Summary
Тканевые сложности многоклеточных систем смужает выявление причинно-следственной связи между внеклеточными сигналами и индивидуальным клеточным поведением. Здесь мы представляем метод изучения прямой связи между контактно-зависимыми сигналами и осями деления с помощью c. elegans эмбриона бластомеры и клея полистирола.
Abstract
В многоклеточных системах отдельные клетки окружены различными физическими и химическими сигналами, поступающими из соседних клеток и окружающей среды. Эта сложность тканей смужает выявление причинно-следственной связи между наличностью и клеточной динамикой. Синтетически восстановленная многоклеточная система преодолевает эту проблему, позволяя исследователям тестировать на определенный сигнал, устраняя при этом других. Здесь мы представляем метод восстановления клеточных контактных моделей с изолированными Caenorhabditis elegans blastomere и клеевыми бусинами из полистирола. Процедуры включают удаление яичной скорлупы, изоляцию бластомеров, нарушая сцепление клеток, приготовление клейких бусинов, и восстановление контакта клеток или клеточного бисера. Наконец, мы представляем применение этого метода для исследования ориентации клеточного деления осей, что способствует регуляции пространственного клеточного шаблона и спецификации судьбы клеток в развивающихся эмбрионах. Этот надежный, воспроизводимый и универсальный метод in vitro позволяет изучать прямые связи между структурами контакта пространственных клеток и клеточными реакциями.
Introduction
Во время многоклеточного развития клеточное поведение (например, ось деления) отдельных клеток определяется различными химическими и физическими сигналами. Чтобы понять, как отдельные клетки интерпретирует эту информацию, и как они регулируют многоклеточной сборки как возникающие свойства является одной из конечных целей морфогенеза исследований. Модель организма C. elegans внесла значительный вклад в понимание клеточного уровня регулирования морфогенеза, таких как клеточная полярность1, клеточное деление узор1, решение судьбы клеток2, и ткани масштаба правил, таких как нейрональная проводка3 и органогенез4,5. Хотя существуют различные генетические инструменты, методы тканевой инженерии ограничены.
Наиболее успешным методом тканевой инженерии в исследовании C. elegans является классическая лапомерная изоляция6; так как эмбрион C. elegans окружен яичной скорлупой и барьером проницаемости7,их удаление является одной из основных процедур этого метода. Хотя этот метод изоляции бластомеров позволяет восстановить контакт клеток в упрощенном порядке, он не позволяет устранить нежелательные сигналы; контакт клеток по-прежнему представляет собой как механические (например, сливки), так и химические сигналы, тем самым ограничивая нашу способность полностью анализировать причинно-следственную связь между кием и клеточным поведением.
Метод, представленный в этой работе, использует карбоксилат модифицированные полистиролные бусы, которые могут ковалентно связываться с любыми амино-реактивными молекулами, включая белки в виде лигандов. В частности, мы использовали амин-реактивную форму родамин Red-X в качестве лигана, чтобы сделать бисер как визуально отслеживаемый и клей к клетке. Карбоксильные группы поверхности бисера и первичные группы амина молекулы лиганд соединены водорастворимым карбодиамидом 1-этил-3-(диметиламинопропил) карбодиамидом (EDAC)8,9. Полученные клеевые бусы позволяют эффекты механического сигнала на клеточной динамике10. Мы использовали этот метод для определения механических сигналов, необходимых для ориентации деления клеток10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление клейкой полистирора
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол не требует асептической техники.
- Взвесьте 10 мг карбоксилата модифицированных полистирола в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки.
- Для мытья бисера добавьте 1 мл 2-(N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES) буфера в трубку. Поскольку буфер МЧС не содержит фосфатов и ацетата, которые могут снизить реактивность карбодиимида, он подходит для использования в реакции сцепления белков. Вихрь трубки, чтобы смешать бисер.
- Спин трубки для 60 с на 2000 х г через скамейке центрифуги.
