Summary
Las complejidades tisulares de los sistemas multicelulares confunden la identificación de la relación causal entre las señales extracelulares y los comportamientos celulares individuales. Aquí, presentamos un método para estudiar el vínculo directo entre las señales dependientes del contacto y los ejes de división utilizando los blastómeros embrionarios de C. elegans y las perlas adhesivas de poliestireno.
Abstract
En los sistemas multicelulares, las células individuales están rodeadas por las diversas señales físicas y químicas procedentes de las células vecinas y el medio ambiente. Esta complejidad tisular confunde la identificación de la relación causal entre las señales extrínsicas y la dinámica celular. Un sistema multicelular reconstituido sintéticamente supera este problema al permitir a los investigadores probar una señal específica mientras elimina a otros. Aquí, presentamos un método para reconstituir patrones de contacto celular con caenorhabditis elegans blastomere aislado y perlas adhesivas de poliestireno. Los procedimientos implican la eliminación de cáscara de huevo, el aislamiento de blastomero al interrumpir la adhesión celular, la preparación de perlas adhesivas de poliestireno y la reconstitución del contacto de células celulares o de cuentas celulares. Por último, presentamos la aplicación de este método para investigar la orientación de los ejes de división celular que contribuye a la regulación del patrón celular espacial y la especificación del destino celular en el desarrollo de embriones. Este método in vitro robusto, reproducible y versátil permite el estudio de las relaciones directas entre los patrones de contacto de células espaciales y las respuestas celulares.
Introduction
Durante el desarrollo multicelular, los comportamientos celulares (por ejemplo, el eje de división) de las células individuales se especifican mediante varias señales químicas y físicas. Entender cómo la célula individual interpreta esta información, y cómo regulan el ensamblaje multicelular como una propiedad emergente es uno de los objetivos finales de los estudios de morfogénesis. El organismo modelo C. elegans ha contribuido significativamente a la comprensión de la regulación a nivel celular de la morfogénesis como la polaridad celular1,el patrón de división celular1,la decisión del destino celular2,y las regulaciones a escala de tejido como el cableado neuronal3 y la organogénesis4,5. Aunque hay varias herramientas genéticas disponibles, los métodos de ingeniería de tejidos son limitados.
El método de ingeniería de tejidos más exitoso en el estudio C. elegans es el aislamiento clásico de blastomero6; como c. elegans embrión está rodeado por una cáscara de huevo y una barrera de permeabilidad7, su eliminación es uno de los principales procedimientos de este método. Si bien este método de aislamiento de blastomero permite la reconstitución del contacto de células celulares de una manera simplificada, no permite la eliminación de señales no deseadas; el contacto celular todavía plantea señales mecánicas (por ejemplo, adhesión) y químicas, lo que limita nuestra capacidad de analizar completamente la relación causal entre la señal y el comportamiento celular.
El método presentado en este artículo utiliza perlas de poliestireno modificadas de carboxilato que pueden unirse covalentemente a cualquier molécula reactiva de amina, incluidas las proteínas como ligandos. Particularmente, utilizamos una forma reactiva de amina de Rhodamine Red-X como ligando para hacer cuentas tanto visualmente rastreables como adhesivas a la célula. Los grupos carboxilo de superficie de cordón y grupos primarios de amina de molécula de ligando están acoplados por carbodiimida soluble en agua 1-etil-3-(dimetilaminopropyl) carbodiimida (EDAC)8,9. Las perlas adhesivas obtenidas permiten los efectos de la señal mecánica en la dinámica celular10. Hemos utilizado esta técnica para identificar las señales mecánicas necesarias para la orientación de división celular10.
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Protocol
1. Preparación de perlas adhesivas de poliestireno
NOTA: Este protocolo no requiere técnica aséptica.
- Pesar 10 mg de perlas de poliestireno modificadas de carboxilato en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Para lavar las perlas, agregue 1 ml de tampón de ácido etanosulfónico (MES) de 2-(N-morpholino) en el tubo. Dado que el tampón MES no contiene fosfato ni acetato, lo que puede reducir la reactividad de carbodiimida, es adecuado para su uso en la reacción de acoplamiento de proteínas. Vortex el tubo para mezclar las perlas.
