Summary
Burada periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyon ve genleşmesini gerçekleştirmek için bir protokol sunmaktayız- periferik kan mononükleer hücrelerden türetilmiş sitokin kaynaklı CD3+CD56+ öldürücü hücreler ve in vitro tanı akış sitometri sistemi kullanarak hematolojik ve katı kanser hücrelerine karşı sitotoksisite etkilerini göstermek.
Abstract
Benimseyen hücresel immünoterapi bağışıklık sistemi üzerinden kanser tanıma geri odaklanır ve etkili tümör hücre öldürme geliştirir. Sitokin kaynaklı katil (CIK) T hücre tedavisi kanser hücrelerine karşı önemli sitotoksik etkileri uygulamak ve kanser tedavilerinde cerrahi, radyasyon ve kemoterapi nin olumsuz etkilerini azaltmak için bildirilmiştir. CIK periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs), kemik iliği ve göbek kordon kanı elde edilebilir. CIK hücreleri CD3+CD56+ ve doğal öldürücü (NK) fenotipik özellikleri ile T hücrelerinin heterojen bir alt popülasyonudur ve majör histokompatibilite kompleksi (MHC)-sınırsız antitümör aktivitesi içerir. Bu çalışmada PBMC kaynaklı CIK hücrelerinin hematolojik ve katı kanser hücrelerine karşı sitolitik yeteneğinin nicelleştirilmesi için klinik olarak uygulanabilir, akış sitometrisi esaslı bir yöntem açıklanmaktadır. Sitiyolitik sitalöz deyiş, CIK hücreleri prestained hedef tümör hücreleri ile farklı oranlarda birlikte inkübe edilir. Kuluçka döneminden sonra, hedef hücrelerin sayısı ölü hücreleri tespit etmek için nükleik asit bağlayıcı bir leke ile belirlenir. Bu yöntem hem araştırma hem de tanı uygulamaları için geçerlidir. CIK hücreleri, sitometre kurulumu ve takibi (CS & T) tabanlı akış sitometri sistemi ile klinik öncesi değerlendirme sonucunda kanser tedavisi için alternatif bir strateji olarak keşfilebilen güçlü sitotoksisiteye sahiptir.
Introduction
Sitotoksik T lenfositler kansere karşı bağışıklık yanıtları aracılık belirli bir bağışıklık efektörü hücre popülasyonuvardır. Lenfokin aktive katil (LAK) hücreleri, tümöre infiltrasyon lu lenfositler (TILs), doğal öldürücü (NK) hücreleri, γδ T hücreleri ve sitokin kaynaklı öldürücü (CIK) hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli efektör hücre popülasyonları benimseyen T hücre tedavisi (ACT)amaçlarıiçin geliştirilmiştir 1 . Cik hücrelerine artan bir ilgi vardır, çünkü otolog periferik kan mononükleer hücrelerden (PMBCs) 2'ye kadargenişlemiş sitokin kaynaklı sitotoksik hücre popülasyonlarının bir karışımını temsil ederler.
Lenfoid progenitor hücrelerinin kontrolsüz büyüme, miyeloblastlar, ve lenfoblastlar kan kanserlerinin üç ana türüne yol açar (yani, lösemi, lenfoma, ve miyelom), katı tümörler, karsinomlar dahil (örneğin, akciğer kanseri, mide kanseri, servikal kanser), ve sarkomlar, diğer kanserler arasında3. CIK hücreleri büyük histokompatibilite kompleksi geniş bir yelpazede sergileyen hücre popülasyonlarının bir karışımıdır (MHC)-sınırsız antitümör aktivitesi ve böylece hematolojik ve ileri tümörlerin tedavisi için söz tutun4,5,6,7. CIK hücreleri, T hücreleri (CD3+CD56−), NK-T hücreleri (CD3+CD56+ )ve NK hücreleri (CD3-CD56+ )dahil olmak üzere hücrelerin bir birleşimini oluşturur. IFN-γ, anti-CD3 antikor ve IL-2 eklenmesi için sabit bir program kullanarak CIK indüksiyon protokolünün optimizasyonu, CIK hücrelerinin genişlemesiile sonuçlanır8. Kanser hücrelerine karşı CIK hücrelerinin sitotoksik yeteneği esas olarak NK grup 2 üyesi D (C-tipi lektin benzeri reseptör ailesinin bir üyesi) Tümör hücreleri üzerinde NKG2D ligands nişan bağlıdır, ve perforin aracılı yollar9. Preklinik bir çalışmanın sonuçları IL-15-uyarılmış CIK hücrelerinin primer ve akut miyeloid lösemi hücre hatlarına infeksiyöz güçlü sitotoksisite indüklediği ve normal PBMC'lere ve fibroblastlara karşı daha düşük alloreaktivite sergilediği ni saptandı9. Son zamanlarda faz II klinik çalışmada miyeloid neoplazm tedavisi için nonmiyeloablatif allojeneik transplantasyon sonrası konsolidasyon olarak bir kerelik sağlıklı donör kaynaklı CIK (1 x 108/kg CD3+ hücre) infüzyonunun sonucuyayınlanmıştır.
