Summary
רקמות המורכבות של מערכות רב-תאיים לבלבל את הזיהוי של הקשר הסיבתי בין רמזים החילוץ והתנהגויות הסלולר הפרט. כאן, אנו מציגים שיטה לבחון את הקשר הישיר בין הרמזים תלויי הקשר וצירי החלוקה באמצעות שימוש בשיטת C. אלגיה העובר בלסטומרים וחרוזי פוליסטירן מוקצף.
Abstract
במערכות רב-תאיים, תאים בודדים מוקפים ברמזים פיזיים וכימיים שונים המגיעים מתאים שכנים ומהסביבה. מורכבות רקמות זה מבלבלת את הזיהוי של הקשר הסיבתי בין רמזים חיצוניים ודינמיקה סלולרית. מערכת מלאכותית מחדש מתגבר על בעיה זו בכך שהיא מאפשרת לחוקרים לבדוק אות מסוים תוך חיסול אחרים. כאן, אנו מציגים שיטה ליצור מחדש דפוסי קשר של התאים עם האלגיה הבודד Caenorditis בלייסטורה ומחרוזות פוליסטירן מוקצף. ההליכים כוללים הסרת קליפת ביצה, בידוד בלסטורה על ידי שיבוש תא תא הדבקה, הכנת חרוזים פוליסטירן מוקצף, והחוקה של תא תא או קשר עם חרוז תא. בסופו של דבר, אנו מציגים את היישום של שיטה זו כדי לחקור את הכיוון של צירי החטיבה התאית התורמת לוויסות הריבוב הסלולר המרחבי ואת מפרט הגורל התא בפיתוח עוברים. שיטת החשיבה האיתנה והמגוונת מאפשרת ללמוד יחסים ישירים בין דפוסי קשר של תאים מרחביים ותגובות סלולריות.
Introduction
במהלך פיתוח רב-תאיים, התנהגויות הסלולר (למשל, ציר החלוקה) של תאים בודדים מצוינים באמצעות רמזים כימיים ופיזיים שונים. כדי להבין כיצד תא בודד מפרש מידע זה, וכיצד הם מסדירים הרכבה רב-תאיים כמאפיין מתהווה מהווה אחת המטרות הסופיות של לימודי הורפוגנזה. האורגניזם מודל C. אלגיה תרם באופן משמעותי להבנת הרגולציה ברמה התאית של מורפוגנזה כגון קוטביות תא1, תא הניתוח1, החלטה של תא הגורל2, ותקנות בקנה מידה של רקמות כגון החיווט העצבי3 ו אורגנוגנזה4,5. למרות שיש כלים גנטיים שונים זמינים, שיטות הנדסת רקמות מוגבלות.
שיטת הנדסת הרקמה המוצלחת ביותר בחקר ה -C. אלגיה היא הבידוד הקלאסי של6; כמו העובר C. אלגיה מוקפת קליפת ביצה וחדירות מחסום7, הוצאתם היא אחת הפרוצדורות העיקריות של שיטה זו. בעוד שיטת הבידוד הבלסטורה מאפשרת ליצור מחדש את הקשר של תא התא באופן פשוט, הוא אינו מאפשר חיסול של רמזים לא רצויים; קשר התא עדיין מהווה הן מכני (למשל, הדבקה) ורמזים כימיים, ובכך להגביל את היכולת שלנו לנתח באופן מלא את הקשר הסיבתי בין האות והתנהגות תאית.
השיטה המוצגת במאמר זה משתמשת carboxylate אוחר שונה פוליסטירן מחרוזות שיכול לאגד באופן מיטבי לכל מולקולות של האמין-תגובתי כולל חלבונים כמו ליגנדס. במיוחד, השתמשנו בצורה של מין מגיב-מאמין של rhodamine אדום-X כמו ליגנד כדי לעשות חרוזים הן העקיבה החזותית ודבק לתא. קבוצות קרבוקסילי של משטח חרוז וקבוצות אמין הראשי של ליגנד מולקולה הם ביחד על ידי מסיס מים קרבודיאימיד 1-אתיל-3-(dimethylaminopropyl) קרבודיאימיד (edac)8,9. חרוזים מקבל דבק לאפשר את ההשפעות של הרמז המכני על דינמיקה סלולרית10. השתמשנו בטכניקה זו כדי לזהות רמזים מכניים הנדרשים לכיוון חלוקת תאים10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת פוליסטירן מוקצף לחרוז
הערה: פרוטוקול זה אינו דורש טכניקה אספזיהומית.
