Summary
여기서, 우리는 말초 혈액 단핵 세포의 단핵 세포 유래 사이토카인 유도 CD3+CD56+ 킬러 세포의 격리 및 확장을 수행하는 프로토콜을 제시하고 시험관 내 진단 유세포 분석 시스템을 사용하여 혈액학적 및 고체 암 세포에 대한 그들의 세포 독성 효과를 예시한다.
Abstract
입양 세포 면역 요법은 면역 계통을 통해 암 인식을 회복하고 효과적인 종양 세포 살해를 향상시키는 데 중점을 둡니다. 사이토카인 유도 살인자 (CIK) T 세포 치료는 암 세포에 대하여 중요한 세포 독성 효력을 발휘하고 암 처리에 있는 수술, 방사선 및 화학요법의 역효과를 감소시키기 위하여 보고되었습니다. CIK는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수 및 탯줄 혈액으로부터 유래 될 수 있습니다. CIK 세포는CD3+CD56+ 및 자연 살인자(NK) 현상형 특성을 가진 T 세포의 이질적인 하위 집단으로 주요 조직 적합성 복합체(MHC)-무제한 항종양 활성을 포함한다. 본 연구는 혈액학적 및 고체 암세포에 대한 PBMC 유래 CIK 세포의 세포용해 능력의 정량화를 위한 적격한, 임상적으로 적용 가능한 유동 세포분석 기반 방법을 기술한다. 세포용해 분석에서, CIK 세포는 미리 염색된 표적 종양 세포와 다른 비율로 공동 배양된다. 잠복기 후, 표적 세포의 수는 핵산 결합 얼룩에 의해 결정되어 죽은 세포를 검출한다. 이 방법은 연구 및 진단 응용 프로그램 모두에 적용할 수 있습니다. CIK 세포는 세포계 설정 및 추적 (CS & T) 기반 유량 세포 측정 시스템에 의한 전임상 평가시 암 치료를위한 대체 전략으로 탐구 될 수있는 강력한 세포 독성을 가지고 있습니다.
Introduction
세포독성 T 림프구는 암에 대하여 면역 반응을 중재하는 특정 면역 이펙터 세포 인구입니다. 림프관 활성화 킬러(LAK) 세포, 종양 침투 림프구(TILs), 자연 살인자(NK) 세포, γδ T 세포 및 사이토카인 유도 킬러(CIK) 세포를 포함하는 몇몇 이펙터 세포 집단은 입양 T 세포 치료(ACT) 목적으로 개발되었다1. CIK 세포에 대한 관심이 증가하고 있는데, 이는 자가말초혈액단핵세포(PMBC)로부터 확장된 사이토카인 유도 세포 집단의 혼합물을 나타내기 때문이다2.
림프선 전구 세포의 통제되지 않은 성장, 골수 세포 및 림프구는 혈액 암 (즉, 백혈병, 림프종 및 골수종) 3 가지 주요 유형의 혈액 암, 암종 (예 : 폐암, 위암, 자궁 경부암) 및 육종을 포함한 고형 종양으로 이어진다3. CIK 세포는 광범위한 주요 조직 적합성 복합체(MHC)-무제한 항종양 활성을 나타내며, 따라서 혈액학적 및 고급 종양의 치료에 대한 약속을 보유하는 세포 집단의혼합물이다 4,5,6,7. CIK 세포는 T 세포(CD3+ CD56- -), NK-T 세포(CD3+ CD56+), 및 NK 세포(CD3- CD56+)를 포함하는 세포의 조합을 포함한다. IFN-γ, 항CD3 항체 및 IL-2의 첨가를 위한 고정 된 스케줄을 이용하여 CIK 유도 프로토콜의 최적화는 CIK 세포의 확장을 초래한다8. 암세포에 대한 CIK 세포의 세포독성 능력은 주로 NK 군 2부재 D(C형 렉틴 유사 수용체 패밀리의 일원) NKG2D 리간드를 종양 세포 상에서, 및 천포 매개경로에결합하는 것에 의존한다. 전임상 연구의 결과, IL-15 자극 CIK 세포는 시험관내 1차 및 급성 골수성 백혈병 세포주에 대해 강력한 세포 독성을 유도하고 정상 PBMC 및 섬유아세포에 대해 더 낮은 동열성을나타냈다9. 최근, 단계 II 임상 연구에서 골수성 신생물 치료를 위한 비골수성 동종 이식에 따른 통합으로서 1회 건강한 공여자 유래 CIK(1 x 108/kgCD3+ 세포)의 결과가발표되었다.
