Summary
Vävnad komplexitet flercelliga system blanda ihop identifieringen av orsakssambandet mellan extracellulära signaler och enskilda cellulära beteenden. Här presenterar vi en metod för att studera den direkta kopplingen mellan kontakt beroende ledtrådar och divisions axlar med hjälp av C. elegans embryo blastomerer och lim polystyren pärlor.
Abstract
I flercelliga system, är enskilda celler omgivna av olika fysiska och kemiska signaler som kommer från angränsande celler och miljön. Denna vävnad komplexitet blandar ihop identifieringen av orsakssambandet mellan extrinsic signaler och cellulära dynamik. Ett syntetiskt rekonstituerat multicellulära system övervinner detta problem genom att göra det möjligt för forskare att testa för en specifik Cue samtidigt eliminera andra. Här presenterar vi en metod för att rekonstruera cell kontakt mönster med isolerade Caenorhabditis elegans biopsi och lim polystyren pärlor. Procedurerna innebär äggskal avlägsnande, biopsi isolering genom att störa cell-cell adhesion, beredning av lim polystyren pärlor, och beredning av cell-cell eller cell-pärla kontakt. Slutligen presenterar vi tillämpningen av denna metod för att undersöka inriktningen av cellulära Division axlar som bidrar till regleringen av rumsliga cellulära mönster och cell öde specifikation i utvecklingen av embryon. Denna robusta, reproducerbara och mångsidiga in vitro-metod möjliggör studiet av direkta relationer mellan rumslig cell kontakt mönster och cellulära svar.
Introduction
Under den flercelliga utvecklingen specificeras de cellulära beteendena (t. ex. divisions axeln) för enskilda celler av olika kemiska och fysiska signaler. För att förstå hur enskilda celler tolkar denna information, och hur de reglerar flercelliga sammansättningen som en framväxande egenskap är ett av de ultimata målen för morfogenes studier. Modellorganismen C. elegans har bidragit avsevärt till förståelsen av cellulära nivåreglering av morfogenes såsom cell polaritet1, celldelning mönstringen1, cell öde beslut2, och vävnad skala förordningar såsom neuronala ledningar3 och organogenes4,5. Även om det finns olika genetiska verktyg tillgängliga, vävnadstekniska metoder är begränsade.
Den mest framgångsrika vävnadstekniska metoden i C. elegans studien är den klassiska biopsi isolering6; som C. elegans embryo är omgiven av en äggskal och en permeabilitet barriär7, är deras avlägsnande en av de viktigaste förfarandena för denna metod. Denna metod för biopsi-isolering möjliggör beredning av cell cells kontakt på ett förenklat sätt, men den tillåter inte eliminering av oönskade ledtrådar. cell kontakt fortfarande utgör både mekanisk (t. ex. vidhäftning) och kemiska signaler, vilket begränsar vår förmåga att helt analysera orsakssambandet mellan Cue och cellulära beteende.
Den metod som presenteras i detta dokument använder karboxylate modifierade polystyren pärlor som kovalent binda till någon Amine-reaktiva molekyler inklusive proteiner som ligander. Speciellt använde vi en Amin-reaktiv form av Rhodamine Red-X som en ligand att göra pärlor både visuellt spårbar och lim till cellen. Karboxylgrupperna av pärlyta och primära amingrupper av ligand-molekylen är sammankopplade med vattenlösliga karbodiimidgrupp 1-etyl-3-(dimetylaminopropyl) karbodiimidgrupp (edac)8,9. Erhållna självhäftande pärlor möjliggöra effekterna av den mekaniska Cue på cellulära dynamik10. Vi har använt denna teknik för att identifiera mekaniska signaler som krävs för celldelning orientering10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av lim polystyren pärla
Anmärkning: detta protokoll kräver inte aseptisk teknik.
- Väg 10 mg karboxylate modifierade polystyren pärlor i en 1,5 mL microcentrifug röret.
