Summary
Automatisering är nyckeln till uppskalning och kostnadshantering i cell tillverkningen. Detta manuskript beskriver användningen av en motströms centrifugalcell process anordning för automatisering av buffertutbytet och cellkoncentrationen steg för småskaliga bio bearbetning.
Abstract
Framgångsrik kommersialisering av gen-och cellbaserade terapier kräver tillverkningsprocesser som är kostnadseffektiva och skalbara. Buffertutbyte och produktkoncentration är viktiga komponenter för de flesta tillverkningsprocesser. Men i ett tidigt skede av produktutvecklingen utförs dessa steg ofta manuellt. Manuell återvändsgränd centrifugering för buffertutbyte är arbetsintensiva, kostsamma och inte skalbar. Ett slutet automatiserat system kan effektivt eliminera detta mödosamma steg, men genomförandet kan vara utmanande. Här beskriver vi en nyutvecklad cell bearbetningsenhet som lämpar sig för små till medelstora cell bearbetning och syftar till att överbrygga klyftan mellan manuell bearbetning och storskalig automatisering. Detta protokoll kan enkelt appliceras på olika celltyper och processer genom att ändra flödeshastigheten och centrifugeringshastigheten. Vårt protokoll visade hög cell återhämtning med kortare bearbetningstider jämfört med den manuella processen. Celler som återhämtade sig från den automatiserade processen behöll också sin spridnings grad. Enheten kan användas som en modulär komponent i en sluten tillverkningsprocess för att rymma åtgärder som buffertutbyte, cell formulering och frysförvaring.
Introduction
Den moderna medicinens landskap har omvandlats snabbt genom den senaste tidens utveckling inom gen-och cellbaserade terapier (GCT). Som ett av de snabbast växande områdena inom translationell forskning står även GCT-sektorn inför unika och oöverträffade utmaningar. Förutom robusta kliniska utfall är effektiva och kostnadseffektiva tillverkningsprocesser avgörande för GCT-kommersiell framgång, vilket är särskilt svårt att uppnå i småskalig tillverkning1. Kostnaden för tid, arbete och kvalitet försäkringar förstoras när varje parti av celler endast producerar några doser för en patient i stället för hundratals eller tusentals. Till skillnad från allogena cellterapier där tillverkningsprocesserna mer liknar produktionen av antikroppar och rekombinanta proteiner, är autologt cellterapier vanligtvis produceras som småskaliga operationer1. Som ett relativt nytt fenomen i biofarmaceutisk tillverkning2, alternativ för småskalig cell bearbetning är för närvarande ganska begränsad.
Buffertutbyte är viktigt för cell tillverkning. Det är en av de nedströms processer där celler avlägsnas från odlingsmedier och koncentrerad till frysförvaring eller infusion. För närvarande gäller småskaliga cell tillverkning ofta processer som liknar dem i den akademiska forskningen inställning och förlitar sig på specialiserade rena rum för att upprätthålla sterilitet3. Manuella nedströms processer använder ofta bänk centrifuger till pellets och Omsuspendera celler för volymreduktion och buffertutbyte. Dessa öppna processer är kostsamma (dvs. arbetskraft och rent rum underhåll) och har begränsad tillverkningskapacitet, som inte är idealiska för kommersiell produktion2,3.
Implementering av Automation har föreslagits som en lösning för att förbättra tillverknings effektiviteten och uppnå kommersiell skala produktioner2. Sterilitet kan inte uppnås i cellbaserade produkter genom traditionella metoder som används för biologiska ämnen, såsom Gammabestrålning eller terminal filtrering. Istället används ett automatiserat slutet system för att minska riskerna för kontaminering och operatörer som förlitar sig på rena rum för att bibehålla sterilitet4. Process Automation löser också problemet med skalbarhet genom att antingen ha flera system som körs parallellt (skala ut) eller öka bearbetningskapaciteten för en enskild enhet (skala upp), vilket i sin tur minimerar variationen mellan operatorer. Dessutom föreslår kostnads modellering analys av autolodiga terapier att automatisering kan minska tillverkningskostnaden5,6. Emellertid, ingen kostnadsfördel hittades i en autolog stamcells klinisk prövning där en automatiserad tillverknings plattform användes7, vilket tyder på att kostnaden för automatisering kan bero på den enskilda tillverkningsprocessen.
