Summary
Automatisering er nøglen til opskalering og omkostningsstyring i celle fremstilling. Dette manuskript beskriver brugen af en modstrøms centrifugal cellebehandling enhed til automatisering af buffer udveksling og celle koncentration trin for lille-skala bioprocessing.
Abstract
Vellykket kommercialisering af gener og cellebaserede terapier kræver fremstillingsprocesser, der er omkostningseffektive og skalerbare. Buffer udveksling og produkt koncentration er væsentlige komponenter i de fleste produktionsprocesser. Men i de tidlige stadier af produktudvikling udføres disse trin ofte manuelt. Manuelle dødende centrifugering til buffer udveksling er arbejdskraftintensiv, bekostelig og ikke skalerbar. Et lukket automatiseret system kan effektivt eliminere dette omstændelig skridt, men gennemførelsen kan være udfordrende. Her beskriver vi en nyudviklet celle behandlingsenhed, der er velegnet til små-til mellemstore celle bearbejdning og har til formål at bygge bro mellem manuel behandling og storstilet automatisering. Denne protokol kan let anvendes til forskellige celletyper og processer ved at ændre strømningshastigheden og centrifugeringshastigheden. Vores protokol viste høj celle opsving med kortere behandlingstider i forhold til den manuelle proces. Celler genvundet fra den automatiserede proces også fastholdt deres spredning satser. Enheden kan anvendes som en modulær komponent i en lukket fremstillingsproces for at imødekomme trin som buffer udveksling, celle formulering og cryopreservation.
Introduction
Landskabet med moderne medicin har ændret sig hurtigt gennem den seneste udvikling i gen-og cellebaserede terapier (GCT). Som et af de hurtigst voksende områder inden for Translationel forskning står GCT-sektoren også over for unikke og hidtil usete udfordringer. Ud over solide kliniske resultater er effektive og omkostningseffektive fremstillingsprocesser afgørende for GCT 's kommercielle succes, hvilket er særligt vanskeligt at opnå i små fremstillingsvirksomheder1. Udgifterne til tid, arbejdskraft, og kvalitet forsikringer er forstørret, når hver batch af celler kun producerer et par doser for en patient i stedet for hundreder eller tusinder. I modsætning til allogene celle terapier, hvor fremstillingsprocesser er mere beslægtet med produktion af antistoffer og rekombinante proteiner, fremstilles autologe celle terapier typisk som små operationer1. Som et relativt nyt fænomen inden for biofarmaceutiske produktion2er mulighederne for småcellet forarbejdning i øjeblikket ret begrænsede.
Buffer udveksling er afgørende for celle produktion. Det er en af downstream-processerne, hvor cellerne fjernes fra dyrkningsmedier og koncentreres om Kryopreservation eller infusion. I øjeblikket anvender småcellet celle fremstilling ofte processer svarende til dem i den akademiske forsknings indstilling og er afhængige af specialiserede rene rum for at opretholde sterilitet3. Manuelle downstream-processer bruger ofte stationære centrifuger til pellet og resuspension af celler til reduktion af volumen og buffer udveksling. Disse åbne processer er dyre (dvs. arbejdskraft og Clean Room vedligeholdelse) og har begrænset produktionskapacitet, som ikke er ideelle til kommerciel produktion2,3.
Implementering automatisering er blevet foreslået som en løsning til at forbedre produktionen effektivitet og opnå kommerciel skala produktioner2. Sterilitet kan ikke opnås i celle-baserede produkter gennem traditionelle metoder, der anvendes til biologiske, såsom gammabestråling eller Terminal ende filtrering. I stedet implementeres et automatiseret lukket system for at reducere risikoen for kontaminering og operatører, der er afhængige af rene rum for at opretholde sterilitet4. Procesautomatisering løser også problemet med skalerbarhed ved enten at have flere systemer kørende parallelt (skalering) eller øge behandlingskapaciteten for en enkelt enhed (Scale-up), hvilket igen minimerer variabiliteten mellem operatørerne. Desuden tyder cost modellering analyse af autologt terapier, at automatisering kan reducere omkostningerne ved fremstilling af5,6. Der blev imidlertid ikke fundet nogen cost-benefit i et klinisk forsøg med autologe stamceller, hvor der blev anvendt en automatiseret fremstillings platform7, hvilket tyder på, at omkostningsfordelen ved automatisering kan afhænge af den enkelte fremstillingsproces.