- Gire el tubo durante 60 s a 2.000 x g a través de una centrífuga de sobremesa.
- Deseche el sobrenadante pipeteando cuidadosamente el búfer.
- Lave las perlas de nuevo con 1 ml de búfer MES siguiendo los pasos 1.2-1.4.
- Añadir 1 ml de tampón MES que contenga 10 mg de EDAC en el tubo para activar los grupos carboxilos de superficie. Vortex el tubo para mezclar las perlas.
- Gire e incubar el tubo durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Gire las perlas durante 60 s a 2.000 x g.
- Deseche el sobrenadante pipeteando cuidadosamente el búfer.
- Para lavar las perlas, agregue 1 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) en el tubo. Vortex el tubo para mezclar las perlas.
- Gire por el tubo durante 60 s a 2.000 x g.
- Deseche el sobrenadante pipeteando cuidadosamente el búfer.
- Lave las perlas de nuevo con 1 ml de PBS siguiendo los pasos 1.10-1.12.
- La concentración final de Rhodamine utilizado dependerá de la cepa que se está haciendo de la imagen. Prepare 1 ml de las series de dilución de 1, 10, 100 y 1000 de Rhodamine Red-X de la solución de stock de 0,65 mM Rhodamine Red-X.
- Pipetear 20 l de perlas en cada tubo de dilución en serie.
- Gire e incubar el tubo durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Lave las perlas dos veces con 1 ml de PBS repitiendo los pasos 1.10-1.12.
- Añadir 1 ml de PBS en el tubo y almacenarlo a 4 oC durante un máximo de 6 semanas. Compruebe la intensidad de la fluorescencia de las perlas bajo un microscopio utilizado para imágenes en vivo. La concentración adecuada del éster de succinimidil Rhodamine Red-X depende de las condiciones de imagen (Figura 1).
NOTA: Las perlas sin tratamiento con Rhodamine Red-X no se adhieren a las células. Rhodamine Red-X sirve como marcador de fluorescencia, así como molécula adhesiva. La interacción electroestática entre Rhodamine Red-X cargada positivamente y la membrana plasmática cargada negativamente es una causa putativa de adhesión.
2. Montaje de pipeta bucal
- Corte los tubos Tygon anchos (6,35 mm de diámetro interior) y estrechos (3.175 mm de diámetro interior) a unos 25 cm y 40 cm de longitud, respectivamente(Figura 2).
- Conecte los tubos Tygon con un filtro de politetrafluoroetileno (PTFE) (tamaño de los poros de 0,2 m)(Figura 2).
- Desmontar un tubo aspirador disponible comercialmente y fijar su soporte capilar y boquilla al extremo de los tubos Tygon estrechos y anchos, respectivamente(Figura 2).
NOTA: Se utilizó un filtro de PTFE para evitar la inhalación de humos de solución de hipoclorito a través de pipeta bucal.
3. Aislamiento de blastomero embrionario
NOTA: Use guantes y bata de laboratorio para evitar el corte y el contacto con la solución de blanqueo.
- Sostenga cada extremo de un microcapilar (capacidad; 10 l) con la mano derecha e izquierda.
- Tire del microcapilar hacia ambos extremos para aplicar tensión y llevar el centro del capilar sobre un quemador para hacer dos capilares tirados a mano(Figura 3A).
- Recortar las puntas de los capilares tirados a mano con fórceps bajo el microscopio de disección y unir el capilar tirado en un aparato de pipeteo de la boca(Figura 2). Prepare dos tipos de pipetas. Los tamaños de apertura de la punta para las pipetas deben ser aproximadamente 2x y 1x la longitud corta del eje de los embriones C. elegans (30 m) para la transferencia de embriones y la eliminación de cáscara de huevo, respectivamente la Figura 3B-D).
- Pipetear 45 l de solución de sal de huevo sobre un pozo de una diapositiva multipozo(Figura 4A;parte inferior).
- Coloque 5-10 C. elegans adultos en un pozo que contenga solución de sal de huevo.