- För att tvätta pärlorna, tillsätt 1 mL 2-(N-morpholino) etansulfonsyra (MES) buffert i röret. Eftersom MES buffert inte innehåller fosfat och acetat, vilket kan minska reaktiviteten av carbodiimide, det är lämpligt att använda i protein koppling reaktion. Vortex röret för att blanda pärlorna.
- Snurra röret för 60 s på 2 000 x g via en bänkmonterade centrifug.
- Kassera supernatanten genom att noggrant Pipettera ut bufferten.
- Tvätta pärlorna igen med 1 mL MES-buffert genom att följa steg 1.2-1.4.
- Tillsätt 1 mL MES-buffert som innehåller 10 mg EDAC i röret för att aktivera ytkarboxylgrupperna. Vortex röret för att blanda pärlorna.
- Rotera och Inkubera röret i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Snurra ner pärlorna för 60 s på 2 000 x g.
- Kassera supernatanten genom att noggrant Pipettera ut bufferten.
- För att tvätta pärlorna, tillsätt 1 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i röret. Vortex röret för att blanda pärlorna.
- Snurra ner röret för 60 s på 2 000 x g.
- Kassera supernatanten genom att noggrant Pipettera ut bufferten.
- Tvätta pärlorna igen med 1 mL PBS genom att följa steg 1.10-1.12.
- Den slutliga koncentrationen av Rhodamine används kommer att bero på stammen som avbildas. Förbered 1 mL av 1-, 10-, 100-, och 1000-faldig utspädningsserie av Rhodamine Red-X från den 0,65 mM Rhodamine Red-X stamlösning.
- Pipettera över 20 μL pärlor i varje seriell utspädnings slang.
- Rotera och Inkubera röret i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta pärlorna två gånger med 1 mL PBS genom att upprepa steg 1.10-1.12.
- Tillsätt 1 mL PBS i röret och förvara det vid 4 ° c i upp till 6 veckor. Kontrollera fluorescensintensiteten hos pärlorna under ett mikroskop som används för Live-avbildning. Den lämpliga koncentrationen av Rhodamine Red-X succinimidyl Ester är beroende av avbildnings förhållandena (figur 1).
Anmärkning: pärlor utan Rhodamine Red-X behandling inte följer cell. Rhodamine Red-X fungerar som fluorescensmarkör och adhesiv molekyl. Den elektrostatiska interaktionen mellan positivt laddade Rhodamine Red-X och negativt laddade plasmamembran är en förmodad orsak till vidhäftning.
2. montering av pipetten för munnen
- Skär bred (6,35 mm innerdiameter) och smala (3,175 mm innerdiameter) Tygon rör till ca 25 cm och 40 cm i längd, respektive (figur 2).
- Anslut Tygon-rören med ett polytetrafluoretylfilter (PTFE) (0,2 μm porstorlek) (figur 2).
- Demontera ett kommersiellt tillgängligt aspiratorrör och fäst dess kapillärhållare och munstycke i slutet av de smala och breda Tygon-rören (figur 2).
Anmärkning: PTFE-filter användes för att förhindra inandning av ångor av hypoklorit lösning via munnen pipett.
3. isolering av embryo biopsi
Obs: Använd handskar och labbrock för att undvika ingrepp och kontakt med bleknings lösningen.
- Håll i vardera änden av en mikrokapillär (kapacitet; 10 μL) med höger och vänster hand.
- Dra microcapillary mot båda ändarna för att tillämpa spänningar och föra mitten av kapillär över en brännare för att göra två Handdragna kapillärer (figur 3a).
- Trimma spetsarna på de Handdragna kapillärerna med tång under den dissekera mikroskopet och fäst den dragna kapillären i en mun pipettering apparat (figur 2). Förbered två typer av pipetter. Spetsen öppnings storlekar för pipetter bör vara cirka 2x och 1x den korta axel längden på C. elegans embryon (30 μm) för embryoöverföring och äggskal avlägsnande, respektive figur 3B-D).
