Summary
Automatisering is de sleutel tot opschaling en kostenbeheer in celproductie. Dit manuscript beschrijft het gebruik van een tegenstroom centrifugale celverwerkings inrichting voor het automatiseren van de buffer uitwisseling en celconcentratie stappen voor kleinschalige bioprocessing.
Abstract
Succesvolle commercialisering van gen-en cel-gebaseerde therapieën vereist productieprocessen die kosteneffectief en schaalbaar zijn. Buffer uitwisseling en productconcentratie zijn essentiële onderdelen voor de meeste productieprocessen. In de vroege stadia van productontwikkeling worden deze stappen echter vaak handmatig uitgevoerd. Handmatige Dead-End-centrifugeren voor buffer uitwisseling is arbeidsintensieve, dure en niet schaalbaar. Een gesloten geautomatiseerd systeem kan deze moeizame stap effectief elimineren, maar de implementatie kan een uitdaging zijn. Hier beschrijven we een nieuw ontwikkeld apparaat voor celverwerking dat geschikt is voor kleine tot middelgrote celverwerking en is bedoeld om de kloof tussen handmatige verwerking en grootschalige automatisering te overbruggen. Dit protocol kan eenvoudig worden toegepast op verschillende celtypen en processen door het debiet en de centrifugeersnelheid te wijzigen. Ons protocol toonde een hoog celherstel met Kortere verwerkingstijden in vergelijking met het handmatige proces. Cellen hersteld van het geautomatiseerde proces ook gehandhaafd hun proliferatie tarieven. Het apparaat kan worden toegepast als een modulair onderdeel in een gesloten fabricageproces om stappen zoals buffer uitwisseling, celformulering en cryopreservation te accommoderen.
Introduction
Het landschap van de moderne geneeskunde is snel getransformeerd door recente ontwikkelingen in genand Cell-based therapieën (GCT). Als een van de snelst groeiende velden in translationeel onderzoek, wordt de GCT-sector ook geconfronteerd met unieke en ongekende uitdagingen. Naast robuuste klinische uitkomsten zijn efficiënte en kosteneffectieve productieprocessen essentieel voor het commerciële succes van GCT, dat bijzonder moeilijk te bereiken is in kleinschalige productie1. De kosten van tijd, arbeid en kwaliteitsgaranties worden vergroot wanneer elke batch cellen slechts een paar doses voor één patiënt produceert in plaats van honderden of duizenden. In tegenstelling tot allogene celtherapieën waarbij de productieprocessen meer verwant zijn aan de productie van antilichamen en recombinant eiwitten, worden autologe celtherapieën meestal geproduceerd als kleinschalige operaties1. Als een relatief nieuw fenomeen in biofarmaceutische productie2zijn opties voor kleinschalige celverwerking momenteel vrij beperkt.
Buffer uitwisseling is essentieel voor de productie van cellen. Het is een van de downstream processen waar cellen worden verwijderd uit de cultuur media en geconcentreerd voor cryopreservatie of infusie. Op dit moment past kleinschalige celfabricage vaak processen toe die vergelijkbaar zijn met die in de academische onderzoeksinstelling en vertrouwt op gespecialiseerde schone kamers om steriliteit3te handhaven. Handmatige downstream processen gebruiken vaak tafel-centrifuges voor pellet-en respendeer cellen voor volume reductie en buffer uitwisseling. Deze open processen zijn kostbaar (d.w.z. het onderhoud van werk en schone kamers) en hebben een beperkte productiecapaciteit, die niet ideaal zijn voor commerciële productie2,3.
