Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utföra isolering och expansion av perifert blod mononukleära celler-härledda cytokin-inducerad CD3+CD56+ mördarceller och illustrera deras cytotoxicitet effekt mot hematologiska och solida cancerceller med hjälp av en in vitro diagnos flöde cytometri system.
Abstract
Adoptiv cellulär immunterapi fokuserar på att återställa cancer erkännande via immunsystemet och förbättrar effektiv tumör cell dödande. Cytokin-inducerad mördare (CIK) T cell terapi har rapporterats att utöva betydande cytotoxiska effekter mot cancerceller och för att minska de negativa effekterna av kirurgi, strålning och kemoterapi i cancerbehandlingar. CIK kan härledas från perifert blod mononukleära celler (PBM), benmärg och navelsträngsblod. CIK celler är en heterogen subpopulation av T-celler med CD3+CD56+ och naturliga mördare (NK) fenotypiska egenskaper som inkluderar stora histocompatibility komplex (MHC)-obegränsad antitumör aktivitet. Denna studie beskriver en kvalificerad, kliniskt tillämplig, flödecytometribaserad metod för kvantifiering av cytolytisk förmåga PBMC-härledda CIK-celler mot hematologiska och solida cancerceller. I cytolytisk analys, CIK celler är co-incubated vid olika förhållanden med prestained mål tumörceller. Efter inkubationstiden bestäms antalet målceller av en nukleinsyrabindande fläck för att upptäcka döda celler. Denna metod är tillämplig på både forsknings- och diagnostiktillämpningar. CIK-celler har potent cytotoxicitet som kan utforskas som en alternativ strategi för cancerbehandling vid sin prekliniska utvärdering av en cytometer setup och spårning (CS & T) baserat flöde cytometri system.
Introduction
Cytotoxiska T-lymfocyter är en specifik immuneffekteller cellpopulation som förmedlar immunsvar mot cancer. Flera effektorcellpopulationer inklusive celler med lymfokinaktiverad mördare (LAK), tumörinfiltrerande lymfocyter (TILs), naturliga mördarceller (NK), γδ T-celler och cytokininducerade mördarceller (CIK) har utvecklats för adoptiv- T-cellterapi (ACT) ändamål1. Det finns ett växande intresse för CIK celler, eftersom de utgör en blandning av cytokin-inducerad cytotoxiska cellpopulationer expanderat från autologperifera blod mononukleära celler (PMBC)2.
Den okontrollerade tillväxten av lymfoida stamceller, myeloblaster och lymfoblaster leder till tre huvudtyper av blodcancer (dvs leukemi, lymfom och myelom), solida tumörer, inklusive carinomcas (t.ex. lungcancer, magcancer, livmoderhalscancer) och sarkom, bland andra cancerformer3. CIK celler är en blandning av cell populationer som uppvisar ett brett spektrum av stora histocompatibility komplex (MHC)-obegränsad antitumör aktivitet och därmed hålla löfte om behandling av hematologiska och avancerade tumörer4,5,6,7. CIK-celler består av en kombination av celler, inklusive T-celler (CD3+CD56−), NK-T-celler (CD3+CD56+) och NK-celler (CD3–CD56+). Optimering av CIK-induktionsprotokollet med hjälp av ett fast schema för tillsats av IFN-γ, anti-CD3-antikroppar och IL-2, resulterar i expansionav CIK-celler8. Cikcellers cytotoxiska förmåga mot cancerceller beror främst på nkgrupp 2-medlem D:s engagemang (medlem i C-typ lektinliknande receptorfamiljen) NKG2D-ligander på tumörceller och på perforinmedierade vägar9. Resultaten av en preklinisk studie visade att IL-15-stimulerade CIK celler inducerad potent cytotoxicitet mot primära och akut myeloisk leukemi cellinjer in vitro och uppvisade en lägre alloreactivity mot normala PBMC och fibroblaster9. Nyligen publicerades resultatet av engångsbehandling med friska donatorderivat CIK (1 x 108/kg CD3+ celler) som konsolidering efter nonmyeloablaative allogentransplantation för myeloisk neoplasmer behandling i en klinisk fas II-studie10.
