Summary
L'automazione è fondamentale per la scalabilità e la gestione dei costi nella produzione di celle. Questo manoscritto descrive l'uso di un dispositivo di elaborazione cellulare centrifuga controil flusso per automatizzare lo scambio di buffer e le fasi di concentrazione cellulare per il bioprocesso su piccola scala.
Abstract
Una commercializzazione efficace delle terapie geniche e basate sulle cellule richiede processi di produzione convenienti e scalabili. Lo scambio di buffer e la concentrazione dei prodotti sono componenti essenziali per la maggior parte dei processi di produzione. Tuttavia, nelle prime fasi dello sviluppo del prodotto, questi passaggi vengono spesso eseguiti manualmente. La centrifugazione manuale senza uscita senza uscita per lo scambio di buffer è laboriosa, costosa e non scalabile. Un sistema automatizzato chiuso può eliminare efficacemente questo laborioso passo, ma l'implementazione può essere difficile. Qui, descriviamo un dispositivo di elaborazione cellulare di recente sviluppo che è adatto per l'elaborazione di celle su piccola e media scala e mira a colmare il divario tra l'elaborazione manuale e l'automazione su larga scala. Questo protocollo può essere facilmente applicato a vari tipi di cellule e processi modificando la portata e la velocità di centrifugazione. Il nostro protocollo ha dimostrato un elevato recupero cellulare con tempi di elaborazione più brevi rispetto al processo manuale. Anche le cellule recuperate dal processo automatizzato hanno mantenuto i loro tassi di proliferazione. Il dispositivo può essere applicato come componente modulare in un processo di produzione chiuso per adattarsi a passaggi come lo scambio di buffer, la formulazione delle cellule e la crioconservazione.
Introduction
Il panorama della medicina moderna si è rapidamente trasformato attraverso recenti sviluppi nelle terapie geniche e basate sulle cellule (GCT). Essendo uno dei settori in più rapida crescita nella ricerca traslazionale, anche il settore GCT si trova ad affrontare sfide uniche e senza precedenti. Oltre ai solidi risultati clinici, processi di produzione efficienti ed efficienti in termini di costi sono essenziali per il successo commerciale della GCT, che è particolarmente difficile da ottenere nella produzione su piccola scala1. Il costo del tempo, del lavoro e delle garanzie di qualità sono amplificati quando ogni lotto di cellule produce solo poche dosi per un paziente invece di centinaia o migliaia. A differenza delle terapie alle cellule allogeniche in cui i processi di produzione sono più simili alla produzione di anticorpi e proteine ricombinanti, le terapie cellulari autologhe sono tipicamente prodotte come operazioni su piccola scala1. Come fenomeno relativamente nuovo nella produzione biofarmaceutica2, le opzioni per l'elaborazione cellulare su piccola scala sono attualmente piuttosto limitate.
Lo scambio di buffer è essenziale per la produzione di cellule. È uno dei processi a valle in cui le cellule vengono rimosse dai mezzi di coltura e concentrate per la crioconservazione o l'infusione. Attualmente, la produzione di cellule su piccola scala spesso applica processi simili a quelli dell'ambito di ricerca accademica e si basa su camere pulite specializzate per mantenere la sterilità3. I processi manuali a valle spesso utilizzano centrifughe da banco per pellet e resospendere le celle per la riduzione del volume e lo scambio di buffer. Questi processi aperti sono costosi (ad esempio, manodopera e manutenzione delle camere pulite) e hanno una capacità di produzione limitata, che non sono ideali per la produzione commerciale2,3.