- שוקל 10 מ ג של carboxylate אוחר שונה פוליסטירן חרוזים בשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
- כדי לשטוף את החרוזים, להוסיף 1 מ ל 2-(N-מורגואולנו) מאגר חומצה ethanesulfonic (MES) לתוך השפופרת. מאז מאגר MES אינו מכיל פוספט ו אצטט, אשר יכול להפחית את הפעילות מחדש של קרבודיאימיד, הוא מתאים לשימוש בתגובת צימוד חלבון. מערבולת הצינור לערבב את החרוזים.
- ספין הצינור עבור 60 s ב 2,000 x g באמצעות צנטריפוגה העליון שחקן.
- השמט את הסופרנטנט בזהירות מתוך הוצאת המאגר.
- שטוף שוב את החרוזים עם 1 מ ל של מאגר MES על-ידי ביצוע השלבים הבאים 1.2-1.4.
- הוסף 1 מ ל של מאגר MES המכיל 10 מ"ג של edac לתוך הצינור להפעיל את פני השטח קרבוקסילי. מערבולת הצינור לערבב את החרוזים.
- לסובב את הצינור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- לסובב את החרוזים עבור 60 s ב 2,000 x g.
- השמט את הסופרנטנט בזהירות מתוך הוצאת המאגר.
- כדי לשטוף את החרוזים, להוסיף 1 מ ל של מלוחים באגירה פוספט (PBS) לתוך הצינור. מערבולת הצינור לערבב את החרוזים.
- ספין במורד הצינור עבור 60 s ב 2,000 x g.
- השמט את הסופרנטנט בזהירות מתוך הוצאת המאגר.
- שטוף שוב את החרוזים עם 1 מ ל של PBS על ידי הצעדים הבאים 1.10-1.12.
- הריכוז הסופי של הרדמון בשימוש יהיה תלוי במתח הנמצא בתמונה. הכינו 1 מ ל של 1-, 10-, 100-, ו-1000 מתקפל סדרת דילול של Rhodamine אדום-X מתוך 0.65 mM Rhodamine אדום-X הפתרון מניות.
- פיפטה 20 μL של חרוזים. לכל צינור הדילול הסדרתי
- לסובב את הצינור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- שטפו את החרוזים פעמיים עם 1 מ ל של PBS בצעדים חוזרים 1.10-1.12.
- הוסיפו 1 מ ג של PBS לתוך הצינור ואחסנו אותו ב -4 ° c עד 6 שבועות. בדקו את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של החרוזים מתחת למיקרוסקופ המשמש ליצירת הדמיה חיה. הריכוז המתאים של אסתר האדום-X של הרודטין, הינו תלוי בתנאי ההדמיה (איור 1).
הערה: חרוזים ללא הטיפול האדום-X של Rhodamine אינם נצמדים לתא. Rhodamine אדום-X משמש סמן פלואורסצנטית, כמו גם מולקולה דבק. האינטראקציה האלקטרו-סטטית בין הטעינה החיובית של Rhodamine אדום-X וממברנה פלזמה טעונה שלילית היא גורם הדבקה.
2. מכלול פיפטה בפה
- גזור רחב (קוטר הפנימי 6.35 מ"מ) וצרה (3.175 מ"מ בקוטר הפנימי) הצינורות Tygon אל כ 25 ס"מ ו 40 ס מ אורך, בהתאמה (איור 2).
- לחבר את צינורות tygon עם מסנן polyטטרפלואורואתילן (0.2 יקרומטר גודל נקבובית) (איור 2).
- פירוק צינור מסחרי זמין מסחרית ולצרף את המחזיק נימי שלו ו לסוף צינורות Tygon רחב, בהתאמה (איור 2).
