Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

In vitro rekonstitution af Rumcelle kontakt mønstre med isolerede Caenorhabditis elegans embryo blastomeres og klæbende polystyren perler

doi: 10.3791/60422 Published: November 26, 2019

Summary

Vævs kompleksiteter af flercellede systemer har bevaret identifikationen af årsagssammenhæng mellem ekstracellulære signaler og individuelle cellulære adfærd. Her præsenterer vi en metode til at studere den direkte forbindelse mellem kontaktafhængige signaler og divisions akser ved hjælp af C. elegans embryo blastomeres og klæbende polystyren perler.

Abstract

I flercellede systemer er individuelle celler omgivet af de forskellige fysiske og kemiske signaler, der kommer fra tilstødende celler og miljøet. Denne vævs kompleksitet behersker identifikationen af årsagssammenhæng mellem ydre signaler og cellulær dynamik. Et syntetisk rekonstitueret multicellulært system overvinder dette problem ved at gøre det muligt for forskerne at teste for en bestemt cue og samtidig eliminere andre. Her præsenterer vi en metode til at rekonstruere celle kontakt mønstre med isolerede caenorhabditis elegans blastomerkerneoverførsel og klæbende polystyren perler. Procedurerne involverer ægge fjernelse, blastomerkerneoverførsel isolation ved at forstyrre celle-celle vedhæftning, fremstilling af klæbende polystyren perler, og rekonstitution af celle-celle eller celle-perle kontakt. Endelig præsenterer vi anvendelsen af denne metode til at undersøge orienteringen af cellulære division akser, der bidrager til reguleringen af rumlige cellulære mønsterog celle skæbne specifikation i at udvikle embryoner. Denne robuste, reproducerbare og alsidige in vitro-metode gør det muligt at studere direkte relationer mellem fysiske celle kontakt mønstre og cellulære reaktioner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Under multi cellulær udvikling, er den cellulære adfærd (f. eks, division akse) af individuelle celler specificeret af forskellige kemiske og fysiske signaler. At forstå, hvordan individuelle celle fortolker disse oplysninger, og hvordan de regulerer flercellet samling som en emergent ejendom er et af de ultimative mål for morfogenese undersøgelser. Den model organisme C. elegans har bidraget væsentligt til forståelsen af cellulære-niveauregulering af morfogenesis såsom celle polaritet1, celle division mønster1, celle skæbne beslutning2, og vævs-skala regler såsom neuronal ledningsføring3 og organogenesen4,5. Selv om der er forskellige genetiske værktøjer til rådighed, vævsteknik metoder er begrænset.

Den mest succesfulde vævsteknik metode i C. elegans undersøgelse er den klassiske blastomerkerneoverførsel isolation6; som C. elegans embryo er omgivet af en æggeskal og en permeabilitet barriere7, deres fjernelse er en af de vigtigste procedurer for denne metode. Mens denne blastomerkerneoverførsel isolationsmetode muliggør rekonstitution af celle celle kontakt på en forenklet måde, giver den ikke mulighed for eliminering af uønskede signaler; celle kontakt stadig udgør både mekaniske (f. eks, vedhæftning) og kemiske signaler, og dermed begrænse vores evne til fuldt ud at analysere årsagssammenhæng mellem cue og cellulære adfærd.

Metoden præsenteret i dette papir bruger carboxylat modificerede polystyren perler, der kan kovalent binde sig til nogen Amin-reaktive molekyler, herunder proteiner som ligands. Især, vi brugte en Amin-reaktiv form af Rhodamine rød-X som en ligand at gøre perler både visuelt track bare og klæbemiddel til cellen. Carboxylgrupper grupper af perle overflade og primære Amin grupper af ligand molekyle er koblet af vandopløselige carbodiimide 1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC)8,9. Opnået klæbende perler giver mulighed for virkningerne af den mekaniske cue på cellulære Dynamics10. Vi har brugt denne teknik til at identificere mekaniske signaler, der kræves for celledeling orientering10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. fremstilling af klæbende polystyren perle

Bemærk: denne protokol kræver ikke aseptisk teknik.

