toe te voegen en geef de buizen als volgt een naam: Tube 1, Blank; Tube 2, Isotype IgG1-CD3; Tube 3, Isotype IgG1-CD56; Buis 4, CD3; Buis 5, CD56; Buis 6, CD3CD56.
- Maak een strooigatsysteem voor de CIK-celpopulaties (figuur 2A).
- Selecteer Tube 1 (Leeg) en klik op de dot plotknop om een FSC-A/SSC-A-plot te maken. Teken een rechthoekpoort over de gehele celpopulatie met een FSC-A-drempel >5 x 104 om celvuil uit te sluiten.
- Selecteer de parameter SSC-A/SSC-H voor de nieuwe puntplot en teken een veelhoekpoort rond alle afzonderlijke cellen. Selecteer respectievelijk de parameter Count/FITC (CD3) en Count/APC (CD56) voor het nieuwe histogramplot. Selecteer de parameter FITC (CD3)/APC (CD56) voor de nieuwe puntplot en teken een vierkwadrantpoort om de vier subpopulaties te definiëren.
- Noteer de gegevens van 20.000 afzonderlijke cellen in elk monster. Klik eerst op de knop Voorbeeld laden om het voorbeeld van leeg besturingselement eerst te analyseren. Identificeer de hele CIK-celpopulatie met behulp van de cd56- en CD3-kanaalparameters.
- Herhaal stap 5.3 voor het onderzoek van alle exemplaren.
- Open de bestanden met de statistische waarden van het afzonderlijke exemplaar om CIK-celpopulaties te analyseren en deze opnieuw af te drukken in analysebestanden.
6. Kweek- en kleuring van menselijke chronische myeloïde leukemie K562 cellen en eierstokkanker OC-3 cellen
- K562-cellen
- Kweek K562-cellen in volledige media (RPMI basale medium met 10% foetaal runderserum [FBS] en 50 U/mL-antibiotica en pas glucose aan tot 4,5 g/L) met een dichtheid van 0,5−1 x 106 cellen/mL in een celkolf en incubeerin een bevochtigde couveuse bij 37 °C en 5% CO2.
- Breng de kweekmedia met de K562-cellen over in 50 mL steriele buizen en pellet de cellen op 300 x g voor 10 min bij 18−20 °C op de dag van het experiment.
- Aanzuigen van de supernatant, resuspend de cellen in 5 mL van steriele PBS, en meng goed zachtjes.
- Pellet de cellen op 300 x g voor 10 min. Aanzuigen van de supernatant, resuspendde de cellen in PBS, en de K562 cellen aan te passen aan een concentratie van 0,5-1 x 106 cellen /mL.
- Voeg 0,5 μL CFSE kleurstof toe aan de 1 mL K562 celvering in een steriel buis van 15 mL bij een eindconcentratie van 5 μM. Meng de vering voorzichtig door minstens 3x op en neer te stampen.
- Laat de buis in een celkweekincubator achter bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 10-15 min.
- Voeg 9 mL PBS toe aan de buis en pellet de cellen op 300 x g voor 10 min. Decant de supernatant en hang vervolgens de celpellet in 10 mL van volledige media. Breng de celvering over naar een celkweekkolf en plaats in de couveuse.
- OC-3-cellen
- Kweek OC-3 cellen in volledige media (DMEM/F12 medium met 10% FBS en 50 U/mL antibiotica) met een dichtheid van 0,5-1 x 106 cellen in een celkweekkolf bij 37 °C en 5% CO2.
- Aanzuigen van de cultuur media en was de cellen met PBS 1 dag voor het experiment.
- Maak de cellen los door 1 mL celdissociatieenzymoplossing(Tabel met materialen)toe te voegen en uitte broed gedurende 5 min bij 37 °C.
- Hang de cellen op door 5 mL PBS toe te voegen en meng goed voorzichtig. Pellet de cellen op 300 x g voor 10 min en aanzuigen van de supernatant. De cellen in PBS opnieuw opschorten en de cellen aanpassen aan een concentratie van 0,5–1 x 106 cellen/mL.