- Откажитесь от супернатанта, тщательно выкладывая буфер.
- Снова вымойте бисер 1 мл буфера МЧС, выдвив на шаг 1.2-1.4.
- Добавьте 1 мл буфера МЧС, содержащего 10 мг EDAC, в трубку, чтобы активировать поверхностные группы карбоксила. Вихрь трубки, чтобы смешать бисер.
- Поверните и инкубировать трубку в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Спин вниз бисера для 60 с на 2000 х г.
- Откажитесь от супернатанта, тщательно выкладывая буфер.
- Для мытья бисера добавьте 1 мл фосфатного буферного солья (PBS) в трубку. Вихрь трубки, чтобы смешать бисер.
- Спин вниз трубки для 60 с на 2000 х г.
- Откажитесь от супернатанта, тщательно выкладывая буфер.
- Снова вымойте бисер 1 мл PBS, выдвивая следующие шаги 1.10-1.12.
- Окончательная концентрация родамина используется будет зависеть от штамма, образуемого. Приготовьте 1 мл 1-, 10-, 100- и 1000-кратной раз разбавления серии родамин Красный X из 0,65 мм родамин Red-X фондового раствора.
- Пипетка 20 л бусин в каждую серийную продавить трубку.
- Поверните и инкубировать трубку в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Вымойте бисер дважды 1 мл PBS, повторяя шаги 1.10-1.12.
- Добавьте 1 мл PBS в трубку и храните ее при 4 градусах По Цельсию в течение 6 недель. Проверьте интенсивность флуоресценции бисера под микроскопом, используемым для живой визуализации. Соответствующая концентрация родамин красно-X succinimidyl эфир зависит от условий изображения(Рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Бусы без лечения родамин красно-X не прилипают к клетке. Родамин Red-X служит маркером флуоресценции, а также клейкой молекулы. Электростатическое взаимодействие между положительно заряженным родамином Red-X и отрицательно заряженной плазменной мембраной является податливой причиной спайки.
2. Сборка устья пипетки
- Вырезать широкий (6,35 мм внутреннего диаметра) и узкие (3,175 мм внутреннего диаметра) Тайгон труб около 25 см и 40 см в длину, соответственно (Рисунок 2).
- Соедините трубки Tygon с фильтром политетрафторэтилена (PTFE) (размер поры 0,2 мкм)(рисунок 2).
- Разберите коммерчески доступную трубку аспиратора и прикрепите ее капиллярный держатель и мундштук к концу узких и широких труб Тайгона, соответственно(рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: PTFE фильтр был использован для предотвращения вдыхания паров гипохлоритного раствора через рот пипетки.
3. Изоляция эмбриона бластомер
ПРИМЕЧАНИЕ: Носите перчатки и лабораторное пальто, чтобы избежать разреза и контакта с раствором отбеливания.
- Держите каждый конец микрокапилляра (емкость; 10 л) правой и левой рукой.
- Потяните микрокапилляр к обоим концам, чтобы применить напряжение и принести центр капилляра над горелкой, чтобы сделать два ручной вытягивания капилляров(Рисунок 3A).
- Обрезать кончики ручных капилляров щипцами под рассекающим сядр и прикрепите вытянутый капилляр в ротовой аппарат(рисунок 2). Подготовьте два типа пипетков. Размеры наконечника для пипетки должны быть примерно в 2 раза и 1x короткая длина оси C. elegans эмбрионов (30 мкм) для переноса эмбриона и удаления яичной скорлупы, соответственно Рисунок 3B-D).
- Пипетка 45 л раствора яичной соли на скважину многовелл-слайда(рисунок 4A;дно).
- Поместите 5-10 взрослых C. elegans на хорошо содержащий раствор яичной соли.
- Чтобы получить ранние эмбрионы C. elegans, разрежьте взрослых на куски, распомещая две иглы вправо и влево от тела C. elegans и сдвинув иглы мимо друг друга(рисунок 4A; верхняя схема).