  1. 10 mg carboxylat-modificerede polystyren-perler vejes i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
  2. For at vaske perlerne tilsættes 1 mL 2-(N-morpholino) ethanesulfonsyre (MES) buffer ind i røret. Da MES buffer ikke indeholder fosfat og acetat, som kan reducere reaktiviteten af carbodiimide, det er egnet til brug i protein kobling reaktion. Vortex røret for at blande perlerne.
  3. Drej røret til 60 s ved 2.000 x g via en stationær centrifuge.
  4. Kassér supernatanten ved omhyggeligt at pipettere bufferen ud.
  5. Perlerne vaskes igen med 1 mL MES-buffer ved at følge trin 1.2-1.4.
  6. Der tilsættes 1 mL MES-buffer indeholdende 10 mg EDAC i røret for at aktivere overflade carboxylgrupperne. Vortex røret for at blande perlerne.
  7. Drej og Inkuber røret i 15 minutter ved stuetemperatur.
  8. Drej perlerne ned til 60 s ved 2.000 x g.
  9. Kassér supernatanten ved omhyggeligt at pipettere bufferen ud.
  10. For at vaske perlerne tilsættes 1 mL fosfat bufferet saltvand (PBS) ind i røret. Vortex røret for at blande perlerne.
  11. Drej røret ned til 60 s ved 2.000 x g.
  12. Kassér supernatanten ved omhyggeligt at pipettere bufferen ud.
  13. Perlerne vaskes igen med 1 mL PBS ved at følge trin 1.10-1.12.
  14. Den endelige koncentration af Rhodamin anvendes vil afhænge af stammen bliver imaged. Forbered 1 mL 1-, 10-, 100-og 1000-fold fortyndings serie af Rhodamine Red-X fra den 0,65 mM Rhodamine Red-X stamopløsning.
  15. 20 μL perler afpipetteres i hvert serie fortyndingsrør.
  16. Drej og Inkuber røret i 5 minutter ved stuetemperatur.
  17. Perlerne vaskes to gange med 1 mL PBS ved at gentage trin 1.10-1.12.
  18. Der tilsættes 1 mL PBS i røret, og det opbevares ved 4 °C i op til 6 uger. Kontrollér perlernes fluorescens intensitet under et mikroskop, der anvendes til levende billeddannelse. Den passende koncentration af Rhodamin rød-X succinimidyl ester afhænger af billedbehandlings forholdene (figur 1).
    Bemærk: perler uden Rhodamine rød-X behandling ikke overholder cellen. Rhodamine rød-X fungerer som fluorescens markør samt klæbemiddel molekyle. Den elektrostatiske interaktion mellem positivt ladede Rhodamine rød-X og negativt ladede plasma membran er en formodet årsag til vedhæftning.

2. samling af mund pipette

  1. Skåret bredt (6,35 mm indvendig diameter) og smal (3,175 mm indvendig diameter) Tygon rør til henholdsvis ca. 25 cm og 40 cm i længden (figur 2).
  2. Tygon-rørene tilsluttes med et polytetrafluorethylen (PTFE) filter (0,2 μm porestørrelse) (figur 2).
  3. Afmonter et kommercielt tilgængeligt aspiratorrør, og fastgør dets kapillar holder og mundstykket til enden af henholdsvis smalle og brede Tygon-rør (figur 2).
    Bemærk: PTFE-filteret blev brugt til at forhindre indånding af dampe af hypochlorit-opløsning via mund pipette.

3. isolering af embryon blastomerkerneoverførsel

Bemærk: bær handsker og lab coat for at undgå snit og kontakt med blegning løsning.

