Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Isolasjon og utvidelse av cytotoktoktokin-indusert killer T-celler for kreftbehandling

Published: January 24, 2020 doi: 10.3791/60420
Automatic Translation
1,2,3, 4, 4,5, 4,6,7, 1,2, 1,2, 4, 4
1Department of Urology, Wan Fang Hospital, 2Department of Urology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Graduate Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Translational Cell Therapy Center, Department of Medical Research, China Medical University Hospital, 5Graduate Institute of Biomedical Sciences, China Medical University, 6Graduate Institute of Immunology, China Medical University, 7Department of Neurosurgery, Neuropsychiatric Center, China Medical University Hospital

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å utføre isolasjon og utvidelse av perifert blod mononukleære celler-avledet cytokin-indusert CD3+CD56+ killer celler og illustrere deres cytotoksiskitet effekt mot hematologiske og solide kreftceller ved hjelp av en in vitro diagnose flyt cytometri system.

Abstract

Adoptivcellulær immunterapi fokuserer på å gjenopprette kreftgjenkjenning via immunsystemet og forbedrer effektiv tumorcelledrap. Cytokin-indusert morder (CIK) T celleterapi har blitt rapportert å utøve betydelige cytotoksiske effekter mot kreftceller og for å redusere de negative effektene av kirurgi, stråling og kjemoterapi i kreftbehandlinger. CIK kan avledes fra perifere blodmononukleære celler (PBMCs), benmarg, og navlestreng blod. CIK celler er en heterogen underpopulasjon av T-celler med CD3+CD56+ og naturlig killer (NK) fenotypiske egenskaper som inkluderer store histokompatibilitet kompleks (MHC) -ubegrenset antitumor aktivitet. Denne studien beskriver en kvalifisert, klinisk anvendelig, flow cytometribasert metode for kvantifisering av cytolytisk evne til PBMC-avledede CIK-celler mot hematologiske og solide kreftceller. I cytolytisk analyse er CIK-celler koinert i forskjellige forhold med forutforede måltumorceller. Etter inkubasjonsperioden bestemmes antall målceller av en nukleinsyrebindende flekk for å oppdage døde celler. Denne metoden gjelder for både forsknings- og diagnostiske applikasjoner. CIK-celler har potent cytotoksisitet som kan utforskes som en alternativ strategi for kreftbehandling ved sin prekliniske evaluering av et cytometeroppsett og -sporing (CS & T)-basert flytcytometrisystem.

Introduction

Cytotoksiske T-lymfocytter er en spesifikk immuneffekteller cellepopulasjon som formidler immunresponsmot kreft. Flere effector cellepopulasjoner inkludert lymfaokin-aktiverte killer (LAK) celler, tumor-infiltrerende lymfocytter (TILs), naturlige killer (NK) celler, γδ T celler, og cytokin-indusert killer (CIK) celler har blitt utviklet for adoptiv T celleterapi (ACT) formål1. Det er en økende interesse for CIK-celler, fordi de representerer en blanding av cytokininduserte cytotoksiske cellepopulasjoner utvidet fra autologperifere blodmononukleære celler (PMBCs)2.

Den ukontrollerte veksten av lymfode stamceller, myeloblaster og lymfoblaster fører til tre hovedtyper av blodkreft (dvs. leukemi, lymfom og myelom), solide svulster, inkludert karsinomer (f.eks. lungekreft, magekreft, livmorhalskreft) og sarkomer, blant annet kreft3. CIK celler er en blanding av cellepopulasjoner som viser et bredt spekter av store histokompatibilitet smimer (MHC)-ubegrenset antitumor aktivitet og dermed holde løfte om behandling av hematologiske og avanserte svulster4,5,6,7. CIK celler består av en kombinasjon av celler, inkludert T-celler (CD3+CD56−),NK-T celler (CD3+CD56+), og NK celler (CD3-CD56+). Optimalisering av CIK induksjonsprotokollen ved bruk av en fast tidsplan for tillegg av IFN-γ, anti-CD3 antistoff og IL-2, resulterer i utvidelse av CIK celler8. Cytotoksisk evne til CIK-celler mot kreftceller avhenger hovedsakelig av engasjementet til NK gruppe 2 medlem D (et medlem av C-type lectin-lignende reseptor familie) NKG2D ligands på tumorceller, og på perforin-medierte veier9. Resultatene av en preklinisk studie viste at IL-15-stimulerte CIK-celler induserte potent cytotoksisitet mot primære og akutte myelogen leukemi cellelinjer in vitro og viste en lavere alloreaktivitet mot normale PBMCs og fibroblaster9. Nylig ble utfallet av engangs sunn donor-avledet CIK (1 x 108/ kg CD3+ celler) infusjon som konsolidering etter nonmyeloabliv allogen transplantasjon for myelogen neoplasmer behandling i en fase II klinisk studie publisert10.