הערה: באמצעות פיפטה בפה, נעשה שימוש במסנן הצדפות כדי למנוע שאיפת אדים של תמיסת היפוכלוריט.
3. בידוד של העובר בלסטורה
הערה: לבש כפפות ומעיל מעבדה כדי למנוע גזירה וקשר עם פתרון הלבנת.
- החזיקו כל קצה של מיקרונימי (קיבולת; 10 μL) עם יד ימין ושמאל.
- משוך את המיקרוקפילר לעבר שני הקצוות כדי להחיל מתח ולהביא את מרכז הקפילר על פני מבער כדי ליצור שתי נימיםמשכוביד (איור 3א).
- חתוך את קצות נימים משכו ביד עם מלקחיים מתחת למיקרוסקופ מבתר וחברו את הנימים הנמשכים לתוך מכשיר ליטוף בפה (איור 2). הכינו שני סוגי פיפטות. גודל הפתיחה של הטיפ עבור הפיפטות צריך להיות כ-2x ו-1x אורך הציר הקצר של העוברים (30 μm) עבור העברת העובר והסרת קליפת המין, בהתאמה איור 3B-D).
- פיפטה 45 μL של תמיסת מלח ביצה על הבאר של שקופית רב-שכבתי (איור 4א; למטה).
- מניחים 5-10 למבוגרים בלבד הכולל תמיסת מלח ביצים.
- כדי להשיג את העוברים המוקדמים של המחוז , חותכים מבוגרים לחתיכות על ידי מיקום שתי מחטים לימין ולשמאל של הגוף C. אלגיה והזזת המחטים מעבר לשני (איור 4א; תרשימים עליונים).
- פיפטה 45 μL של תמיסת היפוכלוריט על באר ליד הבאר המכילה את תמיסת מלח הביצה (איור 4ב).
- פיפטה 45 μL של מדיום הגדילה של שלטון על שלוש הבארות הבאות לצד הבאר המכילה את הפתרון ההיפוכלוריט (איור 4ב).
- העבר את השלב הראשון של התאים והשלב המוקדם של שני תאים לתוך התמיסה של ההיפוכלוריט באמצעות נימי הפה עם הקפילר המצויר ביד להעברת העובר (איור 4ב').
- המתן 40-55 s.
- שטפו את העוברים באמצעות העברת העוברים מתמיסה היפוכלוריט לתוך מדיום הצמיחה של שלטון בעזרת הקפילר המצויר ביד לצורך העברת העובר (איור 4ב').
- שטוף את העוברים שוב על ידי העברת העוברים לבאר חדשה של מדיום הצמיחה של שלטון על ידי מלטף עם הקפילר מצוירת ביד להעברת העובר (איור 4ב).
- העבר את העוברים שטף לבאר חדשה של בינונית הצמיחה של שלטון ידי ליטוף עם הקפילר ביד להעברת העובר. בעזרת הקפילר המצויר ביד להסרת קליפת ביצה, חזרו בזהירות על הפיליטוף (איור 4ג; תרשימים אמצעיים). אם ביצה הוסר בהצלחה, התאים העובריים יהפכו יותר כדוריים (איור 4ג; ימין).
- הפרד בין הבלסטומרים העובריים בשלב שני תאים בעדינות ובאופן רציף עם נימי הידיים הנמשכים להסרת קליפת ביצה (איור 4ד).
4. החוקה של דפוסי קשר עם בלסטורה ו חרוז
הערה: עבודה תחת מיקרוסקופ הדמיה כדי למנוע הדיסוציאציה של תא מתוך חרוז כדי להקל על רכישת תמונה בזמן.
- כדי להתבונן במיקרוסקופ הפוך, הכינו חדר דימות כמו באיור 5.
- מניחים שמיכות על מחזיק שמיכות (איור 5א).
- הקלטת את קצות הכיסויים כדי לייצב אותו. הצד עם הקלטת הוא הצד האחורי (איור 5א, ב).
- הפוך את מחזיק הכיסויים אל הצד הקדמי וצייר עיגול על שמיכות עם עט הידרופובי (איור 5ג).