  1. Hold hver ende af et mikrokapillær (kapacitet; 10 μL) med højre og venstre hånd.
  2. Træk mikrokapillær mod begge ender til at anvende spænding og bringe midten af kapillar over en brænder til at gøre to hånd-trukket kapillærer (figur 3a).
  3. Trim spidserne af de hånd-trak kapillærer med pincet under dissekere mikroskop og fastgør trukket kapillær i en mund pipette Rings apparat (figur 2). Forbered to typer pipetter. Spidsen åbnings størrelserne for pipetterne skal være ca 2x og 1x den korte akse længde af C. elegans embryoner (30 μm) for embryo overførsel og æggeskal fjernelse, henholdsvis figur 3B-D).
  4. Pipette 45 μL ægge saltopløsning på en brønd af en multiwell slide (figur 4a; bund).
  5. Placer 5-10 voksen C. elegans på en brønd indeholdende ægsalt opløsning.
  6. For at opnå tidlige c. elegans embryoner, skæres voksne i stykker ved at placere to nåle til højre og venstre for c. elegans krop og skubbe nåle forbi hinanden (figur 4A; øvre skematik).
  7. Der afpipetteres 45 μL hypochlorit-opløsning på en brønd ved siden af brønden med ægsalt opløsning (figur 4B).
  8. 45 μL af Sheltons vækstmedium afpipetteres på de efterfølgende tre brønde ved siden af den brønd, der indeholder hypochlorit opløsning (figur 4B).
  9. Overfør 1-cellet stadie og tidlige 2-celleembryoer til hypochloritopløsningen ved hjælp af mund pipettering med håndtegnet kapillar til embryo overførsel (figur 4B).
  10. Vent 40 – 55 s.
  11. Embryonerne vaskes ved at overføre embryonerne fra hypochloritopløsning til Sheltons vækstmedium ved hjælp af mund pipettering med håndtegnet kapillær til embryo overførsel (figur 4B).
  12. Embryonerne vaskes igen ved at overføre embryonerne til en ny brønd af Sheltons vækstmedium gennem mund pipettering med håndtegnet kapillar til embryo overførsel (figur 4B).
  13. Overfør de vaskede embryoner til en ny brønd af Sheltons vækstmedium gennem mund pipettering med håndtegnet kapillar til embryo overførsel. Brug den håndtegnede kapillar til at fjerne æggeskaller, og Gentag omhyggeligt pipette ringen (figur 4C; midterste skemaer). Hvis æggeskallen er blevet fjernet, vil embryonale celler blive mere sfæriske (figur 4C; højre).
  14. Adskil 2-celle stadiet embryonale blastomeres ved forsigtigt og kontinuerligt at pipettere med håndtegnet kapillar til fjernelse af æggeskaller (figur 4D).

4. rekonstitution af kontakt mønstre med blastomerkerneoverførsel og perle

Bemærk: Arbejd under billedbehandlings mikroskop for at undgå dissociation af en celle fra en perle og for at lette rettidig billed erhvervelse.

  1. For at observere ved hjælp af et inverteret mikroskop skal du tilberede et billed kammer som i figur 5.
    1. Anbring en dækseddel på en dækseddel holder (figur 5a).
    2. Tape kanterne af dæksedlen for at stabilisere den. Den side med tape er ' bagsiden ' side (figur 5A, B).
    3. Vend dækglas-holderen over på forsiden, og træk en cirkel på dæksedlen med en hydrofobe pen (figur 5C).
      Bemærk: enhver glas-bund skål virker også, forudsat at embryonerne er manipulerbare med munden pipetten.
  2. Tilsæt Shelton's vækstmedium i cirklen tegnet af den hydrofobe markør (figur 5D).
  3. Den isolerede blastomerkerneoverførsel overføres til billed kammeret.
  4. En lille mængde af de kemisk funktionaliserede perler dispenseres ved hjælp af håndtegnet kapillar til embryo overførsel.
  5. Styr positionen af polystyren perler ved at blæse i håndtegnede kapillær indtil perlen binder sig til den isolerede blastomere.
  6. Monter en dækseddel for at undgå fordampning af mediet (figur 5E). Udfør Live imaging.