I den nåværende studien utviklet vi en optimalisert cellekulturformel bestående av IFN-γ, IL-1α, anti-CD3 antistoff og IL-2 lagt til hematopoetisk cellemedium for å øke CIK-produksjonen, og undersøkte den cytotoksiske effekten av CIK-celler mot menneskelig kronisk myelogen leukemi (K562) celler og eggstokkreft (OC-3) celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den kliniske protokollen ble utført og godkjent i samsvar med retningslinjene til Institutional Review Board i China Medical University and Hospital Research Ethics Committee. Perifere blodprøver ble høstet fra friske frivillige med deres informerte samtykke.

1. Utarbeidelse av materialer

  1. Lagre reagenser, antistoffer og kjemikalier som vist i materialsikkerhetsdatabladet (MSDS). Oppløs stoffene eller cytokinene i løsemidler som lagerløsninger og deretter aliquot for lagring ved -20 °C eller -80 °C.
    MERK: Detaljert informasjon for materialforberedelse er notert i materialtabellen.

2. PBMC-isolasjon

  1. Varm tetthetgradientoppløsningen (Materialtabell) til 18–20 °C før bruk. Inverter løsningsflasken flere ganger for å sikre grundig blanding.
  2. Samle 3-5 ml human venøs blodprøve i et heparinisert hetteglass og bland godt ved å forsiktig invertere røret flere ganger.
  3. Forbered 4 ml tetthetgradientløsning i et 15 ml sterilt rør.
  4. Lag forsiktig 1 ml blodprøven på tetthetsgradientoppløsningen.
  5. Sentrifuge ved 400 x g i 30 min ved 18-20 °C (slå av pausen).
  6. Forsiktig og umiddelbart aspirer ekle lag av enukleære celler (ca 1 ml) samtidig for å unngå å forstyrre lagene til et sterilt 15 ml rør ved hjelp av en 1 ml steril pipette.
  7. Tilsett minst 3 bind (~ 3 ml) fosfatbufret saltvann (PBS) til buffy-strøket i sentrifugerøret. Heng cellene ved å forsiktig pipettere dem opp og ned minst 3x med en steril pipette.
  8. Sentrifuge ved 400 x g i 10 min ved 18–20 °C. Aspirer supernatanten.
  9. Heng cellepelleten med 5 ml basalmedium (Materialtabell) og overfør til en kolbe. Kultur cellene i en cellekulturinkubator ved 37 °C og 5% CO2.

3. CIK induksjon og utvidelse

  1. På dag 0, kultur PBMCs (1 x 106) i frisk basal medium som inneholder 1000 IE / ml IFN-γ for 24 timer i en fuktet celle kultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. På dag 1, oppdater mediet med friskt basalmedium som inneholder 50 ng / ml anti-CD3 antistoff, 1 ng / ml rh IL-1α, og 1000 U / ml rh IL-2. Oppdater mediet hver tredje dag.
  3. På dag 7, oppdatere mediet med friskt basalmedium som inneholder 1000 U / ml rf IL-2. Oppdater mediet hver tredje dag til slutten av celleutvidelsen (dag 14).