Der er forskellige strategier, hvor automatisering kan introduceres i en eksisterende fremstillingsproces. Dette kan opnås enten ved at implementere en fuldt integreret platform eller en modulbaseret forarbejdningskæde. Der er flere fuldt integrerede platforme kommercielt tilgængelige for autologt celle produktion, såsom CliniMACS Prodigy (Miltenyi bioTec), Cocoon (Octane Biotech), og Quantum (TERUMO BCT). Disse integrerede platforme, der ofte betegnes som "GMP-in-a-box", har lave krav til infrastrukturen og er nemme at betjene. Produktionskapaciteten for en fuldt integreret opsætning kan dog være begrænset af den inkubator, der er tilsluttet systemet. F. eks. er fremstillings kapaciteten for Prodigy begrænset til 400 ml kammer8 , og kvante patronen har et begrænsende overfladeareal indstillet til 2,1 m2 (svarende til 120 T175 kolber)7, hvilket måske ikke er tilstrækkeligt til patienter, der kræver højere celle doser9,10. Desuden har Prodigy og Quantum en fælles attribut, der begrænser deres anvendelse: den operationelle enhed er besat af en enkelt batch af celler i hele cellen ekspansions perioden, og dermed begrænse antallet af partier, der kan fremstilles af hver enhed11. Den modulære tilgang til automatisering er at skabe en produktionskæde med flere modulære enheder, der simulerer den kommercielle fremstillingsproces12,13. Denne fremgangsmåde, som adskiller kultur enheden fra celle vaske anordningen, kan derved maksimere produktionseffektiviteten. En ideel behandlingsenhed ville være en, der er tilpasningsdygtig og skalerbar til produktionsbehov12.
Counterflow centrifugering (CFC) teknologi, der daterer sig tilbage til 1970 ' erne, har haft en lang historie i cellebehandling14. Det opnår celle koncentration og adskillelse ved at afbalancere centrifugalkraft med en modstrøms kraft. Typisk kommer en cellesuspension fra den smalle ende af et celle kammer under en konstant strømningshastighed, mens den udsættes for en centrifugalkraft (figur 1a). Strømmen af væsken udøves i den modsatte retning til centrifugal kraften. Dette kaldes modstrøms kraften, som danner en gradient i celle kammeret. Modstrøms kraften aftager derefter som celle kammeret udvider væk fra spidsen af den kegleformede celle kammer. Celler med højere densitet og større diameter har en højere sedimenterings hastighed, og dermed når de Kraftligevægt mod spidsen af det kegleformede celle kammer. Mindre partikler kan opnå ligevægt mod bunden af kammeret eller være for lille til at blive opbevaret i kammeret og vil blive vasket væk. CFC-teknologien er mest kendt for sin anvendelse i behandling af blodaferese produkter, såsom isolerende monocytter for dendritiske celle terapier15,16. Med hensyn til buffer udveksling, er CFC-teknologien kun blevet anvendt i storstilet produktion17 og har endnu ikke anvendes til den mindre skala fremstilling af autologt celle terapier.
For at imødegå behovet for en egnet anordning til småcellet fremstilling, en automatiseret CFC-enhed (Se tabel over materialer), blev for nylig udviklet18. Den automatiserede cellebehandling enhed bruger modstrøms Centrifugerings teknologi til at fjerne cellerester og lette buffer udveksling. Enheden udfører buffer udveksling med en engangs-kit, der kan være steril-forbundet til en celle overførsel taske, som gør det muligt for cellerne, der skal behandles i et sterilt, lukket system. Her undersøger vi brugen af en modstrøms centrifugal anordning til at udføre buffer udveksling i pattedyr cellekulturer i automatiserede protokoller. I denne undersøgelse testede vi buffer Exchange-protokollen ved hjælp af Jurkat-celler og mesenchymal stromale celler (MSCs) til at modellere ikke-vedhængende og vedhængende celletyper hhv. Jurkat celler er udødeliggjort t celler ofte anvendes til studiet af akut t celle leukæmi19,20. MSCs er voksne stamceller, der er blevet undersøgt i humane kliniske forsøg for en bred vifte af sygdomme9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring af reagenser og celler til buffer udveksling
- Forbered buffere (Se tabel over materialer) i en klasse 2 laminar flow hætte. Ved hjælp af en sprøjte og nål samling, fjerne 50 mL saltopløsning fra en 500 mL saltvands pose. Udskift dette med 50 mL 20% humant serumalbumin (HSA) for at lave 2% HSA i saltvand, som vil fungere som vaskebuffer.