L'implementazione dell'automazione è stata proposta come soluzione per migliorare l'efficienza produttiva e realizzare produzioni su scala commerciale2. La sterilità non può essere raggiunta nei prodotti a base di cellule attraverso metodi tradizionali utilizzati per i biologici, come l'irradiazione gamma o la filtrazione terminale. Viene invece implementato un sistema chiuso automatizzato per ridurre i rischi di contaminazione e gli operatori si affidano a camere pulite per mantenere la sterilità4. L'automazione dei processi risolve anche il problema della scalabilità con più sistemi in esecuzione in parallelo (scalabilità orizzontale) o aumentando la capacità di elaborazione di un singolo dispositivo (scalabilità verticale), che a sua volta riduce al minimo la variabilità tra gli operatori. Inoltre, l'analisi di modellazione dei costi delle terapie autologhe suggerisce che l'automazione può ridurre il costo della produzione5,6. Tuttavia, nessun vantaggio in termini di costi è stato riscontrato in uno studio clinico sulle cellule staminali autologhe in cui è stata utilizzata una piattaforma di produzione automatizzata7, suggerendo che il vantaggio in termini di costi dell'automazione può dipendere dal singolo processo di produzione.
Esistono diverse strategie in cui l'automazione può essere introdotta in un processo di produzione esistente. Ciò può essere ottenuto implementando una piattaforma completamente integrata o una catena di elaborazione modulare. Ci sono diverse piattaforme completamente integrate disponibili in commercio per la produzione di cellule autologhe, come CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) e Quantum (Terumo BCT). Queste piattaforme integrate, che sono spesso descritte come "GMP-in-a-box", hanno basse esigenze di infrastruttura e sono facili da usare. Tuttavia, la capacità di produzione di un setup completamente integrato può essere limitata dall'incubatore collegato al sistema. Ad esempio, la capacità di coltura di Prodigy è limitata alla sua camera8 da 400 mL e la cartuccia Quantum ha una superficie limitante impostata su 2,1 m2 (equivalente a 120 flaconi T175)7, che potrebbe non essere sufficiente per i pazienti che richiedono dosi cellulari più elevate9,10. Inoltre, Prodigy e Quantum hanno un attributo comune che ne limita l'uso: l'unità operativa è occupata da un singolo lotto di celle durante il periodo di espansione delle celle, limitando così il numero di lotti che possono essere prodotti da ogni unità11. L'approccio modulare all'automazione è quello di creare una catena di produzione con più unità modulari che simula il processo di produzione commerciale12,13. Questo approccio, che separa il dispositivo di coltura dal dispositivo di lavaggio cellulare, può quindi massimizzare l'efficienza di produzione. Un dispositivo di lavorazione ideale sarebbe uno che è adattabile e scalabile alle esigenze di produzione12.
La tecnologia della centrifugazione antistante (CFC), che risale agli anni '70, ha avuto una lunga storia nell'elaborazione cellulare14. Raggiunge la concentrazione e la separazione delle cellule bilanciando la forza centrifuga con una forza di controflusso. In genere, una sospensione cellulare entra dall'estremità stretta di una camera cellulare sotto una portata costante mentre è soggetta a una forza centrifuga (Figura 1A). Il flusso del fluido viene esercitato nella direzione opposta alla forza centrifuga. Questa è indicata come forza di controflusso, che forma un gradiente all'interno della camera cellulare. La forza di controflusso diminuisce man mano che la camera cellulare si allarga dalla punta della camera cellulare a forma di cono. Le cellule con una maggiore densità e un diametro maggiore hanno un tasso di sedimentazione più elevato, e quindi raggiungono l'equilibrio della forza verso la punta della camera cellulare a forma di cono. Le particelle più piccole possono raggiungere l'equilibrio verso la base della camera o essere troppo piccole per essere mantenute nella camera e saranno lavate via. La tecnologia CFC è principalmente conosciuta per la sua applicazione nella lavorazione di prodotti di aferesi del sangue, come l'isolamento di monociti per terapie cellulari dendritiche15,16. In termini di scambio di buffer, la tecnologia CFC è stata applicata solo nella produzione su larga scala17 e deve ancora essere utilizzata per la produzione su scala più piccola di terapie cellulari autologhe.