- Para obtener los embriones C. elegans tempranos, corte a los adultos en pedazos colocando dos agujas a la derecha y a la izquierda del cuerpo de C. elegans y deslizando las agujas unas demás(Figura 4A;esquemas superiores).
- Pipetear 45 l de solución de hipoclorito en un pozo junto al pozo que contiene solución de sal de huevo(Figura 4B).
- Pipetear 45 l del medio de crecimiento de Shelton en los tres pozos siguientes junto al pozo que contiene la solución de hipoclorito(Figura 4B).
- Transferir embriones de etapa de 1 célula y de etapa temprana de 2 células a la solución de hipoclorito por la boca pipeteando con el capilar dibujado a mano para la transferencia de embriones(Figura 4B).
- Espere de 40 a 55 s.
- Lavar los embriones transfiriendo los embriones de la solución de hipoclorito al medio de crecimiento de Shelton por vía oral pipeteando con el capilar dibujado a mano para la transferencia de embriones(Figura 4B).
- Lavar los embriones de nuevo transfiriendo los embriones a un nuevo pozo del medio de crecimiento de Shelton por vía oral pipeteando con el capilar dibujado a mano para la transferencia de embriones(Figura 4B).
- Transfiera los embriones lavados a un nuevo pozo del medio de crecimiento de Shelton por vía oral pipeteando con el capilar dibujado a mano para la transferencia de embriones. Usando el capilar dibujado a mano para la eliminación de cáscara de huevo, repita cuidadosamente el pipeteo(Figura 4C;esquemas medios). Si la cáscara de huevo se elimina con éxito, las células embrionarias se volverán más esféricas(Figura 4C; derecha).
- Separe los blastómeros embrionarios en etapa de 2 células pipeteando suavemente y continuamente con el capilar dibujado a mano para la eliminación de cáscara de huevo(Figura 4D).
4. Reconstitución de patrones de contacto con blastomero y perla
NOTA: Trabaje bajo el microscopio de imágenes para evitar la disociación de una célula de un cordón y para facilitar la adquisición oportuna de la imagen.
- Para observar con un microscopio invertido, prepare una cámara de imágenes como en la Figura 5.
- Coloque un cubreobjetos en un soporte de cubreobjetos(Figura 5A).
- Pegue los bordes de la cubierta para estabilizarlo. El lado con cinta es el lado posterior(Figura 5A,B).
- Voltee el soporte de cubreobjetos hacia el lado "delantero" y dibuje un círculo en el cubreobjetos con una pluma hidrófoba(Figura 5C).
NOTA: Cualquier plato con fondo de vidrio también funciona, siempre que los embriones sean manipulables por la pipeta de la boca.
- Añadir el medio de crecimiento de Shelton dentro del círculo dibujado por el marcador hidrófobo(Figura 5D).
- Transfiera el blastomero aislado a la cámara de imágenes.
- Dispensar un pequeño volumen de las perlas químicamente funcionalizadas utilizando el capilar dibujado a mano para la transferencia de embriones.
- Controle la posición de las perlas de poliestireno soplando en el capilar dibujado a mano hasta que el cordón se adhiera al blastomero aislado.
- Montar una cubierta para evitar la evaporación del medio(Figura 5E). Realice imágenes en vivo.
5. Preparación de reactivos importantes
- Solución de sal de huevo (10 ml): Combinar 235 ml de 5 M de NaCl y 240 ml de 2 M KCl con 9525 ml de dH2O.
- Solución de hipoclorito (10 ml): Combinar 7,5 ml de Clorox (que contiene aproximadamente 7,5% de hipoclorito sódico) con 2,5 ml de 10 N NaOH (la concentración final de hipoclorito sódico es aproximadamente del 5,625%).
NOTA: Aunque muchos métodos publicados han utilizado la chitinasa para digerir cáscaras de huevo chitinas, hemos adoptado un método utilizando la solución de hipoclorito11. Al evitar las variaciones de lote a lote de las actividades de chitinasa, creemos que este método es un enfoque más reproducible y rentable. - 0,81 mM Solución de inulina (40 mL)
- Añadir 0,2 g de inulina a 40 ml de dH2O.