Det finns olika strategier där automatisering kan introduceras i en befintlig tillverkningsprocess. Detta kan åstadkommas antingen genom att implementera en helt integrerad plattform eller en modulbaserad bearbetningskedja. Det finns flera helt integrerade plattformar kommersiellt tillgängliga för autolog cell tillverkning, såsom CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech), och Quantum (Terumo BCT). Dessa integrerade plattformar, som ofta beskrivs som "GMP-in-a-Box", har låga krav på infrastruktur och är lätta att använda. Tillverkningskapaciteten hos en helt integrerad installation kan dock begränsas av den inkubator som är knuten till systemet. Till exempel, den odlingskapacitet Prodigy är begränsad till sin 400 ml kammare8 och Quantum patronen har en begränsande yta inställd på 2,1 m2 (motsvarande 120 T175 flaskor)7, som kanske inte är tillräckligt för patienter som kräver högre cell doser9,10. Dessutom har Prodigy och Quantum ett gemensamt attribut som begränsar deras användning: den operativa enheten upptas av ett enda parti celler under hela cell expansions perioden, vilket begränsar antalet partier som kan tillverkas av varje enhet11. Den modulära metoden för automatisering är att skapa en tillverkningskedja med flera modulära enheter som simulerar den kommersiella tillverkningsprocessen12,13. Denna metod, som separerar kultur enheten från cell tvätt anordningen, kan därmed maximera tillverknings effektiviteten. En idealisk bearbetningsenhet skulle vara en som är anpassningsbar och skalbar till tillverkningsbehov12.
Counterflow centrifugering (CFC) teknik, som går tillbaka till 1970-talet, har haft en lång historia i cell bearbetning14. Den uppnår cell koncentration och separation genom att balansera centrifugalkraften med en motflödeskraft. Typiskt, en cellsuspension in från den smala änden av en cell kammare under en konstant flöde medan utsätts för en centrifugalkraft (figur 1a). Flödet av vätskan utövas i motsatt riktning till centrifugalkraften. Detta kallas för motflödeskraften, som bildar en gradient i cell kammaren. Motflödeskraften minskar sedan när cell kammaren är på avstånd från spetsen på den konformade cell kammaren. Celler med högre densitet och större diameter har högre sedimenteringshastighet, och därmed når de kraftbalansen mot spetsen av den konformade cell kammaren. Mindre partiklar kan nå jämvikt mot botten av kammaren eller vara för små för att behållas i kammaren och kommer att tvättas bort. CFC-tekniken är mest känd för sin tillämpning vid bearbetning av blod aferes produkter, såsom isolerar monocyter för dendritiska cellterapier15,16. När det gäller buffertutbyte har CFC-tekniken endast tillämpats i storskalig tillverkning17 och har ännu inte använts för den småskaliga tillverkningen av autologt cellterapier.
För att tillgodose behovet av en lämplig anordning för småskalig cell tillverkning, en automatiserad CFC-apparat (se tabell över material), utvecklades nyligen18. Den automatiserade cell bearbetning enheten använder motströms centrifugering teknik för att ta bort cell skräp och underlätta buffertutbyte. Enheten utför buffertutbyte med ett engångskit som kan vara sterilt-anslutet till en cell överförings påse, vilket gör att cellerna kan bearbetas i ett sterilt, slutet system. Här undersöker vi användningen av en motströms centrifugalanordning för att utföra buffertutbyte i däggdjurscell kulturer i automatiserade protokoll. I denna studie, vi testade protokollet buffer Exchange med Jurkat celler och mesenkymala stromaceller (MSCs) till modell nonadherent och anhängare celltyper, respektive. Jurkat celler är förevigade t-celler som ofta används för studier av akut t-cellsleukemi19,20. MSCs är vuxna stamceller som har studerats i kliniska prövningar för ett brett spektrum av sjukdomar9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av reagenser och celler för buffertutbyte
- Förbered buffertar (se tabell över material) i en klass 2 laminärt flöde huva. Med hjälp av en spruta och nål montering, ta bort 50 mL saltlösning från en 500 mL koksalt påse. Ersätt detta med 50 mL av 20% humant serumalbumin (HSA) för att göra 2% HSA i saltlösning, som kommer att fungera som tvättbuffert.