De implementatie van automatisering is voorgesteld als een oplossing voor het verbeteren van de productie-efficiëntie en het behalen van commerciële schaal producties2. Steriliteit kan niet worden bereikt in op cellen gebaseerde producten via traditionele methoden die worden gebruikt voor Biologics, zoals gammastraling of terminale filtratie. In plaats daarvan wordt een geautomatiseerd gesloten systeem ingezet om de Risico's van verontreiniging te verminderen en exploitanten die vertrouwen op schone ruimten om steriliteit4te handhaven. Procesautomatisering lost ook de kwestie van schaalbaarheid op door ofwel meerdere systemen parallel (scale-out) te hebben of de verwerkingscapaciteit van een afzonderlijk apparaat (scale-up) te vergroten, wat op zijn beurt de variabiliteit tussen operators minimaliseert. Bovendien suggereert kostenmodellering analyse van autologe therapieën dat automatisering de kosten van de productie van5,6kan verminderen. Er werd echter geen kostenvoordeel gevonden in een autologe stamcel klinische proef waarbij een geautomatiseerd fabricage platform werd gebruikt7, wat suggereert dat het kostenvoordeel van automatisering kan afhangen van het individuele fabricageproces.
Er zijn verschillende strategieën waarin automatisering kan worden geïntroduceerd in een bestaand productieproces. Dit kan worden bereikt door het implementeren van een volledig geïntegreerd platform of een modulaire verwerkingsketen. Er zijn verschillende volledig geïntegreerde platforms die commercieel beschikbaar zijn voor autologe celproductie, zoals CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) en Quantum (Terumo BCT). Deze geïntegreerde platforms, die vaak worden omschreven als "GMP-in-a-Box", hebben lage eisen aan infrastructuur en zijn eenvoudig te bedienen. De productiecapaciteit van een volledig geïntegreerde installatie kan echter worden beperkt door de incubator die aan het systeem is bevestigd. Zo is het kweek vermogen van Prodigy beperkt tot zijn 400 ml kamer8 en heeft de Quantum cartridge een begrenzings oppervlak ingesteld op 2,1 m2 (overeenkomend met 120 T175 kolven)7, wat mogelijk niet voldoende is voor patiënten die hogere celdoses9,10nodig hebben. Daarnaast hebben Prodigy en Quantum een gemeenschappelijk attribuut dat het gebruik ervan beperkt: de operationele eenheid wordt bezet door een enkele partij cellen gedurende de celuitbreidingsperiode, waardoor het aantal batches dat door elke eenheid kan worden geproduceerd11wordt beperkt. De modulaire aanpak van automatisering is het creëren van een productieketen met meerdere modulaire units die het commerciële productieproces van12,13simuleert. Deze aanpak, die het cultuur apparaat van de celwasinrichting scheidt, kan daardoor de efficiëntie van de productie maximaliseren. Een ideaal verwerkings apparaat zou er een zijn die aanpasbaar en schaalbaar is voor productiebehoeften12.
Tegenstroom centrifugeren (CFC) technologie, die dateert uit de jaren 1970, heeft een lange geschiedenis in cel verwerking14. Het bereikt celconcentratie en scheiding door centrifugale kracht te balanceren met een tegenstroom kracht. Normaalgesproken komt een celsuspensie van het smalle uiteinde van een celkamer onder een constant debiet terwijl het wordt onderworpen aan een centrifugale kracht (Figuur 1a). De stroom van de vloeistof wordt uitgeoefend in de tegenovergestelde richting van de centrifugale kracht. Dit wordt de tegenstroom kracht genoemd, die een gradiënt vormt binnen de cel kamer. De tegenstroom kracht neemt dan af naarmate de celkamer uit de punt van de kegelvormige celkamer verwijdt. Cellen met een hogere dichtheid en een grotere diameter hebben een hogere sedimentatie snelheid, waardoor ze een kracht evenwicht bereiken naar de punt van de kegelvormige celkamer. Kleinere deeltjes kunnen een evenwicht bereiken naar de basis van de kamer of te klein zijn om in de kamer te worden bewaard en zullen worden weggespoeld. De CFC-technologie is vooral bekend om zijn toepassing bij de verwerking van bloed aferese producten, zoals het isoleren van monocyten voor dendritische celtherapieën15,16. In termen van buffer uitwisseling is de CFC-technologie alleen toegepast in grootschalige productie17 en moet deze nog worden gebruikt voor de kleinschalige productie van autologe celtherapieën.