- Autoclave para disolver.
NOTA: Se mantiene durante 1 mes a 4 oC.
- Búfer MES de 0,5 M (500 ml)
- Disolver 48,81 g de EMO en 400 ml de agua destilada (dH2O).
- Ajuste el pH a 6.0.
- Lleve el volumen total a 500 ml con dH2O.
- Solución PBS (1 L)
- Para hacer una solución de PBS de 10 veces, disuelva 1 paquete de polvo de premezcla de PBS en 1 L de dH2O.
- Combine 100 ml de solución PBS de 10 veces con 900 ml de dH2O.
- 5% Solución de polivinilpirrolidona (PVP) (4 ml)
- En condiciones estériles, disolver 0,2 g de PVP en 4 ml del medio de Drosophila Schneider.
NOTA: Abra siempre la culata media de Schneider en la capucha de cultivo de tejidos (TC). Mantener durante 1 mes a 4oC.
- En condiciones estériles, disolver 0,2 g de PVP en 4 ml del medio de Drosophila Schneider.
- 0,65 mM Rhodamine Red-X solución en stock (2 mL)
- Pesar 1 mg de Rhodamine Red-X.
- Añadir 2 ml de dimetil sulfóxido (DMSO) para disolver.
- Aliquot y almacenar a -20oC.
- Medio de Crecimiento de Shelton (SGM) (10,25 mL)
- En condiciones estériles, combine 8 ml de medio de Drosophila Schneider, 1 ml de solución de PVP, 1 ml de solución de inulina, 1 ml de vitaminas del águila basal (BME), 50 ml de penicilina-estreptomicina y 100 ml de concentrado de lípidos en conjunto.
- Alícuota 325 l de SGM en microtubos de 1,5 ml.
NOTA: Mantener durante aproximadamente 1 mes a 4 oC. - El día del aislamiento de blastomeros, añadir 175 ml de suero bovino fetal (FBS) al SGM (para un volumen total de 500 l).
NOTA: Almacene FBS a -20 oC y desconédalo antes de usarlo. FBS no necesita ser asesinado por calor.
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Representative Results
Para la preparación de perlas, determinamos la cantidad óptima de éster de succinimidil Rhodamine Red-X para la cepa transgénica que expresa GFP-miosina II y mCherry-histone(Figura 1A-D). Usamos mCherry etiquetó la histona como un marcador de progresión del ciclo celular. Debido a que tanto Rhodamine Red-X y mCherry serán iluminados por un láser de 561 nm, la intensidad óptima de la señal De Rhodamine Red-X es comparable a la de la histona para permitir la toma simultánea de imágenes de células y perlas. Por ejemplo, la señal de fluorescencia del cordón tratado con 0,005 g/ml de éster de succinimidilo Rhodamine Red-X era demasiado débil para visualizar elcordón (Figura 1A). Por otro lado, la señal de fluorescencia de las perlas tratadas con 5 g/ml de éster de succinimidil Rhodamine Red-X era demasiado fuerte para imaginar mCherry-histone(Figura 1D). Hemos determinado que el éster de succinimidil Rojo-X de Rhodamine de 0,5 g/ml es óptimo para esta cepa transgénica en particular(Figura 1C).
El aislamiento de Blastomere se realizó de acuerdo con los procedimientos mostrados en la Figura 4. Los siguientes puntos deben abordarse para experimentos exitosos. 1) Los medios en el pozo se evaporan con el tiempo y se vuelvevisco; esto hace que los embriones se peguen al capilar de vidrio y otros embriones, por lo que es necesario utilizar un nuevo pozo con medios frescos. 2) En la solución de hipoclorito, los embriones flotan a la superficie. Por lo tanto, baje el aumento del microscopio y concéntrese en la superficie de la gota para facilitar la transferencia de embriones. 3) La eficacia de la solución de hipoclorito puede diferir. Por lo tanto, la duración del gasto de los embriones en la solución de hipoclorito debe probarse para cada nuevo lote de solución de hipoclorito realizada. 4) Coloque la pipeta bucal lo más cerca posible del embrión para minimizar la fuerza utilizada para soplar en la pipeta, pero tampoco demasiado cerca para que el embrión también sea aspirado (esto también es cierto cuando se unen cuentas). 5) Después de la eliminación de cáscara de huevo, los embriones se vuelven muy delicados. Por lo tanto, las fuerzas ejercidas sobre la pipeta bucal deben reducirse ligeramente para evitar que los embriones estallen. 6) El uso prolongado de la pipeta bucal puede humedecer el filtro de PTFE, y 7) los embriones de etapa de 2 células sólo deben separarse cuando el núcleo se ha formado claramente(Figura 4C, esquemas izquierdos). En comparación con las células de embriones intactos(Figura 4A; derecha), las células en embriones sin cáscara de huevo se ven más rojas(Figura 4C;derecha). Además, después del aislamiento de blastomero, la forma de los blastómeros se vuelve esférica(Figura 4D; derecha).