- Пипетка 45 Л гипохлоритного раствора на скважину рядом с хорошо содержащим раствор яичной соли(рисунок 4В).
- Пипетка 45 л среды роста Шелтона на последующие три скважины рядом с хорошо содержащим гипохлоритный раствор(рисунок 4B).
- Передача 1-клеточной стадии и ранних 2-клеточных эмбрионов стадии в гипохлоритный раствор с помощью ротовой трубы с нарисованным вручную капилляром для переноса эмбриона(рисунок 4В).
- Подождите 40-55 с.
- Вымойте эмбрионы путем передачи эмбрионов из гипохлоритного раствора в среду роста Шелтона с помощью ротовой трубы с нарисованным вручную капилляром для переноса эмбриона(рисунок 4В).
- Вымойте эмбрионы снова путем передачи эмбрионов в новый колодец шелтона роста среды рот пипеттинг с рисованной капиллярдля для переноса эмбриона(Рисунок 4B).
- Перенесите вымытые эмбрионы в новый колодец среды роста Шелтона с помощью ротовой трубы с нарисованным вручную капилляром для переноса эмбриона. Используя нарисованный вручную капилляр для удаления яичной скорлупы, тщательно повторите пипетку(рисунок 4C;средние схемы). Если яичная скорлупа будет успешно удалена, эмбриональные клетки станут более сферическими(рисунок 4C;справа).
- Отделить 2-клеточный этап эмбриональных бластомеров мягко и непрерывно pipetting с рисованной капиллярдля для удаления яичной скорлупы (Рисунок 4D).
4. Восстановление контактных моделей с бластомером и бисором
ПРИМЕЧАНИЕ: Работа под микроскопом изображения, чтобы избежать диссоциации клетки от биса и для облегчения своевременного приобретения изображения.
- Для наблюдения с помощью перевернутого микроскопа подготовьте камеру изображения, как на рисунке 5.
- Поместите крышку на держатель для обкрытии(рисунок 5A).
- Лента края крышки, чтобы стабилизировать его. Сторона с лентой является "назад" стороны(рисунок 5A,B).
- Переверните держатель крышки к стороне 'передней' и нарисуйте круг на крышке с гидрофобной ручкой(рисунок 5C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Любое стеклянное дно блюдо также работает, при условии, эмбрионы манипулируют рот пипетка.
- Добавить среды роста Шелтона в круге обращается гидрофобный маркер(Рисунок 5D).
- Перенесите изолированные бластомеры в камеру изображения.
- Распределите небольшой объем химически функционированных бусин с использованием нарисованного от руки капилляра для переноса эмбриона.
- Контролируйте положение полистирола, дуя в нарисованный от руки капилляр до тех пор, пока шарик не прикрепится к изолированному бластомере.
- Установите крышку, чтобы избежать испарения среды(рисунок 5E). Выполните живую визуализацию.
5. Подготовка важных реагентов
- Раствор яйцеклетки соль (10 мл): Смешайте 235 л из 5 M NaCl и 240 л из 2 M KCl с 9525 л dH2O.
- Гипохлоритный раствор (10 мл): Смешайте 7,5 мл clorox (содержащий примерно 7,5% гипохлорит натрия) с 2,5 мл 10 N NaOH (окончательная концентрация гипохлорит натрия составляет примерно 5,625%).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя многие опубликованные методы использовали хитиназа для переваривания хитинозных яичной скорлупы, мы приняли метод с использованием гипохлоритного раствора11. Избегая пакетных вариаций хитиназа, мы считаем, что этот метод является более воспроизводимым и рентабельным. - Раствор инулина 0,81 м/м (40 мл)
- Добавьте 0,2 г инулина до 40 мл дН2О.
- Автоклав для растворения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняет в течение 1 месяца при 4 градусах Цельсия.
- Буфер МЧС 0,5 м (500 мл)
- Растворите 48,81 г МЧС в 400 мл дистиллированной воды (дН2О).