5. klargøring af vigtige reagenser

  1. Ægsalt opløsning (10 mL): Kombiner 235 μL af 5 M NaCl og 240 μL 2 M KCl med 9525 μL dH2O.
  2. Hypochlorit opløsning (10 mL): Kombiner 7,5 mL Clorox (indeholdende ca. 7,5% natriumhypochlorit) med 2,5 mL 10 N NaOH (den endelige koncentration af natriumhypochlorit er ca. 5,625%).
    Bemærk: selv om mange offentliggjorte metoder har brugt chitinase til at fordøje chitiløse æggeskaller, har vi vedtaget en metode ved hjælp af natriumhypochlorit løsning11. Ved at undgå de batch-til-batch variationer af chitinase aktiviteter, vi mener, at denne metode er mere reproducerbar og omkostningseffektiv tilgang.
  3. 0,81 mM inulin opløsning (40 mL)
    1. Tilsæt 0,2 g inulinsirup til 40 mL dH2O.
    2. Autoklave til at opløse.
      Bemærk: holder i 1 måned ved 4 °C.
  4. 0,5 M MES buffer (500 mL)
    1. 48,81 g af MES opløses i 400 mL destilleret vand (dH2O).
    2. Justér pH til 6,0.
    3. Bring det totale volumen til 500 mL med dH2O.
  5. PBS-opløsning (1 L)
    1. For at lave 10-fold PBS-opløsning opløses 1 pakke PBS premix pulver i 1 L af dH2O.
    2. Kombiner 100 mL 10-fold PBS-opløsning med 900 mL dH2O.
  6. 5% polyvinylpyrrolidon (PVP) opløsning (4 mL)
    1. Under sterile forhold opløses 0,2 g PVP i 4 mL Drosophila Schneiders medium.
      Bemærk: Åbn altid Schneiders medium bestand i vævs kulturen (TC) Hood. Opbevares i 1 måned ved 4 °C.
  7. 0,65 mM Rhodamine rød-X stamopløsning (2 mL)
    1. Vejer 1 mg Rhodamine rød-X.
    2. Tilsæt 2 mL dimethylsulfoxid (DMSO) for at opløse.
    3. Opbevares ved-20 °C.
  8. Shelton's vækst medium (SGM) (10,25 mL)
    1. Under sterile forhold kombineres 8 mL Drosophila Schneiders medium, 1 mL PVP-opløsning, 1 mL inulin-opløsning, 1 mL basal medium Eagle (BME) vitaminer, 50 μL penicillin-streptomycin og 100 μL lipid koncentrat sammen.
    2. Alikvot 325 μL af SGM til 1,5 mL mikrorør.
      Bemærk: opbevares i ca. 1 måned ved 4 °C.
    3. På dagen for blastomerkerneoverførsel isolation tilsættes 175 μl føtal bovint serum (FBS) til sdb (for samlet volumen på 500 μl).
      Bemærk: Opbevar FBS ved-20 °C og tø den før brug. FBS behøver ikke at blive varme dræbt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Til tilberedning af perler fastsatte vi den optimale mængde Rhodamine rød-X succinimidyl ester til den transgene stamme, der udtrykker GFP-myosin II og mCherry-Histon (figur 1A-D). Vi brugte mCherry Tagged Histon som en markør for celle cyklus progression. Fordi både rhodamine rødt-x og mcherry vil blive belyst af en 561 nm laser, den optimale intensitet af rhodamine rødt-x signal er sammenlignelig med Histon at tillade samtidige billeddannelse af celle og perle. For eksempel var fluorescens signalet fra perlen behandlet med 0,005 μg/mL Rhodamine rød-X succinimidyl ester for svag til at visualisere perlen (figur 1A). På den anden side var fluorescens signalet fra perlerne behandlet med 5 μg/mL Rhodamine rød-X succinimidyl ester for stærkt til at afbilde mCherry-Histon (figur 1D). Vi fastslået, at 0,5 μg/mL Rhodamine rød-X succinimidyl ester er optimal for denne særlige transgene stamme (figur 1C).

Blastomere isolation blev udført i henhold til de procedurer, der er vist i figur 4. Der bør tages fat på følgende punkter for vellykkede eksperimenter. 1) mediet i brønden fordamper over tid og bliver viskøs; Dette får embryonerne til at holde sig til glasset kapillær og andre embryoner, så en ny brønd med friske medier skal anvendes. 2) i hypochlorit opløsning, embryoner flyde til overfladen. Derfor sænke forstørrelse af mikroskopet og fokusere på overfladen af dråbe at lette med overførsel af embryoner. 3) effektiviteten af hypochlorit opløsning kan variere. Derfor, varigheden af embryoner tilbringer i hypochlorit opløsning bør testes for hver ny batch af hypochlorit opløsning lavet. 4) Placer mund pipetten så tæt på embryonet som muligt for at minimere den styrke, der bruges til at blæse i pipetten, men heller ikke for tæt, så embryonet suges op så godt (dette gælder også ved fastgørelse af perler). 5) efter ægshell fjernelse, embryoner bliver meget delikat. Derfor skal kræfter udøvet på munden pipetten være lidt sænket for at forhindre embryoner fra sprængning. 6) langvarig brug af mund pipetten kan dæmpe PTFE-filteret, og 7) 2-cellet embryoer bør kun adskilles, når kernen er blevet klart dannet (figur 4C, venstre skematisk). Sammenlignet med celler i intakte embryoner (figur 4A; højre), celler i embryoner uden æggeskallen ser rounder (figur 4C; højre). Desuden, efter blastomerkerneoverførsel isolation, formen af blastomeres bliver sfærisk (figur 4D; højre).