Bu çalışmada, CIK üretimini artırmak için hematopoetik hücre ortamına IFN-γ, IL-1α, anti-CD3 antikor ve IL-2'den oluşan optimize edilmiş bir hücre kültürü formülü geliştirdik ve CIK hücrelerinin insan kroniklerine karşı sitotoksik etkisini araştırdık. miyeloid lösemi (K562) hücreleri ve yumurtalık kanseri (OC-3) hücreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Klinik protokol çin Tıp Üniversitesi ve Hastane Araştırma Etik Komitesi Kurumsal İnceleme Kurulu yönergelerine uygun olarak yapıldı ve onaylandı. Periferik kan örnekleri sağlıklı gönüllülerden bilgilendirilmiş rızaları ile alındı.
1. Malzemelerin hazırlanması
- Malzeme Güvenliği Veri Formu'nda (MSDS) gösterildiği şekilde reaktifleri, antikorları ve kimyasalları depolayın. İlaçları veya sitokinleri çözücülerde stok çözeltisi olarak çözün ve daha sonra -20 °C veya -80 °C'de depolanması için aliquot.
NOT: Malzeme hazırlama için ayrıntılı bilgiler Malzeme Tablosu'ndabelirtilmiştir.
2. PBMC yalıtımı
- Yoğunluk gradyan çözeltisini(Malzeme Tablosu)kullanmadan önce 18-20 °C'ye ısıtın. Tam karıştırma sağlamak için çözelti şişesi birkaç kez ters.
- Heparinize bir şişede 3−5 mL insan venöz kan örneği alın ve tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirerek iyice karıştırın.
- 15 mL steril bir tüpte 4 mL yoğunluk gradyan çözeltisi hazırlayın.
- Yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine kan örneğinin 1 mL'lik tabakası dikkatlice.
- 18−20 °C'de 30 dakika 400 x g'de santrifüj (kırış kapatın).
- 1 mL steril pipet kullanarak katmanları steril 15 mL boruya rahatsız etmemek için mononükleer hücrelerin (yaklaşık 1 mL) buffy kat tabakasını dikkatlice ve hemen aspire edin.
- Santrifüj tüpündeki buffy kata en az 3 cilt (~3 mL) fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Hücreleri steril bir pipetle en az 3x yukarı ve aşağı borularla hafifçe borulayarak askıya alın.
- 18−20 °C'de 10 dk için 400 x g santrifüj. Süpernatant aspire.
- Bazal orta 5 mL ile hücre pelet askıya(Malzeme Tablosu)ve bir şişe içine aktarın. Kültür 37 °C ve% 5 CO2bir hücre kültürü kuluçka hücreleri .
3. CIK indüksiyon ve genişleme
- 0. Gün, kültür PBMCs (1 x 106) 37 °C ve% 5 CO2nemlendirilmiş hücre kültürü kuluçka 24 saat için IFN-γ 1.000 IU/mL içeren taze bazal ortamda .
- 1. Gün, orta yı 50 ng/mL anti-CD3 antikor, 1 ng/mL rh IL-1α ve 1.000 U/mL rh IL-2 içeren taze bazal ortamla yenileyin. Ortamı her 3 günde bir yenileyin.
- 7. Günde, rh IL-2 1.000 U/mL içeren taze bazal ortam ile orta yenileyin. Hücre genişletmesinin sonuna kadar her 3 günde bir ortamı yenileyin (Gün 14).
4. CIK hücrelerinin değerlendirilmesi için immünofenotipleme
- CIK hücrelerini 10 mL steril PBS ile yıkayın. 300 x g ve 18−20 °C'de 10 dk santrifüj, süpernatantasi aspire edin ve 10 mL PBS ile hücreleri yeniden askıya alın. Trypan mavi dışlama testini kullanarak hücre numarasını ve hücre canlılığını test edin.