- Отрегулируйте рН до 6.0.
- Довести общий объем до 500 мл с dH2O.
- Решение PBS (1 л)
- Чтобы сделать 10-кратный раствор PBS, растворите 1 пакет порошка premix PBS в 1 l dH2O.
- Объедините 100 мл 10-кратного раствора PBS с 900 мл dH2O.
- 5% Поливинилпирролидон (PVP) Решение (4 мл)
- При стерильных условиях растворите 0,2 г PVP в 4 мл медиума Дрозофилы Шнайдера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда открывайте средний запас Шнайдера в тканевой культуре (ТК) капюшоном. Хранить в течение 1 месяца при 4 градусах По Цельсию.
- При стерильных условиях растворите 0,2 г PVP в 4 мл медиума Дрозофилы Шнайдера.
- Раствор запаса родамин Red-X 0,65 мм (2 мл)
- Взвесите 1 мг родамина Red-X.
- Добавьте 2 мл диметилсульфида (DMSO) для растворения.
- Aliquot и хранить при -20 градусах по Цельсию.
- Средний рост Шелтона (SGM) (10.25 мл)
- В стерильных условиях сочетайте в себе 8 мл медиума Дрозофилы Шнайдера, 1 мл раствора PVP, 1 мл раствора Инулина, 1 мл базальных средних орлов (BME) витаминов, 50 л пенициллина-стрептомицина и 100 мл липидного концентрата вместе.
- Aliquot 325 Л SGM в микротрубках 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить около 1 месяца при 4 градусах По Цельсию. - В день изоляции бластомер добавьте 175 кЛ сыворотки плода (FBS) в SGM (общим объемом 500 л).
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните FBS при -20 градусов и оттаивайте его перед использованием. FBS не нужно быть тепло убитым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для приготовления бисера мы определили оптимальное количество родеамина Red-X succinimidyl ester для трансгенного штамма, выражающего GFP-миозин II и mCherry-histone(рисунок 1A-D). Мы использовали mCherry помечены гистон в качестве маркера прогрессии клеточного цикла. Поскольку и Родамин Red-X, и mCherry будут освещены лазером 561 нм, оптимальная интенсивность сигнала Родамин Красный X сопоставима с гистоном, чтобы позволить одновременное изображение клеток и бисера. Например, сигнал флуоресценции от биса обработанные с 0.005 мкг/мл родамин Красный X succinimidyl эфир был слишком слаб, чтобы визуализировать бисину (Рисунок 1A). С другой стороны, сигнал флуоресценции от бисера, обработанного 5 мкг/мл родамин красный X succinimidyl эфир был слишком силен, чтобы изображение mCherry-histone (Рисунок 1D). Мы определили, что 0,5 мкг/мл родамин Красный X succinimidyl эфир является оптимальным для данного конкретного трансгенного штамма(Рисунок 1C).
Blastomere изоляции была выполнена в соответствии с процедурами, показанные в Рисунке 4. Следующие моменты должны быть рассмотрены для успешных экспериментов. 1) Средства массовой информации в колодце со временем испаряются и становятся вязкими; это приводит к тому, что эмбрионы прилипают к стеклянной капиллярной капилляру и другим эмбрионам, поэтому необходимо использовать новый колодец со свежими носителями. 2) В гипохлоритном растворе эмбрионы высажают поверхность. Поэтому опустите увеличение микроскопа и сосредоточьтесь на поверхности капли, чтобы облегчить перенос эмбрионов. 3) Эффективность гипохлоритного раствора может отличаться. Следовательно, продолжительность пребывания эмбрионов в гипохлоритном растворе должна быть проверена на каждую новую партию гипохлоритного раствора. 4) Поместите пипетку рот как можно ближе к эмбриону, как это возможно, чтобы свести к минимуму силу, используемую для удара в пипетку, но и не слишком близко, так что эмбрион всасывается, а (это также верно при присоединении бисера). 5) После удаления яичной скорлупы эмбрионы становятся очень деликатными. Следовательно, силы, приложенные на рот пипетки должны быть слегка снижены, чтобы предотвратить эмбрионы от разрыва. 6) Длительное использование рот пипетки может ослабить фильтр PTFE, и 7) 2-клеточная стадия эмбрионы должны быть разделены только тогда, когда ядро было четко сформировано(Рисунок 4C, левая схема). По сравнению с клетками в нетронутых эмбрионах(рисунок 4A; справа), клетки эмбрионов без яичной скорлупы выглядят круглее(рисунок 4C;справа). Кроме того, после изоляции бластомеров форма бластомеров становится сферической(рисунок 4D;справа).