Per rispondere alla necessità di un dispositivo adatto per la produzione di celle su piccola scala, è stato recentemente sviluppato18un dispositivo CFC automatizzato (vedere Tabella dei materiali). Il dispositivo di elaborazione cellulare automatizzato utilizza la tecnologia di centrifugazione del controflusso per rimuovere i detriti cellulari e facilitare lo scambio di buffer. Il dispositivo esegue lo scambio di buffer con un kit monouso che può essere sterile a un sacchetto di trasferimento cellulare, che consente alle cellule di essere elaborate all'interno di un sistema sterile e chiuso. In questo caso, esaminiamo l'uso di un dispositivo centrifugo a controflusso per eseguire lo scambio di buffer nelle colture cellulari dei mammiferi in protocolli automatizzati. In questo studio, abbiamo testato il protocollo di scambio tampone utilizzando cellule Jurkat e cellule stromali mesenchymale (MSC) per modellare i tipi di cellule non aderenti e aderenti, rispettivamente. Le cellule giurate sono cellule T immortalate spesso utilizzate per lo studio della leucemia acuta delle cellule T19,20. Le MSC sono cellule staminali adulte che sono state studiate negli studi clinici umani per una vasta gamma di malattie9.
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Protocol
1. Preparazione di reagenti e celle per lo scambio di buffer
- Preparare i buffer (vedere Tabella dei materiali) in una cappa di flusso laminare di classe 2. Utilizzando un assemblaggio di siringhe e aghi, rimuovere 50 mL di soluzione salina da un sacchetto salina da 500 mL. Sostituirlo con 50 mL di 20% di albumina di siero umano (HSA) per fare 2% HSA in salina, che servirà come buffer di lavaggio.
- Rimuovere le cellule dai vasi di coltura ed eseguire un conteggio delle cellule per determinare la quantità di celle iniziale e la vitalità dall'esclusione blu trypan. Caricare le celle in un sacchetto di trasferimento.
NOTA: in questo protocollo le celle Jurkat sono state coltivate in RPMI e le MSC sono state coltivate in DMEM:F12. Entrambi i media sono stati integrati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% soluzione antibiotico-antimicotico. Le cellule sono state coltivate a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2. Per le MSC o le cellule aderenti, aggiungere un enzima di digestione (ad esempio, trypsin) nei vasi di coltura al fine di staccare le cellule e dissetare con i mezzi di coltura una volta che le cellule sono staccate. Un sacchetto di trasferimento è stato utilizzato in questo protocollo perché le cellule sono state ampliate in vasi di coltura. Tuttavia, se le cellule sono coltivate in un sacchetto di coltura cellulare, può essere collegato direttamente al kit monouso tramite la saldatura sterile del tubo. In questo protocollo, sono state utilizzate 3 x 107 celle Jurkat o 1 x 107 MSC per ogni esecuzione, dove le celle sono state sospese in 40 mL di supporti di coltura.- Caricare le celle in un sacchetto di trasferimento (vedere Tabella dei materiali)utilizzando una siringa e l'assemblaggio dell'ago se è disponibile un saldatore sterile per collegare il sacchetto di trasferimento al kit di lavorazione monouso.
- In alternativa, utilizzare un paio di forbici autoclaved per tagliare il tubo di collegamento con circa 10 cm di permanente attaccato al sacchetto di trasferimento e aggiungere un connettore Luer femminile all'estremità del tubo. Utilizzare una siringa per aspirare le celle e supporti, quindi collegare la siringa al connettore Luer e caricare le celle al sacchetto di trasferimento.
- Collegare il sacchetto contenente le celle, lavare il sacchetto tampone contenente 500 mL di tampone di lavaggio preparato nel passaggio 1.1, sacchetto dei rifiuti e raccolta della siringa al kit monouso (Figura 1B).