I denna studie utvecklade vi en optimerad cellkulturformel bestående av IFN-γ, IL-1α, anti-CD3-antikroppar och IL-2 som lagts till hematopoietiska cellmediet för att öka CIK-produktionen och undersökte cikcellernas cytotoxiska effekt mot humankronisk myeloisk leukemi (K562) celler och äggstockscancer (OC-3) celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det kliniska protokollet utfördes och godkändes i enlighet med riktlinjerna från Institutional Review Board i China Medical University and Hospital Research Ethics Committee. Perifert blod exemplar skördades från friska frivilliga med deras informerade samtycke.
1. Beredning av material
- Lagra reagenser, antikroppar och kemikalier enligt det materialsäkerhetsdatablad (MSDS). Lös upp drogerna eller cytokinerna i lösningsmedel som lagerlösningar och sedan alikvot för förvaring vid -20 °C eller -80 °C.
Obs! Detaljerad information för materialberedning noteras i materialförteckningen.
2. PBMC isolering
- Värm densitetgradientlösningen (Materialtabell)till 18–20 °C före användning. Invertera lösningsflaskan flera gånger för att säkerställa noggrann blandning.
- Samla 3–5 ml humant venöst blodprov i en hepariniserad injektionsflaska och blanda väl genom att försiktigt invertera röret flera gånger.
- Förbered 4 ml densitetsgradientlösning i ett sterilt 15 ml-rör.
- Försiktigt lager 1 ml av blodprovet på densitetgradientlösningen.
- Centrifug vid 400 x g i 30 min vid 18−20 °C (stäng av rasten).
- Försiktigt och omedelbart aspirera buffy coat lager av mononukleära celler (ca 1 mL) på en gång för att undvika att störa skikten till en steril 15 mL rör med en 1 ml steril pipett.
- Tillsätt minst 3 volymer (~3 ml) fosfatbuffrad koks (PBS) till buffy-pälsen i centrifugröret. Häng upp cellerna genom att försiktigt pipetta dem upp och ner minst 3x med en steril pipett.
- Centrifug vid 400 x g i 10 min vid 18−20 °C. Aspirera supernatanten.
- Häng upp cellpelleten med 5 ml basmedium(Materialform)och överför till en kolv. Kultur cellerna i en cellkulturinkubator vid 37 °C och 5% CO2.
3. CIK-induktion och expansion
- På dag 0, kultur PBMCs (1 x 106) i färskt basmedium som innehåller 1 000 IE/ml IFN-γ för 24 timmar i en fuktad cellkulturinkubator vid 37 °C och 5% CO2.
- På dag 1, uppdatera mediet med färskt basmedium som innehåller 50 ng/ml anti-CD3-antikroppar, 1 ng/ml rh IL-1α och 1 000 E/ml rh IL-2. Uppdatera mediet var tredje dag.
- På dag 7, uppdatera mediet med färskt basmedium som innehåller 1000 U/ml rh IL-2. Uppdatera mediet var 3:e dag fram till slutet av cellexpansionen (dag 14).
4. Immunophenotypning för bedömning av CIK-celler
- Tvätta CIK-cellerna med 10 ml steril PBS. Centrifug i 10 min vid 300 x g och 18−20 °C, aspirera supernatanten och omblandas cellerna med 10 ml PBS. Räkna cellnummer och testcell livskraft med hjälp av trypan blå uteslutning sats.
- Aliquot CIK cellerna i sex sterila 1,5 ml rör med en densitet av ~ 5-10 x 105 celler / ml PBS. Etikett och behandla enligt följande: Tube 1, Blank (ingen antikropp); Rör 2, tillsätt 20 μl isotyp IgG1-FITC; Rör 3, tillsätt 20 μL isotyp IgG1-APC mAbs; Rör 4, tillsätt 20 μl CD3-FITC; Rör 5, tillsätt 20 μl CD56-APC mAbs; och rör 6, tillsätt 20 μl CD3-FITC och 20 μl CD56-APC mAbs.
- Blanda försiktigt CIK-cellerna med antikropparna genom att försiktigt pipetta dem upp och ner minst 3x med en 1 ml steril pipett och sedan inkubera i 30 min vid rumstemperatur i mörkret.
- Centrifugrören i 10 min vid 300 x g och 18−20 °C. Aspirera supernatanten och avbryta cellpelleten en gång med 1 ml PBS. Rör försiktigt dem upp och ner minst 3x med en 1 ml steril pipett.
- Upprepa steg 4.4.
- Lämna rören i mörkret före flöde cytometrisk analys.
5. Cd-markörigenkänning
- Överför cellupphängningen till ett sterilt 5 ml polystyrenrunt bottenrör med ett cellsillock (100 μm mesh) genom att försiktigt leda genom locket. Sätt rören på karusellen i ordning.
