Summary
Çok hücreli sistemlerin doku karmaşıklığı hücre dışı ipuçları ve bireysel hücresel davranışlar arasındaki nedensel ilişkinin belirlenmesini şaşırtmak. Burada, C. elegans embriyo blastomerleri ve yapışkan polistiren boncuklar kullanarak temasa bağlı ipuçları ve bölünme eksenleri arasındaki doğrudan bağlantıyı incelemek için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Çok hücreli sistemlerde, tek tek hücreler komşu hücrelerden ve çevreden gelen çeşitli fiziksel ve kimyasal ipuçları ile çevrilidir. Bu doku karmaşıklığı dışsal ipuçları ve hücresel dinamikler arasındaki nedensel bağlantının belirlenmesini bozar. Sentetik olarak yeniden oluşturulmuş çok hücreli sistem, araştırmacıların belirli bir ipucu için test etmesini sağlarken diğerlerini ortadan kaldırarak bu sorunun üstesinden gelir. Burada izole Caenorhabditis elegans blastomer ve yapışkan polistiren boncuklarla hücre temas desenlerini yeniden oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz. Prosedürler yumurta kabuğu kaldırma, hücre-hücre adezyonu bozarak blastomer izolasyonu, yapışkan polistiren boncuk hazırlanması ve hücre-hücre veya hücre-boncuk temas reconstitution içerir. Son olarak, embriyoların geliştirilmesinde uzamsal hücresel desenleme ve hücre kaderi özelliklerinin düzenlenmesine katkıda bulunan hücresel bölünme eksenlerinin yönünü araştırmak için bu yöntemin uygulanmasını saklı atıyoruz. Bu sağlam, tekrarlanabilir ve çok yönlü in vitro yöntemi uzamsal hücre temas desenleri ve hücresel yanıtlar arasındaki doğrudan ilişkilerin incelenmesini sağlar.
Introduction
Çok hücreli gelişim sırasında, tek tek hücrelerin hücresel davranışları (örneğin, bölünme ekseni) çeşitli kimyasal ve fiziksel ipuçları ile belirtilir. Tek tek hücrenin bu bilgiyi nasıl yorumladığını ve çok hücreli montajı acil bir özellik olarak nasıl düzenlediklerini anlamak morfogenez çalışmalarının nihai hedeflerinden biridir. Model organizma C. elegans hücre polaritesi gibi morfogenezin hücresel düzeyde düzenlenmesinin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunmuştur1, hücre bölünmesi desenleme1, hücre kader kararı2, ve nöronal kablolama gibi doku ölçekli düzenlemeler3 ve organogenez4,5. Çeşitli genetik araçlar mevcut olmasına rağmen, doku mühendisliği yöntemleri sınırlıdır.
C. elegans çalışmasında en başarılı doku mühendisliği yöntemi klasik blastomerizolasyonu 6; C. elegans embriyo bir yumurta kabuğu ve geçirgenlikbariyer7ile çevrili olduğu gibi, bunların kaldırılması bu yöntemin ana prosedürleri biridir. Bu blastomer izolasyon yöntemi hücre-hücre temasının basitleştirilmiş bir şekilde yeniden yapılandırılmasını sağlarken, istenmeyen ipuçlarının ortadan kaldırılmasına izin vermez; hücre teması hala hem mekanik (örneğin, yapışma) hem de kimyasal ipuçları nı oluşturur ve bu da işaret ile hücresel davranış arasındaki nedensel ilişkiyi tam olarak analiz etme yeteneğimizi sınırlandırır.
Bu yazıda sunulan yöntem, ligand olarak proteinler de dahil olmak üzere herhangi bir amin-reaktif moleküllere kovalent bağlanabilen karboksilit modifiye polistiren boncuklar kullanmalıdır. Özellikle, rhodamine Red-X'in amin-reaktif formunu kullanarak boncukları hem görsel olarak izlenebilir hem de hücreye yapıştırıcı hale getirmek için kullandık. Boncuk yüzeyi karboksil grupları ve ligand molekülünün primer amin grupları suda çözünen karbodiimid 1-etil-3-(dimethylaminoproyl) karbodiimide (EDAC)8,9ile birleştiğindedir. Elde edilen yapışkan boncuklar hücresel dinamikleri10mekanik işaret etkileri için izin verir. Hücre bölünmesi oryantasyonu10için gerekli mekanik ipuçlarını tanımlamak için bu tekniği kullandık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Yapıştırıcı polistiren boncuk hazırlanması
NOT: Bu protokol aseptik teknik gerektirmez.