- Aliquot CIK hücrelerini ~5-10 x 105 hücre/mL PBS yoğunluğunda altı steril 1,5 mL tüp halinde aktarın. Etiket ve tedavi aşağıdaki gibi: Tüp 1, Boş (hiçbir antikor); Tüp 2, 20 μL iyotip IgG1-FITC ekleyin; Tüp 3, 20 μL iyotip IgG1-APC mAbs ekleyin; Tüp 4, CD3-FITC 20 μL ekleyin; Tüp 5, CD56-APC mAbs 20 μL ekleyin; ve Tüp 6, 20 μL CD3-FITC ve 20 μL CD56-APC mAbs ekleyin.
- CIK hücrelerini en az 3 x 1 mL steril pipetle hafifçe borulayarak antikorlarla hafifçe karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Tüpleri 300 x g ve 18−20 °C'de 10 dk santrifüj edin. Supernatant aspire ve pbs 1 mL ile bir kez hücre pelet askıya. 1 mL steril pipetle en az 3 x yukarı ve aşağı borular.
- Adımı 4.4'e tekrarlayın.
- Akış sitometrik analizinden önce tüpleri karanlıkta bırakın.
5. CD işaretçisi tanıma
- Hücre süspansiyonunu steril 5 mL polistiren yuvarlak alt boruya, bir hücre süzgeci kapağına (100 μm mesh) yavaşça boru ile aktarın. Tüpleri sırayla atlıkarıncaya koy.
- Akış sitometri analiz yazılımını açın ve deneysel bir klasör oluşturun. Deneye numune ve tüp eklemek için Yeni Numune düğmesini tıklatın ve tüpleri aşağıdaki gibi adlandırın: Tüp 1, Boş; Tüp 2, Isotype IgG1-CD3; Tüp 3, Isotype IgG1-CD56; Tüp 4, CD3; Tüp 5, CD56; Tüp 6, CD3CD56.
- CIK hücre popülasyonları için bir dağılım gating sistemi oluşturun (Şekil 2A).
- Tüp 1 'i (Boş) seçin ve FSC-A/SSC-A çizimi oluşturmak için Nokta Çizimi düğmesine tıklayın. Hücre enkazını dışlamak için FSC-A eşiği >5 x 104 ile tüm hücre popülasyonuna dikdörtgen bir geçit çizin.
- Yeni nokta çizimi için SSC-A/SSC-H parametresini seçin ve tüm tek hücrelerin etrafına çokgen bir kapı çizin. Yeni histogram çizimi için sırasıyla Count/FITC (CD3) ve Count/APC (CD56) parametresini seçin. Yeni nokta çizimi için FITC (CD3)/APC (CD56) parametresini seçin ve dört alt popülasyonu tanımlamak için dört bir çeyrek kapısı çizin.
- Her numunedeki 20.000 tek hücreden gelen verileri kaydedin. Önce Boş denetim örneğini analiz etmek için Yükle Örneği düğmesini tıklatın. CD56 ve CD3 kanal parametrelerini kullanarak tüm CIK hücre popülasyonunu tanımlayın.
- Tüm örneklerin incelenmesi için adım 5.3'ü tekrarlayın.
- CIK hücre popülasyonlarını analiz etmek ve analiz dosyalarına yeniden yazdırmak için tek tek numunenin istatistiksel değerlerini içeren dosyaları açın.
6. Culturing ve insan kronik miyeloid lösemi K562 hücreleri ve yumurtalık kanseri OC-3 hücrelerinin boyanma
- K562 hücreleri
- Kültür K562 hücreleri tam ortamda (RPMI bazal orta içeren 10% fetal sığır serum [FBS] ve 50 U / mL antibiyotik ve 4.5 g /L glukoz ayarlamak) bir hücre kültürü şişesi 0.5 −1 x 106 hücre / mL yoğunluğunda ve 37 °C ve% 5 CO2nemlendirilmiş bir kuluçka kuluçka .
- K562 hücrelerini içeren kültür ortamını 50 mL steril tüplere aktarın ve deney günü 18−20 °C'de 300 x g'de 10 dakika boyunca hücreleri peletleyin.
- Supernatant aspire, steril PBS 5 mL hücreleri resuspend, ve yavaşça karıştırın.