본 연구에서는 CIK 생산을 증가시키기 위해 조혈 세포 배지에 IFN-γ, IL-1α, 항 CD3 항체 및 IL-2로 구성된 최적화된 세포 배양 포뮬러를 개발하고, 인간 만성에 대한 CIK 세포의 세포독성 효과를 조사했습니다. 골수성 백혈병 (K562) 세포 및 난소암 (OC-3) 세포.
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Protocol
임상 프로토콜은 중국 의과 대학 및 병원 연구 윤리위원회의 기관 검토 위원회의 지침에 따라 수행및 승인되었습니다. 말초 혈액 표본은 그들의 통보된 동의를 가진 건강한 자원봉사자에게서 수확되었습니다.
1. 재료의 준비
- MSDS(물질 안전 데이터 시트)에 표시된 대로 시약, 항체 및 화학 물질을 저장합니다. 용매에 약물 또는 사이토카인을 재고 용액으로 용해시킨 다음 -20 °C 또는 -80 °C에서 보관하기 위한 알리쿼트.
참고: 재료 준비에 대한 자세한 정보는 재료 표에기재되어 있습니다.
2. PBMC 격리
- 사용하기 전에 밀도 그라데이션 용액(재료 표)을18-20 °C로 따뜻하게하십시오. 철저한 혼합을 보장하기 위해 용액 병을 여러 번 반전하십시오.
- 3-5 mL의 인간 정맥 혈액 샘플을 헤파린 바이알에 모으고 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 잘 섞습니다.
- 15 mL 멸균 튜브에 4 mL밀도 그라데이션 용액을 준비합니다.
- 혈액 샘플의 1 mL을 밀도 그라데이션 용액에 조심스럽게 겹쳐 서 다.
- 18-20 °C에서 30 분 동안 400 x g에서 원심 분리기 (브레이크 를 해제).
- 1 mL 멸균 파이펫을 사용하여 멸균 15 mL 튜브에 층을 방해하지 않도록 단핵 세포 (약 1 mL)의 버피 코트 층을 조심스럽게 즉시 흡인합니다.
- 원심분리기 튜브의 버피 코트에 인산완충 식염수(PBS)를 적어도 3부량(~3 mL)을 첨가합니다. 멸균 피펫으로 적어도 3배 이상 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 일시 중단합니다.
- 18-20 °C에서 10 분 동안 400 x g의 원심 분리기. 상급자 흡인.
- 기저 배지 5 mL(재료 표)로세포 펠릿을 일시 중단하고 플라스크로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮니다. 37°C 및 5%CO2에서세포 배양 인큐베이터에서 세포를 배양한다.
3. CIK 유도 및 확장
- 0일째에, PBMC(1 x 106)를37°C 및 5%CO2에서가습된 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 동안 IFN-γ의 1,000 IU/mL을 함유하는 신선한 기저 배지에서 배양하였다.
- 1일째, 반 CD3 항체 50 ng/mL, rh IL-1α 의 1 ng/mL, rh IL-2의 1,000 U/mL를 포함하는 신선한 기저 배지로 배지를 새로 고칩니다. 3일마다 매번 매체를 새로 고칩니다.