- 1.5 mL mikrosantrifüj tüpte 10 mg karboksilat modifiye polistiren boncuk ağırlığındadır.
- Boncukları yıkamak için, tüp içine 2-(N-morpholno)etanesulfonik asit (MES) tampon 1 mL ekleyin. MES tamponu, karbodiimidin reaktivitesini azaltabilen fosfat ve asetat içermediğinden protein kaplin reaksiyonunda kullanılması uygundur. Boncukları karıştırmak için tüpü girdap.
- Bir tezgah üstü santrifüj ile 2.000 x g 60 s için tüp spin.
- Tamponu dikkatlice dışarı borulayarak supernatant atın.
- 1.2-1.4 adımlarını izleyerek boncukları 1 mL MES tamponu ile tekrar yıkayın.
- Yüzey karboksil gruplarını etkinleştirmek için tüpe 10 mg EDAC içeren 1 mL MES tamponu ekleyin. Boncukları karıştırmak için tüpü girdap.
- Tüpü oda sıcaklığında 15 dakika döndürün ve kuluçkaya yatırın.
- 2.000 x g60 s için boncuk aşağı spin .
- Tamponu dikkatlice dışarı borulayarak supernatant atın.
- Boncukları yıkamak için tüpe 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Boncukları karıştırmak için tüpü girdap.
- 2.000 x g60 s için tüp aşağı spin .
- Tamponu dikkatlice dışarı borulayarak supernatant atın.
- 1.10-1.12 adımlarını izleyerek boncukları 1 mL PBS ile tekrar yıkayın.
- Rhodamine kullanılan son konsantrasyonu görüntülenecek gerginlik bağlıdır. 0,65 mM Rhodamine Red-X stok çözeltisinden 1 mL 1-, 10-, 100-ve 1000 kat seyreltme serisi Rhodamine Red-X hazırlayın.
- Her seri seyreltme tüpüne 20°L boncuk.
- Tüpü oda sıcaklığında 5 dakika döndürün ve kuluçkaya yatırın.
- 1.10-1.12 adımlarını tekrarlayarak boncukları 1 mL PBS ile iki kez yıkayın.
- Tüpe 1 mL PBS ekleyin ve 4 °C'de 6 haftakadar saklayın. Canlı görüntüleme için kullanılan bir mikroskop altında boncuk floresan yoğunluğunu kontrol edin. Rhodamine Red-X succinimidyl esterinuygun konsantrasyonu görüntüleme koşullarına bağlıdır(Şekil 1).
NOT: Rhodamine Red-X tedavisi olmayan boncuklar hücreye yapışmaz. Rhodamine Red-X floresan belirteci yanı sıra yapışkan molekül olarak hizmet vermektedir. Pozitif yüklü Rhodamine Red-X ve negatif yüklü plazma membran arasındaki elektro statik etkileşim yapışma putatif bir nedenidir.
2. Ağız pipetinin montajı
- Geniş (6,35 mm iç çap) ve dar (3,175 mm iç çap) Tygon tüpleri sırasıyla yaklaşık 25 cm ve 40 cm uzunluğunda kesin (Şekil 2).
- Tygon tüplerini politetetrafloroetilen (PTFE) filtresi (0,2 m gözenek boyutu) ile bağlayın (Şekil 2).
- Ticari olarak mevcut bir aspiratör tüpünü sökün ve kılcal tutucusunu ve ağızlığını sırasıyla dar ve geniş Tygon tüplerinin ucuna takın (Şekil 2).
NOT: PTFE filtre ağız pipet yoluyla hipoklorit çözeltisi dumanı teneffüs önlemek için kullanılmıştır.