הערה: כל מאכל בתחתית הזכוכית פועל גם כן, בתנאי שהעוברים ממניחים על ידי הפיפטה בפה.
- הוסף את מדיום הצמיחה של שלטון בתוך המעגל שצויר על ידי סמן ההידרופובי (איור 5ד).
- העבירו את הבלסטורה המבודד. לחדר ההדמיה
- מחלק נפח קטן מהחרוזים המשואמים בעזרת נימי היד הנמשכים להעברת העובר.
- לשלוט על המיקום של חרוזי פוליסטירן על ידי פיצוץ לתוך הנימים מצוירת ביד עד חרוז מתחבר לבלסטורה מבודדת.
- הר שמיכות כדי למנוע אידוי של בינונית (איור 5E). בצע הדמיה חיה.
5. הכנת ריאגנטים חשוב
- ביצה פתרון מלח (10 mL): לשלב 235 μL של 5 M הנאל ו 240 μL של 2 M KCl עם 9525 μL של dH2O.
- היפוכלוריט פתרון (10 mL): לשלב 7.5 mL של Clorox (המכיל כ 7.5% היפוכלוניט נתרן) עם 2.5 mL של 10 N NaOH (הריכוז הסופי של היפוכלוריט נתרן הוא כ 5.625%).
הערה: למרות שיטות רבות שפורסמו השתמשו chitinase כדי לעכל קליפות בביצים הרסניות, אימצנו שיטה באמצעות היפוכלוניט פתרון11. על ידי הימנעות אצווה-to-אצווה וריאציות של פעילויות chitinase, אנו מאמינים שיטה זו היא יותר להיות הגישה האפקטיבית וחסכונית. - 0.81 מ"מ פתרון אינולין (40 mL)
- הוסף 0.2 גרם של אינולין ל 40 מ ל של dH2O.
- האוטוקלב להתמוסס.
הערה: ממשיך לחודש אחד ב -4 ° c.
- 0.5 M מאגר מס (500 mL)
- התמוססות 48.81 גרם של MES ב400 מ ל של מים מזוקקים (dH2O).
- התאם את ה-pH ל-6.0.
- הביאו את אמצעי האחסון הכולל ל-500 mL עם dH2O.
- הפתרון PBS (1 ל)
- כדי להפוך את פתרון ה-PBS 10 לקפל, לפזר חבילה 1 של אבקת PBS מראש x 1 L של dH2O.
- שילוב 100 mL של פתרון PBS 10 מתקפל עם 900 mL של dH2O.
- 5% pvc פתרון (4 מ ל)
- בתנאים סטריליים, לפזר 0.2 g של PVP ב 4 מ ל של דרוזוהילה שניידר בינונית.
הערה: יש לפתוח תמיד את המניה הבינונית של שניידר במכסה התרבות של הרקמה (TC). המשך חודש אחד ב -4 ° c.
- בתנאים סטריליים, לפזר 0.2 g של PVP ב 4 מ ל של דרוזוהילה שניידר בינונית.
- מ0.65 מניות אדום-X של הרודאמלין (2 מ ל)
- שוקלים 1 מ ג של רומדיין אדום-X.
- הוסף 2 מ ל diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי לפזר.
- מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.
- בינוני הגדילה של שלטון (SGM) (10.25 mL)
- בתנאים סטריליים, לשלב 8 מ ל של דרוזוהילה שניידר בינונית, 1 מ ל של פתרון PVP, 1 מ ל של פתרון אינולין, 1 מ ל של בסיס הנשר הבזאלי (BME) ויטמינים, 50 μL של פניצילין-סטרפטומיצין, ו 100 μL של ליפיד להתרכז יחד.
- Aliquot 325 μL של SGM לתוך 1.5 mL מיקרוצינוריות.
הערה: המשך כחודש אחד ב -4 ° c. - ביום של בידוד בלסטורה, הוסף 175 μL של סרום של שור עוברי (FBS) אל SGM (עבור נפח כולל של 500 μL).