- 10 dk. Süpernatant aspire 300 x g hücreleri pelet, PBS hücreleri resuspend ve 0.5-1 x 106 hücre /mL konsantrasyonuna K562 hücreleri ayarlayın.
- 15 mL steril tüpteki 1 mL K562 hücre süspansiyonuna 5 μM'lik son konsantrasyonda 0,5 l CFSE boya ekleyin. Süspansiyonu en az 3 x yukarı ve aşağı boruile hafifçe karıştırın.
- Tüpü 37 °C'de bir hücre kültürü kuluçka makinesinde ve %5 CO2'de 10-15 dakika bekletin.
- Tüpe 9 mL PBS ekleyin ve 10 dk. Süpernatant için 300 x g'deki hücreleri ekleyin ve 10 mL'lik tam ortamda hücre peletini askıya alın. Hücre süspansiyonuna bir hücre kültürü şişesine aktarın ve kuvöze yerleştirin.
- OC-3 hücreleri
- Kültür OC-3 hücreleri tam ortamda (DMEM/F12 orta içeren 10% FBS ve 50 U / mL antibiyotik) bir hücre kültürü şişesinde 0.5-1 x 106 hücre yoğunluğunda 37 °C ve 5% CO2.
- Kültür ortamını aspire edin ve deneyden 1 gün önce hücreleri PBS ile yıkayın.
- Hücreleri 1 mL hücre ayrıştırma enzim çözeltisi(Malzeme Tablosu)ekleyerek ayırın ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- 5 mL PBS ekleyerek hücreleri askıya alın ve hafifçe karıştırın. 10 dk için 300 x g hücreleri pelet ve supernatant aspire. PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın ve hücreleri 0.5-1 x 106 hücre/mL konsantrasyonuna ayarlayın.
- Son konsantrasyonda 15 mL steril tüpte OC-3 hücresüspansiyonunun 1 mL'sine 0,5 μL CFSE boya ekleyin. Süspansiyonu en az 3 x yukarı ve aşağı boruile hafifçe karıştırın.
- Tüpü 37 °C'de bir hücre kültürü kuluçka makinesinde ve %5 CO2'de 10-15 dakika bekletin.
- Tüpe 9 mL PBS ekleyin ve 10 dk. Süpernatant için 300 x g hücreleri pelet ve sonra tam medya ile hücre pelet askıya alın. Tohum 5 x 105 hücreleri / iyi 6 kuyu plaka içine ve 37 °C ve% 5 CO2 gecede nemlendirilmiş bir kuluçka.
7. Sitotoksik tayun
- CIK ve K562 hücrelerinin coculture (CIK-K562)
- Adım 6.1.7 K562 hücreleri saymak ve trypan mavi dışlama testi ile hücre canlılığını test edin. 5 x 105/mL yoğunlukta 6 kuyu plakasında her kuyuya 1 mL K562 hücresi ekleyin.
- Adım 3.4'ten 6 kuyu plakasına 3.4'ten 6 kuyu plakasına CIK hücreleri olan veya olmayan 1 mL bazal ortam aşağıdaki gibidir: Peki 1 = Boş, K562 hücreleri tek başına (5 x 105); Peki 2 = CFSE lekeli K562 hücreleri tek başına (5 x 105); Peki 3 = CIK hücreleri (E [efektör], 25 x 105) + CFSE lekeli K562 hücreleri (T [hedef], 5 x 105); Peki 4 = CIK hücreleri (E, 50 x 105) + CFSE lekeli K562 hücreleri (T, 5 x 105).
- Hücre süspansiyonlarını en az 3 x yukarı ve aşağı boruile hafifçe karıştırarak karıştırın. Plakayı 24 saat boyunca kuvöze yerleştirin.
- CIK ve OC-3 hücrelerinin coculture (CIK-OC-3)
- Adım 6.2.7'den 6 kuyu plakasına 3.4'ten CIK hücreleri olan veya olmayan 1 mL bazal ortam ekleyin: Tek başına Boş, OC-3 hücreleri (5 x 105); Peki 2 = CFSE lekeli OC-3 hücreleri tek başına (5 x 105); Peki 3 = CIK hücreleri (E, 25 x 105) + CFSE lekeli OC-3 hücreleri (T, 5 x 105); Peki 4 = CIK hücreleri (E, 50 x 105) + CFSE lekeli OC-3 hücreleri (T, 5 x 105).
- Hücre süspansiyonlarını en az 3 x yukarı ve aşağı boruile hafifçe karıştırarak karıştırın. Tabağı 24 saat boyunca kuvöze koy.