Чтобы проверить влияние физического контактозависимого сигнала на ориентацию деления клеток, мы прикрепили родамин Red-X с покрытием бусы ab blastomeres изолированы от 2-клеточной стадии и выполняется живой визуализации (Рисунок 6, Рисунок 7). Бисер без лечения родамин Красный X не придерживался бластомеров, предполагая, что родамин Red-X служит как флуоресцентный маркер и клеевой молекулы. Для анализа ориентации деления клеток, мы реконструировали покадровое изображение с помощью функции "3D-проект" ImageJ12 (рисунок 6A; наклон вокруг Y-оси). Чтобы определить плоскость, содержащую митотический шпиндель (шпиндель плоскости), мы сначала определили плоскость, где две центросомы были вертикально выровнены(Рисунок 6B; 110 "): плоскость с углом 90 "этой плоскости шпиндель плоскости (Рисунок 6B; -20 "). Далее, мы измерили угол шпинделя (ориентация шпинделя) по отношению к контактному интерфейсу клеточного бисера (контактная ориентация) после цитокинеза(рисунок 6C). Когда обе дочерние клетки были прикреплены к бисовосе, линия, которая проходит оба контактных участка, была использована в качестве контактной ориентации.
В нашем предыдущем исследовании, мы определили анизотропных клеточных поверхностей миозина потока во время бисера индуцированной ОРИЕНТАЦИи AB ячейки деления10. Однако, трудно измерить внутриклеточный поток миозина, как клетка движется во время ориентированного деления. Для выполнения этого, сначала мы выбрали образцы с шпинделем выровнены к плоскости изображения (xy плоскости) (Рисунок 7). Во-вторых, стеки были спроецированы с использованием максимального метода проекции(рисунок 7). В-третьих, движения клеток были исправлены с помощью субпиксельного алгоритма регистрации Stack reg plug-in13 of ImageJ с опцией rigid body (рисунок 7B). При регистрации изображений положение ячейки было стабильным(рисунок 7В). Наконец, с помощью ручного отслеживания плагин АМКЭ, миозин фокусы были отслежены(Рисунок 7C). Согласно информации о координатах, скорости миозина вдоль оси деления и оси перпендикулярно ей были рассчитаны в пределах 50 с после начала цитокинеза.