Para probar los efectos de la señal física dependiente del contacto en la orientación de la división celular, adjuntamos perlas recubiertas de Rhodamine Red-X a los blastómeros AB aislados de la etapa de 2 células y realizamos imágenes en vivo(Figura 6, Figura 7). El cordón sin tratamiento Rhodamine Red-X no se adhirió a los blastómeros, lo que sugiere que el Rhodamine Red-X sirve como un marcador de fluorescencia y molécula adhesiva. Para el análisis de la orientación de la división celular, hemos reconstruido 3D la imagen de lapso de tiempo utilizando la función "proyecto 3D" de ImageJ12 (Figura 6A;inclinación alrededor del eje Y). Para determinar el plano que contiene el husillo mitotico (plano de husillo), primero identificamos un plano donde dos centrosomas estaban alineados verticalmente(Figura 6B; 110o): el plano con ángulo de 90o de este plano es plano de husillo(Figura 6B;-20o). A continuación, hemos medido el ángulo del husillo (orientación del husillo) en relación con la interfaz de contacto de cordón de celda (orientación de contacto) después de la citoquinesis(Figura 6C). Cuando ambas celdas hijas se unieron al cordón, se utilizó una línea que pasa por ambos sitios de contacto como orientación de contacto.
En nuestro estudio anterior, hemos identificado un flujo de miosina superficial de células anisotrópicas durante la orientación de división de células AB inducida por perlas10. Sin embargo, es difícil medir el flujo de miosina intracelular a medida que la célula se mueve durante la división orientada. Para ello, primero hemos seleccionado las muestras con el husillo alineado con el plano de imagen (plano xy)(Figura 7). En segundo lugar, las pilas Z se proyectaron utilizando el método de proyección máxima(Figura 7). En tercer lugar, los movimientos de celda se corrigieron utilizando el algoritmo de registro de subpíxeles Stack reg plug-in13 de ImageJ con la opción Cuerpo rígido (Figura 7B). Mediante el registro de imágenes, la posición de la célula se estabilizó(Figura 7B). Por último, mediante el uso del complemento de seguimiento manual de ImageJ, se realizaron un seguimiento de los focos de miosina (Figura 7C). De acuerdo con la información de coordenadas, las velocidades de la miosina a lo largo del eje de división, y el eje perpendicular a él se calcularon dentro de 50 s después del inicio de la citoquinesis.