3. Embriyo blastomer izolasyonu
NOT: Beyazlatma solüsyonunun kesilmesini ve temas etmesini önlemek için eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin.
- Mikrokapillerin (kapasite; 10 μL) her ucunu sağ ve sol el ile tutun.
- Mikrokapilleri her iki ucuna doğru çekin ve kılcal damarın merkezini bir brülör e doğru getirin ve iki elle çekilmiş kılcal damarlar yapın(Şekil 3A).
- Diseksiyon mikroskobu altında forseps ile elle çekilen kılcal damarların uçlarını kırpın ve çekilen kılcal damarı ağız borulama cihazına takın(Şekil 2). İki tür pipet hazırlayın. Pipetler için uç açma boyutları yaklaşık 2x ve 1x C. elegans embriyoların kısa eksen uzunluğu olmalıdır (30 μm) embriyo transferi ve yumurta kabuğu kaldırma için, sırasıyla Şekil 3B-D).
- Pipet 45 μL yumurta tuzu çözeltisi çok kuyulu bir slayt kuyusu üzerine(Şekil 4A; alt).
- 5-10 yetişkin C. elegans iyi yumurta tuzu çözeltisi içeren üzerine yerleştirin.
- Erken C. elegans embriyoları elde etmek için, C. elegans vücudunun sağına ve soluna iki iğne yerleştirerek ve iğneleri birbirinden geçirerek yetişkinleri parçalara ayırır(Şekil 4A; üst şemalar).
- Pipet 45 μL hipoklorit çözeltisi iyi içeren yumurta tuzu çözeltisi yanında bir kuyu üzerine(Şekil 4B).
- Pipet 45 μL Shelton büyüme ortamı sonraki üç kuyu üzerine kuyu içeren hipoklorit çözeltisi(Şekil 4B)yanında .
- 1 hücreli evre ve erken 2 hücreli evre embriyoların, embriyo transferi için elle çizilmiş kılcal damarile ağız borulama ile hipoklorit çözeltisine aktarılması(Şekil 4B).
- 40-55 s bekleyin.
- Embriyotransferi için elle çizilmiş kılcal damar ile ağız borulama ile shelton büyüme ortamına hipoklorit çözeltisinden embriyolar transfer ederek embriyoları yıkayın(Şekil 4B).
- Embriyo transferi için elle çizilmiş kılcal damar ile ağız borulama tarafından Shelton büyüme ortamının yeni bir kuyuiçine embriyolar aktararak tekrar embriyoları yıkayın(Şekil 4B).
- Yıkanmış embriyoları, embriyo transferi için elle çizilmiş kılcal damarla ağız borusu ile Shelton'ın büyüme ortamının yeni bir kuyusuna aktarın. Yumurta kabuğunun çıkarılması için elle çizilmiş kılcal damarı kullanarak pipetlemeyi dikkatlice tekrarlayın(Şekil 4C; orta şemalar). Yumurta kabuğu başarıyla çıkarılırsa, embriyonik hücreler daha küresel hale gelecektir(Şekil 4C; sağ).
- 2 hücreli evreli embriyonik blastomerleri yumurta kabuğunun çıkarılması için elle çizilmiş kılcal damarla hafifçe ve sürekli pipetleme yaparak ayırın(Şekil 4D).
4. Blastomer ve boncuk ile temas desenleri reconstitution
NOT: Bir hücrenin boncuktan ayrışmasını önlemek ve zamanında görüntü edinimi kolaylaştırmak için görüntüleme mikroskobu altında çalışın.
- Ters mikroskop kullanarak gözlemlemek için Şekil 5'teolduğu gibi bir görüntüleme odası hazırlayın.
- Kapak tutucuya bir kapak fişi yerleştirin (Şekil 5A).
- Sabitlemek için kapağın kenarlarını bantlayın. Bantlı yan taraf 'arka' tarafıdır (Şekil 5A,B).
- Kapak tutucuyu 'ön' tarafa çevirin ve hidrofobik kalemle kapak kaymasına bir daire çizin(Şekil 5C).
NOT: Herhangi bir cam alt çanak da çalışır, embriyolar ağız pipet tarafından manipüle edilebilir sağlanan.