- Voeg 0,5 μL CFSE kleurstof toe aan 1 mL van de OC-3 celsuspensie in een steriel buis van 15 mL bij een eindconcentratie van 5 μM. Meng de vering voorzichtig door minstens 3x op en neer te stampen.
- Laat de buis in een celkweekincubator achter bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 10-15 min.
- Voeg 9 mL PBS toe aan de buis en pellet de cellen op 300 x g voor 10 min. Decant de supernatant en hang vervolgens de celpellet op met volledige media. Zaad 5 x 105 cellen/put in een 6 putplaat en uitbroed in een bevochtigde couveuse bij 37 °C en 5% CO2 's nachts.
7. Cytotoxische test
- Cocultuur van CIK en K562 cellen (CIK-K562)
- Tel de K562-cellen uit stap 6.1.7 en test de cellevensvatbaarheid door middel van trypan blauwe uitsluitingstest. Voeg 1 mL K562-cellen toe aan elke put in een 6-putplaat met een dichtheid van 5 x 105/mL.
- Voeg 1 mL basale medium met of zonder CIK-cellen toe van stap 3.4 tot de 6 putplaat van stap 7.1.1 als volgt: Goed 1 = Blanco, K562 cellen alleen (5 x 105); Nou 2 = CFSE-gekleurde K562 cellen alleen (5 x 105); Nou 3 = CIK-cellen (E [effector], 25 x 105) + CFSE-gekleurde K562-cellen (T [doel], 5 x 105); Nou 4 = CIK-cellen (E, 50 x 105) + CFSE-gekleurde K562-cellen (T, 5 x 105).
- Meng de celveringen door ze voorzichtig op en neer te stampen ten minste 3x. Plaats de plaat 24 uur in de couveuse.
- Cocultuur van CIK- en OC-3 cellen (CIK-OC-3)
- Voeg 1 mL basale medium met of zonder CIK-cellen van stap 3.4 toe aan de 6 putplaat van stap 6.2.7 als volgt: Nou 1 = Blanco, OC-3 cellen alleen (5 x 105); Nou 2 = CFSE-gekleurde OC-3 cellen alleen (5 x 105); Nou 3 = CIK-cellen (E, 25 x 105) + CFSE-gekleurde OC-3 cellen (T, 5 x 105); Nou 4 = CIK-cellen (E, 50 x 105) + CFSE-gekleurde OC-3 cellen (T, 5 x 105).
- Meng de celveringen door ze voorzichtig op en neer te stampen ten minste 3x. Zet de plaat 24 uur in de couveuse.
- 7-Aminoactinomycine D (7-AAD) kleurstof kleuring
- Oogst de CIK-K562 celvering vanaf stap 7.1.3 rechtstreeks in een sterielbuis van 15 mL.
- Oogst zowel de suspensie- als aanhangende cellen uit de CIK-OC-3 groepen uit stap 7.2.2.
- Breng de celvering over op een steriele buis van 15 mL. Was de put met 1 mL steriele PBS, verzamel de PBS en voeg toe aan de buis. Voeg 0,5 mL celdissociatieenzymoplossing toe en incubeer gedurende 5 min bij 37 °C.
- Voeg 1 mL van de oplossing van dezelfde buis aan de overeenkomstige put en meng de cellen voorzichtig door ze op en neer te stampen ten minste 3x met een 1 mL steriele pipet. Verzamel alle cellen in dezelfde buis.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 min, aanzuigen van de supernatant, en resuspendde de cellen in 1 mL van steriele PBS. Pellet de cellen op 300 x g voor 10 min, aanzuigen van de supernatant, en opnieuw opschorten cellen in 100 μL van steriele PBS.