- Fjern cellerne fra kultur skibene og Udfør et celletal for at bestemme start cellens mængde og levedygtighed ved trypan og et Blue eksklusion. Læg cellerne i en overførsels pose.
Bemærk: i denne protokol blev Jurkat-cellerne dyrket i RPMI, og MSCs blev kultiveret i DMEM: F12. Begge medier blev suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% antibiotika-antimykotisk opløsning. Celler blev dyrket ved 37 °C med 5% CO2. For MSCs eller vedsiddende celler tilsættes et fordøjelsesenzym (f. eks. trypsin) i kultur beholderne for at frigøre cellerne og slukke med kulturmediet, når cellerne er løsrevet. En overførsels pose blev brugt i denne protokol, fordi cellerne blev udvidet i kultur fartøjer. Men hvis cellerne dyrkes i en cellekultur pose, kan det være direkte forbundet til engangs-kit via steril rørsvejsning. I denne protokol, enten 3 x 107 jurkat celler eller 1 x 107 MSCS blev anvendt til hver kørsel, hvor cellerne blev suspenderet i 40 ml kultur medier.- Læg cellerne i en overførings pose (Se tabel over materialer) ved hjælp af en sprøjte og nål samling hvis der er en steril rørsvejser til rådighed til at forbinde overførsels posen med engangs forarbejdnings sættet.
- Alternativt kan du bruge et par autoklaveres-saks til at klippe Tilslutningsrøret med ca. 10 cm, der er fastgjort til overførsels posen, og tilføje en kvindelig luer-forbindelse til enden af slangen. Brug en sprøjte til at aspirere celler og medier, Tilslut derefter sprøjten til luer-stikket og Indlæs cellerne i overførsels posen.
- Tilslut posen indeholdende cellerne, vask buffer pose indeholdende 500 mL vaskebuffer fremstillet i trin 1,1, affaldspose, og indsamling af sprøjte til engangsbrug Kit (figur 1B).
Bemærk: tilslutnings positionen for hver pose afhænger af indstillingerne i programmet. I denne protokol tilsluttede vi Affaldsposen på position A, vaskebuffer på position B, celle pose på positionerne D og F og opsamlings sprøjten på position H (figur 1C).
2. program til automatiseret buffer udveksling protokol
- Åbn den grafiske brugergrænseflade (GUI) på enheden, og tryk på "StarT"-knappen på en bærbar pc eller tablet. "Åbn" en eksisterende protokol, eller tryk på "ny" for at oprette en ny.
- Brug knappen "fremad" og "baglæns" til at navigere gennem hvert trin, Vælg de ventiler, der skal åbnes/lukkes, centrifugal hastighed, pumpehastighed, pumpe retning og action-udløsere. Indstillingerne for hvert trin er opsummeret i tabel 1. Gem derefter protokollen.
3. opsætning af maskinen
- Anbring engangs behandlings sættet på maskinen, og hæng de tilsluttede poser i overensstemmelse hermed. Tryk på den røde knap "stop/reset" for at nulstille alle ventiler til den lukkede standard position.
Bemærk: maskinen udfører en test, når døren er lukket, for at sikre, at kittet er anbragt korrekt, og at alle ventilerne fungerer korrekt. - Tilslut GUI til behandlingsenheden og tryk på "Connect" knappen. Download derefter det gemte program. Når den grønne knap "Afspil" lyser, indikerer det, at protokollen er klar til at starte.
- Åbn de manuelle klemmer til overførings posen slange.
Bemærk: Hvis operatøren glemmer at åbne klemmerne, stopper enheden, og trykfølerens advarsel vises. Tryk på knappen "stop" for at nulstille enheden og åbne klemmerne for at starte forfra.
4. automatiseret buffer udveksling
- Tryk på "Start" for at starte buffer udvekslingsprogrammet.