הערה: החנות FBS ב-20 ° צ' והפשרת אותו לפני השימוש. FBS לא צריך להיות הרוגים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עבור הכנת חרוזים, קבענו את הכמות האופטימלית של הרדאמלין אדום-X מסוג הרמדמידימאדיל עבור הזן הטרנסגניים המבטא GFP-רירן II ו-mCherry-histone (איור 1א-ד). השתמשנו mcherry מתויג היסטון כסמן של התקדמות מחזור התא. מכיוון הן rhodamine אדום-x ו-mcherry יהיה מואר על ידי 561 ננומטר לייזר, האינטנסיביות האופטימלית של האות האדום rhodamine הוא דומה לזה של היסטון לאפשר הדמיה בו של תא ו חרוז. לדוגמה, האות הפלואורסצנטית מהחרוז שטופל עם 0.005 μg/mL הייתה חלשה מכדי להמחיש את החרוז (איור 1א). מצד שני, את האות הפלואורסצנטית מן החרוזים שטופלו 5 μg/mL האדום-X הרבה מאוד היתה חזקה מכדי לדמות mCherry-histone (איור 1ד). קבענו כי 0.5 μg/mL האדום-X והטוב ביותר של אסתר הוא מיטבי עבור זן זה טרנסגניים מסוים (איור 1ג).
בידוד בלסטורה התבצע בהתאם להליכים המוצגים באיור 4. הנקודות הבאות אמורות להיות מטופלות לניסויים מוצלחים. 1) התקשורת בבאר מתאדה לאורך זמן והופכת צמיגה; הדבר גורם לעוברים לדבוק בנימי הזכוכית ובעוברים אחרים, כך שצריך להשתמש בבאר חדשה עם מדיה טרייה. 2) בפתרון ההיפוכלוריט, עוברים צפים אל פני השטח. לכן, להקטין את ההגדלה של המיקרוסקופ ולהתמקד על פני השטח של droplet כדי להקל עם העברת עוברים. 3) האפקטיביות של פתרון ההיפוכלוריט עשויה להיות שונה. מכאן, המשך של העוברים לבלות את הפתרון רדמה יש להיבדק עבור כל אצווה חדשה של פתרון רדמה עשה. 4) מניחים את פיפטה הפה בקרבת העובר ככל האפשר כדי למזער את הכוח המשמש לפיצוץ לתוך הפיפטה, אך גם לא קרוב מדי, כך שעובר נשאב גם כן (זה נכון בזמן הצמדת חרוזים). 5) לאחר הסרת קליפת ביצה, עוברים להיות עדינים מאוד. מכאן, כוחות המופעל על פיפטה הפה צריכים להיות מופחת מעט כדי למנוע מעוברים להתפרץ. 6) שימוש ממושך בפיפטה הפה עשוי לצנן את המסנן, ו -7) שני תאים העוברים בשלבים צריכים להיות מופרדים רק כאשר הגרעין נוצר בבירור (איור 4C, שמאל תרשימים). בהשוואה לתאים בעוברים שלמים (איור 4א; ימין), תאים בעוברים ללא מראות קליפת ביצה (איור 4ג; ימין). בנוסף, לאחר בידוד בלסטורה, צורת הבלסטומרים הופכת כדורית (איור 4ד; ימין).
כדי לבדוק את ההשפעות של האות הפיזי התלוי הקשר על כיוון חלוקת התאים, היינו מחוברים מחרוזת האדום-X מצופה של Rhodamine ל-AB בלסטומרים מבודדים משלב 2-cell ומבוצע הדמיה חיה (איור 6, איור 7). החרוז ללא הטיפול באדום-X לא דבק בבלסטומרים, והציע שהרומדצין אדום-X משמש כסמן ומולקולה דביקה. לניתוח הכיוון של חלוקת תאים, 3D שחזור התמונה הפקיעה זמן באמצעות "פרויקט 3D" הפונקציה ImageJ12 (איור 6A; הטייתסביב ציר Y). כדי לקבוע את המטוס המכיל mitotic ציר (מישור הציר), זיהינו לראשונה מטוס שבו שני סנטזומים היו מיושרים באופן אנכי (איור 6ב; 110 °): המטוס עם הזווית ± 90 ° של מישור זה הוא מישור ציר (איור 6ב';-20 °). לאחר מכן, מדדנו את זווית הציר (כיוון הציר) ביחס לממשק התא-חרוז למגע (כיוון המגע) לאחר ציטוקינזה (איור 6ג). כאשר שתי תאי הבת היו מחוברים חרוז, קו שעובר שני אתרי הקשר שימש כיוון איש קשר.