- Shelton büyüme ortamını hidrofobik marker tarafından çizilen dairenin içine ekleyin (Şekil 5D).
- İzole blastomeri görüntüleme odasına aktarın.
- Embriyo transferi için elle çizilmiş kılcal kullanarak kimyasal olarak işlevsel boncuk küçük bir hacim dağıtın.
- Boncuk izole blastomer ekene kadar elle çizilmiş kılcal içine üfleyerek polistiren boncuk konumunu kontrol edin.
- Ortamın buharlaşmasını önlemek için bir kapak kayması yerleştirin (Şekil 5E). Canlı görüntüleme yapın.
5. Önemli reaktiflerin hazırlanması
- Yumurta Tuzu Çözeltisi (10 mL): 235 μL 5 M NaCl ve 240 μL 2 M KCl ile 9525 μL dH2O'nun birleştirilmesi.
- Hipoklorit Solüsyonu (10 mL): 7,5 mL Clorox (yaklaşık %7,5 sodyum hipoklorit içeren) ile 2,5 mL 10 N NaOH (son sodyum hipoklorit konsantrasyonu yaklaşık %5,625'tir) birleştirin.
NOT: Birçok yayınlanan yöntemler kitinöz yumurta kabukları sindirmek için kitinaz kullanmış olmasına rağmen, biz hipoklorit çözeltisi11kullanarak bir yöntem benimsemiştir. Kitinaz aktivitelerinin toplu-toplu varyasyonlarından kaçınarak, bu yöntemin daha tekrarlanabilir ve uygun maliyetli bir yaklaşım olduğuna inanıyoruz. - 0,81 mM İnulin Çözeltisi (40 mL)
- DH2O 40 mL için Inulin 0.2 g ekleyin.
- Otoklav çözülecek.
NOT: 4 °C'de 1 ay boyunca saklar.
- 0,5 M MES Tampon (500 mL)
- 400 mL distile suda (dH2O) 48,81 g MES çözün.
- pH'ı 6.0'a ayarlayın.
- Toplam hacmi dH2O ile 500 mL'ye getirin.
- PBS Çözeltisi (1 L)
- 10 kat PBS çözeltisi yapmak için 1 paket PBS premix tozunu 1 L dH2O'da çözün.
- 100 mL 10 kat PBS çözeltisini 900 mL dH2O ile birleştirin.
- %5 Polivinilpyrrolidone (PVP) Solüsyonu (4 mL)
- Steril koşullarda, Drosophila Schneider's Medium 4 mL PVP 0.2 g çözünür.
NOT: Schneider'ın doku kültürü (TC) kaputunda her zaman Orta stokunu açın. 4 °C'de 1 ay bekletin.
- Steril koşullarda, Drosophila Schneider's Medium 4 mL PVP 0.2 g çözünür.
- 0,65 mM Rhodamine Red-X stok çözeltisi (2 mL)
- Rhodamine Red-X 1 mg ağırlığında.
- Çözünmek için 2 mL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin.
- Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
- Shelton Büyüme Orta (SGM) (10,25 mL)
- Steril koşullar altında, Drosophila Schneider'ın Orta 8 mL, PVP çözeltisi 1 mL, Inulin çözeltisi 1 mL, Bazal Orta Kartal (BME) Vitaminler1 mL, Penisilin-Streptomisin 50 μL ve Lipid konsantresi 100 μL birlikte birleştirin.
- Aliquot 325 μL SGM 1.5 mL mikrotüpler içine.
NOT: 4 °C'de yaklaşık 1 ay bekletin. - Blastomer izolasyongününde, SGM'ye (toplam hacmi 500°L) 175 μL Fetal Sığır Serumu (FBS) ekleyin.