- Öppna programvaran flödescytometrianalys och skapa en experimentell mapp. Klicka på knappen Nytt prov för att lägga till ett prov och ett rör i experimentet och namnge rören enligt följande: Tube 1, Blank; Rör 2, Isotyp IgG1-CD3; Rör 3, Isotyp IgG1-CD56; Rör 4, CD3; Rör 5, CD56; Rör 6, CD3CD56.
- Skapa ett spridningssystem för CIK-cellpopulationerna (figur 2A).
- Välj Tube 1 (Blank) och klicka på Dot Plot-knappen för att skapa en FSC-A/SSC-A-tomt. Rita en rektangelgrind över hela cellpopulationen med en FSC-A-tröskel >5 x 104 för att utesluta cellskräp.
- Välj parametern SSC-A/SSC-H för den nya punktytan och rita en polygongrind runt alla enstaka celler. Välj parametern Count/FITC (CD3) och Count/APC (CD56) för den nya histogram-plotten. Välj parametern FITC (CD3)/APC (CD56) för den nya punktytan och rita en fyra kvadrantgrind för att definiera de fyra delpopulationerna.
- Registrera data från 20 000 enstaka celler i varje exemplar. Klicka på knappen Läs in exempel för att först analysera blankkontrollexemplet. Identifiera hela CIK-cellpopulationen med hjälp av CD56- och CD3-kanalparametrarna.
- Upprepa steg 5.3 för undersökning av alla exemplar.
- Öppna filerna som innehåller de statistiska värdena för det enskilda exemplaret för att analysera CIK-cellpopulationer och skriva ut dem i analysfiler.
6. Odla och färgning av mänskliga kronisk myeloisk leukemi K562 celler och äggstockscancer OC-3 celler
- K562 celler
- Kultur K562 celler i kompletta medier (RPMI basmedium innehållande 10% fetalt nötkreatur serum [FBS] och 50 U/ml antibiotika och justera glukos till 4,5 g/l) med en densitet av 0,5−1 x 106 celler/ml i en cellkultur kolv och inkubat i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5% CO2.
- Överför kulturmediet som innehåller K562-cellerna till 50 ml sterila rör och pellet cellerna vid 300 x g i 10 min vid 18−20 °C på experimentets dag.
- Aspirera supernatanten, omblanda cellerna i 5 ml steril PBS och blanda väl försiktigt.
- Pellet cellerna vid 300 x g i 10 min. Aspirera supernatanten, omblandas cellerna i PBS och justera K562-cellerna till en koncentration av 0,5-1 x 106 celler/ml.
- Tillsätt 0,5 μL CFSE-färgämne till 1 ml K562-cellsuspension i ett sterilt 15 ml-rör vid en slutlig koncentration på 5 μM. Blanda försiktigt suspensionen genom att pipetta upp och ner minst 3x.
- Lämna röret i en cellkulturinkubator vid 37 °C och 5% CO2 i 10–15 min.
- Tillsätt 9 ml PBS till röret och pellet cellerna vid 300 x g i 10 min. Dekantera supernatanten och stäng sedan av cellpelleten i 10 ml kompletta medier. Överför cellsuspensionen till en cellkulturkolv och placera i inkubatorn.
- OC-3-celler
- Kultur OC-3-celler i kompletta medier (DMEM/F12 medium innehållande 10% FBS och 50 U/ml antibiotika) med en densitet av 0,5–1 x 106 celler i en cellodlingskolv vid 37 °C och 5 % CO2.
- Aspirera kulturmedia och tvätta cellerna med PBS 1 dag före experimentet.
- Lossa cellerna genom att tillsätt 1 ml celldissociationsenzymlösning (Materialförteckning) och inkubera i 5 min vid 37 °C.
- Häng upp cellerna genom att lägga till 5 ml PBS och blanda väl försiktigt. Pellet cellerna på 300 x g i 10 min och aspirera supernatant. Omblanda cellerna i PBS och justera cellerna till en koncentration av 0,5–1 x 106 celler/ml.
- Tillsätt 0,5 μL CFSE-färgämne till 1 ml oc-3-cellsuspension i ett sterilt 15 ml-rör vid en slutlig koncentration på 5 μM. Blanda försiktigt suspensionen genom att pipetta upp och ner minst 3x.