- 7-Aminoaktinomisin D (7-AAD) boya boyama
- CIK-K562 hücre süspansiyonunun 7.1.3 adımdan doğrudan 15 mL steril tüpe alınmasını hızlandırın.
- 7.2.2 adımdan CIK-OC-3 gruplarından hem süspansiyon hem de yapışık hücreleri hasat edin.
- Hücre süspansiyonuna 15 mL steril tüp aktarın. 1 mL steril PBS ile kuyuyu yıkayın, PBS'yi toplayın ve tüpe ekleyin. Hücre ayrıştırma enzim çözeltisi 0.5 mL ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Çözeltinin 1 mL'ini aynı tüpten ilgili kuyuya ekleyin ve hücreleri 1 mL steril pipetle en az 3 x aşağı boruile karıştırarak hafifçe karıştırın. Aynı tüp tüm hücreleri toplamak.
- 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj, supernatant aspire ve steril PBS 1 mL hücreleri resuspend. 10 dakika boyunca 300 x g'deki hücreleri peletleyin, süpernatantı aspire edin ve steril PBS'nin 100 μL'sinde hücreleri yeniden askıya alın.
- Hücre süspansiyonuna 5 μL 7-AAD boya (50 ng/μL stok) ekleyin. Hücreleri en az 3x'i steril pipetle en az 3 kat aşağı boruhaline getirerek hafifçe karıştırın. 10 dakika kuluçka ve analiz öncesi karanlıkta bırakın.
- Sitoklitik yetenek titreci
- Hücre süspansiyonuna adım 7.3.4'ten karıştırın ve 5.1 ve 5.2 adımlarını bir kez tekrarlayın.
- Deneye numune ve tüp eklemek ve tüpleri aşağıdaki gibi adlandırmak için Yeni Numune düğmesini tıklatın: Yalnızca Tüp 1, K562 (veya OC-3) hücreleri; Tüp 2, CFSE lekeli K562 (veya OC-3) hücreleri sadece; Tüp 3, E:T = 5:1; Tüp 4, E:T = 10:1.
- Sitolitik titreşme için bir Dağılım Gating Sistemi oluşturun (Şekil 3A).
- Tüp 1'i seçin ve FSC-A/SSC-A çizimi oluşturmak için Nokta Çizimi düğmesine tıklayın. Hücre enkazLarını dışlamak için FSC-A eşiği >5 x 104 ile tüm olayların üzerine dikdörtgen bir geçit çizin.
- Yeni nokta çizimi için SSC-A/CFSE parametresini seçin. Yeni nokta çizimi için 7-AAD/CFSE parametresini seçin ve dört alt popülasyonu tanımlamak için dört dörtlük bir kapı çizin.
- Önce boş kontrol örneğini analiz etmek için Örnek Yükle düğmesini tıklatın.
- SSC-A ve FSC-A gerilimini ayarlayın. CFSE ve 7-AAD kanal parametrelerini kullanarak ölü hücre popülasyonunu belirleyin. Her numunedeki >20.000 CFSE+ hücrelerden gelen verileri kaydedin.
- Tüm örneklerin incelenmesi için bölüm 7.4.6'yı tekrarlayın.
- Canlı olmayan hücre popülasyonlarını analiz etmek ve verileri analiz dosyalarına aktarmak için her bir örneğin istatistiksel değerlerini içeren dosyaları açın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolün amacı, sitokin kaynaklı katil (CIK) T hücrelerini periferik kan monositlerinden izole etmek ve genişletmek ve CIK'in hematolojik malignite ve katı kanser hücrelerine karşı sitotoksik etkisini değerlendirmektir. CIK indüksiyonu CD3/CD56 tanıma ile tanımlanmıştır. Şekil 1A, CIK indüksiyonu ve genişlemesi için protokolü gösterir. Sağlıklı donörlerden CD3+CD56+ T hücrelerinin alt popülasyonunun analiz ine yönelik gating stratejisinin temsili sonuçları Şekil 1B'degösterilmiştir. Şekil 1C, cik oranının üç kişiden istatistiksel analizini göstermektedir.
Şekil 2A, CD3+CD56+ hücre oranının (orijinal PBMC için %0,65, sol alt panel ve14.günde hasat edilen CIK hücreleri için %27,4) 14 günlük genişlemeden sonra önemli ölçüde arttığını göstermektedir. Kültür sistemimizde CIK hücreleri orijinal PBMC sayısına göre yaklaşık yarım yüz kat değişiklik elde etti (Şekil 2B).