NOT: FBS'yi -20 °C'de saklayın ve kullanmadan önce eritin. FBS ısı öldürülmeye gerek yoktur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Boncuk ların hazırlanması için, GFP-miyozin II ve mCherry-histon 'u ifade eden transgenik suşu için en uygun Rhodamine Red-X succinimidyl esterini belirledik (Şekil 1A-D). Hücre döngüsü ilerlemesinin bir göstergesi olarak mCherry etiketli histon kullandık. Rhodamine Red-X ve mCherry 561 nm lazer ile aydınlatılacak olduğundan, Rhodamine Red-X sinyalinin optimum yoğunluğu hücre ve boncuk eşzamanlı görüntüleme sağlamak için histon ile karşılaştırılabilir. Örneğin, 0.005 μg/mL Rhodamine Red-X succinimidyl ester ile tedavi edilen boncukfloresan sinyali boncuk görselleştirmek için çok zayıftı (Şekil 1A). Öte yandan, 5 μg/mL Rhodamine Red-X succinimidyl ester ile tedavi boncuklardan gelen floresan sinyali mCherry-histon görüntülemek için çok güçlüydü (Şekil 1D). 0.5 μg/mL Rhodamine Red-X succinimidyl esterinin bu transgenik suşu için en uygun olduğunu belirledik(Şekil 1C).
Blastomer izolasyonu Şekil 4'tegösterilen prosedürlere göre gerçekleştirilmiştir. Başarılı denemeler için aşağıdaki noktalar ele alınmalıdır. 1) Kuyudaki ortam zamanla buharlaşır ve viskoz hale gelir; Bu da embriyoların cam kılcal damarlara ve diğer embriyolara yapışmasına neden olur, bu nedenle taze ortama sahip yeni bir kuyunun kullanılması gerekir. 2) Hipoklorit çözeltisinde embriyolar yüzeye çıkar. Bu nedenle, mikroskop büyütme düşürmek ve embriyotransferi ile kolaylaştırmak için damlacık yüzeyine odaklanmak. 3) Hipoklorit çözeltisinin etkinliği farklı olabilir. Bu nedenle, embriyoların hipoklorit çözeltisi harcamak süresi hipoklorit çözeltisi yapılan her yeni toplu için test edilmelidir. 4) Ağzın pipetini, pipete üflemek için kullanılan gücü en aza indirmek için mümkün olduğunca yakın, ama aynı zamanda embriyo nun da emilmesi için çok yakın değil (boncuk takarken bu da geçerlidir). 5) yumurta kabuğu çıkarılmasından sonra, embriyolar çok hassas hale gelir. Bu nedenle, ağız pipetine uygulanan kuvvetlerin embriyoların patlamasını önlemek için biraz alçaltılması gerekir. 6) Ağız pipetinin uzun süreli kullanımı PTFE filtresini nemlendirebilir ve 7) 2 hücreli evre embriyolar sadece çekirdek açıkça oluştuğunda ayrılmalıdır(Şekil 4C, sol şemalar). Bozulmamış embriyolarda hücrelerle karşılaştırıldığında(Şekil 4A; sağda), yumurta kabuğu olmayan embriyolarda hücreler daha yuvarlak görünür(Şekil 4C; sağda). Ayrıca blastomer izolasyonundan sonra blastomerlerin şekli küresel hale gelir(Şekil 4D; sağda).
Hücre bölünmesi oryantasyonu üzerinde fiziksel temasa bağlı işaretin etkilerini test etmek için, Rhodamine Red-X kaplı boncukları 2 hücreli aşamadan izole edilmiş AB blastomerlerine bağladık ve canlı görüntüleme gerçekleştirdik(Şekil 6, Şekil 7). Rhodamine Red-X tedavisi olmayan boncuk blastomerlere uymadı, Rhodamine Red-X'in hem floresan belirteci hem de yapışkan molekül olarak hizmet verdiğini düşündürmektedir. Hücre bölünmesi yönünün analizi için, ImageJ12'nin "3B proje" işlevini kullanarak hızlandırılmış görüntüyü yeniden yapılandırdık(Şekil 6A; Y ekseni etrafında eğilme). Mitotik mil (mil düzlemi) içeren düzlemi belirlemek için, ilk olarak iki centrozomun dikey olarak hizalandığı bir düzlem belirledik(Şekil 6B; 110°): Bu düzlemin ± 90° açısına sahip düzlem iğ düzlemidir(Şekil 6B; -20°). Daha sonra, sitokinez(Şekil 6C)sonrası hücre-boncuk temas arabirimine (temas yönü) göre mil (mil yönü) açısını ölçtük. Her iki kız hücresi de boncuk'a eklendiğinde, her iki temas sitesinden geçen bir satır kişi yönlendirmesi olarak kullanılmıştır.