Om de noodzaak van een geschikt apparaat voor kleinschalige celfabricage aan te pakken, werd onlangs een geautomatiseerd CFC-apparaat (Zie tabel van de materialen) ontwikkeld18. Het geautomatiseerde celverwerkings apparaat maakt gebruik van de technologie voor het verwijderen van het celafval en vergemakkelijkt de buffer uitwisseling. Het apparaat voert buffer uitwisseling uit met een Kit voor eenmalig gebruik die steriel kan worden aangesloten op een zak voor het overbrengen van een cel, waardoor de cellen in een steriel, ingesloten systeem kunnen worden verwerkt. Hier onderzoeken we het gebruik van een tegenstroom centrifugale apparaat om buffer uitwisseling in zoogdier celculturen in geautomatiseerde protocollen uit te voeren. In deze studie testten we het protocol voor buffer uitwisseling met behulp van Jurkat-cellen en mesenchymale stromale cellen (MSCs) om respectievelijk niet-aanhandige en aanhandige celtypen te modelleren. Jurkat cellen zijn vereeuwigd t cellen vaak gebruikt voor de studie van acute T-cel leukemie19,20. MSCs zijn volwassen stamcellen die zijn bestudeerd in menselijke klinische studies voor een breed scala aan ziekten9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van reagentia en cellen voor buffer uitwisseling
- Buffers voorbereiden (Zie tabel met materialen) in een klasse 2 laminaire stroom afzuigkap. Verwijder met behulp van een spuit en naald assemblage 50 mL zoutoplossing uit een 500 mL zoute zak. Vervang dit met 50 mL van 20% humaan serumalbumine (HSA) om 2% HSA in zoutoplossing te maken, die als de wasbuffer dient.
- Verwijder de cellen uit de kweekvaten en voer een celtelling uit om de Beginhoeveelheid van de cel en de levensvatbaarheid te bepalen door trypeen blauwe uitsluiting. Laad de cellen in een transferzak.
Opmerking: in dit protocol werden de cellen van Jurkat gecultiveerde in RPMI en MSCs werden gekweekt in DMEM: F12. Beide media werden aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum-Antimycotische oplossing. Cellen werden gekweekt bij 37 ° c met 5% CO2. Voeg voor MSCs of aanhandige cellen een verterings enzym (bijv. trypsine) toe aan de kweekvaten om de cellen los te maken en te doven met cultuur media zodra de cellen zijn losgemaakt. In dit protocol werd een transferzak gebruikt omdat de cellen in kweekvaten werden uitgebreid. Echter, als de cellen worden gekweekt in een cel cultuur zak, het kan direct worden aangesloten op de Kit voor eenmalig gebruik via steriele buislassen. In dit protocol werden 3 x 107 jurkat cellen of 1 x 107 MSCS gebruikt voor elke run, waarbij cellen werden opgeschort in 40 ml cultuur media.- Laadcellen in een transferzak (Zie tabel met materialen) met behulp van een spuit en naald assemblage als er een steriele buis lasser beschikbaar is om de transferzak aan te sluiten op de single-use processing Kit.
- U ook een paar geautoclaveerd schaar gebruiken om de verbindingsbuis te knippen met ongeveer 10 cm resten die aan de transferzak zijn bevestigd en een vrouwelijke Luer connector aan het uiteinde van de slang toe te voegen. Gebruik een spuit om cellen en media te aspireren, sluit de spuit vervolgens aan op de Luer-connector en laadcellen in de transferzak.
- Sluit de zak met de cellen, was buffer zakje met 500 mL wasbuffer bereid in stap 1,1, Afvalzak, en het verzamelen van de spuit aan de Kit voor eenmalig gebruik (Figuur 1B).
Opmerking: de verbindingspositie van elke zak is afhankelijk van de instellingen in het programma. In dit protocol hebben we de Afvalzak op positie A aangesloten, was buffer op positie B, celzak op posities D en F, en verzamel spuit op positie H (Figuur 1C).
2. programma voor geautomatiseerd buffer Exchange protocol
- Open de grafische gebruikers interface (GUI) van het apparaat en druk op de "StarT" knop op een laptop PC of Tablet. Vervolgens "Open" een bestaand protocol of druk op "Nieuw" om een nieuwe te maken.