Şekil 3 insan kronik miyeloid lösemi K562 hücreleri ve insan yumurtalık kanseri OC-3 hücrelerine karşı CIK sitotoksik etkisini gösterir. K562 veya OC-3 hücreleri (hedef, T) canlı hücreler içinde hücre içi esterazlar tarafından yarık ve daha sonra son derece floresan boya oldu non-floresan boya (CFSE) ile lekeli edildi. Sitotoksik coculture çalışmasında CFSE lekeli K562 veya OC-3 hücreleri 24 saat boyunca CIK hücreleri ile birlikte tedavi edildi. Kuluçka sonunda, toplam hücreler hasat edildi ve ölü hücre dışlanması için canlılık sondası olarak kullanılan bir nükleik asit bağlayıcı boya olan 7-AAD boya ile boyandı. CIK ve CFSE+ hücrelerinin boyutu ve tanecikleri Şekil 3A'dagösterilmiştir. CFSE lekeli K562 hücreleri (hedef hücreler, T) sırasıyla CIK hücreleri (efektör hücreler, E) ile birlikte E/T = 0:1, 5:1 ve 10:1 oranında birlikte tedavi edildi. CFSE+ K562 hücrelerinin 7-AAD+ hücreleri değerlendirildi. İstatistiksel sonuçlar üç bağımsız deneyden elde edildi. Bazal lisis, efektör hücrelerin yokluğunda hücre ölüm yüzdesi anlamına gelir (E:T = 0:1). Şekil 3B, 24 saat inkübasyon sonrasında CIK'in OC-3 hücrelerine (E:T = 10:1) karşı belirgin sitotoksisitesini göstermektedir.
Şekil 1: Sitokin kaynaklı öldürücü hücrelerin indüksiyonve genleşme akış şeması. (A) Rıza gösteren sağlıklı donörlerin PBMC'leri başlangıçta rhIFN-γ (Gün 0), ardından rhIL-2, rhIL-1α ve anti-CD3 mAb (Gün 1) her 3 günde bir (Gün 4) maruz kalmıştır. Daha sonra orta madde 3 günde bir rhIL-2 içeren ortam la yenilendi ve hücreler 14. (B) 7 gün indüksiyon sırasında CIK hücrelerinin morfolojisi. Cİ hücrelerinin aktivasyonu ve genişlemesi protokolde açıklandığı gibi gerçekleştirilmiştir. Hücreler sırasıyla 1, 5 ve 7. (C) Hücre sayımları haftalık olarak yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Temsili bir PBMC örneğinden CD3+CD56+ T hücrelerinin oranı. (A) Lenfositler belirli boyut ve granüleritlik ile tanındı. Akış sitometrisi ile analiz için seçilen tek hücreli popülasyon. (B) Üç sağlıklı donörün CIK genişleme etkinliğinin istatistiksel analizi t-testi (*, p < 0.01) kullanılarak yapılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Cik hücrelerinin insan kronik miyeloid lösemi K562 ve insan yumurtalık kanseri OC-3 hücrelerine karşı sitotoksik etkileri. (A) 24 saat boyunca CIK hücreleri ile birlikte yapılan k562 hedef hücreleri CFSE boyanın boyanarak tanındı ve geçitlendi. Seçilen 7-AAD/CFSE parametresi altında toplam hücre popülasyonunun çeyrek illüstrasyonu ve belirtilen E:T oranındaKI CIK hücrelerinin kümülatif sitotoksisitesi. (B) CIK hücrelerinin OC-3 hücrelerine karşı E:T = 10:1 oranında ki sitotoksik etkisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan yöntem, sağlıklı donörlerin tam kan örneklerinden sitotoksik sitokin kaynaklı katil (CIK) T hücrelerinin izole edilmesi ve genişlemesi için hızlı, kullanışlı ve güvenilir bir protokoldür. Ayrıca bir akış sitometri kurulum ve izleme (CS & T) sistemi kullanarak lösemi (K562) ve yumurtalık kanseri hücrelerine (OC-3) karşı CIK sitotoksik etkisini gösterir. CIK hücreleri iyi fabrikauygulamaları (GMP) koşullarında GMP dereceli sitokinler ve daha ileri klinik infüzyon için serumsuz ortam kullanılarak indüklenebilir ve genişletilebilir11. Ancak, CIK