Bemærk: Hvis du vil ændre den automatiserede proces manuelt, skal du trykke på knappen "næste" for at gå til næste trin, før du når til "udløseren" eller trykke på "pause" for at sætte processen på hold. Dette vil recirkulere cellerne gennem sættet og samtidig holde kun ventiler J og K åbne (figur 1C). - I slutningen af automatisering trin 6 (tabel 1), vil processen pause, når luften i den nu tømt taske udløser boble sensoren. Tryk på "Next" for at flytte processen til næste trin, hvis posen faktisk er tom, eller tryk på "pause" for at genoptage behandlingen, hvis sensoren blev udløst af en boble i linjen.
5. indsamling og prøvetagning af cellerne
- Når den automatiserede proces er færdig, lukkes alle slangeklemmer. Åbn lågen, og tag engangs kittet ud af enheden. Frakobl sprøjten for at indsamle cellerne til efterfølgende processer. Tag en prøve af de indsamlede celler til en celletal og levedygtighed check (Se trin 6,2).
6. procesvalidering
- Udfør kontrol eksperimenter ved hjælp af en manuel buffer udvekslings protokol.
- Centrifuge cellesuspension ved 200 x g i 5 min. kassér supernatanten, og gensuspender cellerne med 30 ml celle vaskebuffer. Cellesuspensionen centrifugeres igen ved 200 x g i 5 min. kassér supernatanten, og gensuspender cellerne med 10 ml celle vaskebuffer.
- Udfør celletælling via trypan og et Blue eksklusions analyse for at vurdere cellernes levedygtighed ved hjælp af en automatiseret celle tæller.
- Udfør en MTS-analyse for at kvantificere celle proliferation ved 2, 24 og 48 h.
Bemærk: MTS-analysen blev udført på en 96 brønd vævskultur plade i henhold til producentens anvisninger. En 100 μL alikvot cellekultur medier (indeholdende 10.000 Jurkat celler eller 1.500) per brønd blev belagt efter buffer udvekslingsprocessen. Ved hvert tidspunkt blev der tilført 20 μL MTS-reagenser til hver brønd og inkuberet i 2 timer ved 37 °C. Absorbansen blev vurderet ved 490 nm ved hjælp af en plade læser. - Udfør funktionelle assays for at sammenligne virkningen af den automatiserede proces versus den manuelle proces på Jurkat-cellerne og MSC-funktionen.
- Kultur Jurkat celler i en 96-brønd plade ved en densitet på 1 x 106 celler/ml stimuleret med 50 ng/ml phorbols 12-myristate 13-acetat (PMA) og 1 μg/ml ionomycin (celle stimulation cocktail) i DMEM: F12-medier indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS) i 24 timer. Inkubér cellerne ved 37 °c med 5% Co2.
- Mål interleukin-2 produktion fra kultur supernatanten ved hjælp af perle baseret ELISA-analyse (Se tabel over materialer) i henhold til fabrikantens anvisninger.
- Kultur MSCs i en 12 brønd plade ved tætheden af 10.000 celler/cm2 i 1 ml DMEM: F12-medier indeholdende 10% FBS suppleret med interferon-γ 50 enheder/mL for 48 h. Saml supernatanten for kynureninkoncentrationen til måling af indoleamin 2, 3-dioxygenase (Ido) enzymaktivitet af MSCS som tidligere beskrevet21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol brugte vi Jurkat cells og MSCs som repræsentative eksempler til at demonstrere den automatiserede buffer udvekslingsproces. Under processen delte Jurkat-celler og MSCs de samme forarbejdningstrin med forskelle i centrifugalkraft og pumpehastighed, der styrer strømningshastigheden (tabel 1). Figur 2 viser repræsentative billeder taget af kameraet for, hvordan den fluidiserede celle seng kan vises under buffer udvekslingsprocessen. Typisk vil den fluidiserede celle seng ligne billedet i figur 2A, hvor cellerne ophobes i midten og mod forsiden af keglen med en lille plads på spidsen af kammeret, hvor cellerne ikke ophobes og åbningen af cellen lastning indløb er synlig. Den fluidiserede celle seng kan komprimeres (figur 2B) ved indførelse af ny buffer, der har en anden viskositet eller tæthed. I denne protokol blev pumpehastigheden sænket fra 30 – 35 mL/min til 20 mL/min ved starten af vaske trinnet. Når kammeret var fyldt med den nye buffer, blev pumpens hastighed vendt tilbage til normal for at forhindre pelleterings celler ved spidsen af kammeret. En høj strømningshastighed (figur 2C) kan anvendes til at vælge for levende celler, fordi døde celler er mindre og lettere og kan tvinges ud af kammeret ved at øge strømningshastigheden.