- Gebruik de knop "vooruit" en "achterwaarts" om door elke stap te navigeren, selecteer de kleppen die geopend/gesloten moeten worden, centrifugale snelheid, pompsnelheid, pomp richting en actie triggers. De instellingen voor elke stap worden samengevat in tabel 1. Sla het protocol vervolgens op.
3. de machine instellen
- Plaats de verwerkings Kit voor eenmalig gebruik op de machine en hang de aangesloten zakken dienovereenkomstig op. Druk op de rode "Stop/reset" knop om alle kleppen in de standaard gesloten positie te resetten.
Opmerking: de machine voert een test uit wanneer de deur gesloten is om ervoor te zorgen dat de kit correct is geplaatst en dat alle kleppen naar behoren functioneren. - Verbind de GUI met het verwerkings apparaat en druk op de "Connect"-knop. Download dan het opgeslagen programma. Wanneer de groene "Play" knop oplicht, geeft dit aan dat het protocol klaar is om te starten.
- Open de handmatige klemmen voor de transferzak slang.
Opmerking: als de operator vergeet de klemmen te openen, zal het apparaat stoppen en de druksensor waarschuwing verschijnen. Druk op de "Stop" knop om het toestel te resetten en open de klemmen om opnieuw te beginnen.
4. geautomatiseerde buffer uitwisseling
- Druk op "Start" om het programma voor buffer uitwisseling te starten.
Opmerking: om het geautomatiseerde proces handmatig te wijzigen, druk op de knop "volgende" om naar de volgende stap te gaan voordat u de "trigger" bereikt of druk op "pause" om het proces in de wacht te zetten. Dit zal de cellen door de kit recirculeren terwijl alleen kleppen J en K open blijven (Figuur 1C). - Aan het einde van de automatisering stap 6 (tabel 1), het proces zal pauzeren wanneer lucht in de nu geleegd tas activeert de Bubble sensor. Druk op "Next" om het proces naar de volgende stap te verplaatsen als de tas inderdaad leeg is of druk op "pause" om de verwerking te hervatten als de sensor werd geactiveerd door een bubbel in de lijn.
5. de cellen verzamelen en bemonsteren
- Wanneer het geautomatiseerde proces is voltooid, sluit alle slangklemmen. Open de deur en neem de set voor eenmalig gebruik uit het apparaat. Koppel de spuit los om de cellen voor volgende processen te verzamelen. Neem een monster van de verzamelde cellen voor een celtelling en levensvatbaarheid controle (zie stap 6,2).
6. validatie van het proces
- Voer controle experimenten uit met een handmatig protocol voor buffer uitwisseling.
- Centrifuge celsuspensie bij 200 x g gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg en regeer de cellen met 30 ml cel wasbuffer. Centrifugeer de celsuspensie nogmaals bij 200 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en revoer de cellen opnieuw uit met 10 ml cel wasbuffer.
- Voer het tellen van cellen uit via de trypan Blue-uitsluitings test om de levensvatbaarheid van de cellen te beoordelen met behulp van een geautomatiseerde teller.
- Voer een MTS-assay uit om celproliferatie te kwantificeren op 2, 24 en 48 h.
Opmerking: de MTS assay werd uitgevoerd op een 96 goed weefselkweek plaat volgens de instructies van de fabrikant. Een hoeveelheid celkweek media van 100 μL (bevattende 10.000 Jurkat cellen of 1.500) per put werden na het proces van de buffer wisseling geplateerd. Op elk moment werden 20 μL MTS-reagentia in elk goed toegevoegd en gedurende 2 uur geïnineerd bij 37 °C. De extinctie werd beoordeeld op 490 nm met behulp van een plaat lezer. - Voer functionele testen uit om de impact van het geautomatiseerde proces te vergelijken met het handmatige proces op de Jurkat-cellen en MSC-functie.
- Cultuur jurkat cellen in een 96-goed bord met een dichtheid van 1 x 106 cellen/ml gestimuleerd met 50 ng/ml forbol 12-Myristate 13-acetaat (PMA) en 1 μg/ml ionomycine (Cell stimulatie cocktail) in DMEM: F12-media met 10% foetaal runderserum (FBS) gedurende 24 uur. inincuberen van de cellen bij 37 °c met 5% Co2.