- Pipettera 45 μl ägg salt lösning på en brunn av en multispot bild (figur 4a; botten).
- Placera 5-10 vuxna C. elegans på en väl innehållande ägg saltlösning.
- För att få tidiga C. elegans embryon, skära vuxna i bitar genom att placera två nålar till höger och vänster om c. elegans kroppen och glidande nålar förbi varandra (figur 4A; övre schematik).
- Pipettera 45 μL hypokloritlösning till en brunn bredvid den väl innehållande ägg saltlösningen (figur 4B).
- Pipettera över 45 μL av Shelton ' s odlingssubstrat till de efterföljande tre brunnarna bredvid brunnen innehållande hypokloritlösning (figur 4B).
- Överför 1-cellsledet och tidiga embryon i 2-cellsledet till hypokloritlösningen genom Munpipettering med det handritade kapillärområdet för överföring av embryon (figur 4B).
- Vänta 40 – 55 s.
- Tvätta embryona genom att överföra embryona från hypokloritlösning till Sheltons odlingsmedium genom Munpipettering med det handritade kapillärmedlet för överföring av embryon (figur 4B).
- Tvätta embryona igen genom att överföra embryona till en ny brunn av Sheltons odlingsmedium genom att Pipettera med handritade kapillär för överföring av embryon (figur 4B).
- Överför de tvättade embryona till en ny brunn av Sheltons odlingsmedium genom Munpipettering med handritade kapillär för embryoöverföring. Använd handritade kapillär för avlägsnande av äggskal, försiktigt upprepa pipettering (figur 4C; mellersta schematiska). Om äggskal avlägsnas framgångsrikt, kommer de embryonala cellerna att bli mer sfäriska (figur 4C; höger).
- Separera embryonala blastomererna i 2-cellsledet genom att försiktigt och kontinuerligt Pipettera med det handritade kapillärdraget för avlägsnande av äggskal (figur 4D).
4. beredning av kontakt mönster med biopsi och pärla
Obs: arbeta under Imaging Mikroskop för att undvika dissociation av en cell från en pärla och för att underlätta i tid bild förvärv.
- För att observera med ett inverterat Mikroskop, Förbered en bildbehandlings kammare enligt figur 5.
- Placera en täckslip på en täckslip hållare (figur 5a).
- Tejpa kanterna på täckslip för att stabilisera den. Sidan med tejp är "baksidan" (figur 5A, B).
- Vänd täckslip hållaren till "framsidan" och rita en cirkel på täcklocket med en hydrofoba penna (figur 5C).
Anmärkning: alla glasbotten skålen fungerar också, förutsatt att embryona är manipulatable av munnen pipett.
- Lägg till Sheltons odlingssubstrat i cirkeln som dras av den hydrofoba markören (figur 5D).
- Överför den isolerade blastomeren till bild kammaren.
- Fördela en liten volym av kemiskt funktionaliserade pärlor med hjälp av handritade kapillär för embryoöverföring.
- Kontrollera placeringen av polystyren pärlor genom att blåsa i handritade kapillär tills pärlan fäster den isolerade blastomere.
- Montera en täckslip för att undvika avdunstning av mediet (figur 5E). Utföra Live-avbildning.
5. beredning av viktiga reagenser
- Ägg saltlösning (10 mL): kombinera 235 μL med 5 M NaCl och 240 μL av 2 M KCl med 9525 μL dH2O.
- Hypokloritlösning (10 mL): kombinera 7,5 mL Clorox (innehållande cirka 7,5% natriumhypoklorit) med 2,5 mL 10 N NaOH (den slutliga koncentrationen av natriumhypoklorit är cirka 5,625%).