Den automatiserede proces med buffer udveksling blev opnået ved først at koncentrere cellerne og derefter indføre vaskebufferen, som var omkring 10 x af mængden af den fluidiserede celle seng. Cellerne blev derefter formuleret til det ønskede volumen. Disse tre behandlingstrin blev designet til at følge de samme principper som en manuel buffer udveksling. Typisk, en to-cyklus centrifugering (200 x g, 5 min) bruges til at udføre manuel buffer udveksling, hvor cellerne er pelleteret til at koncentrere, resuspenderet til vask, derefter centrifugeret igen og resuspenderet til den endelige volumen. Behandlingstiden for de automatiserede processer var kortere sammenlignet med de manuelle (figur 3). Inddrivelsesprocenten mellem manuelle og automatiserede processer var den samme for både Jurkat-celler og-MSCs, og cellernes levedygtighed blev ikke påvirket af processen (figur 4). Celle kvaliteten blev verificeret ved celle spredning (MTS-assay) og cytokin/enzymproduktion. De gendannede celler viste lignende sprednings hastigheder mellem manualen og de automatiserede processer (figur 5A). Niveauet af interleukin-2 produktion fra Jurkat celler og IDO aktivitet af MSCs var også sammenlignelige mellem de to grupper (figur 5B og 5C).
| Trin nummer | Beskrivelse | Åbne ventiler | Centrifuge hastighed (g) | Pumpehastighed (ml/min) | Udløser | |
| 1 | Prime Tubing fra B til en | A, B, K | 10 | 50 | Volumen: 45 ml | |
| 2 | Udfyld boble fælde fra A til B | A, B, K | 100 | 50 (omvendt) | Volumen: 10 ml | |
| 3 | Prime Tubing A til D | A, D, K | 100 | 50 (omvendt) | Volume: 2 ml | |
| 4 | Prime Tubing J til K | J, K | 100 | 50 | Volumen: 3 ml | |
| 5 | Indlæs celler – indledende start D til G | D, K, G | 1600 (jurkat) 1500 (MSCs) | 25 (jurkat) 30 (MSCs) | Volumen: 100 ml | |
| 6 | Indlæs celler med boble opdage [ved påvisning af boble/Tom slange, programmet vil pause og vente på operatørens kommando, skal du trykke på ' pause ' eller ' næste '] | A, D, K | = sidste trin | 30 (jurkat) 35 (MSCs) | Boble sensor D | |
| 7 | Tøm resterende medier på port D tube | A, D, K | = sidste trin | = sidste trin | Volumen: 1,5 ml | |
| 8 | Vask celler 1 | A, B, K | = sidste trin | 20 | Volumen: 20 ml | |
| 9 | Ramping op vaske hastighed | A, B, K | = sidste trin | 35 | Timer: 5 sekunder hastighed ramping | |
| 10 | Vask celler 2 | A, B, K | = sidste trin | = sidste trin | Volumen: 20 ml | |
| 11 | Forbered dig på at høste | J, K | = sidste trin | = sidste trin | Timer: 2 sekunder | |
| 12 | Gendan celler til output og fortynde til målvolumen | B, J, K | = sidste trin | 60 (omvendt) | Volumen: 10 ml | |
| Bemærk: ' = sidste trin ' er en indstillingsmulighed for centrifugerende hastighed og pumpehastighed i GUI. | ||||||
Tabel 1: automatiseret buffer Exchange GUI setup for Jurkat celler og MSCs.