- Ta bort cellerna från odlings kärlen och utför ett cellantal för att bestämma startcellskvantiteten och lönsamheten genom trypan Blue-exkludering. Ladda cellerna i en överförings påse.
Notera: i detta protokoll odlades Jurkat-celler i RPMI och MSCs odlade i DMEM: F12. Båda medierna kompletterades med 10% foster bovint serum (FBS) och 1% antibiotika-antimykotisk lösning. Cellerna var odlade vid 37 ° c med 5% CO2. För MSCs eller anhängare celler, tillsätt ett matsmältning enzym (t. ex. trypsin) i kulturen fartyg för att lossa cellerna, och släcka med kultur media när cellerna är lossnat. En överförings påse användes i detta protokoll eftersom cellerna utökades i odlingskärl. Men om cellerna odlas i en cellkultur påse, kan det vara direkt ansluten till engångsbruk kit via steril rörsvetsning. I detta protokoll användes antingen 3 x 107 Jurkat-celler eller 1 x 107 MSCS för varje körning, där cellerna avbröts i 40 ml odlingsmedier.- Ladda celler i en överförings påse (se tabell över material) med hjälp av en spruta och nål montering om en steril rör svetsare är tillgänglig för att ansluta överförings påsen till engångsbehandling kit.
- Alternativt kan du använda ett par autoklaverade sax för att skära anslutningsröret med cirka 10 cm rester bifogas överförings påsen och tillsätt en kvinnlig Luer kontakt till slutet av slangen. Använd en spruta för att aspirera celler och media, Anslut sedan sprutan till Luer-kontakten och lastcellerna till överförings påsen.
- Anslut påsen som innehåller cellerna, tvätta buffertpåse som innehåller 500 mL tvättbuffert beredd i steg 1,1, avfallspåse och uppsamlings spruta till engångssatsen (figur 1B).
Obs: anslutnings positionen för varje påse beror på inställningarna i programmet. I detta protokoll anslöt vi avfalls påsen i läge A, tvättbuffert vid position B, cell påse vid positionerna D och F och uppsamlings sprutan vid position H (figur 1C).
2. program för automatiserat buffertutbytes protokoll
- Öppna enhetens grafiska användargränssnitt (GUI) och tryck på "StarT"-knappen på en bärbar dator eller surfplatta. Sedan "Öppna" ett befintligt protokoll eller tryck på "ny" för att skapa en ny.
- Använd "framåt" och "bakåt" knappen för att navigera genom varje steg, Välj de ventiler som ska öppnas/stängas, centrifugalhastighet, pumphastighet, pump riktning, och åtgärder triggers. Inställningarna för varje steg sammanfattas i tabell 1. Spara sedan protokollet.
3. ställa in maskinen
- Placera engångsbearbetningssatsen på maskinen och häng de anslutna säckarna i enlighet med detta. Tryck på den röda "stopp/reset"-knappen för att återställa alla ventiler till standard stängt läge.
Obs: maskinen kommer att utföra ett test när dörren är stängd för att säkerställa att satsen har placerats på rätt sätt och att alla ventiler fungerar korrekt. - Anslut GUI till behandlingsenheten och tryck på "Connect"-knappen. Ladda sedan ned det sparade programmet. När den gröna "Play"-knappen tänds indikerar det att protokollet är klart att starta.
- Öppna de manuella klämmorna för överförings säck slangen.
Obs: om operatören glömmer att öppna klämmorna, kommer enheten att stanna och tryckgivaren varningen visas. Tryck på "Stop"-knappen för att återställa enheten och öppna klämmorna för att starta igen.
4. automatiserat buffertutbyte
- Tryck på "Start" för att initiera buffertutbytesprogrammet.
Obs: för att manuellt ändra den automatiserade processen, tryck på "Nästa" knappen för att gå vidare till nästa steg innan du når "trigger" eller tryck på "PAUSE" för att sätta processen på Hold. Detta kommer att återcirkulera cellerna genom satsen och samtidigt hålla endast ventiler J och K öppna (figur 1C). - I slutet av Automation steg 6 (tabell 1), kommer processen att pausa när luften i den nu tömda påsen utlöser bubblan sensorn. Tryck på "Next" för att flytta processen till nästa steg om påsen verkligen är tom, eller tryck på "PAUSE" för att återuppta bearbetningen om sensorn utlöstes av en bubbla i linjen.