NOTA: la posizione di collegamento di ogni borsa dipende dalle impostazioni del programma. In questo protocollo, abbiamo collegato il sacchetto dei rifiuti nella posizione A, lavare il tampone alla posizione B, il sacchetto cellulare nelle posizioni D e F e la siringa di raccolta alla posizione H (Figura 1C).
2. Programma per il protocollo di scambio automatico del buffer
- Aprire l'interfaccia utente grafica (GUI) del dispositivo e premere il pulsante "START" su un PC o tablet portatile. Poi "Apri" un protocollo esistente o premi "Nuovo" per crearne uno nuovo.
- Utilizzare il pulsante "Avanti" e "Indietro" per navigare attraverso ogni passo, selezionare le valvole da aprire/chiudere, velocità centrifuga, velocità della pompa, direzione della pompa e trigger di azione. Le impostazioni per ogni passaggio sono riepilogate nella Tabella 1. Quindi salvare il protocollo.
3. Configurazione della macchina
- Posizionare il kit di lavorazione monouso sulla macchina e appendere di conseguenza i sacchetti collegati. Premere il pulsante rosso "Stop/Reset" per ripristinare tutte le valvole nella posizione chiusa di default.
NOTA: La macchina eseguirà un test quando la porta è chiusa per garantire che il kit sia stato posizionato correttamente e che tutte le valvole funzionino in modo appropriato. - Collegare la GUI al dispositivo di elaborazione e premere il pulsante "Connetti". Quindi scaricare il programma salvato. Quando il pulsante verde "Riproduci" si illumina, indica che il protocollo è pronto per l'avvio.
- Aprire i morsetti manuali per il tubo del sacchetto di trasferimento.
NOTA: Se l'operatore dimentica di aprire i morsetti, il dispositivo si fermerà e apparirà l'avviso del sensore di pressione. Premere il pulsante "Stop" per reimpostare il dispositivo e aprire i morsetti per ricominciare.
4. Scambio automatico di buffer
- Premere "Start" per avviare il programma di scambio di buffer.
NOTA: per modificare manualmente il processo automatizzato, premere il pulsante "Avanti" per passare al passaggio successivo prima di raggiungere il "Trigger" o premere "Pausa" per mettere il processo in attesa. Questo ricircolerà le cellule attraverso il kit mantenendo aperte solo le valvole J e K(Figura 1C). - Al termine dell'automazione passo 6(Tabella 1), il processo si fermerà quando l'aria nel sacchetto ora svuotato attiva il sensore a bolle. Premere "Avanti" per spostare il processo al passaggio successivo se il sacchetto è effettivamente vuoto, o premere "Pausa" per riprendere l'elaborazione se il sensore è stato attivato da una bolla nella linea.
5. Raccolta e campionamento delle cellule
- Quando il processo automatizzato è finito, chiudere tutti i morsetti tubo. Aprire lo sportello e togliere il kit monouso dal dispositivo. Scollegare la siringa per raccogliere le cellule per i processi successivi. Prendere un campione delle cellule raccolte per un conteggio delle cellule e un controllo di fattibilità (vedere il passaggio 6.2).
6. Convalida del processo
- Eseguire esperimenti di controllo utilizzando un protocollo di scambio manuale del buffer.
- Centrifuga sospensione cellulare a 200 x g per 5 min. Scartare il supernatante e rimettere in sospensione le cellule con 30 mL di buffer di lavaggio cellulare. Centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 200 x g per 5 min. Scartare il supernatante e rimettere in sospensione le cellule con 10 mL di buffer di lavaggio cellulare.
- Eseguire il conteggio delle celle tramite il test di esclusione blu trypan per valutare la vitalità delle cellule utilizzando un contatore cellulare automatizzato.
- Eseguire un saggio MTS per quantificare la proliferazione cellulare a 2, 24 e 48 h.