- Meet de productie van Interleukine-2 van Culture supernatant met behulp van een op kraal gebaseerde ELISA-test (Zie tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
- Cultuur MSCs in een 12-put plaat bij de dichtheid van 10.000 cellen/cm2 in 1 ml van de DMEM: F12-media met 10% FBS aangevuld met interferon-γ 50 eenheden/mL voor 48 h. Verzamel supernatant voor de kynurenine concentratie test om Indoleamine 2, 3-dioxygenase (Ido) enzymactiviteit van MSCS te meten zoals eerder beschreven21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit protocol gebruikten we Jurkat-cellen en MSCs als representatieve voorbeelden om het geautomatiseerde buffer uitwisselingsproces aan te tonen. Tijdens het proces deelden Jurkat-cellen en MSCs dezelfde verwerkingsstappen met verschillen in centrifugale kracht en pompsnelheid die de stroomsnelheid regelen (tabel 1). Figuur 2 toont representatieve beelden die zijn vastgelegd door de camera van hoe het wervelbed van de cel kan verschijnen tijdens het proces van de buffer wisseling. Normaalgesproken zal het wervelbed van de cel lijken op de afbeelding in Figuur 2A, waar cellen zich ophopen in het midden en naar de voorkant van de kegel met een kleine ruimte aan de punt van de kamer, waar de cellen niet accumuleren en de opening van de cel laden inlaat zichtbaar is. Het wervelbed van de cel kan worden gecomprimeerd (Figuur 2B) bij de introductie van een nieuwe buffer met een andere viscositeit of dichtheid. In dit protocol werd de pompsnelheid verlaagd van 30 – 35 mL/min naar 20 mL/min aan het begin van de wasstap. Zodra de kamer gevuld was met de nieuwe buffer, werd de pompsnelheid weer normaal om peen cellen aan de punt van de kamer te voorkomen. Een hoog debiet (Figuur 2C) kan worden toegepast om te selecteren voor levende cellen, omdat dode cellen kleiner en lichter zijn en uit de kamer kunnen worden geforceerd door de stroomsnelheid te verhogen.
Het geautomatiseerde proces van buffer uitwisseling werd bereikt door eerst de cellen te concentreren en vervolgens de wasbuffer te introduceren, die rond de 10x van het volume van het wervelbed van de cel lag. De cellen werden vervolgens naar het gewenste volume geformuleerd. Deze drie verwerkingsstappen zijn ontworpen om dezelfde principes te volgen als een handmatige buffer uitwisseling. Kenmerkend is dat een twee-cyclus centrifugeren (200 x g, 5 min) wordt gebruikt om handmatige buffer uitwisseling uit te voeren, waarbij cellen worden gepelleteerd om zich te concentreren, geresuspendeerd om te wassen, vervolgens opnieuw gecentrifugeerd en geresuspendeerd tot het uiteindelijke volume. De verwerkingstijd van de geautomatiseerde processen was korter in vergelijking met de manuele (Figuur 3). Het herstelpercentage tussen handmatige en geautomatiseerde processen was vergelijkbaar voor Jurkat-cellen en-MSCs, en de levensvatbaarheid van de cellen werd niet beïnvloed door het proces (Figuur 4). De celkwaliteit werd geverifieerd door celproliferatie (MTS assay) en cytokine/enzymproductie. De herstelde cellen vertoonden vergelijkbare proliferatie percentages tussen de handleiding en de geautomatiseerde processen (Figuur 5A). Het niveau van de Interleukine-2 productie van Jurkat cellen en IDO activiteit van MSCs waren ook vergelijkbaar tussen de twee groepen (Figuur 5B en 5C).