Figur 1: Counterflow centrifugal celle Processing system. A) et skematisk diagram, der illustrerer princippet om centrifugering af modstrøms. Modstrøms kraften er til stede i en gradient i celle kammeret. Mens der centrifugerer (grå pil), får celler med større diametre en højere sedimenterings kraft, hvor cellerne når frem til Kraftligevægt mod den smalle ende af kammeret og danner en fluidiseret celle seng. Cellerester og små partikler, der er for små til at blive i kammeret, vaskes væk. B) modstrøms centrifugal behandlingssystemet består af forarbejdnings anordningen og engangs forarbejdnings sættet. (C) konfigurationen af engangs sættet til buffer udvekslings protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: fluidiseret celle seng i celle kammeret. Repræsentative billeder af en fluidiseret celle seng under (a) medium, (B) lav, og (C) høj strømningshastighed. Den stiplede linje angiver arealet af den fluidiserede celle seng i kammeret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: sammenligning af celle behandlingstid af Jurkat celler og MSCs med manuel og automatiseret behandling. (n = 3 – 4 i hver gruppe, vises data som middelværdien ± SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: sammenligning af cellelevedygtighed og levende celle opsving af Jurkat celler og MSCs med manuel og automatiseret behandling. Cellelevedygtighed (A) og levende celle genvinding (B) blev målt ved trypan og et Blue eksklusions analyse ved hjælp af en automatiseret celle tæller. Levende celle opsving blev reduceret i fravær af serum eller når kun 3 x 106 eller 1 x 106 celler blev behandlet. (n = 4 – 9 i hver gruppe, vises data som middelværdien ± SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: celle spredning og celle funktion fra manuel og automatiseret behandling. (A) MTS-assay af jurkat-celler og MSCS blev udført ved 2, 24 og 48 h efter buffer udveksling. Kvaliteten af genvundne celler blev kvantificeret ved interleukin-2 produktion fra Jurkat cells (B), og Ido aktivitet i MSCS (C). (n = 4 – 8 i hver gruppe, vises data som middelværdien ± SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: fluidiseret celle seng stabilitet ved forskellige strømningshastighed. Der blev udført to processer for hver celletype. I en proces, enten 3 x 107 jurkat celler eller 1 x 107 MSCS. I den anden proces, 10x antallet af celler blev brugt. I begge processer blev der indsamlet 10 mL celle elutriat fra port A ved forskellige strømningshastigheder ved hjælp af centrifuger hastigheden angivet i denne protokol (1.600 x g for jurkat-celler og 1.500 x g for MSCS). Antallet af celler i elutriatet blev fastlagt og præsenteret som procentdel af den samlede mængde celler, der er indlæst i kammeret. (n = 3 for hver gruppe vises data som middel ± SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne automatiserede buffer udvekslings protokol er enkel og brugervenlig. Ikke desto mindre er der et par vigtige skridt i denne protokol, der er kritiske og kræver særlig opmærksomhed. I vores erfaring, ved behandling af større celler såsom MSCs (gennemsnitlige diameter 10 – 15 μm) hver kørsel bør omfatte mindst 1 x 107 celler for at opnå optimal celle opsving (figur 4B). Behandling af mindre celler, såsom Jurkat celler (Gennemsnitlig ~ 10 μm diameter), kræver omkring 3 x 107 celler for at opnå en stabil fluidiseret celle seng (figur 4B). Når celle nummeret er for lavt, er cellerne mere tilbøjelige til at blive fjernet fra den fluidiserede seng, hvilket vil påvirke den endelige celle opsving. Derudover sammenlignede vi celle tabs hastigheder ved forskellige pumpehastigheder, når der anvendes en konstant centrifugal hastighed. Her bemærkede vi, at celle tabet steg med strømningshastigheden (figur 6), hvilket skyldes den stigende ustabilitet af den fluidiserede seng ved højere strømningshastigheder. Imidlertid var procentdelen af celle tabet lavere, da 10x antallet af celler blev indlæst i kammeret, hvilket tyder på, at en højere pumpehastighed kan anvendes, når der behandles et større antal celler for at muliggøre hurtigere behandling. I trin 5 af processen blev 100 mL kultur medier recirkuleret fra kammeret tilbage til celle overførsels posen for at tillade, at den fluidiserede seng dannes og stabiliseres før volumen reduktion og buffer udveksling. Hvis celle koncentrationen er lav (f. eks. under 0,2 x 106/ml), kan det være nødvendigt at forlænge recirkulations trinnet, så der er nok celler til at danne den fluidiserede celle seng. Ligeledes, hvis celle koncentrationen er høj, recirkulations trinnet kan forkortes.
Tilstedeværelsen af serum i vaskebufferen er også afgørende for celle genvinding. Tidligere undersøgelser har vist, at Hydrodynamisk stress kan forårsage nekrotisk celledød i fravær af buffering proteiner22,23. Strømmen dynamik af modstrøms centrifugal system er ganske kompliceret. I denne protokol faldt celle restitutionssatserne til ca. 70%, når processen blev udført uden serum (figur 4B). Selv om den nøjagtige mekanisme ikke er klar, var tilstedeværelsen af serum i kultur medier eller albumin i vaske buffere i stand til at afbøde de potentielle mekaniske skader på cellerne. For applikationer, der kræver serum frie buffere, er hydroxyethylstivelse og dextran 40 eksempler på ikke-protein tilsætningsstoffer, som ofte anvendes i celle fremstilling for at beskytte mod Hydrodynamisk stress24,25.