Рисунок 1: Определение концентрации родамин красно-X. (A-D) Эмбрионы, выражающие ГФП-миозин (зеленый) и мчерри-гистон (пурпурный) были помещены в непосредственной близости от бисера, связанного с различными концентрациями родамина Red-X (magenta). Интенсивность сигнала mCherry и Родамин Red-X прокладываются вдоль белых пунктирных линий (нижние графики). Сигналы бисера и гистона были четко обнаружены для бисера, обработанного 0,5 мкг/мл родамин красный X. Шкала баров показать 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Сборка сетчатых пипеток. Рот пипетка собирается путем соединения узких (1) и широкие (2) Тайгона труб с фильтром PTFE (3). В конце узкой и широкой трубки Tygon, капиллярный держатель (4) и рот кусок (5) были прикреплены, соответственно. Нарисованный вручную стеклянный капилляр (6) может быть вставлен в держатель капилляра. Шкала бар 50 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Изоляция Бластомера. (A) Рука потянув из стекла капилляров. (B) Нарисованный вручную стеклянный капилляр для переноса эмбриона. (C) Нарисованный вручную стеклянный капилляр для удаления яичной скорлупы. (D) Схемы, показывающие соответствующий размер капиллярного отверстия для удаления яичной скорлупы. Стрелки указывают на эмбрионы. Шкала баров показать 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Рабочий процесс изоляции Blastomere. (A) Рассеивание взрослых C. elegans в буфере яичной соли для получения эмбрионов. Фотографии показывают 2-клеточные и 4-клеточные эмбрионы стадии до удаления яичной скорлупы. (B) Гипохлорит лечения и стирки. (C) Схемы изображают соответствующее время для удаления яичной скорлупы. Фотография показывает 4-клеточный эмбрион стадии после удаления яичной скорлупы. (D) Blastomere разделения. На фотографии показан разделенный 2-клеточный эмбрион. Размеры стрелок в C и D указывают на относительные силы, необходимые во время пайпеттинга. Шкала баров показать 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Сборка камеры изображения. (A) Прикрепляя крышку к держателю coverslip. (B) Изображения держателя крышки. Держатель Coverslip до и после сборки указан слева и справа, соответственно. (C) Круг, нарисованный с помощью гидрофобной ручки. (D) Добавление среды роста Шелтона и образца в пределах круга. (E) Монтаж coverslip, чтобы избежать испарения. Шкала баров показать 50 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Анализ ориентации деления клеток. (A) Диаграмма анализа ориентации деления клеток. (B) Определение шпинделя плоскости. На снимках слева показан пример образца. 3D реконструированные 4-D фильмы вращались вокруг Y-оси, чтобы определить плоскость, в которой две центросомы выравниваются вертикально (правое изображение; правая верхняя схема). В этом примере плоскость шпинделя составляет 90 евро (среднее изображение; схема правого дна). (C) Измерение ориентации шпинделя относительно контакта с клеточной шариком. Используя изображения шпиндельной плоскости, ориентация шпинделя после цитокинеза определялась на основе угла между линиями, соединяющими две центросомы (оранжевые пунктирные линии в правой схеме) и клеточном контактом (синие пунктирные линии). Когда обе дочерние клетки были прикреплены к бисеру, контактная ориентация на клеточный шарик была линией, которая проходит оба контактных участка. Зеленый миозин и центросома, пурпурный - гистон и бисер. Шкала баров 10 мкм. Время минут и секунд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Анализ потока миозина. (A) Диаграмма анализа потока миозина. (B) Коррекция ориентации деления клеток. Для количественной оценки динамики потока внутриклеточного миозина, вращение разделительной ячейки было исправлено с помощью плагина ImageJ Stack reg(опция rigid body). Верхние и нижние изображения — до и после обработки стек-рега. Право большинство изображений показывают временный цветовой код временных рядов. (C) Отслеживание фоци миозина. Используя изображения, обработанные Stack reg, отдельные движения фоци с фоцисов миосина отслеживались плагином отслеживания руководства ImageJ. Ось деления и перпендикулярная ей ось были определены как x и y, соответственно (правые схемы). Скорости потока миозина в оси x и y (Vx и Vy) измерялись в соответствии с информацией о координатах. Шкала баров 10 мкм. Время минут и секунд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Восстановление упрощенных моделей контакта клеток позволит исследователям проверить роли конкретных моделей контакта клеток в различных аспектах морфогенеза. Мы использовали этот метод, чтобы показать, что ось деления клеток контролируется физическим контактом с клеевыми шариками10. Как спецификация оси деления имеет решающее значение для многоклеточного развития, способствуя морфогенез14, стволовой клетки деление15,16, и ткани гомеостаза15,16, этот метод должен быть в состоянии осветить новый механизм формирования тканей животных.