- 7일째에는 1,000 U/mL의 rh IL-2가 들어있는 신선한 기초 매체로 매체를 새로 고칩니다. 세포 확장이 끝날 때까지 3일마다 배지를 새로 고칩니다(14일째).
4. CIK 세포의 평가를 위한 면역phenotnotyping
- 멸균 PBS 10 mL로 CIK 세포를 세척하십시오. 300 x g 및 18-20 °C에서 10 분 동안 원심 분리기를, 상월체를 흡인하고, PBS의 10 mL로 세포를 재중단시. 트라이판 블루 배제 분석기를 사용하여 세포 수 및 시험 세포 생존가능성을 계산한다.
- CIK 세포를 ~5-10 x 10 5 세포/mL PBS의 밀도로 6개의 멸균 1.5 mL 튜브로 Aliquot. 다음과 같이 라벨 및 치료: 튜브 1, 블랭크(항체 없음); 튜브 2, 아이소타입 IgG1-FITC의 20 μL을 첨가; 튜브 3, 아이소타입 IgG1-APC mAbs의 20 μL을 첨가; 튜브 4, CD3-FITC의 20 μL을 추가; 튜브 5, CD56-APC mAbs의 20 μL을 추가; 및 튜브 6, CD3-FITC 20 μL 및 CD56-APC mAbs 20 μL을 추가합니다.
- CIK 세포를 항체와 부드럽게 혼합하여 1 mL 멸균 파이펫으로 적어도 3배 이상 위아래로 부드럽게 피펫을 피펫한 다음 어두운 실내 온도에서 30분 동안 배양합니다.
- 300 x g 및 18−20 °C에서 10 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상급자를 흡인하고 1 mL의 PBS로 세포 펠릿을 한 번 중단시. 1 mL 멸균 파이펫으로 적어도 3배 이상 위아래로 부드럽게 피펫을 피펫으로 피펫처리합니다.
- 4.4단계를 반복합니다.
- 유동 세포 측정 해석 전에 튜브를 어둠 속에서 둡니다.
5. CD 마커 인식
- 셀 스트레이너 캡(100 μm 메쉬)을 사용하여 멸균 된 5 mL 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브로 세포 현탁액을 캡을 부드럽게 피펫팅하여 옮김을 옮김. 튜브를 회전 목마에 순서대로 놓습니다.
- 유세포분석 소프트웨어를 열고 실험 폴더를 작성합니다. 새로운 시편 버튼을 클릭하여 실험에 표본과 튜브를 추가하고 튜브의 이름을 다음과 같이 지정합니다: 튜브 1, 블랭크; 튜브 2, 아이소타입 IgG1-CD3; 튜브 3, 아이소타입 IgG1-CD56; 튜브 4, CD3; 튜브 5, CD56; 튜브 6, CD3CD56.
- CIK 세포 모집단에 대한 분산 게이팅 시스템을만듭니다(그림 2A).
- 튜브 1(공백)을 선택하고 점 도표 버튼을 클릭하여 FSC-A/SSC-A 플롯을 작성합니다. FSC-A 임계값 >5 x 104로 전체 셀 모집단에 사각형 게이트를 그려 셀 이물질을 제외합니다.
- 새 점 도표에 대한 SSC-A/SSC-H 매개변수를 선택하고 모든 단일 셀 주위에 다각형 게이트를 그립니다. 새 히스토그램 플롯에 대해 CD3(CD3) 및 개수/APC(CD56) 매개변수를 각각 선택합니다. 새 도트 플롯에 대한 FITC(CD3)/APC(CD56) 매개변수를 선택하고 4개의 사분면 게이트를 그려 4개의 하위 모집단을 정의합니다.
- 각 표본에서 20,000개의 단일 셀의 데이터를 기록합니다. 먼저 빈 제어 샘플을 분석하려면 로드 샘플 단추를 클릭합니다. CD56 및 CD3 채널 매개변수를 사용하여 전체 CIK 셀 집단을 식별합니다.