Modstrøms Centrifugerings teknologi er blevet anvendt i storstilet biofarmaceutiske fremstilling og behandling af blodprodukter17. Anvendelser af CFC-teknologi i små celle fremstillingsvirksomheder (dvs., 0,1 – 10 L) er ofte begrænset til isolering af mononukleare celler fra aferese produkter, såsom Elutra (TERUMO BCT)26, hvor yderligere manuel indgriben er nødvendig for at udføre vask og koncentrere trin. Andre små celle behandlings platforme omfatter membran filtrerings baserede buffer udvekslingssystemer såsom LOVO (Fresenius kabi)27 og vertikal Centrifugerings adskillelse såsom sepax (ge Healthcare)28. Selv om det er vanskeligt at udføre en direkte sammenligning mellem enheder, en af fordelene ved denne modstrøms centrifugal enhed er dens evne til at levere meget små output mængder (minimum 5 ml), som er den mindste blandt aktuelt tilgængelige cellebehandling platforme. Den lille udgangsvolumen er velegnet til applikationer såsom formulering af celler til lokale injektioner29 eller infusioner for nyfødte30. Kameraet indlejret i enheden er også en unik funktion, der giver visualisering af den fluidiserede celle seng under processen udvikling fase.
En af begrænsningerne ved CFC-teknologien er, at den er følsom over for cellernes størrelse og tæthed. Når du konfigurerer en buffer udvekslings protokol for en anden celletype, bør den protokol, der præsenteres her, fungere som en retningslinje for brugerne at optimere i henhold til deres behov, idet der holdes øje med størrelsen af deres celler af interesse og tætheden af deres cellesuspension. Selv om den nuværende protokol kan anvendes til behandling af op til 5 L medier, vil behandlingstiden blive udvidet betydeligt (dvs. 1 – 2 timer). Det er vigtigt at bemærke, at virkningen af forlænget behandlingstid på celle kvalitet ikke er blevet undersøgt i denne aktuelle undersøgelse.
Fremtidige undersøgelser vil evaluere virkningen af behandling hastighed og behandlingstid på celle funktion til at bestemme den maksimale processorkapacitet af enheden. Desuden kan fremtidige undersøgelser undersøge andre anvendelser, såsom fjernelse af dimethylsulfoxid (DMSO) fra kryopræserverede produkter og selektiv fjernelse af døde celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SW, IF, og DJ er COO, CTO, og CEO for Scinogy Pty. Ltd. Adgangen til CFC-anordningen blev også leveret af Scinogy.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af den victorianske regerings operationelle infrastruktur støtte program, og den victorianske regering teknologi voucher leveres af Department of økonomisk udvikling, job, transport og ressourcer. RL er modtager af en national sundhed og medicinsk forskning Rådet karriereudvikling fællesskab. AL er modtager af en australsk postgraduate Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 | |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C | |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 | |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A | |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A | |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A | |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A | |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS | |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
References
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
- Hampson, B., Ceccarelli, J. Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here? BioProcess International. 14 (4), (2016).
- Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. Mapping success for commercial cell therapy manufacturing. BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).
- Heathman, T. R., et al. The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges. Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).
- Lipsitz, Y. Y., et al. A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products. Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2. BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).
- Hanley, P. J., et al. Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System. Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).
- Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like? Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).
- Galipeau, J., Sensebe, L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
- Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry? Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).
- James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
- Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies. Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).
- Rafiq, Q. A. Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture. Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).
- Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE). Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).
- Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra™) for clinical-scale generation of dendritic cells. Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).
- Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study. Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).
- Whitford, W. G. Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. Subramanian, G. , (2014).
- Scinogy. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH & CONCENTRATION. , https://www.scinogy.com/projects (2019).
- Yu, D., et al. Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule. Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).
- Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways. Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).
- Ling, W., et al. Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment. Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).
- Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Zhu, F., et al. Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products. Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).
- Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch. Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).
- Stroncek, D. F., et al. Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies. Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).
- Mfarrej, B., et al. Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts. Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).
- Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation. Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).
- Lim, R., et al. First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study. Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).