- Voeg 5 μL 7-AAD kleurstof (50 ng/μL-voorraad) toe aan de celvering. Meng de cellen voorzichtig door ze minstens 3x op en neer te stampen met een steriel pipet van 1 mL. Incubeer voor 10 minuten en laat in het donker voor analyse.
- Cytolytische vermogen test
- Meng de celvering uit stap 7.3.4 en herhaal stap 5.1 en 5.2 eenmaal.
- Klik op de knop Nieuw specimen om een specimen en buis aan het experiment toe te voegen en geef de buizen als volgt de naam: Tube 1, K562 (of OC-3) cellen; Tube 2, CFSE-gekleurde K562 (of OC-3) cellen; Buis 3, E:T = 5:1; Buis 4, E:T = 10:1.
- Maak een Scatter Gating System voor de cytolytische test(figuur 3A).
- Selecteer Tube 1 en klik op de Dot Plot-knop om een FSC-A/SSC-A-plot te maken. Teken een rechthoekpoort over alle gebeurtenissen met een FSC-A-drempel >5 x 104 om celvuil uit te sluiten.
- Selecteer de parameter SSC-A/CFSE voor de nieuwe puntplot. Selecteer de parameter 7-AAD/CFSE voor het nieuwe puntperceel en teken een poort met vier kwadranten om de vier subpopulaties te definiëren.
- Klik eerst op de knop Voorbeeld laden om het voorbeeld van leeg besturingselementen eerst te analyseren.
- Pas de spanning van SSC-A en FSC-A aan. Identificeer de dode celpopulatie met behulp van de CFSE- en 7-AAD-kanaalparameters. Neem de gegevens op van >20.000 CFSE+ cellen in elk exemplaar.
- Herhaal punt 7.4.6 voor het onderzoek van alle specimens.
- Open de bestanden met de statistische waarden van elk afzonderlijk exemplaar om de niet-levensvatbare celpopulaties te analyseren en de gegevens naar analysebestanden te exporteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van het huidige protocol is het isoleren en uitbreiden van cytokine-geïnduceerde killer (CIK) T-cellen uit perifere bloedmonocyten en het cytotoxische effect van CIK te evalueren tegen respectievelijk hematologische maligniteit en vaste kankercellen. De inductie van CIK werd geïdentificeerd door de CD3/CD56 erkenning. Figuur 1A toont het protocol voor CIK-inductie en -expansie. De representatieve resultaten van de gatingstrategie voor het analyseren van de subpopulatie van CD3+CD56+ T-cellen van gezonde donoren worden geïllustreerd in figuur 1B. Figuur 1C toont de statistische analyse van het CIK-aandeel van drie personen.
Figuur 2A toont aan dat het CD3+CD56+ celaandeel (0,65% voor het oorspronkelijke PBMC, linker onderpaneel en 27,4% voor de CIK-cellen die op dag 14e, rechts onderpaneel) zijn geoogst, aanzienlijk is toegenomen na 14 dagen van expansie. In ons kweeksysteem leverden de CIK-cellen ongeveer een halve honderdvoudige verandering op ten opzichte van het oorspronkelijke aantal PBMC's (figuur 2B).
Figuur 3 toont het cytotoxische effect van CIK tegen menselijke chronische myeloïde leukemie K562 cellen en menselijke eierstokkanker OC-3 cellen. K562 of OC-3 cellen (doel, T) werden gekleurd met een niet-fluorescerende kleurstof (CFSE), die werd gespleten door intracellulaire esterases in levensvatbare cellen en vervolgens werd een zeer fluorescerende kleurstof. In de cytotoxische cocultuurstudie werden CFSE-gekleurde K562- of OC-3-cellen 24 uur lang samenbehandeld met CIK-cellen. Aan het einde van de incubatie werden de totale cellen geoogst en gekleurd met 7-AAD kleurstof, een nucleïnezuurbindende kleurstof die wordt gebruikt als levensvatbaarheidssssonde voor uitsluiting van dode cellen. De grootte en granulariteit van de CIK- en CFSE+ cellen worden geïllustreerd in figuur 3A. De CFSE-gekleurde K562-cellen (doelcellen, T) werden medebehandeld met CIK-cellen (effectorcellen, E) met een verhouding van respectievelijk E/T = 0:1, 5:1 en 10:1. De 7-AAD+ cellen van CFSE+ K562 cellen werden allemaal geëvalueerd. De statistische resultaten waren afkomstig van drie onafhankelijke experimenten. Basal lyse betekent het percentage celdood bij afwezigheid van effectorcellen (E:T = 0:1). Figuur 3B toont de duidelijke cytotoxiciteit van CIK tegen OC-3 cellen (E:T = 10:1) na 24 uur incubatie.