5. insamling och provtagning av celler
- När den automatiserade processen är klar, Stäng alla slangklämmor. Öppna luckan och ta engångssatsen ur enheten. Koppla bort sprutan för att samla in cellerna för efterföljande processer. Ta ett prov av de insamlade cellerna för ett cellantal och lönsamhets kontroll (se steg 6,2).
6. process validering
- Utför kontroll experiment med hjälp av ett manuellt buffertutbytes protokoll.
- Centrifugera cellsuspension vid 200 x g i 5 min. Kassera supernatanten och Omsuspendera cellerna med 30 ml celltvättbuffert. Centrifugera cellsuspensionen igen vid 200 x g i 5 min. Kassera supernatanten och Omsuspendera cellerna med 10 ml celltvättbuffert.
- Utför cell inventering via trypan blå uteslutnings analys för att bedöma cellernas lönsamhet med hjälp av en automatiserad cell räknare.
- Utför en MTS-analys för att kvantifiera cellproliferation vid 2, 24 och 48 h.
Obs: MTS analysen utfördes på en 96 väl vävnadsodling plattan enligt tillverkarens anvisningar. En 100 μL alikvot av cell odlingsmedier (innehållande 10 000 Jurkat-celler eller 1 500) per brunn var pläterade efter buffertutbytet. Vid varje tidpunkt sattes 20 μL MTS-reagens i varje brunn och inkuberades i 2 timmar vid 37 ° c. Absorbansen bedömdes vid 490 nm med hjälp av en Plattläsare. - Utför funktionella analyser för att jämföra effekten av den automatiserade processen kontra den manuella processen på Jurkat-cellerna och MSC-funktionen.
- Kultur Jurkat celler i en 96-brunn plattan på en densitet av 1 x 106 celler/ml stimuleras med 50 ng/ml phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) och 1 μg/ml ionomycin (cell stimulering cocktail) i DMEM: F12 media som innehåller 10% foster bovin serum (FBS) för 24 h. Inkubera cellerna vid 37 ° c med 5% Co2.
- Mät interleukin-2 Production från Culture supernatanten med hjälp av pärlbaserad ELISA-analys (se tabell över material) enligt tillverkarens anvisningar.
- Kultur MSCs i en 12 väl skylt vid densiteten av 10 000 celler/cm2 i 1 ml DMEM: F12-material innehållande 10% FBS kompletterat med interferon-γ 50 enheter/mL för 48 h. samla supernatanten för kynurenine koncentrations analys för att mäta indoleamine 2, 3-dioxygenase (Ido) enzymaktivitet av MSCS som tidigare beskrivits21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll använde vi Jurkat-celler och MSCs som representativa exempel för att demonstrera den automatiserade buffertutbytesprocessen. Under processen delade Jurkat-celler och MSCs samma bearbetningssteg med skillnader i centrifugalkraft och pumphastighet som styr flödeshastigheten (tabell 1). Figur 2 visar representativa bilder tagna av kameran på hur den fluidiserade cellbädden kan visas under buffertutbytes processen. Typiskt, fluidiserad bädd cell sängen kommer att likna bilden i figur 2A, där celler ackumuleras i mitten och mot framsidan av konen med ett litet utrymme på spetsen av kammaren, där cellerna inte ackumuleras och öppnandet av cellen lastning inloppet är synlig. Den fluidiserade cell bädden kan komprimeras (figur 2B) vid införande av ny buffert som har en annan viskositet eller densitet. I detta protokoll sänktes pumpens varvtal från 30 – 35 mL/min till 20 mL/min i början av tvättsteget. När kammaren fylldes med den nya bufferten, var pumpens varvtal återgått till det normala för att förhindra pelleteringsceller på kammarens spets. En Högflödes hastighet (figur 2C) kan appliceras för att välja för levande celler eftersom döda celler är mindre och lättare och kan tvingas ut ur kammaren genom att öka flödet.