במחקר הקודם שלנו, זיהינו משטח תא אניסוטרופי רירן זרימה במהלך האוריינטציה חרוז תא AB כיוון החלוקה10. עם זאת, קשה למדוד את זרימת רירן תאיים כמו מהלכים תא במהלך החלוקה מונחה. כדי לבצע זאת, תחילה בחרנו את הדגימות עם ציר המיושר למישור ההדמיה (מישור xy) (איור 7). שנית, Z-ערימות הוקרן באמצעות שיטת הקרנה מקסימלית (איור 7). שלישית, תנועות התא תוקנו באמצעות התוסף של אלגוריתם הרישום subpixel התוספת13 של Imagej עם אפשרות גוף קשיח (איור 7ב). על-ידי רישום של תמונות, המיקום של התא היה מבוקר (איור 7ב). לבסוף, באמצעות תוסף מעקב ידני של imagej, אותרו רירן וקדי (איור 7ג). על פי מידע הקואורדינטות, המהירויות של רירן לאורך ציר החילוק, ואת הציר הניצב אליו חושבו בתוך 50 s לאחר התחלתה של ציטוקינזה.
איור 1: קביעת ריכוז האדום-X של רומדיין. (A-D) העוברים המבטאים את GFP-רירן (ירוק) ו-שרי-הייסטון (מגנטה) הוצבו בסמיכות לחרוזים הקשורים בריכוזים שונים של האדום-X (מגנטה). עוצמות האות של מצ ו-Rhodamine האדום מותוות לאורך קווים מנוקדים לבנים (גרפים תחתונים). החרוזים ואותות היסטון זוהו בבירור עבור חרוזים שטופלו עם 0.5 μg/mL rhodamine אדום-X. סרגלי קנה מידה מראים 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הרכבת של פיפטה בפה. פיפטה בפה מורכב באמצעות חיבור צר (1) ורחב (2) צינורות Tygon עם פילטר (3). בקצה צינור הצינורית הצר והרחב, מחזיק נימי (4) וחלק הפה (5) צורפו, בהתאמה. בעבודת יד נימי זכוכית (6) ניתן להוסיף למחזיק נימי. סרגל בקנה מידה הוא 50 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: בידוד בלסטורה. (א) יד משיכת נימי זכוכית. (ב) כנימי זכוכית מצוירים ביד להעברת העובר. (C) מצויר בעבודת יד להסרת קליפת ביצה. (ד) תרשימים המראים את הגודל המתאים של פתיחת הקפילר עבור הסרת קליפת היצה. חיצים מציינים עוברים. סרגלי קנה מידה מציגים 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: זרימת העבודה של בידוד בלסטורה. (א) הניתוח של מבוגרים C. אלגיה במאגר מלח ביצה כדי להשיג עוברים. תמונות מציגות שני תאים ו -4 תאים העוברים שלב לפני הסרת קליפת היצה. (ב) היפוכלוריט, טיפול וכביסה. (ג) תרשימים מתארים את העיתוי המתאים להסרת קליפת ביצה. הצילום מראה העובר בשלב 4 תאים לאחר הסרת ביצה. (ד) בלסטורה הפרדה. הצילום מראה העובר בשלב שני תאים מופרדים. מידות החיצים בדו-ממד מציינות את הכוחות היחסיים הנדרשים במהלך הליטוף. סרגלי קנה מידה מציגים 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הרכבת של חדר הדמיה. (א) הצמדת שמיכות למחזיק הכיסויים. (ב) תמונות של מחזיק שמיכות. מחזיק כיסוי לפני ואחרי ההרכבה מצוין בצד שמאל וימין, בהתאמה. (ג) עיגול הנמשך דרך עט הידרופובי. (ד) תוספת של מדיום הצמיחה של שלטון והמדגם בתוך המעגל. (ה) הרכבה שמיכות כדי למנוע אידוי. פסי קנה מידה מציגים 50 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ניתוח הכיוון של חלוקת תאים. (א) דיאגרמה של ניתוח כיוון של חלוקת תאים. (ב) קביעת מישור הציר. תמונות שמאלה מציגות דוגמה למדגם. 3D סרטים תלת-ממדיים משוחזרים סביב ציר Y כדי לקבוע את המישור שבו שני centrosomes ליישר אנכית (התמונה הנכונה; שרטוט הימני העליון). בדוגמה זו, מישור הציר הוא ± 90 ° 110 ° (התמונה האמצעית; התרשימים התחתונים הימניים). (ג) מדידת כיוון הציר ביחס לאיש הקשר עם חרוז התא. באמצעות תמונות של מישור הציר, כיוון הצירים לאחר ציטוקינזה נקבע בהתאם לזווית בין קווים המחברים שתי משולשים (קווים מנוקדים כתומים בתרשימים הנכונים) ואיש קשר לתא (קווים מנוקדים כחולים). כאשר שתי התאים של הבת היו מחוברים החרוזים, חרוז התא הכיוון קשר היה הקו שעובר שני אתרי הקשר. ירוק הוא רירן ו centrosome מגנטה הוא האבן וחרוזים. סרגלי קנה מידה הם 10 μm.. הזמנים הם דקות ושניות אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: ניתוח זרימה רירן. (א) דיאגרמה של ניתוח זרימה רירן. (ב) תיקון כיוון של חלוקת תאים. כדי לכמת את הדינמיקה רירן flow, הסיבוב של התא המפריד תוקן באמצעות התוסף ImageJ מחסנית reg (אפשרותגוף קשיח ). התמונות העליונות והתחתונות הן לפני ואחרי העיבוד של reg במחסנית. רוב התמונות מציגות קוד צבע זמני של סדרת הזמן. (ג) מעקב אחר רירן foci. באמצעות תמונות מעובד על ידי reg מחסנית, בודדים רירן וקדי תנועות במעקב על ידי מעקב הידני imagej תוסף. ציר החילוק והציר הניצב אליו הוגדרו כ-x ו-y, בהתאמה (שרטוט מימין). מהירויות זרימה רירן בציר x ו-y (הוי וי) נמדדו לפי מידע הקואורדינטות. סרגלי קנה מידה הם 10 μm.. הזמנים הם דקות ושניות אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
החוקה החוזרת של דפוסי קשר של תא מפושט יאפשר לחוקרים לבדוק את התפקידים של דפוסי קשר תאים ספציפיים בהיבטים שונים של הורפוגנזה. השתמשנו בטכניקה זו כדי להראות כי ציר החלוקה של התאים נשלט על ידי מגע פיזי עם חרוזים הדבק10. כמו מפרט ציר החלוקה הוא חיוני עבור פיתוח רב-תאיים על ידי תורם מורפוגנזה14, תא גזע החטיבה15,16, והומאוסטזיס רקמות15,16, שיטה זו אמורה להיות מסוגלת להאיר מנגנון חדש של היווצרות רקמת בעלי חיים.
בנוסף לאוריינטציה של חלוקת תאים, לשיטה זו יש פוטנציאל להיות פלטפורמה כדי לבחון את הקשר בין רמזים מכניים לבין גורל התא. מחקרים קודמים דיווחו כי הרמז המכני שולט מפרט הגורל התא. תאי גזע האדם mesenchymal להבדיל לתוך העצב, adipocyte, תא שריר השלד, ו אוסטאופתי כאשר תרבותי במצע עם קשיות שונות17. בתגובה לקשיות המצע, הרגולטורים הטרנסקריפטוניים הקשורים כן-חלבון (לצ) ו-TAZ (ההמרה activator עם מוטיב PDZ) יהיה לאתר את הגרעין, כדי להסדיר את מפרט הגורל של התא18. השיטה המוצגת בנייר זה צריך גם להיות שימושי כדי לבדוק את התפקיד של רמזים מכניים על מפרט הגורל התא, על ידי תא culturing לטווח ארוך במגע עם חרוזים דבק.