- Lämna röret i en cellkulturinkubator vid 37 °C och 5% CO2 i 10–15 min.
- Tillsätt 9 ml PBS till röret och pellet cellerna vid 300 x g i 10 min. Dekantera supernatanten och häng sedan upp cellpelleten med komplettmedia. Frö 5 x 105 celler/väl in i en 6 brunnsplatta och inkubera i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5% CO2 över natten.
7. Cytotoxisk analys
- Kokultur av CIK- och K562-celler (CIK-K562)
- Räkna K562-cellerna från steg 6.1.7 och testa cellens livskraft genom trypanblå uteslutningsanalys. Tillsätt 1 ml K562 celler till varje brunn i en 6 brunnsplatta med en densitet av 5 x 105/ml.
- Tillsätt 1 ml basmedium med eller utan CIK-celler från steg 3.4 till 6-brunnsplattan från steg 7.1.1 enligt följande: Brunn 1 = Blank, K562 celler ensamt (5 x 105); Brunn 2 = CFSE-färgade K562 celler ensam (5 x 105); Tja 3 = CIKceller (E [effektor], 25 x 105) + CFSE-färgade K562 celler (T [mål], 5 x 105); Well 4 = CIK celler (E, 50 x 105) + CFSE-färgade K562 celler (T, 5 x 105).
- Blanda cellsuspensionerna genom att försiktigt pipetting dem upp och ner minst 3x. Placera plattan i inkubatorn i 24 timmar.
- Kokultur av CIK- och OC-3-celler (CIK-OC-3)
- Tillsätt 1 ml basmedium med eller utan CIK-celler från steg 3.4 till 6-brunnsplattan från steg 6.2.7 enligt följande: Brunn 1 = Enbart, OC-3-celler (5 x 105). Brunn 2 = CFSE-färgade OC-3 celler ensam (5 x 105); Jo 3 = CIKceller (E, 25 x 105) + CFSE-färgade OC-3-celler (T, 5 x 105); Well 4 = CIK celler (E, 50 x 105) + CFSE-färgade OC-3 celler (T, 5 x 105).
- Blanda cellsuspensionerna genom att försiktigt pipetting dem upp och ner minst 3x. Lägg plattan i inkubatorn i 24 timmar.
- 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) färgning
- Skörda CIK-K562 cellsuspensionfrån steg 7.1.3 direkt till ett 15 ml sterilt rör.
- Skörda både fjädrings- och följceller från CIK-OC-3-grupperna från steg 7.2.2.
- Överför cellupphängningen till ett sterilt 15 ml-rör. Tvätta brunnen med 1 ml steril PBS, samla pbs och lägg i röret. Tillsätt 0,5 ml celldissociationsenzymlösning och inkubera i 5 min vid 37 °C.
- Tillsätt 1 ml av lösningen från samma rör till motsvarande brunn och blanda försiktigt cellerna genom att pipetta upp och ner minst 3x med en 1 ml steril pipett. Samla alla celler i samma rör.
- Centrifug vid 300 x g i 10 min, aspirera supernatanten och omfördela cellerna i 1 ml steril PBS. Pellet cellerna vid 300 x g i 10 min, aspirera supernatanten och omblandas celler i 100 μL sterilpbs.
- Tillsätt 5 μL 7-AAD-färgämne (50 ng/μL-lager) till cellsuspensionen. Blanda försiktigt cellerna genom att pipetta dem upp och ner minst 3x med en 1 ml steril pipett. Inkubera i 10 min och lämna i mörkret före analys.
- Cytolytisk förmåga analys
- Blanda cellsuspensionen från steg 7.3.4 och upprepa steg 5.1 och 5.2 en gång.
- Klicka på knappen Nytt prov för att lägga till ett prov och ett rör i experimentet och namnge rören enligt följande: Endast rör 1, K562 (eller OC-3) celler; Rör 2, endast CFSE-färgade K562 -celler (eller OC-3) celler; Rör 3, E:T = 5:1; Rör 4, E:T = 10:1.
- Skapa ett Scatter Gating-system för cytolytisk analys (figur 3A).
- Välj Tube 1 och klicka på Dot Plot-knappen för att skapa en FSC-A/SSC-A-tomt. Rita en rektangelgrind över alla händelser med en FSC-A-tröskel >5 x 104 för att utesluta cellskräp.