For at teste virkningerne af fysisk kontakt-afhængig cue på celle opdeling orientering, vi vedhæftet Rhodamine rød-X belagt perler til AB blastomeres isoleret fra 2-celle scenen og udført Live-imaging (figur 6, figur 7). Perlen uden Rhodamine rød-X behandling ikke holde sig til blastomeres, tyder på, at Rhodamine Red-X fungerer som en både fluorescens markør og klæbende molekyle. Til analyse af celle opdeling orientering, har vi 3D rekonstrueret tidsforskudt billede ved hjælp af "3D-projektet" funktion ImageJ12 (figur 6A; vippe omkring Y-aksen). For at bestemme flyet, der indeholder mitotisk spindel (spindel plan), identificerede vi først et plan, hvor to centrosomer var vertikalt justeret (figur 6b; 110 °): flyet med ± 90 ° vinkel på dette plan er spindel plan (figur 6b;-20 °). Dernæst har vi målt vinklen af spindel (spindel orientering) i forhold til celle-perle kontaktfladen (kontakt orientering) efter cytokinese (figur 6C). Da begge datter celler blev fastgjort til perlen, blev en linje, der passerer begge kontaktsteder, brugt som en kontakt orientering.

I vores tidligere undersøgelse, vi har identificeret en Anisotropisk celle overflade myosin flow under vulst-induceret AB celle division orientering10. Det er dog svært at måle den intracellulære myosin flow som celle bevæger sig under orienteret division. For at udføre dette, først har vi valgt prøverne med spindel justeret til billedplanet (XY-plan) (figur 7). For det andet, Z-stakke blev projiceret ved hjælp af maksimal projektion metode (figur 7). For det tredje, celle bevægelser blev korrigeret ved hjælp af subpixel registrering algoritme stak reg plug-in13 af ImageJ med stiv krop option (figur 7B). Ved registrering af billeder blev cellens position stukket (figur 7B). Endelig, ved hjælp af Manuel tracking plug-in af ImageJ, myosin Foci blev sporet (figur 7C). Ifølge koordinat informationen blev hastigheder af myosin langs divisions aksen og aksen vinkelret på den beregnet inden for 50 s efter cytokinese debut.