- 모든 시편에 대한 조사를 위해 5.3단계를 반복한다.
- 개별 표본의 통계 값이 포함된 파일을 열어 CIK 셀 모집단을 분석하고 분석 파일로 재인쇄합니다.
6. 인간 만성 골수성 백혈병 K562 세포 및 난소암 OC-3 세포의 배양 및 염색
- K562 셀
- 배양 K562 세포는 완전한 배지(10% 태아 소 혈청 [FBS] 및 50 U/mL 항생제를 함유하는 RPMI 기저 배지)에서 0.5-1 x 10 6 세포/mL의 밀도로 포도당을 4.5 g/L로 조정하고 37°C에서 가습된 인큐베이터에서 배양한다.
- 실험 당일 K562 세포를 함유하는 배양 배지를 50 mL 멸균 튜브로 옮기고 300 x g에서 10분 동안 18-20°C에서 펠릿을.
- 상급을 흡인하고 멸균 PBS 5 mL로 세포를 다시 일시 중단하고 부드럽게 잘 섞습니다.
- 300 x g에서 10 분 동안 세포를 펠렛. 상수부 흡입, PBS에서 세포를 다시 중단하고 K562 세포를 0.5-1 x 106 세포 / mL의 농도로 조정하십시오.
- 최종 농도 5 μM에서 15 mL 멸균 튜브에 K562 세포 현탁액의 1 mL에 CFSE 염료 0.5 μL을 추가합니다. 서스펜션을 위아래로 3배 이상 파이펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
- 튜브를 세포 배양 인큐베이터에 37°C 및 5%CO2를 10-15분 동안 방치한다.
- 9 mL의 PBS를 튜브에 넣고 세포를 300 x g에서 10 분 동안 펠렛합니다. 세포 현탁액을 세포 배양 플라스크로 옮기고 인큐베이터에 놓습니다.
- OC-3 세포
- 배양 OC-3 세포는 37°C 및 5%CO2에서세포 배양 플라스크에서 0.5-1 x 106세포의 밀도로 완전한 배지(DMEM/F12 배지 10% FBS 및 50 U/mL 항생제를 함유하는 배지)를 배양한다.
- 배양 배지를 흡인하고 실험 1일 전에 PBS로 세포를 세척하였다.
- 세포 해리 효소 용액 1 mL을 첨가하여 세포를분리하고 37 °C에서 5 분 동안 배양하십시오.
- PBS 5 mL을 추가하여 세포를 일시 중단하고 잘 부드럽게 섞습니다. 세포를 300 x g에서 10 분 동안 펠렛하고 상월체를 흡인합니다. PBS에서 세포를 다시 중단하고 세포를 0.5-1 x 106 세포 /mL의 농도로 조정합니다.
- CFSE 염료 0.5 μL을 15 mL 멸균 튜브에서 5 μM의 최종 농도에서 OC-3 세포 현탁액의 1 mL에 첨가합니다. 서스펜션을 위아래로 3배 이상 파이펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
- 튜브를 세포 배양 인큐베이터에 37°C 및 5%CO2를 10-15분 동안 방치한다.
- 튜브에 9 mL의 PBS를 추가하고 10 분 동안 300 x g에서 세포를 펠렛. 상류를 데산트 한 다음 완전한 매체로 세포 펠릿을 일시 중단합니다. 종자 5 x 105 세포 /잘 6 웰 플레이트에 37 °C 및 5 %CO2 하룻밤에 가습 인큐베이터에 배양.
7. 세포 독성 분석
- CIK 및 K562 세포의 공동 배양 (CIK-K562)
- 6.1.7단계에서 K562 세포를 카운트하고 트라이판 블루 배제 분석으로 세포 생존가능성을 시험하였다. 5 x 105/mL의 밀도로 6 개의 웰 플레이트에 K562 셀 1 mL을 각각 잘 추가하십시오.
- 다음과 같이 단계 3.4에서 6 웰 플레이트에 CIK 세포의 유무에 관계없이 기저 배지의 1 mL을 추가 : 잘 1 = 블랭크, K562 셀 혼자 (5 x 105); 잘 2 = CFSE 염색 K562 셀 만 (5 x 105); 잘 3 = CIK 세포 (E [이펙터], 25 x 105)+ CFSE 염색 K562 세포 (T [대상], 5 x 105); 음 4 = CIK 세포 (E, 50 x 105)+ CFSE 염색 K562 셀 (T, 5 x 105).
- 셀 현탁액을 위아래로 3배 이상 부드럽게 파이펫팅하여 혼합합니다. 접시를 인큐베이터에 24 시간 동안 놓습니다.
- CIK 및 OC-3 세포의 공동 배양 (CIK-OC-3)
- 다음과 같이 단계 6.2.7에서 6 웰 플레이트에 3.4 단계에서 CIK 세포의 유무에 관계없이 기저 배지의 1 mL을 추가 : 잘 1 = 블랭크, OC-3 셀 혼자 (5 x 105); 잘 2 = CFSE 염색 OC-3 세포 만 (5 x 105); 잘 3 = CIK 세포 (E, 25 x 105)+ CFSE 염색 OC-3 세포 (T, 5 x 105); 음 4 = CIK 세포 (E, 50 x 105)+ CFSE 염색 OC-3 세포 (T, 5 x 105).
- 셀 현탁액을 위아래로 3배 이상 부드럽게 파이펫팅하여 혼합합니다. 접시를 인큐베이터에 넣고 24 시간 동안 넣습니다.
- 7-아미노액티노마이신 D(7-AAD) 염색
- CIK-K562 셀 현탁액을 단계 7.1.3에서 15 mL 멸균 튜브로 직접 수확합니다.
- 7.2.2 단계에서 CIK-OC-3 기로부터 현탁액 및 부착 세포를 모두 수확한다.
- 셀 현탁액을 15 mL 멸균 튜브로 옮김. 멸균 PBS 1 mL로 잘 씻고, PBS를 수집하고, 튜브에 추가하십시오. 0.5 mL의 세포 해리 효소 용액을 추가하고 37 °C에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 동일한 튜브에서 용액의 1 mL을 해당 웰에 추가하고 1 mL 멸균 파이펫으로 적어도 3배 이상 위아래로 파이펫팅하여 셀을 부드럽게 혼합합니다. 동일한 튜브에 있는 모든 세포를 수집합니다.
- 300 x g에서 10 분 동안 원심 분리기를, 상월체를 흡인하고, 멸균 PBS의 1 mL에서 세포를 다시 중단시다. 300 x g에서 10 분 동안 세포를 펠렛하고, 상월체를 흡인하고, 멸균 PBS의 100 μL에서 세포를 재중단시.
- 셀 현탁액에 7-AAD 염료 5 μL(50 ng/μL 스톡)을 추가합니다. 1 mL 멸균 파이펫으로 적어도 3배 이상 위아래로 파이펫팅하여 세포를 부드럽게 섞습니다. 10 분 동안 배양하고 분석하기 전에 어둠 속에서 둡니다.
- 세포 분석
- 7.3.4 단계에서 셀 현탁액을 혼합하고 5.1 단계 및 5.2 단계를 한 번 반복합니다.
- 새로운 시편 버튼을 클릭하여 실험에 표본과 튜브를 추가하고 튜브의 이름을 다음과 같이 지정합니다: 튜브 1, K562(또는 OC-3) 세포만; 튜브 2, CFSE 염색 K562 (또는 OC-3) 세포만; 튜브 3, E:T = 5:1; 튜브 4, E:T = 10:1.
- 세포 용해 분석(그림 3A)에대한 분산 게이팅 시스템을 만듭니다.
- 튜브 1을 선택하고 도트 플롯 버튼을 클릭하여 FSC-A/SSC-A 플롯을 작성합니다. FSC-A 임계값 >5 x 104로 모든 이벤트에 사각형 게이트를 그려 셀 파편을 제외합니다.
- 새 점 도표에 대한 SSC-A/CFSE 매개변수를 선택합니다. 새 점도표에 대한 7AD/CFSE 매개변수를 선택하고 4사분면 게이트를 그려 4개의 하위 모집단을 정의합니다.
- 먼저 빈 제어 샘플을 분석하려면 샘플 로드 단추를 클릭합니다.
- SSC-A 및 FSC-A의 전압을 조정합니다. CFSE 및 7-AAD 채널 매개변수를 사용하여 죽은 세포 집단을 식별합니다. 각 시편에서 >20,000 CFSE+ 셀의 데이터를 기록합니다.
- 모든 표본을 조사하기 위해 7.4.6 절을 반복하십시오.
- 각 개별 표본의 통계 값을 포함하는 파일을 열어 실행 불가능한 셀 모집단을 분석하고 데이터를 분석 파일로 내보냅니다.
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Representative Results
본 프로토콜의 목적은 말초 혈액 단핵구로부터 사이토카인 유도 살인자(CIK) T 세포를 분리 및 확장하고 혈액학적 악성 종양 및 고형 암 세포에 대해 CIK의 세포 독성 효과를 각각 평가하는 것이다. CIK의 유도는 CD3/CD56 인식에 의해 확인되었다. 그림 1A는 CIK 유도 및 확장에 대한 프로토콜을 나타낸다. 건강한 공여자로부터CD3+CD56+ T 세포의 하위 집단을 분석하기 위한 게이팅 전략의 대표적인 결과는 도 1B에예시된다. 도 1C는 3명의 개인으로부터의 CIK 비율의 통계 분석을 나타낸다.
도 2A는 CD3+ CD56+ 세포 비율(원래 PBMC에 대해 0.65%, 좌측 하부 패널 및 14일째에 수확된 CIK 셀에 대해 27.4%, 오른쪽 하부 패널)이 14일 확장 후 크게 증가한 것을 나타낸다. 우리의 배양 시스템에서, CIK 세포는 PBMC의 원래 수에 비해 약 반 백 배 변화를 산출(그림 2B).
도 3은 인간 만성 골수성 백혈병 K562 세포 및 인간 난소암 OC-3 세포에 대한 CIK의 세포독성 효과를 나타낸다. K562 또는 OC-3 세포(표적, T)는 비형광 염료(CFSE)로 염색되었고, 이는 생존 가능한 세포 내의 세포내 에스테라제에 의해 갈라진 후 고도로 형광 염료가 되었다. 세포독성 동배 연구에서, CFSE 염색 된 K562 또는 OC-3 세포를 24 시간 동안 CIK 세포로 공동 처리하였다. 인큐베이션이 끝나면, 총 세포를 7-AAD 염료로 수확하고 염색하였는데, 이는 핵산 결합 염료로 죽은 세포 배제를 위한 생존 성 프로브로서 사용된다. CIK 및 CFSE+ 셀의 크기 및 세분성은 도 3A에도시되어 있습니다. CFSE 염색된 K562 세포(표적 세포, T)를 각각 E/T=0:1, 5:1 및 10:1의 비율로 CIK 세포(effector cells, E)와 공동 처리하였다. CFSE+ K562 세포의 7-AAD+ 세포를 모두 평가하였다. 통계 결과는 3개의 독립적인 실험으로부터 하였다. 기저 포해는 이펙터 세포가 없는 경우의 세포 사멸의 백분율을 의미한다(E:T = 0:1). 도 3B는 24시간 배양 후 OC-3 세포에 대한 CIK의 명백한 세포 독성을 나타낸다(E:T = 10:1).
도 1: 사이토카인-유도 킬러 세포 유도 및 확장의 흐름 차트. (a)동의된 건강한 기증자로부터의 PBMC는 처음에 rhIFN-γ(Day 0)에 노출되었고, 그 다음으로 rhIL-2, rhIL-1α 및 항-CD3 mAb(1일째)가 3일마다(4일째) 하였다. 이어서, 배지를 3일마다 rhIL-2 함유 배지로 새로 고치고 세포를 14일째에 수확하였다. (B)유도 7 일 동안 CIK 세포의 형태. CIK 세포의 활성화 및 확장은 프로토콜에 기재된 바와 같이 수행되었다. 세포는 각각 1일, 5일 및 7일에 광 현미경으로 관찰하였다(배율 = 40x, 스케일 바 = 200 μm). (C)세포 수를 매주 수행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 대표적인 PBMC 샘플로부터의CD3+CD56+ T 세포의 비율. (A)림프구는 특정 크기 및 세분성으로 인식되었다. 유세포분석에 의한 분석을 위해 선택된 단일 세포 집단. (b)3명의 건강한 공여자로부터의 CIK 팽창 효능의 통계적 분석은 t-검정(*, p< 0.01)을 이용하여 수행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 인간 만성 골수성 백혈병 K562 및 인간 난소암 OC-3 세포에 대한 CIK 세포의 세포독성 효과. (a)24시간 동안 CIK 세포와 의 교양 후, K562 표적 세포는 CFSE 염료의 염색에 기초하여 인식 및 게이트하였다. 선택된 7-AAD/CFSE 파라미터 하에서 총 세포 집단의 사분면 그림 및 표시된 E:T 비율에서 CIK 세포의 누적 세포 독성. (B)E:T = 10:1 비율로 OC-3 세포에 대한 CIK 세포의 세포 독성 효과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
기재된 방법은 건강한 공여자들의 전혈 샘플로부터 세포독성 사이토카인 유도 킬러(CIK) T 세포의 격리 및 확장을 위한 빠르고, 편리하고, 신뢰할 수 있는 프로토콜이다. 또한 유세포분석 설정 및 추적(CS&T) 시스템을 이용한 백혈병(K562) 및 난소암세포(OC-3)에 대한 CIK의 세포독성 효과를 나타낸다. CIK 세포는 GMP 등급 사이토카인 및 무혈청 배지를 사용하여 추가적인 임상 주입을 위해 좋은 제조소 관행(GMP) 조건에서 유도 및 확장될 수있다 11. 그러나, CIK 유도 및 확장의 효능은 개인적 차이를 나타낸다12,13,14. 더욱이, 안전성은 암 세포 치료를 위한 환자 유래 CIK 세포의 주입의 이점이다. CIK 세포는 주로 NKG2D 의존적 방식으로 상피 고형 암세포에 세포용광 효과를 발휘한다고 보고되었다. 혈액학적암세포에서, 특정 항체로 NKG2D를 차단하면 NKG2D-로우 K562 세포에 대한 CIK 유도 세포 독성을 현저히 억제한다; 그러나, 이 처리는 NKG2D15결이없는 HL-60 세포에 어떤 효력도 없습니다. 더욱이, CIK 세포는CD8+ CIK세포(16)에비해 K562 세포에 대하여 더 적은 세포 사멸 활성을 나타낸다. 이 연구에서는, 우리는 CIK가 백혈병 K562 세포에 비해 난소암 OC-3 세포에 대하여 더 중대한 세포독성 잠재력을 전시했다는 것을 것을을 발견했습니다. 이 데이터는 CIK 이펙터가 종양 세포를 죽이는 정확한 분자 기계장치가 아직 명확하지 않다는 것을 건의합니다.
표적세포 생존가능성을 추적하고 유세포세포를 이용한 이펙터 세포의 세포독성 전위를 평가하는 것은 임상시험17에대한 표준및 통상적인 방법이 되었다. 유세포측정을 이룬 CFSE 염색 림프구에서CD3+모집단과 같은 활성화 마커의 발현 및 세포 생존력에 부정적인 효과가 관찰되는 것이18,19로제안되고 있다. 따라서, 표적 암세포를 염색하는 것은 1차 CIK 세포의 세포독성 효과를 평가하기 위한 보다 효과적인 전략이다. IFN-γ, OKT3 및 IL-2는 CIK 분화 및 증식을 위한 주요 사이토카인 또는 자극제이다. 더욱이, 티모글로불린, IL-1α, IL-10, IL-15와 같은 다른 인자들도 자극제이다. 현재, 인간 혈청, 인간 혈소가 풍부한 혈장, 심지어 태아 소 혈청은 CIK 세포의 증식을 향상시킬 수있는 배지 보충제로 사용됩니다. 혈청 이나 플라즈마는 영양소와 성장 인자로 풍부하지만, 동종 동물 제품의 추가는 실험 적 가변성을 초래하는 소스, 배치 및 많은 변화를 제시하고, 필연적으로 배양 된 세포에 대한 치료 결과와 연구를 당황. 본 연구에서는 시판되는 무혈청, 알부민 이없음, 제노 프리 GMP 등급 배지를 임상 등급사이토카인으로 보충하여 CIK 세포를 성공적으로 배양시켰습니다. xeno-free 또는 동종 없는 보충제를 사용 하 여 단점은 그들은 세포 증식의 효능을 줄일.
프로토콜에 제공된 2색 세포 추적 방법은 직접 세포 독성 분석법에서 실행 가능한 또는 죽은 이펙터 표적 세포를 독립적으로 계산하였다. 우리의 게이팅 전략에서, CFSE+ 표적 세포는 CIK 이펙터 세포와 명백하게 구별될 수 있다(그림3). 가장 중요한 것은 CIK 유도 및 확장 프로세스가 자격을 갖추어야 하며 높은 생존력을 보여야 한다는 것입니다. 추가 다중 복용량 주입을 위해, 동결 보존의 조건, 그리고 해동 후 생존력과 세포 독성은 다른 중요한 도전이다. 특정 용해의 실제 비율은 100 x의 비율과 같습니다 (%샘플 용해 - %기저 용해)/(100 - %Basal 용해). 다른 연구와 는 달리18,20,모든 표적 세포는 CIK 세포의 정확하고 실제 세포 독성을 밝히기 위해 조사되는 것이 좋습니다.
결론적으로, 본 연구에서 기술된 프로토콜은 건강한 기증자로부터 PBMC 유래 CIK 세포의 수를 증가시키고 선택적 추적을 위한 2색 광활성 프로브를 사용하여 암세포에 대한 세포 독성 기능을 평가하기 위해 고안되었습니다. 체외 진단 (IVD) 시스템을 가진 유동 세포측정에 의하여 표적 세포.
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Disclosures
저자는 재정적 이익의 경쟁 충돌을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 의과 대학 병원에 의해 지원되었다 (DMR 세포-1809).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-Amino Actinomycin D | BD | 559925 | |
| APC Mouse Anti-Human CD56 antibody | BD | 555518 | B159 |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | MOPC-21 |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD | 338962 | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | BD | 565082 | |
| D-(+)-Glucose solution | SIGMA | G8644 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 | HyClone | SH30023.02 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare Life Sciences | 71101700-EK | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody | BD | 555332 | UCHT1 |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555748 | MOPC-21 |
| Human anti-CD3 mAb | TaKaRa | T210 | OKT3 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Proleukin | NOVARTIS | ||
| Recombinant Human Interferon-gamma | CellGenix | 1425-050 | |
| Recombinant Human Interleukin-1 alpha | PEPROTECH | 200-01A | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 11875-085 | |
| Sigma 3-18K Centrifuge | Sigma | 10295 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12605028 | |
| X-VIVO 15 medium | Lonza | 04-418Q |
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