indüksiyon ve genişleme etkinliği bireysel farklılıklar sergiler12,13,14. Ayrıca, güvenlik kanser hücresi tedavisi için hasta kaynaklı CIK hücrelerinin infüzyon avantajıdır. CIK hücrelerinin epitelyal solid kanser hücreleri üzerinde çoğunlukla NKG2D'ye bağımlı bir şekilde sitoklitik etkiler uyguladığı bildirilmiştir. Hematolojik kanser hücrelerinde, NKG2D'nin spesifik bir antikorla engellenmesi, NKG2D-düşük K562 hücrelerine karşı CIK kaynaklı sitotoksisiteyi önemli ölçüde inhibe eder; ancak, bu tedavinin NKG2D15'tenyoksun HL-60 hücreleri üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. Ayrıca CIK hücreleri CD8+ CIK hücrelerine göre K562 hücrelerine karşı daha az hücre öldürme aktivitesisergilerler 16. Bu çalışmada, CIK'in yumurtalık kanseri OC-3 hücrelerine karşı lösemi K562 hücrelerine göre daha büyük bir sitotoksik potansiyel sergilediği bulunmuştur. Bu veriler, CIK efektörlerinin tümör hücrelerini öldürdüğü moleküler mekanizmaların henüz net olmadığını göstermektedir.
Hedef hücre canlılığının izlenmesi ve akış sitometrisi kullanılarak efektör hücrelerin sitotoksik potansiyelinin değerlendirilmesi klinik muayene için standart ve konvansiyonel bir yöntem haline gelmiştir17. Bu hücre canlılığı ve aktivasyon belirteçleri ekspresyonu üzerinde olumsuz bir etki gözlendiği ileri sürülmüştür, cd3 gibi+ cfse lekeli lenfositler nüfus akış sitometri ile18,19. Bu nedenle, hedef kanser hücrelerinin boyanması primer CIK hücrelerinin sitotoksik etkilerini değerlendirmek için daha etkili bir stratejidir. IFN-γ, OKT3 ve IL-2 CIK farklılaşması ve çoğalması için önemli sitokinler veya uyarıcılardır. Ayrıca timoglobulin, IL-1α, IL-10, IL-15 gibi diğer faktörler de uyarıcıdır. Şu anda, insan serumu, insan trombosit açısından zengin plazma, ve hatta fetal sığır serumu CIK hücrelerinin çoğalmasını artırabilir orta takviyeleri olarak kullanılır. Serum veya plazma besin ve büyüme faktörleri ile zenginleştirilmiş olmasına rağmen, allojenik hayvansal ürünlerin eklenmesi, deneysel değişkenlikle sonuçlanan kaynak, toplu ve çok varyasyonlar sunar ve kültür hücreleri için terapötik sonuçlarla kaçınılmaz olarak rahatsız edici çalışmalar sunar. Bu çalışmada, CIK hücrelerini başarılı bir şekilde kültüre almak için klinik dereceli sitokinlerle desteklenen, serumsuz, albüminsiz ve ksiz-gmp sınıfı bir ortam kullandık. Kseno içermeyen veya allojeneik olmayan takviyeleri kullanmanın dezavantajı hücre çoğalmasının etkinliğini azaltmak olduğunu.
Protokollerde sağlanan iki renkli hücre izleme yöntemleri, doğrudan sitotoksisite testinde canlı veya ölü efektör hedef hücreleri bağımsız olarak hesaplanmıştır. Gating stratejilerimizde CFSE+ hedef hücreler cik efektör hücrelerinden açıkça ayırt edilebilir(Şekil 3). En önemlisi, CIK indüksiyon ve genişleme süreci nitelikli olmalı ve yüksek canlılık göstermelidir. Daha fazla çoklu doz infüzyon için, kriyopreservation durumu, ve canlılık ve erime sonrası sitotoksisite, diğer kritik zorluklardır. Spesifik lisisin gerçek oranı 100 x (%Örnek lisis - %Bazal lisis)/(100 - %Bazal lisis) oranına eşittir. Diğer çalışmaların aksine18,20, Tüm hedef hücrelerin CIK hücrelerinin tam ve gerçek sitotoksisitesini ortaya çıkarmak için araştırılması tavsiye edilir.