Obs: även om många publicerade metoder har använt Chitinase att smälta kitina äggskal, vi har antagit en metod med hjälp av hypoklorit lösning11. Genom att undvika batch-till-sats varianter av Chitinase verksamhet, anser vi att denna metod är mer reproducerbara och kostnadseffektiv strategi. - 0,81 mM Inulinlösning (40 mL)
- Tillsätt 0,2 g inulin till 40 mL dH2O.
- Autoklav att lösa.
Obs: håller i 1 månad vid 4 ° c.
- 0,5 M MES-buffert (500 mL)
- Lös upp 48,81 g MES i 400 mL destillerat vatten (dH2O).
- Justera pH till 6,0.
- Ta den totala volymen till 500 mL med dH2O.
- PBS-lösning (1 L)
- För att göra 10-faldig PBS lösning, lös upp 1 paket med PBS premix pulver i 1 L dH2O.
- Kombinera 100 mL 10-faldig PBS-lösning med 900 mL dH2O.
- 5% polyvinylpyrrolidon (PVP) lösning (4 mL)
- Lös 0,2 g PVP i 4 mL Drosophila Schneiders medium under sterila förhållanden.
Obs: öppna alltid Schneiders medelstora lager i vävnadsodling (TC). Förvaras i 1 månad vid 4 ° c.
- Lös 0,2 g PVP i 4 mL Drosophila Schneiders medium under sterila förhållanden.
- 0,65 mM Rhodamine röd-X stamlösning (2 mL)
- Väg 1 mg Rhodamine röd-X.
- Tillsätt 2 mL dimetylsulfoxid (DMSO) för att lösa upp.
- Och förvara vid-20 ° c.
- Shelton ' s odlingssubstrat (SGM) (10,25 mL)
- Under sterila förhållanden, kombinera 8 mL av Drosophila Schneiders medium, 1 mL PVP-lösning, 1 ml Inulinlösning, 1 mL basala medium Eagle (BME) vitaminer, 50 μL av penicillin-streptomycin, och 100 μL av lipidkoncentrat tillsammans.
- Alikvot 325 μL av SGM till 1,5 mL mikrotuber.
Obs: håll i ca 1 månad vid 4 ° c. - På dagen för biopsi isolering, tillsätt 175 μl av fetalt bovint serum (FBS) till SGM (för total volym av 500 μl).
Obs: Förvara FBS vid-20 ° c och Tina den före användning. FBS behöver inte vara värmedödade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För pärlor beredning, vi bestämde den optimala mängden av Rhodamine Red-X succinimidyl Ester för den transgena stammen uttrycker GFP-myosin II och mCherry-histone (figur 1A-D). Vi använde mcherry taggade Histon som en markör för cell Cycle progression. Eftersom både rhodamine Red-x och mcherry kommer att belysas av en 561 nm-Laser, är den optimala intensiteten av rhodamine Red-x-signalen jämförbar med den för Histon för att möjliggöra samtidig avbildning av cell och pärla. Till exempel var fluorescenssignalen från den pärla som behandlades med 0,005 μg/mL Rhodamine Red-X succinimidyl Ester för svag för att visualisera pärlan (figur 1A). Å andra sidan var fluorescenssignalen från pärlorna som behandlades med 5 μg/mL Rhodamine Red-X succinimidyl Ester för stark för att avbilda mCherry-histone (figur 1D). Vi bestämde att 0,5 μg/mL Rhodamine Red-X succinimidyl Ester är optimalt för denna specifika transgena stam (figur 1C).