NOTA: Il saggio MTS è stato eseguito su una piastra di coltura dei tessuti da 96 pozzi secondo le istruzioni del produttore. Un'aliquota di 100 - Laliquot di coltura cellulare (contenente 10.000 celle Jurkat o 1.500) per pozzo sono stati placcati dopo il processo di scambio del buffer. Ad ogni momento, 20 l di reagenti MTS sono stati aggiunti in ogni pozzo e incubati per 2 h a 37 gradi centigradi. L'assorbimento è stato valutato a 490 nm utilizzando un lettore di lastre. - Esegui analisi funzionali per confrontare l'impatto del processo automatizzato rispetto al processo manuale sulle celle Jurkat e sulla funzione MSC.
- Coltura cellule Jurkat in una piastra di 96 pozze ad una densità di 1 x 106 cellule /mL stimolate con 50 ng/mL phorbol 12-myristate 13 acetati (PMA) e 1 g/mL ionomycin (cocktail di stimolazione cellulare) in supporti DMEM:F12 contenenti 10% siero bovino fetale (FBS) per 24 h. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.
- Misurare la produzione di interleuquiin-2 da coltura supernatant utilizzando il saggio ELISA basato su perline (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
- Colture MSC in una piastra di 12 pozzi alla densità di 10.000 cellule/cm2 in 1 mL di supporti DMEM:F12 contenenti 10% FBS integrati con l'interferone-z 50 unità/mL per 48 h. Raccogliere il solatto per il saggio di concentrazione di chinonuro per misurare l'indoleamina 2,3-diossigenasi (IDO) attività enzimatica delle MSS come descritto in precedenza21.
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Representative Results
In questo protocollo, abbiamo usato le celle Jurkat e MSC come esempi rappresentativi per dimostrare il processo di scambio automatico del buffer. Durante il processo, le cellule Jurkat e le MSC condividevano le stesse fasi di lavorazione con differenze di forza centrifuga e velocità di pompaggio che controllano la portata (Tabella 1). La figura 2 mostra le immagini rappresentative catturate dalla fotocamera di come può apparire il letto cellulare fluido durante il processo di scambio del buffer. Tipicamente, il letto cellulare fluidizzato sarà simile all'immagine in Figura 2A, dove le cellule si accumulano nel mezzo e verso la parte anteriore del cono con un piccolo spazio sulla punta della camera, dove le cellule non si accumulano e l'apertura dell'ingresso di carico della cella è visibile. Il letto cellulare fluidizzato può essere compresso (Figura 2B) quando si introduce un nuovo buffer che si trova in una diversa viscosità o densità. In questo protocollo, la velocità della pompa è stata abbassata da 30 a 35 mL/min a 20 mL/min all'inizio della fase di lavaggio. Una volta che la camera è stata riempita con il nuovo buffer, la velocità della pompa è stata riportata alla normalità per evitare celle di pelletizzazione sulla punta della camera. Una portata elevata (Figura 2C) può essere applicata per selezionare per le cellule vive perché le cellule morte sono più piccole e più leggere e possono essere forzate fuori dalla camera aumentando la portata.
Il processo automatizzato di scambio tampone è stato ottenuto concentrando prima le cellule, quindi introducendo il buffer di lavaggio, che era circa 10 x del volume del letto cellulare fluidizzato. Le celle sono state quindi formulate al volume desiderato. Questi tre passaggi di elaborazione sono stati progettati per seguire gli stessi principi di uno scambio manuale di buffer. Tipicamente, una centrifugazione a due cicli (200 x g,5 min) viene utilizzata per eseguire lo scambio manuale del buffer, in cui le cellule vengono pellettate per concentrarsi, risospese per lavarsi, quindi centrifuse di nuovo e risospese al volume finale. Il tempo di elaborazione dei processi automatizzati è stato più breve rispetto a quelli manuali (Figura 3). Il tasso di recupero tra processi manuali e automatizzati era simile sia per le celle Jurkat che per le MSC, e la fattibilità cellulare non è stata influenzata dal processo (Figura 4). La qualità cellulare è stata verificata dalla proliferazione cellulare (test MTS) e dalla produzione di citochine/enzimi. Le cellule recuperate hanno mostrato tassi di proliferazione simili tra i processi manuali e automatizzati (Figura 5A). Il livello di produzione di interleuchino2 da cellule Jurkat e l'attività IDO delle MSC erano anche comparabili tra i due gruppi (Figura 5B e 5C).