Figura 1: Determinación de la concentración de Rhodamine Red-X. (A-D) Los embriones que expresaban GFP-miosina (verde) y mCherry-histone (magenta) se colocaban cerca de cuentas unidas con diferentes concentraciones de Rhodamine Red-X (magenta). Las intensidades de la señal de mCherry y Rhodamine Red-X se trazan a lo largo de las líneas de puntos blancas (gráficos inferiores). Las perlas y las señales histonas se detectaron claramente para las perlas tratadas con 0,5 g/ml de Rhodamine Red-X. Las barras de escala muestran 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Montaje de pipeta bucal. La pipeta de la boca se monta conectando tubos Tygon estrechos (1) y anchos (2) con un filtro de PTFE (3). Al final del tubo Tygon estrecho y ancho, se unieron el soporte capilar (4) y la boquilla (5), respectivamente. Se puede insertar un capilar de vidrio dibujado a mano (6) en el soporte capilar. La barra de escala es de 50 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Aislamiento de blastomere. (A) Extracción manual del capilar de vidrio. (B) Capilar de vidrio dibujado a mano para transferencia de embriones. (C) Capilar de vidrio dibujado a mano para la eliminación de cáscara de huevo. (D) Esquemas que muestren el tamaño adecuado de la abertura capilar para la eliminación de cáscara de huevo. Las flechas indican embriones. Las barras de escala muestran 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Flujo de trabajo de aislamiento de Blastomere. (A) Disección de C. elegans adultos en tampón de sal de huevo para obtener embriones. Las fotografías muestran embriones de etapa de 2 y 4 células antes de la eliminación de cáscara de huevo. (B) Tratamiento y lavado de hipoclorito. (C) Los esquemas representan el momento adecuado para la eliminación de cáscara de huevo. La fotografía muestra un embrión de etapa de 4 células después de la eliminación de la cáscara de huevo. (D) Separación de blastomere. La fotografía muestra un embrión de etapa de 2 células separado. Los tamaños de las flechas en C y D indican las fuerzas relativas necesarias durante el pipeteo. Las barras de escala muestran 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Montaje de la cámara de imágenes. (A) Fije la cubierta al soporte de la cubierta. (B) Imágenes de un soporte de encubridor. El soporte de cubreobjetos antes y después del montaje se indica a la izquierda y a la derecha, respectivamente. (C) Un círculo dibujado a través de una pluma hidrófoba. (D) Adición del medio de crecimiento de Shelton y muestra dentro del círculo. (E) Montaje de una cubierta para evitar la evaporación. Las barras de escala muestran 50 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Análisis de la orientación de la división celular. (A) Un diagrama de análisis de orientación de división de celda. (B) Determinación del plano del husillo. Las imágenes izquierdas muestran un ejemplo de una muestra. Las películas 4D reconstruidas en 3D se rotaron alrededor del eje Y para determinar el plano en el que dos centrosomas se alinean verticalmente (imagen derecha; esquemas superiores derecho). En este ejemplo, el plano del husillo es de 90o de 110o (imagen media; esquemas inferiores derecho). (C) Medición de la orientación del husillo en relación con el contacto del cordón celular. Utilizando imágenes del plano del husillo, la orientación del husillo después de la citoquinesis se determinó en función del ángulo entre las líneas que conectan dos centrosomas (líneas de puntos naranjas en los esquemas correctos) y el contacto de celda (líneas de puntos azules). Cuando ambas celdas hijas se unían a las cuentas, la orientación del contacto de cordón celular era la línea que pasaba ambos sitios de contacto. El verde es miosina y centrosome, magenta es histona y cuentas. Las barras de escala son de 10 m. Los tiempos son minutos y segundos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Análisis del flujo de miosina. (A) Un diagrama de análisis de flujo de miosina. (B) Corrección de la orientación de la división de celda. Para cuantificar la dinámica de flujo de miosina intracelular, la rotación de la celda divisoria se corrigió utilizando el plugin ImageJ Stack reg (Opción de cuerpo rígido). Las imágenes superior e inferior son antes y después del procesamiento de registro de pila. A la derecha, la mayoría de las imágenes muestran el código de color temporal de las series temporales. (C) Seguimiento de los focos de miosina. Usando las imágenes procesadas por Stack reg, los movimientos individuales de myosin foci fueron rastreados por ImageJ Manual tracking plugin. El eje de división y el eje perpendicular a él se definieron como x e y, respectivamente (esquemas derecho). Las velocidades de flujo de miosina en los ejes x e y (Vx y Vy) se midieron de acuerdo con la información de coordenadas. Las barras de escala son de 10 m. Los tiempos son minutos y segundos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La reconstitución de patrones de contacto celular simplificados permitirá a los investigadores probar las funciones de patrones de contacto celular específicos en diferentes aspectos de la morfogénesis. Hemos utilizado esta técnica para demostrar que el eje de división celular está controlado por el contacto físico con cuentas adhesivas10. Como especificación del eje de división es crucial para el desarrollo multicelular al contribuir a la morfogénesis14,división de células madre15,16, y homeostasis tisular15,16, este método debe ser capaz de iluminar un nuevo mecanismo de formación de tejido animal.