Blastomere isolering utfördes enligt de förfaranden som visas i figur 4. Följande punkter bör åtgärdas för lyckade experiment. 1) medierna i brunnen avdunstar med tiden och blir trögflytande; Detta gör att embryona att hålla sig till glaset kapillär och andra embryon, så en ny brunn med färska medier måste användas. 2) i hypokloritlösningen, embryon flyter till ytan. Därför, lägre förstoringen av mikroskopet och fokusera på ytan av DROPP för att underlätta med överföring av embryon. 3) effekten av hypoklorit lösning kan variera. Därför, varaktigheten av embryon tillbringar i hypokloritlösning bör testas för varje ny sats av hypoklorit lösning som gjorts. 4) Placera munnen pipetten så nära embryot som möjligt för att minimera den styrka som används för att blåsa i pipetten, men inte heller för nära så att embryot sugs upp också (detta är också sant när du fäster pärlor). 5) efter avlägsnande av äggskal, embryon blir mycket känsliga. Därför måste krafter som utövas på munpipetten sänkas något för att förhindra att embryon spricker. 6) långvarig användning av munnen pipett kan dämpa PTFE-filtret, och 7) 2-cellsledet bör endast separeras när kärnan har tydligt bildats (figur 4C, vänster schematik). Jämfört med celler i intakt embryon (figur 4A; höger), celler i embryon utan äggskal ser rundare (figur 4C; höger). Efter isolering av blastomeren blir formen av blastomerer dessutom sfärisk (figur 4D; till höger).
För att testa effekterna av fysisk kontakt-beroende Cue på celldelning orientering, bifogade vi Rhodamine Red-X belagda pärlor till AB blastomerer isolerade från 2-cells scenen och utförde Live-Imaging (figur 6, figur 7). Pärlan utan behandling med Rodamine Red-X har inte anslutit sig till blastomererna, vilket tyder på att Rhodamine Red-X fungerar som en både fluorescensmarkör och limmolekyl. För analys av celldelning orientering, vi har 3D rekonstruerade tidsförlopp bild med hjälp av "3D-projektet" funktion av ImageJ12 (figur 6A; luta runt Y-axeln). För att bestämma det plan som innehåller mitotisk spindel (spindel plan) identifierade vi först ett plan där två centrosomes var vertikalt justerade (figur 6b; 110 °): planet med en vinkel på ± 90 ° för detta plan är spindel plan (figur 6b;-20 °). Därefter har vi mätt vinkeln på spindeln (spindelorientering) i förhållande till cell-Bead kontakt Interface (kontakt orientering) efter cytokinesi (figur 6C). När båda dottercellerna fästes på Pärlan användes en linje som passerar båda kontaktsidorna som en kontakt orientering.
I vår tidigare studie har vi identifierat en anisotropisk cellyta myosin flöde under pärlinducerad AB cell Division orientering10. Emellertid, det är svårt att mäta intracellulära myosin flödet som cell flyttar under orienterad division. För att utföra detta, först har vi valt ut proverna med spindel justerad till bildplanet (XY-planet) (figur 7). För det andra projicerades Z-stackar med maximal projektionsmetod (figur 7). Tredje, cell rörelser korrigerades med hjälp av subpixel registrering algoritm stack REG plug-in13 av imagej med styv kropp alternativ (figur 7B). Genom registrering av bilder, var positionen för cellen stabil (figur 7B). Slutligen, genom att använda Manuell spårning plug-in av imagej, myosin Foci spårades (figur 7C). Enligt den koordinatinformation, hastigheter myosin längs Division Axis, och axel vinkelrätt mot den beräknades inom 50 s efter cytokinesi debut.
Figur 1: bestämning av Rhodamine Red-X-koncentrationen. (a-D) Embryon som uttrycker GFP-myosin (grön) och mCherry-histone (magenta) placerades i närheten av pärlor bundna med olika koncentrationer av Rhodamine Red-X (magenta). Signalintensiteten hos mCherry och Rhodamine Red-X ritas längs de vita prickade linjerna (botten grafer). Pärlorna och histonsignalerna upptäcktes tydligt för pärlor behandlade med 0,5 μg/mL Rhodamine Red-X. Skalstreck visar 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: hopsättning av munnen pipett. Munnen pipett monteras genom att ansluta smala (1) och breda (2) Tygon rör med ett PTFE-filter (3). I slutet av det smala och breda Tygon-röret fästes kapillärhållaren (4) och munstycket (5). Ett handritat glas kapillär (6) kan sättas in i kapillärhållaren. Skalstapeln är 50 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: isolering av Blastomere. (A) hand dra av glas kapillär. B) handritade glas kapillär för överföring av embryon. C) handritade glas kapillär för avlägsnande av äggskal. Dschematik som visar lämplig storlek på kapilläröppningen för avlägsnande av äggskal. Pilar indikerar embryon. Skala staplar visar 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: arbetsflöde för isolering av Blastomere. Adissektion av vuxna C. elegans i äggsalt-buffert för att erhålla embryon. Fotografier visar 2-cells-och 4-cellsledet innan äggskal avlägsnas. B) hypokloritbehandling och tvättning. (C) Schematics visar lämplig tidpunkt för avlägsnande av äggskal. Fotografi visar en 4-cells skede embryo efter äggskal avlägsnande. Dseparation med blastomere. Fotografi visar ett separerat 2-cells-stegembryo. Storleken på pilarna i C och D indikerar de relativa krafterna som krävs vid pipettering. Skala staplar visar 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: montering av bildbehandlings kammare. (A) fästa täckslip på täckslip hållaren. (B) bilder av en täckslip hållare. Täckslip hållare före och efter monteringen anges till vänster respektive höger. C) en cirkel som dras via en hydrofoba penna. (D) tillägg av Sheltons odlingssubstrat och prov i cirkeln. (E) montera en täckslip för att undvika avdunstning. Skala staplar visar 50 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: analys av cell delnings orientering. A) ettdiagram över analys av cell delnings orientering. Bbestämning av spindel plan. Vänster bilder visar ett exempel på ett prov. 3D rekonstruerade 4-D filmer roteras runt Y-axeln för att bestämma planet där två centrosomes rikta vertikalt (höger bild, höger övre Schematics). I detta exempel är spindel planet ± 90 ° av 110 ° (mellersta bild, höger botten Schematics). Cmätning av spindelorientering i förhållande till kontakt med cell pärla. Med hjälp av bilder av spindel planet bestämdes spindel orienteringen efter cytokinesi utifrån vinkeln mellan linjer som förbinder två centrosomes (orange streckade linjer i rätt schematik) och cell kontakt (blå prickade linjer). När båda dottercellerna var knutna till pärlorna, cell-pärla kontakt orientering var den linje som passerar båda kontakt sidor. Grön är myosin och centrosome, magenta är Histon och pärlor. Skalstreck är 10 μm. tiden är minuter och sekunder. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: analys av myosinflödet. A) ettdiagram över myosin-Flödesanalys. Bkorrigering av cell delnings orientering. För att kvantifiera intracellulära myosin Flow dynamik, rotation av dividera cell korrigerades med hjälp av ImageJ plugin stack REG (styv kropp alternativ). Övre och nedre bilder är före och efter stacken REG bearbetning. Rätt de flesta bilder visar temporala färgkod tidsserier. C) spårning av myosinfoci. Med hjälp av bilder som bearbetas av stack REG, enskilda myosin Foci rörelser spåras av ImageJ Manuell spårning plugin. Divisions axeln och axeln som är vinkelrät mot den definierades som x respektive y (höger schematik). Myosin flödeshastigheter i x-och y-axeln (VX och vy) mättes enligt koordinatinformationen. Skalstreck är 10 μm. tiden är minuter och sekunder. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beredning av förenklade cell kontakt mönster kommer att låta forskarna att testa rollerna för specifika cell kontakt mönster i olika aspekter av morfogenes. Vi har använt denna teknik för att visa att cell Division Axis styrs av den fysiska kontakten med självhäftande pärlor10. Som Division Axis specifikation är avgörande för multicellulära utveckling genom att bidra till morfogenes14, Stem cell Division15,16, och vävnad homeostas15,16, denna metod bör kunna belysa en ny mekanism av djurvävnad bildas.