Den automatiserade processen för buffertutbyte uppnåddes genom att först koncentrera cellerna, sedan införa tvättbuffert, som var runt 10X av volymen av fluidiserad cell sängen. Cellerna formulerades sedan till önskad volym. Dessa tre bearbetningssteg utformades för att följa samma principer som ett manuellt buffertutbyte. Typiskt, en två-cykel centrifugering (200 x g, 5 min) används för att utföra manuella buffertutbyte, där cellerna pelleterade att koncentrera, återsuspenderas att tvätta, sedan centrifugeras igen och återsuspenderas till den slutliga volymen. Bearbetningstiden för de automatiserade processerna var kortare jämfört med de manuella (figur 3). Återvinningsgraden mellan manuella och automatiserade processer var likartad för både Jurkats celler och MSCs, och cellernas lönsamhet påverkades inte av processen (figur 4). Cell kvaliteten kontrollerades genom cellproliferation (MTS-analys) och cytokin/enzymproduktion. De återvunna cellerna visade liknande spridnings frekvenser mellan manualen och de automatiserade processerna (figur 5A). Nivån på interleukin-2-produktionen från Jurkat-celler och IDO-aktiviteten hos MSCs var också jämförbar mellan de två grupperna (figur 5B och 5C).
| Steg nummer | Beskrivning | Öppna ventiler | Centrifugera hastighet (g) | Pumpens varvtal (ml/min) | Utlösare | |
| 1 | Prime slangar från B till A | A, B, K | 10 | 50 | Volym: 45 ml | |
| 2 | Fyll Bubble trap från A till B | A, B, K | 100 | 50 (omvänd) | Volym: 10 ml | |
| 3 | Prime slangar A till D | A, D, K | 100 | 50 (omvänd) | Volym: 2 ml | |
| 4 | Prime slangar J till K | J, K | 100 | 50 | Volym: 3 ml | |
| 5 | Lastceller – initial start D till G | D, K, G | 1600 (Jurkat) 1500 (MSCs) | 25 (Jurkat) 30 (MSCs) | Volym: 100 ml | |
| 6 | Ladda celler med Bubble detect [vid detektering av bubbla/tomma slangar, programmet kommer att pausa och vänta på operatörens kommando, tryck på "pausa" eller "Nästa"] | A, D, K | = sista steget | 30 (Jurkat) 35 (MSCs) | Bubbla sensor D | |
| 7 | Töm återstående material på port D-röret | A, D, K | = sista steget | = sista steget | Volym: 1,5 ml | |
| 8 | Tvätta celler 1 | A, B, K | = sista steget | 20 | Volym: 20 ml | |
| 9 | Upprampning av tvätt hastighet | A, B, K | = sista steget | 35 | Timer: 5 sekunder hastighets rampning | |
| 10 | Tvätta celler 2 | A, B, K | = sista steget | = sista steget | Volym: 20 ml | |
| 11 | Förbered dig på skörd | J, K | = sista steget | = sista steget | Timer: 2 sekunder | |
| 12 | Återskapa celler för att mata ut och späd till målvolymen | B, J, K | = sista steget | 60 (omvänd) | Volym: 10 ml | |
| Obs: ' = sista steget ' är ett inställningsalternativ för centrifugering hastighet och pumphastighet i GUI. | ||||||
Tabell 1: automatiserad buffert Exchange GUI inställning för Jurkat celler och MSCs.