Figuur 1: Stroomdiagram van cytokine-geïnduceerde killer cellen inductie en expansie. (A) PBMC's van instemmende gezonde donoren werden in eerste instantie blootgesteld aan rhIFN-γ (Dag 0), gevolgd door rhIL-2, rhIL-1α en anti-CD3 mAb (Dag 1) om de 3 dagen (dag 4). Vervolgens werd het medium elke 3 dagen vernieuwd met rhIL-2-bevattend medium en werden de cellen geoogst op dag 14. (B) Morfologie van CIK-cellen gedurende 7 dagen inductie. De activering en uitbreiding van CIK-cellen werden uitgevoerd zoals beschreven in het protocol. Cellen werden respectievelijk onder een lichtmicroscoop waargenomen op de dagen 1, 5 en 7 (vergroting = 40x, schaalbalk = 200 μm). (C) Celtellingen werden wekelijks uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Het aandeel CD3+CD56+ T-cellen uit een representatief PBMC-monster. (A) Lymfocyten werden herkend door specifieke grootte en granulariteit. Geselecteerde eencellige populatie voor analyse per stroomcytometrie. (B) Statistische analyse van de expansiewerkzaamheid van CIK van drie gezonde donoren werd uitgevoerd met behulp van een t-test (*, p < 0,01). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Cytotoxische effecten van CIK-cellen tegen menselijke chronische myeloïde leukemie K562 en menselijke eierstokkanker OC-3 cellen. (A) Na cocultuur met de CIK-cellen voor 24 uur, k562 doelcellen werden erkend en gated op basis van de kleuring van CFSE kleurstof. Kwadrantillustratie van de totale celpopulatie onder de geselecteerde parameter 7-AAD/CFSE en de cumulatieve cytotoxiciteit van CIK-cellen bij de aangegeven E:T-verhouding. (B) Het cytotoxische effect van CIK-cellen tegen OC-3-cellen bij een E:T = 10:1-verhouding. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven methode is een snel, handig en betrouwbaar protocol voor de isolatie en uitbreiding van cytotoxische cytokine-geïnduceerde killer (CIK) T-cellen uit volbloedmonsters van gezonde donoren. Het toont ook het cytotoxische effect van CIK tegen leukemie (K562) en eierstokkankercellen (OC-3) met behulp van een flow cytometrie setup and tracking (CS & T) systeem. CIK-cellen kunnen worden geïnduceerd en uitgebreid in goede manufactory praktijken (GMP) voorwaarden met behulp van GMP-grade cytokinen en serum-vrij medium voor verdere klinische infusie11. De werkzaamheid van CIK-inductie en -expansie vertoont echter individuele verschillen12,13,14. Bovendien is veiligheid het voordeel van de infusie van door de patiënt afgeleide CIK-cellen voor kankerceltherapie. Er is gemeld dat CIK cellen cytolytische effecten uit te oefenen op epitheliale vaste kankercellen meestal op een NKG2D-afhankelijke manier. In hematologische kankercellen remt het blokkeren van NKG2D met een specifiek antilichaam de door CIK geïnduceerde cytotoxiciteit tegen NKG2D-lage K562-cellen aanzienlijk; deze behandeling heeft echter geen effect op HL-60-cellen die NKG2D15missen. Bovendien vertonen CIK-cellen minder celdodende activiteit tegen K562-cellen in vergelijking met CD8+ CIK-cellen16. In deze studie, vonden we dat CIK vertoonde een groter cytototoxisch potentieel tegen eierstokkanker OC-3 cellen in vergelijking met leukemie K562 cellen. Deze gegevens suggereren dat de exacte moleculaire mechanismen waardoor CIK-effectoren tumorcellen doden nog niet duidelijk zijn.