В дополнение к ориентации деления клеток, этот метод имеет потенциал, чтобы быть платформой для проверки взаимосвязи между механическими сигналами и судьбой клеток. Предыдущие исследования показали, что механический кий контролирует спецификацию судьбы клеток. Мезенхимальные стволовые клетки человека дифференцируются в нейрон, адипоциты, скелетные мышечные клетки и остеобласты при культивировании в субстрате с разной жесткостью17. В ответ на жесткость субстрата, транскрипционные регуляторы Да-ассоциированный белок (YAP) и ТАЗ (транскрипционный со-активатор с PD- связывающий мотив) будет трансперелоспособен в ядро, чтобы регулировать спецификацию судьбы клеток18. Метод, представленный в настоящем документе, также должен быть полезен для проверки роли механических сигналов на спецификации судьбы клеток, путем тщательного культивирования клеток в долгосрочном контакте с клеевыми шариками.
Этот метод имеет ограничения в повторении некоторых механических сигналов наблюдается in vivo. В C. elegans, хитинозная яичная скорлупа и проницаемость барьер аслужит физическим ограничением. Хотя удаление яичной скорлупы не влияет на нормальное развитие, удаление как яичной скорлупы, так и барьера проницаемости приводит к ненормальному формированию шаблона19. При отсутствии яичной скорлупы и барьера проницаемости, форма клетки становится более сферической, что свидетельствует о том, что давление между клетками и клеточной яичной скорлупой играет важную роль в деформации клеток и узора. Действительно, ячейки ячейки сжимая силы было предложено регулировать ориентацию деления клеток20. Без физического ограничения и преобразительного давления среди тканей, мы ожидаем, что этот метод также не может резюмировать in vivo области контакта клеток. Как область контакта клеток, как известно, влияют Notch сигнализации21, это ограничение должно быть дополнительно рассмотрено, когда определенные механические или химические сигнал не работает с помощью этого метода in vitro.
Мы до сих пор тестировали ориентацию деления клеток изолированных AB, P1, EMS, P2, ABa, ABp клеток (клетки до 6 стадий ячейки) в наших руках10, но метод может быть применен к более позднему развитию, насколько отдельные клетки могут быть изолированы. Недавнее одноклеточное секвенирование исследование использовало проназе пищеварения тела червя изолировать личиночных клеток22. Таким образом, потенциально можно использовать проназе лечения изолировать более поздние стадии эмбриональных клеток и личинок клеток.
В этом исследовании, мы показали пример взаимодействия между механическим сигналом и ориентацией деления клеток, но связь клеток также опосредовано химическими сигналами, такими как Wnt23, Notch24, сливки, соединенные рецепторами25 и так далее. Важно отметить, что представленный здесь метод приготовления бисера может соединить шарики с любыми белками, тем самым позволив восстановить химические сигналы. Предыдущие исследования также использовали Sepharose бис26 и белок-магнитный бусин27 покрытием с белком Wnt, чтобы продемонстрировать Wnt-зависимых процессов развития. Тем не менее, эти бусы не коммерчески доступны в различных размерах по сравнению с карбоксилат модифицированных полистирола бусы. Таким образом, будущие исследования могут использовать представленный метод в качестве платформы для проверки роли как химических, так и физических сигналов в более настраиваемых манерах. В совокупности этот метод подходит для исследователей, которые изучают клеточного поведения и реакции, которые являются результатом пространственных контактных моделей клеток и хотят устранить другие клеточные сигналы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Джеймса Присса и Брюса Бауэрмана за советы и предоставление штаммов C. elegans, Дона Мормана, Кота Мизумото и Института биологических наук Imaging Core Facility для совместного использования оборудования и реагентов, Аои Хироясу, Лизы Фернандо, Мина Джи Кима за содержание C. elegans и критическое чтение нашей рукописи. Наша работа поддерживается Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC), (RGPIN-2019-04442).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
References
- Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
- Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
- McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
- Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
- Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
- Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
- Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
- Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
- Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
- Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
- Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
- Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
- Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
- Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
- Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
- Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).
- Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
- Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).