Además de la orientación de la división celular, este método tiene un potencial para ser una plataforma para probar la relación entre las señales mecánicas y el destino celular. Estudios anteriores informaron que la señal mecánica controla la especificación del destino celular. Células madre mesenquimales humanas se diferencian en neurona, adipocitos, células musculares esqueléticas, y osteoblasto cuando se cultivan en sustrato con rigidez diferente17. En respuesta a la rigidez del sustrato, los reguladores transcripcionales Proteína asociada al Sí (YAP) y TAZ (coactivador transcripcional con motivo de unión a PDZ) se trasladarán al núcleo, para regular la especificación del destino celular18. El método presentado en este documento también debe ser útil para probar el papel de las señales mecánicas en la especificación del destino celular, mediante el cultivo de células a largo plazo en contacto con cuentas adhesivas.
Este método tiene limitaciones en la recapitulación de ciertas señales mecánicas observadas in vivo. En C. elegans,la cáscara de huevo quitinosa y la barrera de permeabilidad sirven como restricción física. Aunque la eliminación de cáscara de huevo no afecta el desarrollo normal, la eliminación de la cáscara de huevo y la barrera de permeabilidad da como resultado la formación de patrones anormales19. En ausencia de cáscara de huevo y barrera de permeabilidad, la forma celular se vuelve más esférica, lo que sugiere que la presión entre las células y la cáscara de huevo celular juega un papel crítico en la deformación celular y el patrón. De hecho, se han propuesto fuerzas de compresión de células celulares para regular la orientación de la división celular20. Sin tener restricción física y presión putativa entre los tejidos, esperamos que este método tampoco pueda recapitular el área de contacto celular in vivo. Como se sabe que el área de contacto celular afecta la señalización Notch21, esta limitación debe considerarse aún más cuando cierta señal mecánica o química no funciona utilizando este método in vitro.
Hasta ahora hemos probado la orientación de la división celular de las células aisladas AB, P1, EMS, P2, ABa, ABp (células de hasta 6 etapas celulares) en nuestras manos10,pero el método se puede aplicar al desarrollo posterior en la medida en que las células individuales pueden ser aisladas. El reciente estudio de secuenciación de una sola célula ha utilizado la digestión de la pronasa del cuerpo del gusano para aislar la célula larval22. Por lo tanto, potencialmente se puede utilizar el tratamiento de pronasa para aislar células embrionarias en etapaposterior y células larvales.
En este estudio, mostramos el ejemplo de interacción entre la cue mecánica y la orientación de la división celular, pero la comunicación célula-célula también está mediada por señales químicas como Wnt23, Notch24, receptores acoplados a la adhesión25 y así sucesivamente. Es importante destacar que el método de preparación de perlas presentado aquí puede acoplar las cuentas con cualquier proteína, permitiendo así la reconstitución de señales químicas. Estudios anteriores también han utilizado sepharose perla26 y proteína-A cuenta magnética27 recubierto con proteína Wnt para demostrar los procesos de desarrollo dependientes de Wnt. Sin embargo, estas cuentas no están disponibles comercialmente en varios tamaños en comparación con las perlas de poliestireno modificadas en carboxilato. Por lo tanto, la investigación futura puede utilizar el método presentado como una plataforma para probar el papel de las señales químicas y físicas de maneras más ajustables. En conjunto, este método es adecuado para los investigadores, que están estudiando los comportamientos celulares y las respuestas que resultan de los patrones de contacto de células espaciales y desean eliminar otras señales celulares.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a James Priess y Bruce Bowerman por su asesoramiento y suministro de cepas de C. elegans, Don Moerman, Kota Mizumoto y Life Sciences Institute Imaging Core Facility por compartir equipos y reactivos, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim para el mantenimiento de C. elegans y la lectura crítica de nuestro manuscrito. Nuestro trabajo cuenta con el apoyo del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC), (RGPIN-2019-04442).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
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References
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