Förutom celldelning orientering, denna metod har en potential att vara en plattform för att testa relationen mellan mekaniska signaler och cell öde. Tidigare studier rapporterade att mekanisk Cue styr cell Fate specifikation. Mänskliga mesenkymala stamceller differentierar till neuron, adipocyte, skelettmuskulaturen cell, och osteoblast när odlade i substrat med olika styvhet17. Som svar på substrat stelhet, transkriptionella regulatorer Ja-associerade protein (YAP) och TAZ (transkriptionella Co-Activator med PDZ-bindande motiv) kommer att translocate till kärnan, att reglera cell Fate specifikation18. Den metod som presenteras i detta dokument bör också vara användbart för att testa rollen av mekaniska ledtrådar på cell Fate specifikation, genom odling cell långsiktig i kontakt med lim pärlor.
Denna metod har begränsningar i går igenom vissa mekaniska signaler observeras in vivo. I C. elegans, kitina äggskal och permeabilitet barriär fungera som en fysisk Bibehåll. Även om avlägsnande av äggskal inte påverkar normal utveckling, avlägsnande av både äggskal och permeabilitet barriär resulterar i onormal mönster bildning19. I avsaknad av äggskal och permeabilitet barriär, cell form blir mer sfäriska, vilket tyder på att trycket mellan celler och cell-äggskal spelar en avgörande roll i cell deformation och mönkning. I själva verket har cell-cell klämma styrkor föreslagits för att reglera celldelning orientering20. Utan att ha fysisk begränsa och förmodade tryck bland vävnader, vi förväntar oss att denna metod också inte kan recapitulate in vivo cell kontaktyta. Eftersom cell kontaktområdet är känt för att påverka notch signalering21, denna begränsning måste övervägas ytterligare när vissa mekaniska eller kemiska Cue inte fungerar med denna in vitro-metod.
Vi har hittills testat celldelning orientering isolerade AB, P1, EMS, P2, ABa, ABp celler (celler upp till 6 cell stadier) i våra händer10, men metoden kan tillämpas på senare utveckling så långt som enskilda cellen kan isoleras. Senaste Single cell sekvensering studie har använt pronase nedbrytning av masken kroppen att isolera larv cell22. Därför kan potentiellt en använda pronase behandling för att isolera senare skede embryonala celler och larv celler.
I denna studie visade vi exemplet på interaktion mellan mekanisk Cue och celldelning orientering, men cell-cellkommunikation också förmedlas av kemiska signaler som WNT23, notch24, adhesion kopplade receptorer25 och så vidare. Viktigt, den pärlor förberedelse metod som presenteras här kan paret pärlorna med några proteiner, vilket möjliggör beredning av kemiska ledtrådar. Tidigare studier har också använt Sepharose Bead26 och protein-en magnetisk pärla27 belagda med WNT protein för att demonstrera WNT-beroende utvecklingsprocesser. Emellertid, dessa pärlor är inte kommersiellt tillgängliga i olika storlekar jämfört med karboxylate modifierade polystyren pärlor. Därför kan framtida forskning använda den presenterade metoden som en plattform för att testa rollen av både kemiska och fysiska signaler i mer avstämbara seder. Sammantaget är denna metod lämpad för forskare, som studerar cellulära beteenden och svar som resultat från rumslig cell kontakt mönster och vill eliminera andra cellulära ledtrådar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar James Priess och Bruce Bowerman för råd och ger c. elegans stammar, Don Moerman, Kota Mizumoto, och Life Sciences Institute Imaging Core anläggning för att dela utrustning och reagenser, AOI Hiroyasu, Lisa Fernando, min JEE Kim för underhåll av c. elegans och kritisk läsning av vårt manuskript. Vårt arbete stöds av naturvetenskapliga och tekniska forskningsrådet i Kanada (NSERC), (RGPIN-2019-04442).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
References
- Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
- Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
- McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
- Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
- Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
- Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
- Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
- Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
- Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
- Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
- Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
- Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
- Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
- Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
- Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
- Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).
- Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
- Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).