| Numero fase | Descrizione | Valvole aperte | Velocità di centrifuga (g) | Velocità della pompa (ml/min) | Trigger | |
| 1 | Tubi Prime da B ad A | A, B, K | 10 | 50 | Volume: 45 ml | |
| 2 | Riempi trapping a bolle da A a B | A, B, K | 100 | 50 (inverso) | Volume: 10 ml | |
| 3 | Prime tubing da A a D | A, D, K | 100 | 50 (inverso) | Volume: 2 ml | |
| 4 | Prime tubing da J a K | J, K | 100 | 50 | Volume: 3 ml | |
| 5 | Celle di carico – inizio iniziale da D a G | D, K, G | 1600 (Jurkat) 1500 (MSC) | 25 (Jurkat) 30 (MSC) | Volume: 100 ml | |
| 6 | Caricare le celle con bubble detect [Al rilevamento di bolle / tubi vuoti, il programma si fermerà e attenderà il comando dell'operatore, premere 'pausa' o 'next'] | A, D, K | - ultimo passo | 30 (Jurkat) 35 (MSC) | Sensore a bolle D | |
| 7 | Svuotare il supporto rimanente sulla porta D | A, D, K | - ultimo passo | - ultimo passo | Volume: 1,5 ml | |
| 8 | Celle di lavaggio 1 | A, B, K | - ultimo passo | 20 | Volume: 20 ml | |
| 9 | Aumentare la velocità di lavaggio | A, B, K | - ultimo passo | 35 | Timer: 5 secondi di rampa di velocità | |
| 10 | Celle Lavatrici 2 | A, B, K | - ultimo passo | - ultimo passo | Volume: 20 ml | |
| 11 | Prepararsi a raccogliere | J, K | - ultimo passo | - ultimo passo | Timer: 2 secondi | |
| 12 | Recuperare le celle in uscita e diluire al volume di destinazione | B, J, K | - ultimo passo | 60 (Inverti) | Volume: 10 ml | |
| Nota: ''ultimo passo' è un'opzione di impostazione per la velocità di centrifuga e velocità della pompa nella GUI. | ||||||
Tabella 1: Configurazione automatica della GUI di scambio del buffer per le celle Jurkat e le MSC.
Figura 1: Sistema di elaborazione cellulare centrifuga del controflusso. (A) Un diagramma schematico che illustra il principio della centrifugazione del controflusso. La forza del controflusso è presente in un gradiente all'interno della camera cellulare. Durante la centrifuga (freccia grigia), le cellule con diametri maggiori ricevono una forza di sedimentazione più alta, in cui le cellule raggiungono l'equilibrio della forza verso l'estremità stretta della camera, formando un letto cellulare fluido. I detriti cellulari e le piccole particelle troppo piccole per rimanere nella camera vengono lavati via. (B) Il sistema di elaborazione centrifuga del controflusso è costituito dal dispositivo di elaborazione e dal kit di elaborazione monouso. (C) La configurazione del kit monouso per il protocollo di scambio del buffer. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: letto cellulare fluido nella camera cellulare. Immagini rappresentative di un letto cellulare fluido sotto (A) medio, (B) bassa e (C) alta portata. La linea tratteggiata indica l'area del letto cellulare fluido all'interno della camera. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronto del tempo di elaborazione cellulare delle cellule Jurkat e delle MSC con l'elaborazione manuale e automatizzata. (n - 3-4 in ogni gruppo, i dati sono presentati come media - SD). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Confronto tra la vitalità delle cellule e il recupero delle cellule vive delle cellule Jurkat e delle MSC con l'elaborazione manuale e automatizzata. La vitalità cellulare (A) e il recupero delle cellule vive (B) sono stati misurati mediante il saggio di esclusione blu trypan utilizzando un contatore cellulare automatico. Il recupero delle cellule vive è stato ridotto in assenza di siero o quando sono state elaborate solo 3 x 106 o 1 x 106 celle. (n - 4-9 in ogni gruppo, i dati sono presentati come media : SD). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: proliferazione cellulare e funzione cellulare dall'elaborazione manuale e automatizzata. (A) Il saggio MTS delle cellule Jurkat e delle MSC è stato eseguito a 2, 24 e 48 h dopo lo scambio di buffer. La qualità delle cellule recuperate è stata quantificata dalla produzione di Interleukin-2 da cellule Jurkat (B) e dall'attività IDO nelle MSC (C). (n - 4-8 in ogni gruppo, i dati sono presentati come media - SD). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Stabilità del letto cellulare fluido a vari flussi. Sono stati eseguiti due processi per ogni tipo di cella. In un processo, 3 x 107 celle Jurkat o 1 x 107 MSC. Nel secondo processo, 10 volte il numero di cellule sono state utilizzate. In entrambi i processi, 10 mL di eluriato cellulare sono stati raccolti dalla porta A a varie portate utilizzando la velocità di centrifuga indicata in questo protocollo (1.600 x g per le cellule Jurkat e 1.500 x g per le MSC). Il numero di cellule nell'elutriato è stato determinato e presentato come percentuale della quantità totale di cellule caricate nella camera. (n - 3 per ogni gruppo, i dati sono presentati come media : SD). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo di scambio automatico del buffer descritto è semplice e facile da usare. Tuttavia, ci sono alcuni passaggi chiave in questo protocollo che sono critici e richiedono particolare attenzione. Nella nostra esperienza, durante l'elaborazione di celle più grandi come MSC (diametro medio 10-15 m) ogni esecuzione dovrebbe includere almeno 1 x 107 celle per ottenere un recupero ottimale delle cellule (Figura 4B). L'elaborazione di celle più piccole, come le cellule Jurkat (media di 10 m di diametro), richiede circa 3 x 107 celle per ottenere un letto cellulare fluidizzato stabile (Figura 4B). Quando il numero di cellule è troppo basso, è più probabile che le cellule vengano rimosse dal letto fluido, il che influenzerà il recupero finale della cellula. Inoltre, abbiamo confrontato i tassi di perdita cellulare a velocità di pompaggio diverse quando viene applicata una velocità centrifuga costante. Qui, abbiamo osservato che la perdita di cellule è aumentata con la portata (Figura 6), che è dovuta alla crescente instabilità del letto fluido a portate più elevate. Tuttavia, la percentuale di perdita di cellule era più bassa quando 10 volte il numero di cellule sono state caricate nella camera, il che suggerisce che una maggiore velocità della pompa può essere applicata durante l'elaborazione di un numero maggiore di celle per consentire un'elaborazione più rapida. Nella fase 5 del processo, 100 mL di supporti di coltura sono stati ricircolati dalla camera al sacchetto di trasferimento cellulare per consentire alla forma e alla stabilizzazione del letto fluido prima della riduzione del volume e allo scambio di tamponati. Se la concentrazione cellulare è bassa (ad esempio, inferiore a 0,2 x 106/mL), potrebbe essere necessario estendere la fase di ricircolo per consentire a un numero sufficiente di cellule di formare il letto cellulare fluidizzato. Allo stesso modo, se la concentrazione cellulare è elevata, la fase di ricircolo può essere accorciata.