Figur 1: Counterflow centrifugalcellsbearbetning system. A) ettSchematiskt diagram som illustrerar principen för motflödescentrifugering. Motflödeskraften förekommer i en gradient i cell kammaren. Medan centrifugering (grå pil), celler med större diametrar får en högre sedimentering kraft, där cellerna når Kraftjämvikt mot den smala änden av kammaren, bildar en fluidiserad cellbädd. Cellrester och små partiklar som är för små för att stanna kvar i kammaren tvättas bort. (B) systemet med motflödescentrifugalbearbetning består av bearbetnings anordningen och engångsbearbetningssatsen. (C) konfiguration av engångssats för buffertutbytes protokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: fluidiserad cellbädd i cell kammaren. Representativa bilder av en fluidiserad cellbädd under (a) medium, (B) låg, och (C) Högflödes hastighet. Den streckade linjen indikerar området för den fluidiserade cell bädden i kammaren. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: jämförelse av cell behandlingstiden för Jurkat-celler och MSCs med manuell och automatiserad behandling. (n = 3 – 4 i varje grupp presenteras data som medelvärde ± SD). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: jämförelse av cellernas lönsamhet och levande cell återhämtning av Jurkat-celler och MSCs med manuell och automatiserad behandling. Cellernas viabilitet (a) och levande cell återhämtning (B) mättes genom trypan blå uteslutnings analys med hjälp av en automatiserad cell räknare. Levande cell återhämtning reducerades i avsaknad av serum eller när endast 3 x 106 eller 1 x 106 celler behandlades. (n = 4 – 9 i varje grupp presenteras data som medelvärde ± SD). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: cellproliferation och cell funktion från manuell och automatiserad behandling. (A) MTS-analysen av Jurkat-celler och MSCS utfördes vid 2, 24 och 48 h efter buffertutbyte. Kvaliteten på återvunna celler kvantifierades genom interleukin-2-produktion från Jurkat-celler (B) och ido-aktivitet i MSCS (C). (n = 4 – 8 i varje grupp presenteras data som medelvärde ± SD). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: stabilitet i fluidiserad cell bädden vid olika flödeshastighet. Två processer utfördes för varje celltyp. I en process, antingen 3 x 107 Jurkat celler eller 1 x 107 MSCS. I den andra processen, 10X antalet celler användes. I båda processerna samlades 10 mL cellelutriat från Port A vid olika flödeshastigheter med hjälp av centrifugeringshastigheten som anges i detta protokoll (1 600 x g för Jurkat-celler och 1 500 x g för MSCS). Antalet celler i elutriatet bestämdes och presenterades i procent av den totala mängden celler som lästes in i kammaren. (n = 3 för varje grupp presenteras data som medelvärde ± SD). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det automatiserade buffertutbytes protokollet som beskrivs är enkelt och användarvänligt. Det finns dock några viktiga steg i detta protokoll som är kritiska och som kräver särskild uppmärksamhet. Enligt vår erfarenhet, vid bearbetning av större celler såsom MSCs (genomsnittlig diameter 10-15 μm) varje körning bör omfatta minst 1 x 107 celler för att uppnå optimal cell återhämtning (figur 4B). Bearbetning av mindre celler, såsom Jurkat celler (genomsnitt ~ 10 μm diameter), kräver cirka 3 x 107 celler för att uppnå en stabil fluidiserad Cellbädd (figur 4B). När cellnumret är för lågt, celler är mer benägna att tas bort från fluidiserad bädd sängen, vilket kommer att påverka den slutliga cell återhämtning. Dessutom jämförde vi cellförlust frekvenser vid olika pumphastigheter när en konstant centrifugalhastighet tillämpas. Här observerade vi att cell förlusten ökade med flödeshastigheten (figur 6), vilket beror på den ökande instabiliteten i fluidiserad säng vid högre flöden. Dock var andelen cellförlust lägre när 10X antalet celler laddades in i kammaren, vilket tyder på att en högre pumphastighet kan tillämpas vid bearbetning av ett större antal celler för att möjliggöra snabbare bearbetning. I steg 5 i processen, 100 ml kultur Media återcirkuleras från kammaren tillbaka till cellen överföring påsen så att fluidiserad bädd sängen att bilda och stabilisera före volym minskning och buffertutbyte. Om cellkoncentrationen är låg (t. ex. under 0,2 x 106/ml), kan återcirkulationssteget behöva utökas för att tillåta tillräckligt med celler för att bilda den fluidiserade cell bädden. Likaså, om cellkoncentrationen är hög, kan återcirkulationssteget förkortas.
Förekomsten av serum i tvättbufferten är också avgörande för cell återhämtning. Tidigare studier har visat att hydrodynamisk stress kan orsaka nekrotisk celldöd i avsaknad av buffrande proteiner22,23. Flödet dynamiken i motströms centrifugalsystemet är ganska komplicerat. I detta protokoll sjönk cell återvinningsgraden till omkring 70% när processen utfördes i avsaknad av serum (figur 4B). Även om den exakta mekanismen inte är klar, förekomsten av serum i odlingsmedier eller albumin i tvättbuffertar kunde lindra den potentiella mekaniska skador på cellerna. För applikationer som kräver serum fria buffertar, hydroxyethylstärkelse och dextran 40 är exempel på icke-proteintillsatser som ofta används i cell tillverkning för att skydda mot hydrodynamisk stress24,25.