Bir önceki çalışmamızda, boncuk kaynaklı AB hücre bölünmesi oryantasyonu10sırasında bir anizotropik hücre yüzeyi miyozin akışı tespit ettik. Ancak, hücre içi miyozin akışını ölçmek zordur, çünkü yönelimli bölünme sırasında hücre hareket eder. Bunu gerçekleştirmek için önce görüntüleme düzlemine (xy düzlemi) hizalanmış mil ile örnekleri seçtik (Şekil 7). İkinci olarak, Z-yığınları maksimum projeksiyon yöntemi kullanılarak yansıtıldı (Şekil 7). Üçüncü olarak, hücre hareketleri altpiksel kayıt algoritması Stack reg plug-in13 ImageJ katı gövde seçeneği ile kullanılarak düzeltildi (Şekil 7B). Görüntülerin kaydıyla hücrenin konumu sabitlenmiştir (Şekil 7B). Son olarak, ImageJ Manuel izleme eklentisi kullanılarak, miyozin foci izlendi (Şekil 7C). Koordinat bilgilerine göre, bölünme ekseni boyunca miyozin in hızları ve buna dik eksen sitokinoz başlangıcından sonra 50 s cinsinden hesaplandı.
Şekil 1: Rhodamine Kırmızı-X konsantrasyonunun belirlenmesi. (A-D) GFP-miyozin (yeşil) ve mCherry-histon (macenta) ifade eden embriyolar, rhodamine Red-X (macenta) konsantrasyonları farklı olan boncuklara yakın bir yere yerleştirildi. mCherry ve Rhodamine Red-X'in sinyal yoğunlukları beyaz noktalı çizgiler (alt grafikler) boyunca çizilir. 0.5 g/mL Rhodamine Red-X ile tedavi edilen boncuklar ve histon sinyalleri açıkça tespit edildi. Ölçek çubukları 10 μm gösterir.
Şekil 2: Ağız pipetinin montajı. Ağız pipeti dar (1) ve geniş (2) Tygon tüpleri PTFE filtre (3) ile bağlanarak monte edilir. Dar ve geniş Tygon tüpünün sonunda sırasıyla kılcal damar tutucu (4) ve ağız parçası (5) eklenmiştir. Bir el çizilmiş cam kılcal (6) kılcal tutucu eklenebilir. Ölçek çubuğu 50 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Blastomer izolasyonu. (A) Cam kılcal damarların elle çekilmesi. (B) Embriyo transferi için elle çizilmiş cam kılcal damar. (C) Yumurta kabuğunun çıkarılması için elle çizilmiş cam kılcal damar. (D) Yumurta kabuğunun çıkarılması için kılcal açıklık uygun boyutunu gösteren şemalar. Oklar embriyoları gösteriyor. Ölçek çubukları 100 μm gösterir.
Şekil 4: Blastomer izolasyon iş akışı. (A) Embriyo elde etmek için yumurta tuzu tampon yetişkin C. elegans diseksiyon. Fotoğraflar yumurta kabuğu çıkarmadan önce 2 hücreli ve 4 hücreli evre embriyoları gösteriyor. (B) Hipoklorit tedavisi ve yıkama. (C) Şemalar yumurta kabuğu nun çıkarılması için uygun zamanlamayı betimlenir. Fotoğraf yumurta kabuğu çıkarıldıktan sonra 4 hücreli evre embriyo gösterir. (D) Blastomer ayırma. Fotoğraf ayrılmış 2 hücreli evre embriyo gösterir. C ve D'deki okların boyutları, pipetleme sırasında gerekli olan göreli kuvvetleri gösterir. Ölçek çubukları 50 μm gösterir.