La presenza di siero nel buffer di lavaggio è anche fondamentale per il recupero delle cellule. Studi precedenti hanno dimostrato che lo stress idrodinamico può causare la morte delle cellule necrotiche in assenza di tamponamento di proteine22,23. La dinamica di flusso del sistema centrifugo del controflusso è piuttosto complessa. In questo protocollo, i tassi di recupero delle celle sono scesi a circa il 70% quando il processo è stato eseguito in assenza di siero (Figura 4B). Anche se l'esatto meccanismo non è chiaro, la presenza di siero nei mezzi di coltura o albumina nei buffer di lavaggio è stata in grado di mitigare il potenziale danno meccanico alle cellule. Per le applicazioni che richiedono buffer senza siero, amido di idrossiet e dextran 40 sono esempi di additivi non proteici che vengono spesso utilizzati nella produzione cellulare per proteggere dallo stress idrodinamico24,25.
La tecnologia di centrifugazione a contrasto è stata utilizzata nella produzione biofarmaceutica su larga scala e nella lavorazione dei prodotti ematici17. Le applicazioni della tecnologia CFC nella produzione di celle su piccola scala (cioè da 0,1 a 10 L) sono spesso limitate all'isolamento di celle mononucleari da prodotti apheresi, come l'Elutra (Terumo BCT)26, in cui è necessario un ulteriore intervento manuale per eseguire passaggi di lavaggio e concentrazione. Altre piattaforme di elaborazione cellulare su piccola scala includono sistemi di scambio tampone basati sulla filtrazione a membrana come il LOVO (Fresenius Kabi)27 e la separazione della centrifugazione verticale come il Sepax (GE Healthcare)28. Anche se è difficile eseguire un confronto diretto tra dispositivi, uno dei vantaggi di questo dispositivo centrifugo a controflusso è la sua capacità di fornire volumi di uscita molto piccoli (minimo 5 mL), che è il più piccolo tra le piattaforme di elaborazione cellulare attualmente disponibili. Il piccolo volume di uscita è adatto per applicazioni come la formulazione di cellule per iniezioni locali29 o infusioni per neonati30. La fotocamera incorporata nel dispositivo è anche una caratteristica unica che fornisce la visualizzazione del letto cellulare fluido durante la fase di sviluppo del processo.
Uno dei limiti della tecnologia CFC è che è sensibile alle dimensioni e alla densità delle cellule. Quando si imposta un protocollo di scambio buffer per un tipo di cella diverso, il protocollo qui presentato dovrebbe servire da linea guida per gli utenti per ottimizzare in base alle loro esigenze, tenendo presente le dimensioni delle loro cellule di interesse e la densità della loro sospensione cellulare. Anche se il protocollo corrente è utilizzabile per l'elaborazione fino a 5 L di supporti, il tempo di elaborazione sarà notevolmente esteso (cioè 1–2 h). È importante notare che l'impatto del tempo di elaborazione prolungato sulla qualità delle cellule non è stato esaminato in questo studio attuale.
Studi futuri valuteranno l'impatto della velocità di elaborazione e del tempo di elaborazione sulla funzione cellulare per determinare la capacità massima di elaborazione del dispositivo. Inoltre, studi futuri possono esplorare altre applicazioni come la rimozione del solfuro dimetilo (DMSO) dai prodotti crioconservati e la rimozione selettiva delle cellule morte.
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Disclosures
SW, IF e DJ sono COO, CTO e CEO di Scinogy Pty. Ltd. L'accesso al dispositivo CFC è stato fornito anche da Scinogy.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dal programma operativo di supporto alle infrastrutture del governo vittoriano e dal voucher tecnologico del governo vittoriano fornito dal Dipartimento di Sviluppo Economico, Lavoro, Trasporti e Risorse. RL è il destinatario di una borsa di studio national Health and Medical Research Council Career Developmentship. AL ha ricevuto un Australian Postgraduate Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 | |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C | |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 | |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A | |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A | |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A | |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A | |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS | |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
References
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