Figure 1
Figur 1: bestemmelse af Rhodamin rød-X-koncentration. (A-D) Embryoner, der udtrykker GFP-myosin (grøn) og mCherry-Histon (magenta), blev anbragt i nærheden af perler bundet med forskellige koncentrationer af Rhodamine rød-X (magenta). Signal intensiteterne for mCherry og Rhodamine Red-X er afbildet langs de hvide punkterede linjer (nederste grafer). Perlerne og Histon signalerne blev tydeligt detekteret for perler behandlet med 0,5 μg/ml rhodamine rød-X. Skala bjælker viser 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: samling af mund pipette. Mund pipetten samles ved at forbinde smalle (1) og brede (2) Tygon-rør med et PTFE-filter (3). I slutningen af det smalle og brede Tygon rør blev kapillar holderen (4) og mundstykket (5) henholdsvis fastgjort. En håndtegnet glas kapillar (6) kan indsættes i kapillar holderen. Scale bar er 50 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Blastomere isolation. A) hånd træk af glas kapillar. B) håndtegnet glas kapillar til embryo overførsel. C) håndtegnet glas kapillar til fjernelse af æggeskaller. (D) skemaer, der viser den passende størrelse af kapillær åbning for ægskal fjernelse. Pilene indikerer embryoner. Skala bjælker viser 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Blastomere isolation workflow. (A) dissektion af voksne C. elegans i ægge salt buffer for at opnå embryoner. Fotografier viser 2-celle og 4-celle fase embryoner før ægge fjernelse. B) behandling og vask af hypochlorit. (C) skematiske skildrer passende timing for ægskallen fjernelse. Fotografi viser en 4-celle fase embryo efter ægshell fjernelse. D) blastomere separation. Fotografi viser en adskilt 2-celle fase embryo. Størrelsen af pilene i C og D angiver de relative kræfter, der kræves under pipettering. Skala bjælker viser 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: samling af billed kammer. (A) fastgørelse af dækglas til dækglas-holderen. B) billeder af en dækseddel holder. Coverslip holderen før og efter montering er angivet på henholdsvis venstre og højre. C) en cirkel, der trækkes via en Hydrofobisk pen. D) tilsætning af Sheltons vækstmedium og prøve i cirklen. E) montering af en dækseddel for at undgå fordampning. Skala stænger viser 50 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: analyse af celle divisions orientering. (A) et diagram over celle divisions orienterings analyse. B) bestemmelse af spindel plan. Venstre billeder viser et eksempel på en prøve. 3D rekonstruerede 4-D-film blev roteret omkring Y-aksen for at bestemme flyet, hvori to centrosomes justeres lodret (højre billede; højre øvre skematik). I dette eksempel er spindel plan ± 90 ° af 110 ° (mellem billede; højre bundskematisk). C) måling af spindel orienteringen i forhold til celle vulstens kontakt. Brug af billeder af spindel planet, spindel orientering efter cytokinese blev bestemt baseret på vinkel mellem linjer, der forbinder to centrosomer (orange stiplede linjer i de rigtige skemaer) og celle kontakt (blå punkterede linjer). Når begge datter celler blev knyttet til perlerne, celle-perle kontakt orientering var den linje, der passerer begge kontakt sites. Grøn er myosin og centrosome, magenta er Histon og perler. Skala stænger er 10 μm. gange er minutter og sekunder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: analyse af myosin flow. A) et diagram over analyse af myosin-flow. (B) korrektion af celle divisions orientering. At kvantificere intracellulære myosin flow dynamik, rotation af dividere celle blev korrigeret ved hjælp af ImageJ plugin stack reg (stiv krop option). Øvre og nederste billeder er før og efter stakken reg behandling. Højre de fleste billeder viser tidsmæssig farvekode tidsserie. C) sporing af myosin Foci. Ved hjælp af billederne behandles af stack reg, individuelle myosin Foci bevægelser blev sporet af ImageJ Manuel tracking plugin. Divisions aksen og aksen vinkelret på den blev defineret som henholdsvis x og y (højre skematisk). Myosin flowhastigheder i x-og y-aksen (VX og Vy) blev målt i overensstemmelse med koordinat informationen. Skala stænger er 10 μm. gange er minutter og sekunder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Rekonstitution af forenklede celle kontakt mønstre vil lade forskerne teste rollerne for specifikke celle kontakt mønstre i forskellige aspekter af morphogenesis. Vi har brugt denne teknik til at vise, at celle divisions aksen styres af den fysiske kontakt med klæbe perler10. Som division Axis specifikation er afgørende for flercellede udvikling ved at bidrage til morfogenesis14, stamcelle division15,16, og væv homøostase15,16, denne metode bør være i stand til at belyse en ny mekanisme af animalsk væv dannelse.

Ud over celle opdeling orientering, denne metode har et potentiale til at være en platform til at teste forholdet mellem mekaniske signaler og celle skæbne. Tidligere undersøgelser rapporterede, at mekanisk cue styrer celle skæbne specifikation. Humane mesenchymale stamceller skelne i neuron, adipocyt, skeletmuskulatur celle, og osteoblastdannelse når dyrkes i substrat med forskellig stivhed17. Som reaktion på substrat stivhed, de transkriptionelle regulatorer ja-associeret protein (YAP) og TAZ (transkriptional Co-aktivator med PDZ-bindende motiv) vil omplacere til kernen, at regulere celle skæbne specifikation18. Den metode, der præsenteres i dette papir bør også være nyttigt at teste rollen af mekaniske stikord på celle skæbne specifikation, ved dyrkning celle lang sigt i kontakt med klæbende perler.

Denne metode har begrænsninger i at rekapitulere visse mekaniske signaler observeret in vivo. I C. elegans, chitinerende æggeskaller og permeabilitet barriere tjene som en fysisk begrænse. Selv om fjernelse af æggeskal ikke påvirker normal udvikling, fjernelse af både æggeskal og permeabilitet barriere resulterer i unormal mønster dannelse19. I fravær af æggeskal og permeabilitet barriere, celle form bliver mere sfærisk, tyder på, at trykket mellem celler og celle-æggeskal spiller en afgørende rolle i celle deformation og mønster. Faktisk er celle-celle klemme kræfter blevet foreslået at regulere celle division orientering20. Uden at have fysisk begrænse og formodede tryk blandt væv, vi forventer, at denne metode også kan ikke rekapitulere in vivo celle kontaktområde. Da celle kontaktområde er kendt for at påvirke notch signalering21, denne begrænsning skal overvejes yderligere, når visse mekaniske eller kemiske cue virker ikke ved hjælp af denne in vitro-metode.

Vi har hidtil testet celle opdelingen orientering af isolerede AB, P1, EMS, P2, ABa, ABp celler (celler op til 6 celle stadier) i vores hænder10, men metoden kan anvendes til senere udvikling, så vidt individuelle celle kan isoleres. Nylige enkelt celle sekventering undersøgelse har brugt pronasen fordøjelse af orm krop til at isolere larve celle22. Derfor kan potentielt man bruge pronasen behandling til at isolere senere stadie embryonale celler og larve celler.

I denne undersøgelse, viste vi eksemplet med interaktion mellem mekanisk cue og celle division orientering, men celle-celle kommunikation er også medieret af kemiske signaler såsom WNT23, notch24, adhæsion koblede receptorer25 og så videre. Vigtigere, perlerne forberedelse metode præsenteret her kan par perlerne med eventuelle proteiner, hvilket giver mulighed for rekonstitution af kemiske signaler. Tidligere undersøgelser har også brugt Sepharose perle26 og protein-en magnetisk perle27 belagt med WNT protein til at demonstrere WNT-afhængige udviklingsmæssige processer. Men disse perler er ikke kommercielt tilgængelige i forskellige størrelser i forhold til carboxylat modificerede polystyren perler. Derfor kan fremtidig forskning bruge den præsenterede metode som en platform til at teste rollen af både kemiske og fysiske signaler i mere tunable manerer. Taget sammen, denne metode er velegnet til forskere, der studerer cellulære adfærd og reaktioner, der skyldes rumcelle kontakt mønstre og ønsker at eliminere andre cellulære signaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker James Priess og Bruce Bowerman for rådgivning og giver C. elegans stammer, Don Moerman, Kota mizumoto, og Life Sciences Institute Imaging Core facilitet til deling af udstyr og reagenser, AOI Hiroyasu, Lisa Fernando, min Jee Kim til vedligeholdelse af C. elegans og kritisk læsning af vores manuskript. Vores arbejde er støttet af Canadas naturvidenskabelige og tekniske Forskningsråd (NSERC) (RGPIN-2019-04442).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride Alfa Aesar AAA1080703 For the bead preparation
Aspirator Tube Assembly Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type Caenorhabditis Genetics Center N2 Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 in house KSG5 Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) KISKER Biotech PPS-30.0COOHP For the bead preparation
CD Lipid Concentrate Life Technologies 11905031 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox Clorox N. A. For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder In house N.A. For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. Carl Zeiss Stemi 508 For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin Gibco A3160701 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge BD 14-826AA For the blastomere isolation
Inulin Alfa Aesar AAA1842509 For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x) Gibco 11120052 For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals) Fisher BioReagents BP300-100 For the bead preparation
Multitest Slide 10 Well MP Biomedicals ICN6041805 For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder Fisher BioReagents BP665-1 For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140148 For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone Fisher BioReagents BP431-100 For the blastomere isolation
Potassium Chloride Bioshop POC888 For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer Molecular Probes R6160 For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium Gibco 21720024 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride Bioshop SOD001 For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N Fisher Chemical SS255-1 For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. Intelligent Imaging Innovation N.A. For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile Basix 13100115 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-862 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-854 For the blastomere isolation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. (2006).
  2. Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. (2014).
  3. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314, (1165), 1 (1986).
  4. Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. (2007).
  5. McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. (2007).
  6. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  7. Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. (2018).
  8. Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22, (1), 165-174 (1978).
  9. Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276, (2), 407-415 (1972).
  10. Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46, (3), 257-270 (2018).
  11. Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130, (15), 3547-3556 (2003).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  13. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7, (1), 27-41 (1998).
  14. Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21, (15), 599-609 (2011).
  15. Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
  16. Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, (12), 849-860 (2010).
  17. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  18. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474, (7350), 179-183 (2011).
  19. Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Archives of Developmental Biology. 202, (1), 10-16 (1992).
  20. Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. 305-312 (2017).
  21. Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40, (5), 505-511 (2017).
  22. Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357, (6352), 661-667 (2017).
  23. Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10, (3), 391-396 (2006).
  24. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. (2005).
  25. Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11, (10), 1005624 (2015).
  26. Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
  27. Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339, (6126), 1445-1448 (2013).
In vitro rekonstitution af Rumcelle kontakt mønstre med isolerede <em>Caenorhabditis elegans</em> embryo blastomeres og klæbende polystyren perler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).More

Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter