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Developmental Biology

분리 된 예쁜 꼬마 염 철충 배아 블라스타미어와 접착 성 폴리스티렌 구슬과 공간 세포 접촉 패턴의 체외 재구성

doi: 10.3791/60422 Published: November 26, 2019

Summary

다세포 시스템의 조직 복잡성은 세포 외 단서와 개별 적인 세포 행동 사이 인과 관계의 확인을 혼동. 여기에서, 우리는 C. elegans 배아 블라스토미어와 접착성 폴리스티렌 구슬을 사용하여 접촉 의존적 큐와 분할 축 사이의 직접적인 링크를 연구하는 방법을 제시한다.

Abstract

다세포 시스템에서, 개별 세포는 인접한 세포 및 환경에서 오는 각종 물리적 및 화학적인 단서에 의해 포위됩니다. 이 조직 복잡성은 외인성 단서와 세포 역학 사이 인과 링크의 확인을 혼동합니다. 종합적으로 재구성된 다세포 시스템은 연구원이 다른 사람을 제거하는 동안 특정 단서를 테스트할 수 있게 함으로써 이 문제를 극복합니다. 여기서, 우리는 분리 된 예쁜 꼬마염 블래스토미어 및 접착 성 폴리스티렌 구슬로 세포 접촉 패턴을 재구성하는 방법을 제시합니다. 절차는 계란 껍질 제거, 세포 세포 접착을 방해하여 blastomere 격리, 접착성 폴리스티렌 구슬의 준비, 세포 세포 또는 세포 비드 접촉의 재구성을 포함합니다. 마지막으로, 우리는 배아 개발에서 공간 세포 패터닝 및 세포 운명 사양의 조절에 기여하는 세포 분열 축의 방향을 조사하기 위해이 방법의 응용 프로그램을 제시한다. 이 견고하고 재현 가능하며 다재다능한 체외 식 방법을 통해 공간 세포 접촉 패턴과 세포 반응 사이의 직접적인 관계를 연구할 수 있습니다.

Introduction

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다세포 발달 도중, 개별 적인 세포의 세포 행동 (예를 들면, 분할 축)는 각종 화학적 및 물리적 단서에 의해 지정됩니다. 개별 세포가 이 정보를 해석하는 방법, 그리고 다세포 어셈블리를 응급 재산으로 조절하는 방법을 이해하는 것은 형태 형성 연구의 궁극적인 목표 중 하나입니다. 모델 유기체 C. elegans는 세포 극성1,세포 분열 패턴1,세포 운명 결정2,신경 배선3 및 유기발생과같은 조직 규모 규정과 같은 형태 형성의 세포 수준 조절에 크게 기여하고 있다4,5. 다양한 유전 적 도구가 있지만 조직 공학 방법은 제한적입니다.

C. elegans 연구에서 가장 성공적인 조직 공학 방법은 고전적인 blastomere 격리6; C. 예쁜꼬마조충태아는 달걀 껍질과 투과성 장벽7에둘러싸여 있기 때문에 제거는이 방법의 주요 절차 중 하나입니다. 이 blastomere 절연 방법은 단순화 된 방식으로 세포 세포 접촉의 재구성을 가능하게하지만, 원치 않는 큐의 제거를 허용하지 않습니다; 세포 접촉은 여전히 기계적(예: 접착) 및 화학 적 단서를 모두 발생시켜 큐와 세포 행동 사이의 인과 관계를 완전히 분석하는 능력을 제한합니다.

이 백서에 제시된 방법은 리간드로 단백질을 포함하여 어떤 아민 반응성 분자든지에 공유하게 묶을 수 있는 carboxylate 수정된 폴리스티렌 구슬을 이용합니다. 특히, 우리는 구슬을 시각적으로 추적 할 수 있고 세포에 접착제로 만들기 위해 리간드로 로다민 레드-X의 아민 반응성 형태를 사용했습니다. 리간드 분자의 비드 표면 및 1차 아민 기의 카르복실 기는 수용성 카르보디미드 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필) 카르보디미드(EDAC)8,9에의해 결합된다. 얻어진 접착제 비드는 세포역학(10)에기계적 큐의 효과를 허용한다. 우리는 세포 분열 방향10에필요한 기계적 단서를 식별하기 위해이 기술을 사용했다.

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Protocol

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1. 접착제 폴리스티렌 비드의 준비

참고:이 프로토콜은 무균 기술이 필요하지 않습니다.

  1. 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 카르복실레이트 변형 폴리스티렌 구슬 10 mg의 무게.
  2. 구슬을 세척하려면 튜브에 2-(N-morpholino) 에탄설포닉산(MES) 완충제 1mL를 추가합니다. MES 완충제는 인산염 및 아세테이트를 포함하지 않기 때문에, 이는 탄수화물의 반응성을 감소시킬 수 있고, 단백질 커플링 반응에 사용하기에 적합하다. 튜브를 소용돌이로 혼합하여 구슬을 혼합한다.
  3. 벤치탑 원심분리기를 통해 2,000 x g에서 60초동안 튜브를 회전시다.
  4. 버퍼를 조심스럽게 파이펫팅하여 상급을 폐기하십시오.
  5. 1.2-1.4 단계 다음 단계로 MES 버퍼의 1 mL로 구슬을 다시 씻으십시오.
  6. 표면 카르복실 기를 활성화하기 위해 튜브에 EDAC 10 mg을 포함하는 MES 버퍼 1 mL을 추가하십시오. 튜브를 소용돌이로 혼합하여 구슬을 혼합한다.
  7. 실온에서 15분 동안 튜브를 회전하고 배양합니다.
  8. 2,000 x g에서60 s에 대한 구슬을 아래로 회전 .
  9. 버퍼를 조심스럽게 파이펫팅하여 상급을 폐기하십시오.
  10. 구슬을 세척하려면 튜브에 인산 완충 식염수 (PBS) 1 mL을 추가합니다. 튜브를 소용돌이로 혼합하여 구슬을 혼합한다.
  11. 2,000 x g에서60 s에 대 한 튜브를 회전 합니다.
  12. 버퍼를 조심스럽게 파이펫팅하여 상급을 폐기하십시오.
  13. 1.10-1.12 단계 다음 단계로 PBS의 1 mL로 구슬을 다시 씻습니다.
  14. 사용되는 로다민의 최종 농도는 이미지화되는 변형에 따라 달라집니다. 0.65 mM 로다민 Red-X 재고 용액에서 로다민 레드-X의 1mL, 10-100배 및 1000배 희석 시리즈를 준비합니다.
  15. 각 직렬 희석 튜브에 비펫 20 μL의 비펫.
  16. 실온에서 튜브를 5분 동안 회전하고 배양합니다.
  17. 1.10-1.12 단계를 반복하여 PBS의 1 mL로 구슬을 두 번 씻습니다.
  18. 튜브에 1 mL의 PBS를 넣고 최대 6 주 동안 4 °C에 보관하십시오. 살아있는 화상 진찰을 위해 이용된 현미경의 밑에 구슬의 형광 강렬을 검사하십시오. 로다민 레드-X 수치니미딜 에스테르의 적절한 농도는 이미징 조건에 의존한다(도1).
    참고 : 로다민 적색 X 처리가없는 구슬은 세포에 부착되지 않습니다. 로다민 레드-X는 형광 마커뿐만 아니라 접착제 분자의 역할을 한다. 양전하로다민 적색-X와 음전하 플라즈마 멤브레인 사이의 정전기 상호 작용은 접착의 원인이다.

2. 입 피펫의 조립

  1. 폭(내경 6.35mm)과 좁은(내경 3.175mm) 타이곤 튜브를 각각 약 25cm 및 40cm 길이로 자른다(그림2).
  2. 타이곤 튜브를 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 필터(0.2 μm 모공 크기)와 연결합니다(그림2).
  3. 시판되는 흡입기 튜브를 분해하고 좁고 넓은 타이곤 튜브의 끝에 모세관 홀더와 마우스피스를 각각 부착합니다(그림2).
    참고 : PTFE 필터는 입 파이펫을 통해 하이포 염액 용액의 연기 흡입을 방지하기 위해 사용되었다.

3. 배아 블라스포미어의 분리

참고: 표백 용액과의 절단 및 접촉을 피하기 위해 장갑과 실험실 코트를 착용하십시오.

  1. 마이크로 모세관의 각 끝(용량; 10 μL)을 오른손과 왼손으로 잡습니다.
  2. 미세 모세관을 양쪽 끝으로 당겨 긴장을 가하고 모세관의 중심을 버너 위에 가져와 손으로 당긴 두 개의 모세 혈관을 만듭니다(그림 3A).
  3. 해부 현미경 아래 집게로 손으로 뽑은 모세 혈관의 끝을 다듬고 당겨진 모세관을 입 파이펫팅 장치에 부착합니다(그림2). 두 가지 유형의 파이펫을 준비합니다. 파이펫에 대한 팁 개방 크기는 배아 전달 및 난자 제거를 위한 C. elegans 배아(30 μm)의 짧은 축 길이의 약 2배 및 1배이어야 하며, 각각 도 3B-D).
  4. 파이펫 45 μL의 달걀 소금 용액을 멀티웰 슬라이드의 우물 상에(그림4A;하단)에.
  5. 5-10명의 성인 C. 예쁜꼬마선충을 달걀 소금 용액이 들어있는 우물 위에 놓습니다.
  6. 초기 C. 예쁜꼬마선충 배아를 얻으려면, C. 예쁜꼬마선충의 오른쪽과 왼쪽에 두 개의 바늘을 배치하고 바늘을 서로 지나서 슬라이딩하여 성인을 조각으로 잘라냅니다(그림 4A;상부 회로도).
  7. 피펫 45 μL의 하이포아염소산염 용액을 잘 함유된 계란 염액 옆에 있는 우물위에(그림 4B).
  8. 쉘튼의 성장 배지의 피펫 45 μL을 하모염염 액을 함유하는 웰 옆에 있는 3개의 웰 에 상구한다(도4B).
  9. 배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관으로 입 파이펫팅에 의해 1 세포 단계 및 초기 2 세포 단계 배아를 하이포아염소산염 용액으로 옮김(도4B)으로옮김을 옮김을 전달한다.
  10. 40-55s 기다립니다.
  11. 배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관으로 입 파이펫팅을 하여 하이포아염소산염 용액에서 배아를 쉘튼의 성장 배지로 옮겨 배아를 세척한다(그림4B).
  12. 배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관으로 입 파이펫팅을 하여 배아를 쉘튼의 성장 배지의 새로운 우물로 옮겨 다시 세척한다(그림4B).
  13. 씻은 배아를 배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관으로 입 피펫팅하여 쉘튼의 성장 배지의 새로운 우물로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮니다. 손으로 그린 모세관을 사용하여 달걀 껍질 제거를 위해 조심스럽게 파이펫팅을 반복합니다(그림 4C; 중간 회로도). 난자 껍질이 성공적으로 제거되면 배아 세포가 더 구형이 됩니다(그림 4C; 오른쪽).
  14. 2 세포 단계 배아 블래스타미어를 달걀 껍질 제거를 위해 손으로 그린 모세관으로 부드럽고 지속적으로 파이펫팅하여 분리합니다(그림4D).

4. 블라스포미어와 구단으로 접촉 패턴 의 재구성

참고 : 비드에서 세포의 해리를 방지하고 적시에 이미지 수집을 용이하게하기 위해 이미징 현미경에서 작동합니다.

  1. 반전된 현미경을 사용하여 관찰하려면 그림 5에서와같이 이미징 챔버를 준비합니다.
    1. 커버슬립 홀더에 커버슬립을 놓습니다(그림5A).
    2. 커버슬립의 가장자리를 테이프로 테이프로 하여 안정화합니다. 테이프가 있는 쪽은 '뒷면' 면입니다(그림5A, B).
    3. 커버슬립 홀더를 '앞면' 쪽으로 뒤집고 소수성 펜으로 커버슬립에 원을그립니다(그림5C).
      참고 : 배아가 입 피펫에 의해 조작 할 수 있다면 모든 유리 바닥 요리도 작동합니다.
  2. 소수성 마커에 의해 그려진 원 내에 셸튼의 성장 배지를 추가합니다(그림5D).
  3. 분리된 블래스토미어를 이미징 챔버로 옮김.
  4. 배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관을 사용하여 화학적으로 기능화된 비드의 소량을 분배합니다.
  5. 비드가 분리된 블래스토미어에 부착될 때까지 손으로 그린 모세관에 불어 폴리스티렌 비드의 위치를 제어합니다.
  6. 매체의 증발을 방지하기 위해 커버 슬립을 장착합니다(그림 5E). 라이브 이미징을 수행합니다.

5. 중요한 시약의 준비

  1. 계란 소금 용액 (10 mL): 235 μL 의 5 M NaCl 및 2M KCl의 240 μL과 9525 μL의 dH2O를 결합합니다.
  2. 하이포아염소산염 용액 (10 mL): 클로록스 7.5 mL (약 7.5 % 하이포 염화 나트륨 함유)와 10 N NaOH 2.5 mL (하이포 아염소산 나트륨의 최종 농도는 약 5.625 %)를 결합합니다.
    참고 : 많은 출판 된 방법이 치틴 계란 껍질을 소화하기 위해 치티 나아제 (chitinase)를 사용했지만, 우리는 hypochlorite 용액11을사용하는 방법을 채택했습니다. 치티나제 활동의 배치 대 배치 변형을 피함으로써, 우리는이 방법이 더 재현 가능하고 비용 효율적인 접근 방식이라고 생각합니다.
  3. 0.81 mM 이눌린 용액 (40 mL)
    1. dH2O 의 40 mL에 이눌린 0.2 g을 추가하십시오.
    2. 용해할 오토클레이브.
      참고: 4°C에서 1개월 동안 보관하십시오.
  4. 0.5 M MES 버퍼(500mL)
    1. 400 mL의 증류수(dH2O)에MES 48.81 g을 용해시.
    2. pH를 6.0으로 조정합니다.
    3. dH2O로 총 볼륨을 500 mL로 가져옵니다.
  5. PBS 솔루션(1L)
    1. 10배 PBS 용액을 만들려면, 10-dH2O의 1L에 PBS 프리믹스 파우더 1패키지를 용해시고.
    2. 10배 PBS 솔루션 100mL와 900mL의 dH2O를 결합합니다.
  6. 5% 폴리비닐피롤리돈(PVP) 용액(4mL)
    1. 멸균 조건하에서, 초파리 슈나이더 의 배지 4 mL에 0.2 g의 PVP를 용해시다.
      참고 : 항상 조직 배양 (TC) 후드에 슈나이더의 중간 주식을 엽니 다. 4 °C에서 1 개월 동안 유지하십시오.
  7. 0.65 mM 로다민 레드-X 재고 솔루션 (2 mL)
    1. 무게 1 로다민 레드-X의 mg.
    2. 용해시키기 위해 디메틸 설폭사이드(DMSO) 2 mL를 첨가합니다.
    3. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.
  8. 셸튼의 성장 매체 (SGM) (10.25 mL)
    1. 멸균 조건하에서, 드로소필라 슈나이더 배지 8mL, PVP 용액 1 mL, 이눌린 용액 1mL, 기저 미디엄 이글(BME) 비타민 1mL, 페니실린-스트렙토마이신 50 μL, 100 μL의 지질 농축액을 함께 결합합니다.
    2. 1.5 mL 마이크로튜브로 SGM의 325 μL.
      참고: 4 °C에서 약 1개월 동안 보관하십시오.
    3. 블라스토미어 분리의 날에, SGM에 175 μL의 태아 소 혈청 (FBS)을 추가하십시오 (총 부피 500 μL).
      참고: FBS를 -20°C에 보관하고 사용 전에 해동하십시오. FBS는 열을 죽일 필요가 없습니다.

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Representative Results

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구슬 제제를 위해, GFP-미오신 II 및 mCherry-histone을 발현하는 형질전환 균주에 대한 로다민 레드-X 수치니미딜 에스테르의 최적 양을 결정하였다(도1A-D). 우리는 세포 주기 진행의 마커로 mCherry 태그 히스톤을 사용. 로다민 레드-X와 mCherry 모두 561 nm 레이저로 조명되기 때문에 로다민 레드-X 신호의 최적 강도는 세포와 비드의 동시 이미징을 허용하는 히스톤의 강도와 비교할 수 있습니다. 예를 들어, 0.005 μg/mL 로다민 Red-X 수치니미딜 에스테르로 처리된 비드로부터의 형광 신호는 비드를 가시화하기에는 너무 약했다(도1A). 한편, 5 μg/mL로 처리된 구슬로부터의 형광 신호는 로다민 레드-X 수치니미딜 에스테르가 이미지 mCherry-histone에 너무 강했다(도1D). 우리는 0.5 μg/mL 로다민 Red-X 수치니미딜 에스테르가 이 특정 형질전환 균주에 최적이라는 것을 결정했습니다(그림1C).

Blastomere 격리는 도 4에도시된 절차에 따라 수행되었습니다. 성공적인 실험을 위해 다음 사항을 해결해야 합니다. 1) 우물의 미디어는 시간이 지남에 따라 증발하고 점성이된다; 이것은 배아가 유리 모세관 및 그밖 태아에 달라붙는 원인이 됩니다, 그래서 신선한 매체를 가진 새로운 우물은 이용될 필요가 있습니다. 2) 하이포아염소산염 용액에서 배아는 표면에 떠 있습니다. 따라서, 현미경의 배율을 낮추고 배아의 전달을 용이하게 하기 위해 액적의 표면에 초점을 맞춘다. 3) 하이포염화염 용액의 효과는 다를 수 있습니다. 따라서, 하이포아염소산염 용액에서 배아의 지속 기간은 만든 하이포아염소산염 용액의 각각의 새로운 배치에 대해 시험되어야 한다. 4) 입 피펫을 가능한 한 배아에 가깝게 배치하여 파이펫으로 날려 버리는 데 사용되는 강도를 최소화할 뿐만 아니라 배아도 빨려 들어가지 않도록 너무 가깝지 않습니다 (구슬을 부착 할 때도 마찬가지입니다). 5) 달걀 껍질 제거 후 배아는 매우 섬세해집니다. 따라서 입 피펫에 가해지는 힘은 배아가 파열되는 것을 방지하기 위해 약간 낮아야합니다. 6) 입 피펫의 장기간 사용은 PTFE 필터를 약화시킬 수 있으며, 7) 2 세포 단계 배아는 핵이 명확하게 형성되었을 때만 분리되어야한다(그림 4C,좌측 회로도). 온전한 배아의 세포와 비교하여(그림 4A;오른쪽), 난자 껍질이없는 배아의 세포는 둥글게 보입니다(그림 4C; 오른쪽). 또한, 블라소미어 분리 후, 블라스포미어의 모양은 구형이 된다(그림 4D;오른쪽).

세포 분열 배향에 대한 물리적 접촉 의존적 큐의 효과를 테스트하기 위해, 우리는 2 세포 단계에서 분리된 AB 블라스토미어에 로다민 Red-X 코팅 비드를 부착하고 라이브 이미징을 수행하였다(도6, 도 7). 로다민 적색-X 처리가 없는 비드는 블래스토미어에 부착되지 않았으며, 이는 로다민 레드-X가 형광 마커와 접착제 분자의 역할을 한다는 것을 시사한다. 셀 분할 방향 분석을 위해 ImageJ12(그림 6A;Y축 주위 기울기)의 "3D 프로젝트" 기능을 사용하여 타임랩스 이미지를 3D 재구성했습니다. 유사분열 스핀들(스핀들 평면)을 포함하는 평면을 결정하기 위해 먼저 두 개의 중심체가 수직으로 정렬된 평면을 확인했습니다(그림6B;110°): 이 평면의 ± 90° 각도의 평면은 스핀들 평면(그림6B;-20°)입니다. 다음으로, 사이토카인시스 후 셀 비드 접촉 인터페이스(contact orientation)를 기준으로 스핀들(spindle orientation)의 각도를 측정하였다(도6C). 두 딸 셀이 비드에 부착되었을 때, 두 접촉 부위를 통과하는 선이 접촉 방향으로 사용되었다.

우리의 이전 연구에서, 우리는 비드 유도 AB 세포 분열 방향 동안 이방성 세포 표면 myosin 흐름을 확인10. 그러나, 세포가 방향분열 동안 이동함에 따라 세포내 미오신 흐름을 측정하는 것은 어렵다. 이를 수행하기 위해 먼저 이미징 평면(xy 평면)에 정렬된 스핀들로 샘플을선택했습니다(그림 7). 둘째, Z-스택은 최대 투영 방법을 사용하여 투영되었다(그림7). 셋째, 셀 움직임은 서브픽셀 등록 알고리즘 스택 등록 플러그인(13)의 강체 옵션을 사용하여 보정하였다(도7B). 이미지의 등록에 의해, 세포의 위치는 안정되었다(도 7B). 마지막으로, ImageJ의 수동 추적 플러그인을 사용하여, myosin foci를 추적하였다(그림 7C). 좌표 정보에 따르면, 분할 축을 따라 미오신의 속도, 그것에 수직축은 사이토카인증 발병 후 50s 이내에 계산되었다.

Figure 1
그림 1: 로다민 적색-X 농도의 결정. (A-D) GFP-미오신(녹색) 및 mCherry-histone(마젠타)을 발현하는 배아는 로다민 레드-X(마젠타)의 상이한 농도로 결합된 구슬에 근접하여 배치되었다. mCherry 및 로다민 적색-X의 신호 강도는 흰색 점선(아래그래프)을 따라 플롯됩니다. 구슬과 히스톤 신호는 0.5 μg/mL 로다민 적색-X로 처리된 구슬에 대해 명확하게 검출되었다. 배율 막대는 10 μm을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 입 피펫의 조립. 구강 피펫은 좁은(1)과 와이드(2) 타이곤 튜브를 PTFE 필터(3)와 연결하여 조립됩니다. 좁고 넓은 타이곤 튜브의 끝에, 모세관 홀더(4)와 입조각(5)을 각각 부착하였다. 손으로 그린 유리 모세관 (6)은 모세관 홀더에 삽입 할 수 있습니다. 배율 표시줄은 50mm입니다.

Figure 3
그림 3: 블라스포미어 격리. (A)유리 모세관을 손으로 당깁니다. (B)배아 이식을 위해 손으로 그린 유리 모세관. (C)달걀 껍질 제거를 위한 손으로 그린 유리 모세관. (D)달걀 껍질 제거를 위한 모세관 개구부의 적절한 크기를 나타내는 회로도. 화살표는 배아를 나타냅니다. 배율 막대는 100 μm을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 블라스포미어 절연 워크플로우. (A)알소금 완충제에 성인 C. 예쁜꼬마선충을 해부하여 배아를 얻었다. 사진은 계란 껍질 제거 전에 2 세포 및 4 세포 단계 배아를 보여줍니다. (B)하이포 아 염소 처리 및 세척. (C)도식은 달걀 껍질 제거에 적합한 타이밍을 묘사합니다. 사진은 난자 껍질 제거 후 4 세포 단계 배아를 보여줍니다. (D)블라스포미어 분리. 사진은 분리된 2세포 단계 배아를 나타낸다. C 및 D의 화살표 크기는 파이펫팅 중에 필요한 상대힘을 나타냅니다. 배율 막대는 50 μm을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 이미징 챔버의 조립체. (A)커버슬립 홀더에 커버슬립을 부착합니다. (B)커버 슬립 홀더의 이미지. 조립 전후의 커버슬립 홀더는 각각 왼쪽과 오른쪽에 표시됩니다. (C)소수성 펜을 통해 그려진 원입니다. (D)쉘튼의 성장 배지 및 원 내의 샘플을 첨가한다. (E)증발을 방지하기 위해 커버슬립을 장착합니다. 배율 막대는 50mm를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 세포 분열 방향 분석. (A)세포 분열 방향 분석의 다이어그램입니다. (B)스핀들 평면의 결정. 왼쪽 이미지는 샘플의 예를 보여줍니다. 3D 재구성된 4D 동영상은 Y축을 중심으로 회전하여 두 개의 중심이 수직으로 정렬되는 평면을 결정했습니다(오른쪽 이미지; 오른쪽 위 도식). 이 예에서 스핀들 평면은 ±90°의 110°입니다(가운데 이미지; 오른쪽 하단 회로도). (C)셀 비드 접촉에 대한 스핀들 배향의 측정. 스핀들 평면의 이미지를 사용하여 사이토카인시스 후 스핀들 배향은 두 중심체(오른쪽 회로도의 주황색 점선)와 셀 접촉(파란색 점선)을 연결하는 선 사이의 각도에 따라 결정되었습니다. 두 딸 세포가 구슬에 부착되었을 때, 셀 비드 접촉 배향은 두 접촉 부위를 통과하는 라인이었다. 녹색은 미오신과 중구, 마젠타는 히스톤과 구슬입니다. 눈금 막대는 10 μm입니다. 시간은 분 및 초입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
도 7: 미오신 흐름분석. (A)미오신 유량 분석의 다이어그램. (B)세포 분열 방향 의 보정. 세포내 myosin 흐름 역학을 정량화하기 위해, 분할 셀의 회전은 ImageJ 플러그인 스택 reg(강체 옵션)를 사용하여 수정되었습니다. 위쪽 및 아래쪽 이미지는 스택 reg 처리 전후입니다. 오른쪽 대부분의 이미지는 타임 시리즈의 시간적 색상 코드를 보여줍니다. (C)묘신 초점의 추적. 스택 reg에 의해 처리 된 이미지를 사용하여, 개별 myosin 초점 움직임은 ImageJ 수동 추적 플러그인에 의해 추적되었다. 분할 축과 수직축은 각각 x및 y(오른쪽 회로도)로 정의하였다. x 및 y축(Vx 및 Vy)의 미오신 유속을 좌표 정보에 따라 측정하였다. 눈금 막대는 10 μm입니다. 시간은 분 및 초입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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단순화된 세포 접촉 패턴의 재구성은 연구원이 형태 형성의 다른 양상에 있는 특정 세포 접촉 패턴의 역할을 시험하는 것을 시킬 것입니다. 우리는 세포 분열 축이 접착제 비드(10)와의물리적 접촉에 의해 제어된다는 것을 보여주기 위해이 기술을 사용했다. 분할축 명세서는형태형성14, 줄기세포분열15,16,조직항상성15,16에기여함으로써 다세포발달에 매우 중요하므로, 이 방법은 동물조직 형성의 새로운 기전을 조명할 수 있어야 한다.

세포 분열 배향 이외에, 이 방법은 기계적 단서와 세포 운명 사이의 관계를 시험하는 플랫폼이 될 가능성이 있다. 이전 연구는 기계적 큐가 세포 운명 사양을 제어한다고 보고했다. 인간 중간엽 줄기세포는 신경, 지방세포, 골격근세포, 및 골세포로 분화하여 상이한 강성을 가진 기질에서 배양할 때17. 기질 강성에 반응하여, 전사 조절제 예-관련 단백질(YAP) 및 TAZ(PDZ 결합 모티프를 가진 전사 공동 활성제)는 핵으로 전이되며, 세포 운명 규격18을조절한다. 이 논문에 제시된 방법은 접착제 비드와 접촉하여 세포를 장기간 배양하여 세포 운명 명세서에 대한 기계적 단서의 역할을 테스트하는 데에도 유용해야 한다.

이 방법은 생체 내에서 관찰된 특정 기계적 단서를 재화하는 데 한계가 있다. C. 예쁜 꼬마,키틴 계란 껍질과 투과성 장벽은 물리적 인 제약 역할을합니다. 계란 껍질을 제거하는 것이 정상적인 발달에 영향을 미치지 않지만, 달걀 껍질과 투과성 장벽을 모두 제거하면 비정상적인 패턴 형성(19)이발생합니다. 달걀 껍질과 투과성 장벽이 없는 경우 세포 모양이 구형이 되어 세포와 세포 계란 껍질 사이의 압력이 세포 변형 및 패터닝에 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 실제로, 세포 압착력은 세포 분열방향(20)을조절하는 것으로 제안되었다. 조직 중 물리적 인 제약 및 가압 압력이없는, 우리는이 방법은 또한 생체 내 세포 접촉 영역에서 재발 할 수 없다는 것을 기대합니다. 세포 접촉 영역이 노치신호(21)에영향을 미치는 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 제한은 특정 기계적 또는 화학적 단서가 시험관 내 방법을 사용하여 작동하지 않을 때 더 고려될 필요가 있다.

우리는 지금까지 우리의 손10에서단리된 AB, P1, EMS, P2, ABa, ABp 세포 (최대 6 세포 단계)의 세포 분열 배향을 시험했지만, 이 방법은 개별 세포가 단리될 수 있는 한 이후 의 발달에 적용될 수 있다. 최근 단일 세포 염기서열 분석 연구는 애벌레세포(22)를분리하기 위해 벌레 체의 프로나제 소화를 이용하고 있다. 따라서, 잠재적으로 하나는 나중에 단계 배아 세포 및 애벌레 세포를 격리하기 위해 pronase 처리를 사용할 수 있습니다.

본 연구에서, 우리는 기계적 큐와 세포 분열 배향 사이의 상호작용의 예를 보여주었지만, 세포-세포 통신은 또한 Wnt23,Notch24,접착 결합수용체(25) 등과 같은 화학적 단서에 의해 매개된다. 중요한 것은, 여기에 제시된 구슬 제제 방법은 구슬을 임의의 단백질과 결합시켜 화학적 단서의 재구성을 허용할 수 있다는 것이다. 이전 연구는 또한 Wnt 의존적 발달 과정을 입증하기 위해 세파로즈 비드26및 단백질-A 자기 비드27을 Wnt 단백질로 코팅했습니다. 그러나, 이들 비드는 카복실레이트 변형 폴리스티렌 비드에 비해 다양한 크기로 시판되지 않는다. 따라서, 미래 연구는 더 조정 가능한 방식으로 화학적 및 물리적 단서 모두의 역할을 테스트하는 플랫폼으로 제시 된 방법을 사용할 수 있습니다. 종합하면, 이 방법은 공간 세포 접촉 패턴에서 유래하고 그밖 세포 단서를 제거하하고자하는 세포 행동 및 반응을 공부하고 있는 연구원을 위해 적당합니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

우리는 조언과 C. elegans 균주, 돈 모어만, 코타 미즈모토, 생명 과학 연구소 이미징 코어 시설 공유 장비 및 시약, 아오이 히로야수, 리사 페르난도, 김민지 의 유지 보수에 대한 우리의 원고의 유지 보수에 대한 조언과 제공 에 대한 제임스 프리스와 브루스 Bowerman 감사합니다. 우리의 작업은 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회에 의해 지원됩니다 (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride Alfa Aesar AAA1080703 For the bead preparation
Aspirator Tube Assembly Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type Caenorhabditis Genetics Center N2 Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 in house KSG5 Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) KISKER Biotech PPS-30.0COOHP For the bead preparation
CD Lipid Concentrate Life Technologies 11905031 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox Clorox N. A. For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder In house N.A. For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. Carl Zeiss Stemi 508 For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin Gibco A3160701 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge BD 14-826AA For the blastomere isolation
Inulin Alfa Aesar AAA1842509 For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x) Gibco 11120052 For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals) Fisher BioReagents BP300-100 For the bead preparation
Multitest Slide 10 Well MP Biomedicals ICN6041805 For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder Fisher BioReagents BP665-1 For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140148 For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone Fisher BioReagents BP431-100 For the blastomere isolation
Potassium Chloride Bioshop POC888 For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer Molecular Probes R6160 For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium Gibco 21720024 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride Bioshop SOD001 For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N Fisher Chemical SS255-1 For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. Intelligent Imaging Innovation N.A. For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile Basix 13100115 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-862 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-854 For the blastomere isolation.

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References

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분리 된 <em>예쁜 꼬마 염 철충</em> 배아 블라스타미어와 접착 성 폴리스티렌 구슬과 공간 세포 접촉 패턴의 체외 재구성
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Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).More

Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).

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