4. Immunfenotyping for vurdering av CIK-celler

  1. Vask CIK-cellene med 10 ml steril PBS. Sentrifuge i 10 min ved 300 x g og 18-20 °C, aspirere supernatanten, og resuspendere cellene med 10 ml PBS. Telle cellenummeret og testcellelevedyktigheten ved hjelp av trypan blå ekskluderingsanalyse.
  2. Aliquot CIK cellene i seks sterile 1,5 ml rør med en tetthet på ~ 5-10 x 105 celler / ml PBS. Etikett og behandle som følger: Rør 1, Blank (ingen antistoff); Rør 2, tilsett 20 μL isotype IgG1-FITC; Rør 3, tilsett 20 μL isotype IgG1-APC mAbs; Rør 4, tilsett 20 μL CD3-FITC; Rør 5, tilsett 20 μL CD56-APC mAbs; og Rør 6, tilsett 20 μL CD3-FITC og 20 μL CD56-APC mAbs.
  3. Bland forsiktig CIK-cellene med antistoffene ved å forsiktig pipettere dem opp og ned minst 3x med en 1 ml steril pipette, og deretter inkubere i 30 min ved romtemperatur i mørket.
  4. Sentrifuge rørene i 10 min ved 300 x g og 18-20 °C. Aspirer supernatanten og suspendere cellepellet en gang med 1 ml PBS. Rør dem forsiktig opp og ned minst 3x med en 1 ml steril pipette.
  5. Gjenta trinn 4.4.
  6. La rørene stå i mørket før flyt cytometrisk analyse.

5. GJENKJENNING AV CD-markør

  1. Overfør cellesuspensjonen til et sterilt 5 ml polystyren rundt bunnrør med en cellesilhette (100 μm mesh) ved å forsiktig pipettere gjennom hetten. Sett rørene på karusellen i orden.
  2. Åpne flow cytometry analyse programvare og opprette en eksperimentell mappe. Klikk på Ny prøve-knappen for å legge til en prøve og rør i eksperimentet og gi rørene navnet på følgende: Tube 1, Blank; Rør 2, Isotype IgG1-CD3; Rør 3, Isotype IgG1-CD56; Rør 4, CD3; Rør 5, CD56; Rør 6, CD3CD56.
  3. Opprett et scatter-gatingsystem for CIK-cellepopulasjonene (figur 2A).
    1. Velg Tube 1 (Blank) og klikk på Dot Plot-knappen for å opprette et FSC-A/SSC-A-plott. Tegn en rektangelport over hele cellepopulasjonen med en FSC-A-terskel > 5 x 104 for å utelukke celleavfall.
    2. Velg Parameteren SSC-A/SSC-H for det nye punktplottet, og tegn en polygonport rundt alle enkeltceller. Velg parameteren Antall/FITC (CD3) og Count/APC (CD56) for det nye histogrammet plottet. Velg parameteren FITC (CD3)/APC (CD56) for det nye punktplottet, og tegn en fire kvadrantport for å definere de fire underpopulasjonene.
    3. Registrer dataene fra 20 000 enkeltceller i hver prøve. Klikk Last inn eksempel-knappen for å analysere eksemplet på tom kontroll først. Identifiser hele CIK-cellepopulasjonen ved hjelp av cd56- og CD3-kanalparameterne.
  4. Gjenta trinn 5.3 for undersøkelse av alle prøver.
  5. Åpne filene som inneholder de statistiske verdiene for den enkelte prøven for å analysere CIK-cellepopulasjoner og skrive dem ut på nytt i analysefiler.