Sonuç olarak, bu çalışmada açıklanan protokol sağlıklı donörlerden PBMC kaynaklı CIK hücrelerinin sayısını artırmak ve seçici izleme için iki renkli fotoaktiv probları ile kanser hücrelerine karşı sitotoksik fonksiyonlarını değerlendirmek için tasarlanmıştır in vitro diagnostik (IVD) sistemi ile akış sitometrisi ile hücreleri hedef.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkar çatışması ilan.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Tıp Üniversitesi Hastanesi (DMR-Cell-1809) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-Amino Actinomycin D | BD | 559925 | |
| APC Mouse Anti-Human CD56 antibody | BD | 555518 | B159 |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | MOPC-21 |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD | 338962 | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | BD | 565082 | |
| D-(+)-Glucose solution | SIGMA | G8644 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 | HyClone | SH30023.02 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare Life Sciences | 71101700-EK | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody | BD | 555332 | UCHT1 |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555748 | MOPC-21 |
| Human anti-CD3 mAb | TaKaRa | T210 | OKT3 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Proleukin | NOVARTIS | ||
| Recombinant Human Interferon-gamma | CellGenix | 1425-050 | |
| Recombinant Human Interleukin-1 alpha | PEPROTECH | 200-01A | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 11875-085 | |
| Sigma 3-18K Centrifuge | Sigma | 10295 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12605028 | |
| X-VIVO 15 medium | Lonza | 04-418Q |
References
- Cappuzzello, E., et al. Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of Cytokine-Induced Killer (CIK) cells. Cytokine & Growth Factor Reviews. 36, 99-105 (2017).
- Schmidt-Wolf, R. S., et al. Propagation of large numbers of T cells with natural killer cell markers. British Journal of Haematology. 87 (3), 453-458 (1994).
- Grainger, S., et al. Wnt Signaling in Hematological Malignancies. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 153, 321-341 (2018).
- Dai, C., et al. Implication of combined PD-L1/PD-1 blockade with cytokine-induced killer cells as a synergistic immunotherapy for gastrointestinal cancer. Oncotarget. 7 (9), 10332-10344 (2016).
- Schmidt-Wolf, I. G., et al. Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity. TheJournal of Experimental Medicine. 174 (1), 139-149 (1991).
- Introna, M., et al. Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells: an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 38 (9), 621-627 (2006).
- Schmeel, L. C., et al. Cytokine-induced killer (CIK) cells in cancer immunotherapy: report of the international registry on CIK cells (IRCC). Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (5), 839-849 (2015).
- Rutella, S., et al. Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new good manufacturing practice-grade protocol. Cytotherapy. 14 (7), 841-850 (2012).
- Nausch, N., et al. NKG2D ligands in tumor immunity. Oncogene. 27 (45), 5944-5958 (2008).
- Gammaitoni, L., et al. Effective activity of cytokine-induced killer cells against autologous metastatic melanoma including cells with stemness features. Clinical Cancer Research. 19 (16), 4347-4358 (2013).
- Rettinger, E., et al. The cytotoxic potential of interleukin-15-stimulated cytokine-induced killer cells against leukemia cells. Cytotherapy. 14 (1), 91-103 (2012).
- Narayan, R., et al. Donor-derived cytokine-induced killer cell infusion as consolidation after nonmyeloablative allogeneic transplantation for myeloid neoplasms. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 19, 1083 (2019).
- Castiglia, S., et al. Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 237 (2018).
- Bonanno, G., et al. Thymoglobulin, interferon-γ and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer (CIK) cells in clinical-grade cultures. Journal of Translational Medicine. 8, 129 (2010).
- Iudicone, P., et al. Interleukin-15 enhances cytokine induced killer (CIK) cytotoxic potential against epithelial cancer cell lines via an innate pathway. Human Immunology. 77 (12), 1239-1247 (2016).
- Liu, J., et al. Phenotypic characterization and anticancer capacity of CD8+ cytokine-induced killer cells after antigen-induced expansion. PLoS One. 12 (4), 0175704 (2017).
- Chen, D., et al. Cytokine-induced killer cells as a feasible adoptive immunotherapy for the treatment of lung cancer. Cell Death & Disease. 9 (3), 366 (2018).
- Tario, J. D. Jr Monitoring cell proliferation by dye dilution: considerations for probe selection. Methods in Molecular Biology. 1678, 249-299 (2018).
- Last'ovicka, J., et al. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular Immunology. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Yoshida, T., et al. Characterization of natural killer cells in tamarins: a technical basis for studies of innate immunity. Frontiers in Microbiology. 1, 1-9 (2010).