Şekil 5: Görüntüleme odasının montajı. (A) Kapak kapağını kapak tutucuya takmak. (B) Kapak tutucunun görüntüleri. Montajdan önce ve sonra kapak tutucu sırasıyla solda ve sağda belirtilir. (C) Hidrofobik kalem ile çizilmiş bir daire. (D) Shelton büyüme orta ve örnek daire içinde eklenmesi. (E) Buharlaşmayı önlemek için bir kapak kayma montaj. Ölçek çubukları 50 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Hücre bölünmesi yönünün analizi. (A) Hücre bölünmesi oryantasyon analizi diyagramı. (B) Mil düzleminin tayini. Sol daki resimler bir örnek gösterir. 3D yeniden yapılan 4-B filmler, iki centrozomun dikey olarak hizalandığı düzlemi belirlemek için Y ekseni etrafında döndürüldü (sağ görüntü; sağ üst şemalar). Bu örnekte, mil düzlemi ± 90° 110° (orta görüntü; sağ alt şemalar) şeklindedir. (C) Hücre-boncuk kontamına göre mil yönünün ölçülmesi. Mil düzleminin görüntüleri kullanılarak, sitokinez sonrası mil yönü, iki centrozom (sağ şemadaki turuncu noktalı çizgiler) ve hücre teması (mavi noktalı çizgiler) bağlayan çizgiler arasındaki açıya göre belirlendi. Her iki kız hücresi de boncuklara iliştirildiğinde, her iki temas sitesinden de geçen hat hücre-boncuk temas oryantasyonu ydu. Yeşil miyozin ve centrozsome, macenta histon ve boncuk olduğunu. Ölçek çubukları 10 μm. Kez dakika ve saniye vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Miyozin akışının analizi. (A) Miyozin akış analizi diyagramı. (B) Hücre bölünmesi yönünün düzeltilmesi. Hücre içi miyozin akış dinamiklerini ölçmek için, bölünen hücrenin dönüşü ImageJ eklentistack stack reg(Rijit gövde seçeneği) kullanılarak düzeltilmiştir. Üst ve alt görüntüler Stack reg işlemeden önce ve sonradır. Sağ çoğu görüntü zaman serisinin zamansal renk kodu gösterir. (C) Miyozin focisinin takibi. Stack reg tarafından işlenen görüntüler kullanılarak, bireysel miyozin foci hareketleri ImageJ Manuel izleme eklentisi tarafından izlendi. Bölünme ekseni ve ona dik eksen sırasıyla x ve y (sağ şemalar) olarak tanımlanmıştır. X ve y eksenindeki (Vx ve Vy) miyozin akış hızları koordinat bilgilerine göre ölçüldü. Ölçek çubukları 10 μm. Kez dakika ve saniye vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Basitleştirilmiş hücre temas kalıplarının yeniden yapılandırılması, araştırmacıların morfogenezin farklı yönlerindeki belirli hücre temas modellerinin rollerini test etmesini sağlayacaktır. Bu tekniği, hücre bölünmesi ekseninin yapışkan boncuklar 10 ile fiziksel temas tarafından kontrol altında olduğunu göstermek içinkullandık. Bölünme ekseni belirtimi morfogenez14katkıda bulunarak çok hücreli gelişim için çok önemli olduğu gibi , kök hücre bölünmesi15,16, ve doku homeostaz15,16, Bu yöntem hayvan dokusu oluşumunun yeni bir mekanizma aydınlatmak gerekir.
Hücre bölünmesi oryantasyonuna ek olarak, bu yöntem mekanik ipuçları ve hücre kaderi arasındaki ilişkiyi test etmek için bir platform olma potansiyeline sahiptir. Önceki çalışmalarmekanik işaret hücre kader belirtimi kontrol ettiğini bildirdi. İnsan mezenkimal kök hücreleri nöron içine ayırt, adiposit, iskelet kas hücresi, ve osteoblast zaman farklı sertlik ile substrat kültürlü17. Substrat sertliğine yanıt olarak, transkripsiyonel düzenleyiciler Evet ilişkili protein (YAP) ve TAZ (PDZ bağlayıcı motifli transkripsiyonel koaktivatör) hücre kader belirtimini düzenlemek için çekirdeğe aktarılacaktır18. Bu yazıda sunulan yöntem, hücrenin uzun süreli yapışkan boncuklarla temas etmesini sağlayarak hücre kader belirtimindeki mekanik ipuçlarının rolünü test etmek için de yararlı olmalıdır.
Bu yöntem, in vivo gözlenen bazı mekanik ipuçları recapitulating sınırlamalar vardır. C. elegansolarak, kitinous yumurta kabuğu ve geçirgenlik bariyeri fiziksel bir kısıtlama olarak hizmet vermektedir. Yumurta kabuğunun çıkarılması normal gelişimi etkilemese de, hem yumurta kabuğunun hem de geçirgenlik bariyerinin çıkarılması anormal örüntü oluşumuna neden olur19. Yumurta kabuğu ve geçirgenlik bariyeri yokluğunda, hücre şekli daha küresel hale gelir, hücre ve hücre-yumurta kabuğu arasındaki basınç hücre deformasyonu ve desenleme kritik bir rol oynadığını düşündürmektedir. Nitekim, hücre-hücre sıkma kuvvetleri hücre bölünmesi yönünü düzenlemek için önerilmiştir20. Dokular arasında fiziksel kısıtlama ve putatif basınç olmadan, bu yöntemin vivo hücre temas alanında da tekrarlanamayacağını ugörüyoruz. Hücre temas alanı çentiksinyalizasyon 21etkilediği bilinmektedir gibi, bazı mekanik veya kimyasal işaret bu in vitro yöntemi kullanılarak işe yaramazsa bu sınırlama daha fazla dikkate alınması gerekir.
Şimdiye kadar ellerimizde izole AB, P1, EMS, P2, ABa, ABp hücrelerinin hücre bölünmesi yönünü test ettik10, ancak yöntem kadar bireysel hücre izole edilebilir daha sonraki gelişim için uygulanabilir. Son tek hücre dizileme çalışması larva hücre22izole etmek için solucan vücudunun pronase sindirim kullandı. Bu nedenle, potansiyel bir daha sonraki aşamada embriyonik hücreleri ve larva hücrelerini izole etmek için pronase tedavi kullanabilirsiniz.
Bu çalışmada, mekanik işaret ve hücre bölünmesi oryantasyonu arasındaki etkileşim örneğini gösterdik, ancak hücre-hücre iletişimi de Wnt23, Çentik24, yapvesiyon birleştiği reseptörleri25 ve benzeri gibi kimyasal ipuçları aracılık. Daha da önemlisi, burada sunulan boncuk hazırlama yöntemi, boncukları herhangi bir proteinle biraraya getirebilir ve böylece kimyasal ipuçlarının yeniden yapılandırılmasına izin verebilir. Önceki çalışmalarda ayrıca Wnt'e bağlı gelişimsel süreçleri göstermek için Sepharose boncuk26 ve protein-A manyetik boncuk27 Wnt proteini ile kaplanmış kullanılmıştır. Ancak, bu boncuklar carboxylate modifiye polistiren boncuklar ile karşılaştırıldığında çeşitli boyutlarda ticari olarak mevcut değildir. Bu nedenle, gelecekteki araştırmalar, hem kimyasal hem de fiziksel ipuçlarının rolünü daha zor bir şekilde test etmek için sunulan yöntemi bir platform olarak kullanabilir. Birlikte ele alındığında, bu yöntem, uzamsal hücre temas örüntülerinden kaynaklanan hücresel davranışlar ve tepkiler üzerinde çalışan ve diğer hücresel ipuçlarını ortadan kaldırmak isteyen araştırmacılar için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.
Acknowledgments
Biz tavsiye için James Priess ve Bruce Bowerman teşekkür ve C. elegans suşları, Don Moerman, Kota Mizumoto ve Yaşam Bilimleri Enstitüsü Görüntüleme Çekirdek Tesisi ekipman ve reaktifler, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim C. elegans bakımı ve el yazması eleştirel okuma paylaşımı için sağlayan. Çalışmalarımız Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC), (RGPIN-2019-04442) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
References
- Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
- Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
- McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
- Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
- Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
- Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
- Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
- Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
- Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
- Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
- Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
- Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
- Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
- Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
- Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
- Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).
- Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
- Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).