- Välj parametern SSC-A/CFSE för den nya punktytan. Välj parametern 7-AAD/CFSE för den nya punktytan och rita en fyrkvadrantport för att definiera de fyra subpopulationerna.
- Klicka på knappen Läs in exempel för att först analysera det tomma kontrollexemplet.
- Justera spänningen för SSC-A och FSC-A. Identifiera den döda cellpopulationen med hjälp av PARAMETRARna CFSE och 7-AAD-kanal. Registrera data från >20 000 CFSE+ celler i varje exemplar.
- Upprepa avsnitt 7.4.6 för undersökning av alla exemplar.
- Öppna filerna som innehåller statistiska värden för varje enskilt exemplar för att analysera icke-viabla cellpopulationer och exportera data till analysfiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syftet med detta protokoll är att isolera och expandera cytokin-inducerad mördare (CIK) T-celler från perifera blodmonocyter och utvärdera cytotoxiska effekten av CIK mot hematologiska malignitet och solida cancerceller, respektive. Induktionen av CIK identifierades genom CD3/CD56-igenkänningen. Figur 1A visar protokollet för CIK-induktion och expansion. De representativa resultaten av gating strategi för att analysera subpopulationen av CD3+CD56+ T celler från friska givare illustreras i figur 1B. Figur 1C visar den statistiska analysen av CIK-andelen från tre individer.
Figur 2A visar att CD3+CD56+ cellandel (0,65% för den ursprungliga PBMC, vänster nedre panelen och 27,4% för CIK celler skördas på dag14,höger nedre panelen) ökade avsevärt efter 14 dagars expansion. I vårt kultursystem gav CIK-cellerna ungefär ett halvt hundrafaldigt förändringar jämfört med det ursprungliga antalet PBMCs(figur 2B).
Figur 3 visar den cytotoxiska effekten av CIK mot humant kroniskt myeloisk leukemi K562 celler och human äggstockscancer OC-3 celler. K562 eller OC-3 celler (mål, T) var färgade med en icke-fluorescerande färgämne (CFSE), som klyvdes av intracellulära esterases inom livskraftiga celler och sedan blev en mycket fluorescerande färgämne. I cytotoxisk kokultur studie, CFSE-färgade K562 eller OC-3 celler behandlades med CIK celler i 24 h. I slutet av inkubationen skördades och färgades de totala cellerna med 7-AAD-färgämne, vilket är ett nukleinsyrabindande färgämne som används som en livskraftssond för uteslutning av döda celler. Cik- och CFSE+ cellernas storlek och granularitet illustreras i figur 3A. CFSE-färgade K562-cellerna (målceller, T) behandlades tillsammans med CIK-celler (effektorceller, E) med ett förhållande på E/T = 0:1, 5:1 respektive 10:1. 7-AAD+ cellerna i CFSE+ K562 celler utvärderades alla. De statistiska resultaten kom från tre oberoende experiment. Basallys avser andelen celldöd i avsaknad av effektorceller (E:T = 0:1). Figur 3B visar ciks uppenbara cytotoxicitet mot OC-3-celler (E:T = 10:1) efter 24 timmar inkubation.
Figur 1: Flödesschema för cytokininducerade mördarceller induktion och expansion. (A)PBMFrån godkända friska givare exponerades ursprungligen för rhIFN-γ (dag 0), följt av rhIL-2, rhIL-1α och anti-CD3 mAb (dag 1) var tredje dag (dag 4). Därefter var mediet uppdateras med rhIL-2-innehållande medium var tredje dag och cellerna skördades på dag 14. (B) Morfologi av CIK-celler under 7 dagars induktion. Aktiveringen och expansionen av CIK-celler genomfördes enligt beskrivningen i protokollet. Celler observerades under ett ljust mikroskop på dag 1, 5 respektive 7 (förstoring = 40x, skalstång = 200 μm). (C) Antalet celler utfördes varje vecka. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Andelen CD3+CD56+ T-celler från ett representativt PBMC-prov. (A) Lymfocyter erkändes av specifik storlek och granularitet. Vald encellig population för analys efter flödescytometri. (B) Statistisk analys av CIK expansion effekt från tre friska givare genomfördes med hjälp av ett t-test (*, p < 0,01). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Cytotoxiska effekter av CIK-celler mot humant kroniskmyeloisk leukemi K562 och human äggstockscancer OC-3 celler. (A)Efter samkultur med CIK-cellerna i 24 timmar kändes K562-målceller igen och gated spån baserat på färgning av CFSE-färgämne. Kvadrantillustration av den totala cellpopulationen under den valda parametern 7-AAD/CFSE och den kumulativa cytotoxiciteten hos CIK-celler vid det angivna E:T-förhållandet. (B)Cikcellernas cytotoxiska effekt mot OC-3-celler vid ett E:T = 10:1-förhållande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrivna metoden är ett snabbt, bekvämt och tillförlitligt protokoll för isolering och expansion av cytotoxiska cytokin-inducerad mördare (CIK) T-celler från hela blodprov av friska givare. Det visar också cytotoxiskeffekt av CIK mot leukemi (K562) och äggstockscancer celler (OC-3) med hjälp av ett flöde cytometri setup och spårning (CS & T) system. CIK-celler kan induceras och utvidgas i god manufactory praxis (GMP) villkor med hjälp av GMP-klass cytokiner och serumfritt medium för ytterligare klinisk infusion11. Effekten av CIK-induktion och expansion uppvisar dock individuella skillnader12,13,14. Dessutom är säkerheten fördelen med infusion av patienter som härrör CIK celler för cancercellterapi. Det har rapporterats att CIK celler utövar cytolytiska effekter på epitelial solida cancerceller främst på ett NKG2D-beroende sätt. I hematologiska cancerceller hämmar blockering nkg2d med en specifik antikropp signifikant CIK-inducerad cytotoxicitet mot NKG2D-låga K562 celler; Denna behandling har dock ingen effekt på HL-60-celler som saknar NKG2D15. Dessutom uppvisar CIK-celler mindre celldödande aktivitet mot K562-celler jämfört med CD8+ CIK-celler16. I denna studie fann vi att CIK uppvisade en större cytotoxisk potential mot äggstockscancer OC-3 celler jämfört med leukemi K562 celler. Dessa data tyder på att de exakta molekylära mekanismer genom vilka CIK effektorer döda tumörceller är ännu inte klart.
Spårning av målcelllivskraft och utvärdering av den cytotoxiska potentialen hos effektorceller med flödescytometri har blivit en standard- och konventionell metod för klinisk undersökning17. Det har föreslagits att en negativ effekt observeras på cellens livskraft och uttrycket av aktiveringsmarkörer, såsom CD3+ populationen i CFSE-färgade lymfocyter med flödescytometri18,19. Således, färgning av målcancerceller är en mer effektiv strategi för att utvärdera cytotoxiska effekterna av primära CIK celler. IFN-γ, OKT3 och IL-2 är stora cytokiner eller stimulatoner för CIK differentiering och spridning. Dessutom är andra faktorer som thymoglobulin, IL-1α, IL-10, IL-15, också stimulatorer. För närvarande, humant serum, humant blodplättsrika plasma, och även fetala nötkreatur serum används som medelstora kosttillskott som kan öka spridningen av CIK celler. Även om serum eller plasma är berikade med näringsämnen och tillväxtfaktorer, presenterar tillsats av allogena animaliska produkter källa, parti och variationer mycket som resulterar i experimentell variation, och oundvikligen oroande studier med terapeutiska resultat för odlade celler. I denna studie använde vi en kommersiellt tillgänglig serum-fri, albumin-fri, och xeno-fri GMP-klass media kompletteras med klinisk kvalitet cytokiner att framgångsrikt kultur CIK celler. Nackdelen med att använda xeno-fria eller allogenfria kosttillskott är att de minskar effekten av cellproliferation.
De tvåfärgscellspårningsmetoder som tillhandahålls i protokollen självständigt beräknade livskraftiga eller döda effektormålceller i en direkt cytotoxicitetsanalys. I våra gating strategier, CFSE+ målceller kan naturligtvis skiljas från CIK effektor celler(Figur 3). Viktigast av allt, processen för CIK induktion och expansion måste kvalificeras och visa hög livskraft. För ytterligare flera doser infusioner, tillståndet för kryobevarande, och lönsamheten och cytotoxicitet en efter upptining, är andra kritiska utmaningar. Den faktiska kvoten för specifik lys motsvarar andelen 100 x (%Provlys - %Basal lys)/(100 - %Basal lysis). I motsats till andra studier18,20,rekommenderas att alla målceller undersökas för att avslöja den exakta och faktiska cytotoxiciteten hos CIK-celler.