Het bijhouden van de levensvatbaarheid van de doelcel en de evaluatie van het cytotoxische potentieel van effectorcellen met behulp van stroomcytometrie is een standaard en conventionele methode geworden voor klinisch onderzoek17. Er is gesuggereerd dat een negatief effect wordt waargenomen op de levensvatbaarheid van de cel en de expressie van activeringsmarkers, zoals de CD3+ populatie in CFSE-gekleurde lymfocyten met stroomcytometrie18,19. Zo, vlekken op het doel kankercellen is een meer effectieve strategie voor de evaluatie van de cytotoxische effecten van primaire CIK cellen. IFN-γ, OKT3 en IL-2 zijn belangrijke cytokines of stimulatoren voor CIK-differentiatie en proliferatie. Verder zijn andere factoren zoals thymoglobulin, IL-1α, IL-10, IL-15, ook stimulatoren. Momenteel worden menselijk serum, menselijk bloedplaatjesrijk plasma en zelfs foetaal runderserum gebruikt als medium supplementen die de proliferatie van CIK-cellen kunnen verbeteren. Hoewel serum of plasma zijn verrijkt met voedingsstoffen en groeifactoren, presenteert de toevoeging van allogene dierlijke producten bron-, batch- en partijvariaties die resulteren in experimentele variabiliteit, en onvermijdelijk verontrustende studies met therapeutische resultaten voor gekweekte cellen. In deze studie gebruikten we een commercieel beschikbare serumvrije, albuminevrije en xeno-vrije GMP-grade media aangevuld met klinische cytokines om de CIK-cellen succesvol te kweken. Het nadeel van het gebruik van xeno-vrije of allogene-vrije supplementen is dat ze de werkzaamheid van celproliferatie te verminderen.
De twee-kleuren cel tracking methoden die in de protocollen onafhankelijk berekend levensvatbare of dode effector doelcellen in een directe cytotoxiciteit test. In onze gatingstrategieën kunnen CFSE+ doelcellen duidelijk worden onderscheiden van CIK-effectorcellen(figuur 3). Het belangrijkste is dat het proces van CIK-inductie en -uitbreiding gekwalificeerd moet zijn en een hoge levensvatbaarheid moet aantonen. Voor verdere infusies met meerdere doseringen zijn de toestand van cryopreservatie en de levensvatbaarheid en de cytotoxiciteit na het ontdooien andere kritieke uitdagingen. De werkelijke verhouding van specifieke lyse is gelijk aan het aandeel van 100 x (%Monster lysis - %Basal lysis)/(100 - %Basal lysis). In tegenstelling tot andere studies18,20, wordt aanbevolen dat alle doelcellen worden onderzocht om de exacte en werkelijke cytotoxiciteit van CIK-cellen te onthullen.