6. Kulturing og farging av menneskelig kronisk myelogen leukemi K562 celler og eggstokkreft OC-3 celler

  1. K562 celler
    1. Kultur K562 celler i komplette medier (RPMI basal medium som inneholder 10% føtal storfe serum [FBS] og 50 U / ml antibiotika og justere glukose til 4,5 g / L) med en tetthet på 0,5-1 x 106 celler / ml i en cellekultur kolbe og inkubator i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
    2. Overfør kulturmediet som inneholder K562-cellene til 50 ml sterile rør og pellet cellene ved 300 x g i 10 min ved 18-20 °C på dagen for eksperimentet.
    3. Aspirer supernatanten, resuspender cellene i 5 ml sterile PBS, og bland godt forsiktig.
    4. Pellet cellene på 300 x g i 10 min. Aspirer supernatanten, resuspender cellene i PBS, og juster K562 cellene til en konsentrasjon på 0,5-1 x 106 celler / ml.
    5. Tilsett 0,5 μL CFSE-farge til 1 ml K562 cellesuspensjon i et 15 ml sterilt rør ved en endelig konsentrasjon på 5 μM. Bland forsiktig suspensjonen ved å pipettere opp og ned minst 3x.
    6. La røret stå i en cellekulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i 10–15 min.
    7. Legg 9 ml PBS til røret og pellet cellene på 300 x g i 10 min. Dekanter supernatanten og deretter suspendere cellepellet i 10 ml komplette medier. Overfør cellesuspensjonen til en cellekulturkolbe og plasser i inkubatoren.
  2. OC-3 celler
    1. Kultur OC-3 celler i komplette medier (DMEM / F12 medium som inneholder 10% FBS og 50 U / ml antibiotika) med en tetthet på 0,5-1 x 106 celler i en cellekultur kolbe på 37 ° C og 5% CO2.
    2. Aspirer kulturmediene og vask cellene med PBS 1 dag før eksperimentet.
    3. Løsne cellene ved å legge til 1 ml celledissosiasjonsenzymoppløsning (Materialtabell) og inkuber i 5 min ved 37 °C.
    4. Suspender cellene ved å legge til 5 ml PBS og bland godt forsiktig. Pellet cellene på 300 x g i 10 min og aspirer supernatant. Resuspender cellene i PBS og juster cellene til en konsentrasjon på 0,5–1 x 106 celler/ml.
    5. Tilsett 0,5 μL CFSE-farge til 1 ml OC-3-cellesuspensjon i et 15 ml sterilt rør ved en endelig konsentrasjon på 5 μM. Bland forsiktig suspensjonen ved å pipettere opp og ned minst 3x.
    6. La røret stå i en cellekulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i 10–15 min.
    7. Legg 9 ml PBS til røret og pellet cellene på 300 x g for 10 min. Dekanter supernatanten og deretter suspendere cellepellet med komplette medier. Frø 5 x 105 celler/brønn inn i en 6 brønnplate og inkubator i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 over natten.