| Stap nummer | Beschrijving | Open kleppen | Centrifugeersnelheid (g) | Pompsnelheid (ml/min) | Triggers | |
| 1 | Priem slangen van B naar A | A, B, K | 10 | 50 | Volume: 45 ml | |
| 2 | Vul de bubbel Vanger van A naar B | A, B, K | 100 | 50 (achteruit) | Inhoud: 10 ml | |
| 3 | Priem slang A tot D | A, D, K | 100 | 50 (achteruit) | Inhoud: 2 ml | |
| 4 | Prime tubing J tot K | J, K | 100 | 50 | Inhoud: 3 ml | |
| 5 | Load cells-initiële Start D naar G | D, K, G | 1600 (jurkat) 1500 (MSCs) | 25 (jurkat) 30 (MSCs) | Volume: 100 ml | |
| 6 | Load cellen met Bubble detect [bij de detectie van bellen/lege slangen, het programma zal pauzeren en wachten op de opdracht van de operator, druk op ' Pause ' of ' volgende '] | A, D, K | = laatste stap | 30 (jurkat) 35 (MSCs) | Bubble sensor D | |
| 7 | Resterende media op poort D-buis leegmaken | A, D, K | = laatste stap | = laatste stap | Volume: 1,5 ml | |
| 8 | Spoel cellen 1 | A, B, K | = laatste stap | 20 | Inhoud: 20 ml | |
| 9 | Opramping van de wassnelheid | A, B, K | = laatste stap | 35 | Timer: 5 seconden snelheid hellend frezen | |
| 10 | Was de cellen 2 | A, B, K | = laatste stap | = laatste stap | Inhoud: 20 ml | |
| 11 | Bereid je voor op de oogst | J, K | = laatste stap | = laatste stap | Timer: 2 seconden | |
| 12 | Herstel cellen naar output en Verdun tot doelvolume | B, J, K | = laatste stap | 60 (achteruit) | Inhoud: 10 ml | |
| Opmerking: ' = laatste stap ' is een insteloptie voor centrifugeren snelheid en pompsnelheid in de GUI. | ||||||
Tabel 1: automatische buffer uitwisseling GUI Setup voor Jurkat cellen en MSCs.
Figuur 1: centrifugale celverwerkings systeem tegenstroom. A) eenschematisch diagram dat het principe van de tegenstroom centrifugeren illustreert. De tegenstroom kracht is aanwezig in een gradiënt in de celkamer. Bij het centrifugeren (grijze pijl) krijgen cellen met grotere diameters een hogere sedimentatie kracht, waarbij de cellen een evenwicht bereiken naar het smalle uiteinde van de kamer, waarbij een wervelbed wordt gevormd. Celresten en kleine deeltjes die te klein zijn om in de kamer te blijven, worden weggewassen. B) het centrifugale verwerkingssysteem voor de tegenstroming bestaat uit het verwerkings apparaat en de verwerkings Kit voor eenmalig gebruik. (C) de configuratie voor eenmalig gebruik voor het protocol voor buffer uitwisseling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: wervelbed in de celkamer. Representatieve beelden van een wervelbed van een cel onder (a) gemiddeld, (B) laag en (C) hoog debiet. De stippellijn geeft het gebied aan van het wervelbed in de kamer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: vergelijking van de celverwerkings tijd van Jurkat-cellen en-MSCs met handmatige en geautomatiseerde verwerking. (n = 3 – 4 in elke groep worden de gegevens weergegeven als gemiddelde ± SD). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: vergelijking van de levensvatbaarheid van de cel en het herstel van de levende cellen van Jurkat-cel en-MSCs met handmatige en geautomatiseerde verwerking. De levensvatbaarheid van de cellen (A) en het herstel van de levende cellen (B) werden gemeten met een trypaanse blauwe uitsluitings test met behulp van een geautomatiseerde celteller. Het herstel van de levende cellen werd verminderd bij afwezigheid van serum of wanneer slechts 3 x 106 of 1 x 106 cellen werden verwerkt. (n = 4 – 9 in elke groep worden gegevens weergegeven als gemiddelde ± SD). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: celproliferatie en celfunctie van handmatige en geautomatiseerde verwerking. A) de MTS-assay van jurkat-cellen en-MSCS werd uitgevoerd op 2, 24 en 48 h na buffer wisseling. De kwaliteit van de herstelde cellen werd gekwantificeerd door de Interleukine-2-productie van Jurkat-cellen (B), en Ido-activiteit in MSCS (C). (n = 4 – 8 in elke groep worden de gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SD). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: wervelde celbedstabiliteit bij verschillende stromingssnelheid. Voor elk celtype zijn twee processen uitgevoerd. In één proces, ofwel 3 x 107 jurkat cellen of 1 x 107 MSCS. In het tweede proces, 10x het aantal cellen werden gebruikt. In beide processen werd 10 mL celelutriate verzameld van haven A bij verschillende stromings percentages met behulp van de centrifugerende snelheid zoals aangegeven in dit Protocol (1.600 x g voor jurkat cellen en 1.500 x g voor MSCS). Het aantal cellen in het elutriaat werd bepaald en gepresenteerd als percentage van de totale hoeveelheid cellen die in de kamer werden geladen. (n = 3 voor elke groep worden de gegevens weergegeven als gemiddelde ± SD). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol voor automatische buffer uitwisseling dat wordt beschreven, is eenvoudig en gebruiksvriendelijk. Niettemin zijn er een paar belangrijke stappen in dit protocol die kritisch zijn en bijzondere aandacht vereisen. In onze ervaring, bij de verwerking van grotere cellen zoals MSCs (gemiddelde diameter 10 – 15 μm) elke run moet bevatten ten minste 1 x 107 cellen om optimale celherstel te bereiken (Figuur 4B). Het verwerken van kleinere cellen, zoals Jurkat cellen (gemiddelde ~ 10 μm diameter), vereist ongeveer 3 x 107 cellen om een stabiel wervelbaar celbed te bereiken (Figuur 4B). Wanneer het celnummer te laag is, zullen cellen eerder worden verwijderd uit het wervelbed, wat het uiteindelijke celherstel beïnvloedt. Bovendien vergeleken we de celverlies snelheden bij verschillende pompsnelheden wanneer een constante centrifugale snelheid wordt toegepast. Hier hebben we geconstateerd dat het celverlies toenam met de stroomsnelheid (Figuur 6), wat te wijten is aan de toenemende instabiliteit van het wervelbed bij hogere stroomsnelheden. Het percentage celverlies was echter lager toen 10x het aantal cellen in de kamer werd geladen, wat suggereert dat een hogere pompsnelheid kan worden toegepast bij het verwerken van een groter aantal cellen om snellere verwerking mogelijk te maken. In stap 5 van het proces werd 100 mL kweekmedia gerecregeerd van de kamer terug naar de cel Transfer zak zodat het wervelbed te vormen en te stabiliseren vóór volume reductie en buffer uitwisseling. Als de celconcentratie laag is (bijvoorbeeld onder 0,2 x 106/ml), moet de recirculatie stap mogelijk worden verlengd om voldoende cellen te kunnen vormen van het wervelbed van de cel. Evenzo, als de celconcentratie hoog is, kan de recirculatie stap worden verkort.
De aanwezigheid van serum in de wasbuffer is ook van cruciaal belang voor het herstel van cellen. Eerdere studies hebben aangetoond dat hydrodynamische stress necrotische celdood kan veroorzaken bij afwezigheid van buffer eiwitten22,23. De stromings dynamiek van het tegenstroom centrifugale systeem is vrij complex. In dit protocol, cel herstel percentages daalde tot ongeveer 70% wanneer het proces werd uitgevoerd in de afwezigheid van serum (Figuur 4B). Hoewel het precieze mechanisme niet duidelijk is, was de aanwezigheid van serum in kweekmedia of albumine in wasbuffers in staat om de potentiële mechanische schade aan de cellen te verzachten. Voor toepassingen waarvoor serum vrije buffers nodig zijn, zijn hydroxyethyl zetmeel en dextran 40 voorbeelden van niet-eiwit additieven die vaak worden gebruikt in de productie van cellen om te beschermen tegen hydrodynamische stress24,25.
Tegenstroom centrifugeren technologie is gebruikt in grootschalige biofarmaceutische productie en verwerking van bloedproducten17. De toepassingen van CFC-technologie in kleinschalige celproductie (d.w.z. 0,1 – 10 L) zijn vaak beperkt tot het isoleren van mononucleaire cellen van aferese producten, zoals de Elutra (Terumo BCT)26, waarbij extra manuele interventie nodig is om de stappen voor wassen en concentreren uit te voeren. Andere kleinschalige celverwerkende platformen omvatten op membraanfiltratie gebaseerde buffer wisselsystemen zoals de LOVO (Fresenius Kabi)27 en verticale centrifugeren scheiding zoals de SEPAX (GE Healthcare)28. Hoewel het moeilijk is om een directe vergelijking tussen apparaten uit te voeren, is een van de voordelen van dit centrifugaalsysteem de capaciteit om zeer kleine uitgangs volumes (minimaal 5 mL) te leveren, wat de kleinste is onder de momenteel beschikbare celverwerkings platformen. Het kleine uitgangsvolume is geschikt voor toepassingen zoals het formuleren van cellen voor lokale injecties29 of infusies voor neonaten30. De camera die is ingebed in het apparaat is ook een unieke functie die visualisatie van de wervelbed van de cel tijdens het proces ontwikkelingsfase biedt.
Een van de beperkingen van de CFC-technologie is dat het gevoelig is voor de grootte en dichtheid van de cellen. Bij het instellen van een protocol voor buffer uitwisseling voor een ander celtype, moet het hier gepresenteerde Protocol dienen als richtsnoer voor gebruikers om te optimaliseren op basis van hun behoeften, rekening houdend met de grootte van hun cellen van belang en de dichtheid van hun celsuspensie. Hoewel het huidige protocol bruikbaar is voor het verwerken van maximaal 5 L media, zal de verwerkingstijd aanzienlijk worden verlengd (d.w.z. 1 – 2 h). Het is belangrijk op te merken dat de impact van verlengde verwerkingstijd op celkwaliteit niet is onderzocht in deze huidige studie.
Toekomstige studies zullen de impact van de verwerkingssnelheid en de verwerkingstijd op de celfunctie evalueren om de maximale verwerkingscapaciteit van het apparaat te bepalen. Verder kunnen toekomstige studies andere toepassingen onderzoeken, zoals het verwijderen van Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) uit cryopreserved producten en selectieve verwijdering van dode cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SW, IF en DJ zijn COO, CTO en CEO van Scinogy Pty. Ltd. De toegang tot het CFC-apparaat werd ook geleverd door Scinogy.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door het operationele infrastructuur ondersteuningsprogramma van de Victoriaanse overheid, en de Victoriaanse overheids technologie voucher die wordt verstrekt door het ministerie van economische ontwikkeling, banen, vervoer en hulpbronnen. RL is de ontvanger van een nationale gezondheids-en medische Onderzoeksraad loopbaanontwikkeling Fellowship. AL is de winnaar van een Australische postdoctorale onderscheiding.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 | |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C | |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 | |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A | |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A | |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A | |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A | |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS | |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
References
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
- Hampson, B., Ceccarelli, J. Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here? BioProcess International. 14 (4), (2016).
- Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. Mapping success for commercial cell therapy manufacturing. BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).
- Heathman, T. R., et al. The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges. Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).
- Lipsitz, Y. Y., et al. A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products. Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2. BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).
- Hanley, P. J., et al. Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System. Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).
- Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like? Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).
- Galipeau, J., Sensebe, L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
- Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry? Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).
- James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
- Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies. Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).
- Rafiq, Q. A. Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture. Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).
- Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE). Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).
- Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra™) for clinical-scale generation of dendritic cells. Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).
- Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study. Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).
- Whitford, W. G. Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. Subramanian, G. , (2014).
- Scinogy. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH & CONCENTRATION. , https://www.scinogy.com/projects (2019).
- Yu, D., et al. Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule. Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).
- Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways. Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).
- Ling, W., et al. Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment. Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).
- Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Zhu, F., et al. Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products. Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).
- Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch. Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).
- Stroncek, D. F., et al. Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies. Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).
- Mfarrej, B., et al. Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts. Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).
- Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation. Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).
- Lim, R., et al. First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study. Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).