Tot slot is het protocol beschreven in deze studie ontworpen om het aantal PBMC-afgeleide CIK-cellen van gezonde donoren te verhogen en hun cytotoxische functies tegen kankercellen te evalueren met tweekleurige fotoredes voor selectieve tracking van doelcellen door een flow cytometrie met een in vitro diagnostisch (IVD) systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangenconflicten van financieel belang.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door China Medical University Hospital (DMR-Cell-1809).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-Amino Actinomycin D | BD | 559925 | |
| APC Mouse Anti-Human CD56 antibody | BD | 555518 | B159 |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | MOPC-21 |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD | 338962 | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | BD | 565082 | |
| D-(+)-Glucose solution | SIGMA | G8644 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 | HyClone | SH30023.02 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare Life Sciences | 71101700-EK | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody | BD | 555332 | UCHT1 |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555748 | MOPC-21 |
| Human anti-CD3 mAb | TaKaRa | T210 | OKT3 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Proleukin | NOVARTIS | ||
| Recombinant Human Interferon-gamma | CellGenix | 1425-050 | |
| Recombinant Human Interleukin-1 alpha | PEPROTECH | 200-01A | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 11875-085 | |
| Sigma 3-18K Centrifuge | Sigma | 10295 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12605028 | |
| X-VIVO 15 medium | Lonza | 04-418Q |
References
- Cappuzzello, E., et al. Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of Cytokine-Induced Killer (CIK) cells. Cytokine & Growth Factor Reviews. 36, 99-105 (2017).
- Schmidt-Wolf, R. S., et al. Propagation of large numbers of T cells with natural killer cell markers. British Journal of Haematology. 87 (3), 453-458 (1994).
- Grainger, S., et al. Wnt Signaling in Hematological Malignancies. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 153, 321-341 (2018).
- Dai, C., et al. Implication of combined PD-L1/PD-1 blockade with cytokine-induced killer cells as a synergistic immunotherapy for gastrointestinal cancer. Oncotarget. 7 (9), 10332-10344 (2016).
- Schmidt-Wolf, I. G., et al. Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity. TheJournal of Experimental Medicine. 174 (1), 139-149 (1991).
- Introna, M., et al. Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells: an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 38 (9), 621-627 (2006).
- Schmeel, L. C., et al. Cytokine-induced killer (CIK) cells in cancer immunotherapy: report of the international registry on CIK cells (IRCC). Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (5), 839-849 (2015).
- Rutella, S., et al. Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new good manufacturing practice-grade protocol. Cytotherapy. 14 (7), 841-850 (2012).
- Nausch, N., et al. NKG2D ligands in tumor immunity. Oncogene. 27 (45), 5944-5958 (2008).
- Gammaitoni, L., et al. Effective activity of cytokine-induced killer cells against autologous metastatic melanoma including cells with stemness features. Clinical Cancer Research. 19 (16), 4347-4358 (2013).
- Rettinger, E., et al. The cytotoxic potential of interleukin-15-stimulated cytokine-induced killer cells against leukemia cells. Cytotherapy. 14 (1), 91-103 (2012).
- Narayan, R., et al. Donor-derived cytokine-induced killer cell infusion as consolidation after nonmyeloablative allogeneic transplantation for myeloid neoplasms. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 19, 1083 (2019).
- Castiglia, S., et al. Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 237 (2018).
- Bonanno, G., et al. Thymoglobulin, interferon-γ and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer (CIK) cells in clinical-grade cultures. Journal of Translational Medicine. 8, 129 (2010).
- Iudicone, P., et al. Interleukin-15 enhances cytokine induced killer (CIK) cytotoxic potential against epithelial cancer cell lines via an innate pathway. Human Immunology. 77 (12), 1239-1247 (2016).
- Liu, J., et al. Phenotypic characterization and anticancer capacity of CD8+ cytokine-induced killer cells after antigen-induced expansion. PLoS One. 12 (4), 0175704 (2017).
- Chen, D., et al. Cytokine-induced killer cells as a feasible adoptive immunotherapy for the treatment of lung cancer. Cell Death & Disease. 9 (3), 366 (2018).
- Tario, J. D. Jr Monitoring cell proliferation by dye dilution: considerations for probe selection. Methods in Molecular Biology. 1678, 249-299 (2018).
- Last'ovicka, J., et al. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular Immunology. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Yoshida, T., et al. Characterization of natural killer cells in tamarins: a technical basis for studies of innate immunity. Frontiers in Microbiology. 1, 1-9 (2010).