Counterflow centrifugering Technology har använts i storskalig biofarmaceutiska tillverkning och bearbetning av blodprodukter17. Tillämpningar av CFC-teknik i småskaliga cell tillverkning (dvs. 0,1 – 10 L) är ofta begränsade till att isolera mononukleära celler från aferes produkter, såsom Elutra (Terumo BCT)26, där ytterligare manuella ingrepp krävs för att utföra tvätta och koncentrera steg. Andra småskaliga cellbearbetningsplattformar omfattar membran filtreringsbaserade system för buffertutbyte såsom LOVO (Fresenius Kabi)27 och vertikal centrifugering separation såsom SEPAX (ge Healthcare)28. Även om det är svårt att utföra en direkt jämförelse mellan enheter, är en av fördelarna med denna motströms centrifugalenhet dess kapacitet att leverera mycket små produktionsvolymer (minst 5 ml), som är den minsta bland tillgängliga cellbearbetningsplattformar. Den lilla utmatnings volymen lämpar sig för tillämpningar som att formulera celler för lokala injektioner29 eller infusioner för nyfödda30. Kameran inbäddad i enheten är också en unik funktion som ger visualisering av fluidiserade cellbädd under processen utvecklingsstadiet.
En av begränsningarna i CFC-tekniken är att den är känslig för cellernas storlek och densitet. När du ställer in ett buffertutbytes protokoll för en annan celltyp, bör det protokoll som presenteras här fungera som en riktlinje för användare att optimera efter deras behov, med tanke på storleken på deras celler av intresse och tätheten av deras cellsuspension. Även om det aktuella protokollet kan användas för bearbetning av upp till 5 L media, kommer bearbetningstiden att utökas avsevärt (dvs. 1 – 2 timmar). Det är viktigt att notera att effekten av förlängd bearbetningstid på cell kvalitet inte har undersökts i denna aktuella studie.
Framtida studier kommer att utvärdera effekten av processorhastighet och bearbetningstid på cell funktion för att fastställa den maximala bearbetningskapaciteten för enheten. Vidare kan framtida studier undersöka andra tillämpningar såsom avlägsnande av dimetylsulfoxid (DMSO) från kryopreserverade produkter och selektiv borttagning av döda celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SW, IF och DJ är COO, CTO, och VD för Scinogy Pty. Ltd. Tillgången till CFC-enheten tillhandahölls också av Scinogy.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av den viktorianska regeringens program för drift infrastrukturstöd, och den viktorianska regeringens teknik kupong som tillhandahålls av Institutionen för ekonomisk utveckling, jobb, transport och resurser. RL är mottagare av en nationell hälso-och medicinsk forskning rådets karriärutveckling Fellowship. AL är mottagare av en australisk doktorand utmärkelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 | |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C | |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 | |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A | |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A | |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A | |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A | |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS | |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
References
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
- Hampson, B., Ceccarelli, J. Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here? BioProcess International. 14 (4), (2016).
- Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. Mapping success for commercial cell therapy manufacturing. BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).
- Heathman, T. R., et al. The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges. Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).
- Lipsitz, Y. Y., et al. A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products. Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2. BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).
- Hanley, P. J., et al. Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System. Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).
- Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like? Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).
- Galipeau, J., Sensebe, L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
- Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry? Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).
- James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
- Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies. Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).
- Rafiq, Q. A. Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture. Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).
- Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE). Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).
- Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra™) for clinical-scale generation of dendritic cells. Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).
- Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study. Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).
- Whitford, W. G. Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. Subramanian, G. , (2014).
- Scinogy. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH & CONCENTRATION. , https://www.scinogy.com/projects (2019).
- Yu, D., et al. Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule. Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).
- Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways. Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).
- Ling, W., et al. Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment. Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).
- Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Zhu, F., et al. Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products. Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).
- Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch. Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).
- Stroncek, D. F., et al. Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies. Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).
- Mfarrej, B., et al. Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts. Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).
- Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation. Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).
- Lim, R., et al. First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study. Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).