Sammanfattningsvis är det protokoll som beskrivs i denna studie utformat för att öka antalet PBMC-härledda CIK-celler från friska givare och att utvärdera deras cytotoxiska funktioner mot cancerceller med två-färg fotoaktivt diagnosttable sonder för selektiv spårning av målceller genom flödescytometri med ett in vitro-diagnostiksystem (IVD).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande konflikter av ekonomiskt intresse.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av China Medical University Hospital (DMR-Cell-1809).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-Amino Actinomycin D | BD | 559925 | |
| APC Mouse Anti-Human CD56 antibody | BD | 555518 | B159 |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | MOPC-21 |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD | 338962 | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | BD | 565082 | |
| D-(+)-Glucose solution | SIGMA | G8644 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 | HyClone | SH30023.02 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare Life Sciences | 71101700-EK | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody | BD | 555332 | UCHT1 |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555748 | MOPC-21 |
| Human anti-CD3 mAb | TaKaRa | T210 | OKT3 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Proleukin | NOVARTIS | ||
| Recombinant Human Interferon-gamma | CellGenix | 1425-050 | |
| Recombinant Human Interleukin-1 alpha | PEPROTECH | 200-01A | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 11875-085 | |
| Sigma 3-18K Centrifuge | Sigma | 10295 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12605028 | |
| X-VIVO 15 medium | Lonza | 04-418Q |
References
- Cappuzzello, E., et al. Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of Cytokine-Induced Killer (CIK) cells. Cytokine & Growth Factor Reviews. 36, 99-105 (2017).
- Schmidt-Wolf, R. S., et al. Propagation of large numbers of T cells with natural killer cell markers. British Journal of Haematology. 87 (3), 453-458 (1994).
- Grainger, S., et al. Wnt Signaling in Hematological Malignancies. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 153, 321-341 (2018).
- Dai, C., et al. Implication of combined PD-L1/PD-1 blockade with cytokine-induced killer cells as a synergistic immunotherapy for gastrointestinal cancer. Oncotarget. 7 (9), 10332-10344 (2016).
- Schmidt-Wolf, I. G., et al. Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity. TheJournal of Experimental Medicine. 174 (1), 139-149 (1991).
- Introna, M., et al. Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells: an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 38 (9), 621-627 (2006).
- Schmeel, L. C., et al. Cytokine-induced killer (CIK) cells in cancer immunotherapy: report of the international registry on CIK cells (IRCC). Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (5), 839-849 (2015).
- Rutella, S., et al. Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new good manufacturing practice-grade protocol. Cytotherapy. 14 (7), 841-850 (2012).
- Nausch, N., et al. NKG2D ligands in tumor immunity. Oncogene. 27 (45), 5944-5958 (2008).
- Gammaitoni, L., et al. Effective activity of cytokine-induced killer cells against autologous metastatic melanoma including cells with stemness features. Clinical Cancer Research. 19 (16), 4347-4358 (2013).
- Rettinger, E., et al. The cytotoxic potential of interleukin-15-stimulated cytokine-induced killer cells against leukemia cells. Cytotherapy. 14 (1), 91-103 (2012).
- Narayan, R., et al. Donor-derived cytokine-induced killer cell infusion as consolidation after nonmyeloablative allogeneic transplantation for myeloid neoplasms. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 19, 1083 (2019).
- Castiglia, S., et al. Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 237 (2018).
- Bonanno, G., et al. Thymoglobulin, interferon-γ and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer (CIK) cells in clinical-grade cultures. Journal of Translational Medicine. 8, 129 (2010).
- Iudicone, P., et al. Interleukin-15 enhances cytokine induced killer (CIK) cytotoxic potential against epithelial cancer cell lines via an innate pathway. Human Immunology. 77 (12), 1239-1247 (2016).
- Liu, J., et al. Phenotypic characterization and anticancer capacity of CD8+ cytokine-induced killer cells after antigen-induced expansion. PLoS One. 12 (4), 0175704 (2017).
- Chen, D., et al. Cytokine-induced killer cells as a feasible adoptive immunotherapy for the treatment of lung cancer. Cell Death & Disease. 9 (3), 366 (2018).
- Tario, J. D. Jr Monitoring cell proliferation by dye dilution: considerations for probe selection. Methods in Molecular Biology. 1678, 249-299 (2018).
- Last'ovicka, J., et al. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular Immunology. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Yoshida, T., et al. Characterization of natural killer cells in tamarins: a technical basis for studies of innate immunity. Frontiers in Microbiology. 1, 1-9 (2010).