לשיטה זו יש מגבלות שמגבנות מספר רמזים מכניים שנצפו בvivo. בג, המכשול בקליפת ביצה וחדירות הרסניות משמשים כהגבלת פיזית. למרות הסרת קליפת ביצה לא משפיע על התפתחות נורמלית, הסרת הן ביצה וחדירות המכשול תוצאות דפוס חריג היווצרות19. בהעדר מכשול וחדירות, צורת התא הופכת להיות כדורית יותר, ומרמזת כי הלחץ בין תאים ותא קליפת הבית ממלא תפקיד קריטי בדפורמציה בתא ובעיוות. אכן, תא תא כוחות לסחוט כבר הציע לווסת את הכיוון חלוקת תאים20. מבלי להיות בעל הגבלת לחץ פיסי ולחץ בקרב רקמות, אנו מצפים כי שיטה זו גם אינה יכולה להיות מvivo באזור המגע התאי. כאשר אזור אנשי הקשר של התא ידוע להשפיע על איתות מדרגה21, מגבלה זו צריכה להיחשב עוד כאשר סימן מכני או כימי מסוים אינו פועל בשיטה זו בשיטת החוץ.
יש לנו עד כה בדקנו את הכיוון של חלוקת התא של AB מבודד, P1, EMS, P2, אבא, בתאי ABp (תאים עד 6 שלבים תא) בידיים שלנו10, אבל השיטה יכולה להיות מיושם לפיתוח מאוחר ככל תא בודדים יכול להיות מבודד. לאחרונה מחקר תא בודד ברצף השתמש בעיכול של הגוף תולעת לבודד את תא הזחל22. לכן, ייתכן שאדם יכול להשתמש בטיפול הבאואז כדי לבודד תאים עובריים בשלב מאוחר יותר ותאי זחל.
במחקר זה, הצגנו את הדוגמה של האינטראקציה בין cue מכני הכיוון חלוקת תאים, אבל תקשורת תא תא מתווכת גם על ידי רמזים כימיים כגון Wnt23, חריץ24, הדבקה מצמידים קולטנים25 וכן הלאה. חשוב מכך, שיטת הכנת החרוזים המוצגת כאן יכולה לזוג את החרוזים עם כל החלבונים, ובכך לאפשר את החוקה של רמזים כימיים. מחקרים קודמים השתמשו גם בספרד חרוז26 ו חלבון-חרוז מגנטי27 מצופה עם חלבון wnt להדגים תהליכים התפתחותיים תלוי wnt. עם זאת, חרוזים אלה אינם זמינים מסחרית בגדלים שונים לעומת carboxylate אוחר חרוזים פוליסטירן מוקצף. לפיכך, מחקר עתידי יכול להשתמש בשיטה המוצגת כפלטפורמה כדי לבחון את התפקיד של הרמזים כימיים ופיזיים בנימוסים יותר מטונבי. יחד, שיטה זו מתאימה לחוקרים, הלומדים התנהגויות סלולר ותגובות הנובעות דפוסי קשר תא מרחבית ורוצים לחסל רמזים סלולריים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
אנו מודים לג פרינס ולברוס בוקרמן לקבלת ייעוץ ולמתן זנים של C. אלגיה , דון מירמן, קוטה מיזומוטו, ומכון למדעי החיים במכון לעיבוד ציוד וריאגנטים, אחאי הירוסו, ליסה פרננדו, מין ג'י קים למען תחזוקת הג והקריאה הקריטית של כתב היד שלנו. העבודה שלנו נתמכת על ידי מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה של קנדה (NSERC), (RGPIN-2019-04442).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
References
- Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
- Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
- McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
- Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
- Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
- Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
- Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
- Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
- Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
- Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
- Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
- Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
- Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
- Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
- Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
- Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).
- Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
- Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).