7. Cytotoksisk analyse

  1. Coculture av CIK og K562 celler (CIK-K562)
    1. Tell K562-cellene fra trinn 6.1.7 og test cellelevedyktigheten ved å prøve den blå ekskluderingsanalysen. Tilsett 1 ml K562 celler til hver brønn i en 6 brønnplate med en tetthet på 5 x 105/ml.
    2. Tilsett 1 ml basalmedium med eller uten CIK-celler fra trinn 3,4 til 6 brønnplaten fra trinn 7.1.1 som følger: Vel 1 = Blank, K562 celler alene (5 x 105); Vel 2 = CFSE-beiset K562 celler alene (5 x 105); Vel 3 = CIK celler (E [effektor], 25 x 105) + CFSE-beiset K562 celler (T [mål], 5 x 105); Vel 4 = CIK celler (E, 50 x 105)+ CFSE-beiset K562 celler (T, 5 x 105).
    3. Bland cellesuspensjonene ved å forsiktig pipettere dem opp og ned minst 3x. Legg platen i inkubatoren i 24 timer.
  2. Coculture av CIK og OC-3 celler (CIK-OC-3)
    1. Legg til 1 ml basalmedium med eller uten CIK-celler fra trinn 3,4 til 6 brønnplaten fra trinn 6.2.7 som følger: Vel 1 = Blank, OC-3 celler alene (5 x 105); Vel 2 = CFSE-farget OC-3 celler alene (5 x 105); Vel 3 = CIK celler (E, 25 x 105)+ CFSE-farget OC-3 celler (T, 5 x 105); Vel 4 = CIK celler (E, 50 x 105)+ CFSE-farget OC-3 celler (T, 5 x 105).
    2. Bland cellesuspensjonene ved å forsiktig pipettere dem opp og ned minst 3x. Sett platen i inkubatoren i 24 timer.
  3. 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) fargefarging
    1. Høst CIK-K562 cellesuspensjonen fra trinn 7.1.3 direkte inn i et 15 ml sterilt rør.
    2. Høst både suspensjon og tilhengerceller fra CIK-OC-3-gruppene fra trinn 7.2.2.
      1. Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml sterilt rør. Vask brønnen med 1 ml steril PBS, samle PBS, og legg til røret. Tilsett 0,5 ml celledissosiasjonsenzymoppløsning, og inkuber i 5 min ved 37 °C.
      2. Tilsett 1 ml av løsningen fra samme rør til den tilsvarende brønnen og bland forsiktig cellene ved å pipettere dem opp og ned minst 3x med en 1 ml steril pipette. Samle alle cellene i samme rør.
    3. Sentrifuge ved 300 x g i 10 min, aspirere supernatanten, og resuspendere cellene i 1 ml steril PBS. Pellet cellene på 300 x g i 10 min, aspirer supernatanten, og resuspenderceller i 100 μL sterile PBS.
    4. Tilsett 5 μL 7-AAD-farge (50 ng/μL-lager) i cellesuspensjonen. Bland cellene forsiktig ved å pipettere dem opp og ned minst 3x med en 1 ml steril pipette. Inkuber i 10 min og la det stå i mørket før analysen.
  4. Cytolytisk evne analyse
    1. Bland cellesuspensjonen fra trinn 7.3.4 og gjenta trinn 5.1 og 5.2 én gang.
    2. Klikk på Ny prøve-knappen for å legge til en prøve og rør i eksperimentet og gi rørene bare navnet på følgende: Bare Rør 1, K562 (eller OC-3). Rør 2, CFSE-beiset K562 (eller OC-3) celler bare; Rør 3, E:T = 5:1; Rør 4, E:T = 10:1.
    3. Opprett et scatter-gatingsystem for cytolytisk analyse (figur 3A).
      1. Velg Tube 1 og klikk på Dot Plot-knappen for å opprette et FSC-A/SSC-A-plott. Tegn en rektangelport over alle hendelser med en FSC-A-terskel > 5 x 104 for å utelukke celleavfall.
      2. Velg parameteren SSC-A/CFSE for det nye punktplottet. Velg parameteren 7-AAD/CFSE for det nye punktplottet, og tegn en firekvarantport for å definere de fire underpopulasjonene.
      3. Klikk Last inn eksempel-knappen for å analysere det tomme kontrolleksemplet først.
      4. Juster spenningen til SSC-A og FSC-A. Identifiser den døde cellepopulasjonen ved hjelp av CFSE- og 7-AAD-kanalparametrene. Registrer dataene fra > 20 000 CFSE+ celler i hver prøve.
    4. Gjenta pkt. 7.4.6 for utredning av alle prøver.
    5. Åpne filene som inneholder statistiske verdier for hver enkelt prøve for å analysere de ikke-levedyktige cellepopulasjonene og eksportere dataene til analysefiler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Formålet med den nåværende protokollen er å isolere og utvide cytokin-indusert ei (CIK) T-celler fra perifere blodmonocytter og evaluere cytotoksisk effekt av CIK mot hematologisk malignitet og solide kreftceller. Induksjon av CIK ble identifisert av CD3/CD56-gjenkjenningen. Figur 1A viser protokollen for CIK induksjon og utvidelse. De representative resultatene av gating strategi for å analysere underpopulasjonen av CD3+CD56+ T celler fra friske donorer er illustrert i figur 1B. Figur 1C viser den statistiske analysen av CIK-andelen fra tre personer.

Figur 2A viser at CD3+CD56+ celleproporsjonen (0,65% for den opprinnelige PBMC, venstre nedre panel og 27,4% for CIK-cellene høstet på dag 14th, høyre nedre panel) betydelig økt etter 14 dager med ekspansjon. I vårt kultursystem ga CIK-cellene omtrent en halv ganger endring sammenlignet med det opprinnelige antallet PBMCer (figur 2B).

Figur 3 viser den cytotoksiske effekten av CIK mot human kronisk myelogen leukemi K562 celler og humane ovariekreft OC-3 celler. K562 eller OC-3 celler (mål, T) ble farget med en ikke-fluorescerende farget (CFSE), som ble spaltet av intracellulære esterases i levedyktige celler og deretter ble en svært fluorescerende fargetan. I cytotoksisk kokulturstudien ble CFSE-beiset K562- eller OC-3-celler behandlet sammen med CIK-celler i 24 timer. På slutten av inkubasjonen ble de totale cellene høstet og farget med 7-AAD-farge, som er et nukleinsyrebindende farge som brukes som en levedyktighetssonde for død celleeksklusjon. Størrelsen og detaljrikdommen til CIK- og CFSE+ cellene er illustrert i figur 3A. CFSE-beiset K562-celler (målceller, T) ble behandlet samtidig med CIK-celler (effektorceller, E) i et forhold mellom E/T = henholdsvis 0:1, 5:1 og 10:1. De 7-AAD+ cellene i CFSE+ K562 cellene ble alle evaluert. De statistiske resultatene var fra tre uavhengige eksperimenter. Basal lysis betyr prosentandelen av celledød i fravær av effektorceller (E:T = 0:1). Figur 3B viser den åpenbare cytotoksisiteten til CIK mot OC-3-celler (E:T = 10:1) etter 24 timer inkubasjon.

Figure 1
Figur 1: Flytskjema av cytokininduserte morderceller induksjon og utvidelse. (A)PBMCer fra samtykkede friske donorer ble opprinnelig utsatt for rhIFN-γ (Dag 0), etterfulgt av rhIL-2, rhIL-1α og anti-CD3 mAb (dag 1) hver 3. Deretter ble mediet oppdatert med rhIL-2-inneholdende medium hver tredje dag, og cellene ble høstet på dag 14. (B) Morfologi av CIK celler under 7 dager med induksjon. Aktivering og utvidelse av CIK-celler ble utført som beskrevet i protokollen. Celler ble observert under et lett mikroskop på henholdsvis dag 1, 5 og 7 (forstørrelse = 40x, skalabar = 200 μm). (C) Celletellinger ble utført ukentlig. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Andelen CD3+CD56+ T-celler fra et representativt PBMC-eksempel. (A) Lymfocytter ble anerkjent av spesifikk størrelse og detaljrikdom. Valgt enkeltcellepopulasjon for analyse etter flytcytometri. (B) Statistisk analyse av CIK-utvidelseseffekt fra tre friske donorer ble utført ved hjelp av en t-test (*, p < 0,01). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Cytotoksiske effekter av CIK-celler mot human kronisk myelogen leukemi K562 og humane ovariekreft OC-3 celler. (A) Etter coculture med CIK cellene i 24 timer, K562 målceller ble gjenkjent og inngjerdet basert på farging av CFSE farge. Quadrant illustrasjon av den totale cellepopulasjonen under den valgte 7-AAD / CFSE parameteren og den kumulative cytotoksisitetav CIK celler ved det angitte E:T forholdet. (B) Den cytotoksiske effekten av CIK-celler mot OC-3 celler ved et E:T = 10:1-forhold. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrevne metoden er en rask, praktisk og pålitelig protokoll for isolasjon og utvidelse av cytokininduserte drapsmann (CIK) T-celler fra hele blodprøver av friske donorer. Det viser også cytotoksisk effekt av CIK mot leukemi (K562) og eggstokkreftceller (OC-3) ved hjelp av en flyt cytometri oppsett og sporing (CS & T) system. CIK celler kan induseres og utvides i gode manufactory praksis (GMP) forhold ved hjelp av GMP-grade cytokiner og serum-fri medium for videre klinisk infusjon11. Effekten av CIK induksjon og utvidelse viser imidlertid individuelle forskjeller12,13,14. Videre er sikkerhet fordelen med infusjon av pasientavledede CIK-celler for kreftcellebehandling. Det har blitt rapportert at CIK-celler utøver cytolytiske effekter på epitelsolide kreftceller hovedsakelig på en NKG2D-avhengig måte. I hematologiske kreftceller hemmer blokkering av NKG2D med et bestemt antistoff betydelig CIK-indusert cytotoksisitet mot NKG2D-lav K562-celler; Denne behandlingen har imidlertid ingen effekt på HL-60-celler som mangler NKG2D15. Videre viser CIK-celler mindre celledrepende aktivitet mot K562-celler sammenlignet med CD8+ CIK-celler16. I denne studien fant vi at CIK viste et større cytotoksisk potensial mot eggstokkreft OC-3 celler sammenlignet med leukemi K562 celler. Disse dataene tyder på at de eksakte molekylære mekanismene der CIK-effektorer dreper tumorceller ennå ikke er klare.

Sporing av målcellelevedyktighet og evaluering av cytotoksisk potensial av effektorceller ved hjelp av flow cytometri har blitt en standard og konvensjonell metode for klinisk undersøkelse17. Det er foreslått at en negativ effekt observeres på cellenlevedyktighet og uttrykk for aktiveringsmarkører, for eksempel CD3+ populasjon en CFSE-farget lymfocytter med flow cytometri18,19. Dermed er farging av målkreftcellene en mer effektiv strategi for å evaluere de cytotoksiske effektene av primære CIK-celler. IFN-γ, OKT3 og IL-2 er store cytokiner eller stimulatorer for CIK differensiering og spredning. Videre er andre faktorer som thymoglobulin, IL-1α, IL-10, IL-15, også stimulatorer. For tiden brukes humant serum, humant blodplaterikt plasma og til og med føtal storfeserum som middels kosttilskudd som kan forbedre spredningen av CIK-celler. Selv om serum eller plasma er beriket med næringsstoffer og vekstfaktorer, presenterer tillegg av allogene animalske produkter kilde,batch og mange variasjoner som resulterer i eksperimentell variasjon, og uunngåelig urovekkende studier med terapeutiske resultater for kultiverte celler. I denne studien brukte vi en kommersielt tilgjengelig serumfri, albuminfri og xeno-fri GMP-klasse media supplert med klinisk-grade cytokiner for å lykkes med å kultur CIK cellene. Ulempen med å bruke xeno-frie eller allogene-frie kosttilskudd er at de reduserer effekten av cellespredning.

To-fargecellesporingsmetodene i protokollene beregnet uavhengig levedyktige eller døde effekteller målceller i en direkte cytotoksisitetsanalyse. I våre gating strategier, CFSE+ målceller kan åpenbart skilles fra CIK effektor celler(Figur 3). Viktigst av alt, prosessen med CIK induksjon og utvidelse må være kvalifisert og vise høy levedyktighet. For ytterligere flerdoseringsinfusjoner er tilstanden til kryopreservation, og levedyktigheten og cytotoksisiteten etter tining, andre kritiske utfordringer. Det faktiske forholdet mellom spesifikk lysis tilsvarer andelen 100 x (%Eksempellysis - %Basal lysis)/(100 - %Basal lysis). I motsetning til andre studier18,20, anbefales det at alle målceller undersøkes for å avsløre den nøyaktige og faktiske cytotoksisiteten til CIK-celler.

Til slutt er protokollen beskrevet i denne studien utformet for å øke antall PBMC-avledede CIK-celler fra friske donorer og for å evaluere deres cytotoksiske funksjoner mot kreftceller med to-farge fotoaktiverelige sonder for selektiv sporing av målceller ved en flytcytometri med et in vitro diagnostisk system (IVD).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av China Medical University Hospital (DMR-Cell-1809).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-Amino Actinomycin D BD 559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody BD 555518 B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control BD 555751 MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer BD 338962
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) BD 565082
D-(+)-Glucose solution SIGMA G8644
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 HyClone SH30023.02
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare Life Sciences 71101700-EK
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody BD 555332 UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control BD 555748 MOPC-21
Human anti-CD3 mAb TaKaRa T210 OKT3
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Proleukin NOVARTIS
Recombinant Human Interferon-gamma CellGenix 1425-050
Recombinant Human Interleukin-1 alpha PEPROTECH 200-01A
RPMI1640 medium Gibco 11875-085
Sigma 3-18K Centrifuge Sigma 10295
TrypLE Express Enzyme Gibco 12605028
X-VIVO 15 medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cappuzzello, E., et al. Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of Cytokine-Induced Killer (CIK) cells. Cytokine & Growth Factor Reviews. 36, 99-105 (2017).
  2. Schmidt-Wolf, R. S., et al. Propagation of large numbers of T cells with natural killer cell markers. British Journal of Haematology. 87 (3), 453-458 (1994).
  3. Grainger, S., et al. Wnt Signaling in Hematological Malignancies. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 153, 321-341 (2018).
  4. Dai, C., et al. Implication of combined PD-L1/PD-1 blockade with cytokine-induced killer cells as a synergistic immunotherapy for gastrointestinal cancer. Oncotarget. 7 (9), 10332-10344 (2016).
  5. Schmidt-Wolf, I. G., et al. Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity. TheJournal of Experimental Medicine. 174 (1), 139-149 (1991).
  6. Introna, M., et al. Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells: an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 38 (9), 621-627 (2006).
  7. Schmeel, L. C., et al. Cytokine-induced killer (CIK) cells in cancer immunotherapy: report of the international registry on CIK cells (IRCC). Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (5), 839-849 (2015).
  8. Rutella, S., et al. Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new good manufacturing practice-grade protocol. Cytotherapy. 14 (7), 841-850 (2012).
  9. Nausch, N., et al. NKG2D ligands in tumor immunity. Oncogene. 27 (45), 5944-5958 (2008).
  10. Gammaitoni, L., et al. Effective activity of cytokine-induced killer cells against autologous metastatic melanoma including cells with stemness features. Clinical Cancer Research. 19 (16), 4347-4358 (2013).
  11. Rettinger, E., et al. The cytotoxic potential of interleukin-15-stimulated cytokine-induced killer cells against leukemia cells. Cytotherapy. 14 (1), 91-103 (2012).
  12. Narayan, R., et al. Donor-derived cytokine-induced killer cell infusion as consolidation after nonmyeloablative allogeneic transplantation for myeloid neoplasms. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 19, 1083 (2019).
  13. Castiglia, S., et al. Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 237 (2018).
  14. Bonanno, G., et al. Thymoglobulin, interferon-γ and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer (CIK) cells in clinical-grade cultures. Journal of Translational Medicine. 8, 129 (2010).
  15. Iudicone, P., et al. Interleukin-15 enhances cytokine induced killer (CIK) cytotoxic potential against epithelial cancer cell lines via an innate pathway. Human Immunology. 77 (12), 1239-1247 (2016).
  16. Liu, J., et al. Phenotypic characterization and anticancer capacity of CD8+ cytokine-induced killer cells after antigen-induced expansion. PLoS One. 12 (4), 0175704 (2017).
  17. Chen, D., et al. Cytokine-induced killer cells as a feasible adoptive immunotherapy for the treatment of lung cancer. Cell Death & Disease. 9 (3), 366 (2018).
  18. Tario, J. D. Jr Monitoring cell proliferation by dye dilution: considerations for probe selection. Methods in Molecular Biology. 1678, 249-299 (2018).
  19. Last'ovicka, J., et al. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular Immunology. 256 (1-2), 79-85 (2009).
  20. Yoshida, T., et al. Characterization of natural killer cells in tamarins: a technical basis for studies of innate immunity. Frontiers in Microbiology. 1, 1-9 (2010).

Tags

Kreftforskning Utgave 155 adoptivcellulær immunterapi cytokinindusert mordercelle perifere blodmononukleære celler hematologiske og faste kreftformer immuncellulær terapi cytotoksisk effekt strømningcytometri
Isolasjon og utvidelse av cytotoktoktokin-indusert killer T-celler for kreftbehandling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsiao, C. H., Chiu, Y. H., Chiu, S.… More

Hsiao, C. H., Chiu, Y. H., Chiu, S. C., Cho, D. Y., Lee, L. M., Wen, Y. C., Li, J. J., Shih, P. H. Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment. J. Vis. Exp. (155), e60420, doi:10.3791/60420 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter