Summary
L'automatisation est essentielle à la mise à l'échelle et à la gestion des coûts dans la fabrication de cellules. Ce manuscrit décrit l'utilisation d'un dispositif de traitement centrifuge de contre-flux pour automatiser l'échange de tampons et les étapes de concentration cellulaire pour le biotraitement à petite échelle.
Abstract
La commercialisation réussie des thérapies géniques et cellulaires nécessite des procédés de fabrication rentables et évolutifs. L'échange de tampons et la concentration des produits sont des composants essentiels pour la plupart des procédés de fabrication. Cependant, aux premiers stades du développement du produit, ces étapes sont souvent effectuées manuellement. La centrifugation manuelle sans issue pour l'échange de tampons est laborieuse, coûteuse et non évolutive. Un système automatisé fermé peut effectivement éliminer cette étape laborieuse, mais la mise en œuvre peut être difficile. Ici, nous décrivons un dispositif de traitement cellulaire nouvellement développé qui convient au traitement cellulaire à petite et moyenne échelle et vise à combler l'écart entre le traitement manuel et l'automatisation à grande échelle. Ce protocole peut être facilement appliqué à divers types et processus cellulaires en modifiant le débit et la vitesse de centrifugation. Notre protocole a démontré la récupération élevée de cellules avec des temps de traitement plus courts par rapport au processus manuel. Les cellules récupérées du processus automatisé ont également maintenu leurs taux de prolifération. L'appareil peut être appliqué comme un composant modulaire dans un processus de fabrication fermé pour accueillir des étapes telles que l'échange de tampons, la formulation cellulaire, et la cryoconservation.
Introduction
Le paysage de la médecine moderne s'est rapidement transformé grâce aux développements récents des thérapies géniques et cellulaires (TCM). En tant que l'un des domaines de la recherche translationnelle qui connaît la croissance la plus rapide, le secteur de la GCT est également confronté à des défis uniques et sans précédent. En plus des résultats cliniques robustes, des procédés de fabrication efficaces et rentables sont essentiels au succès commercial de GCT, qui est particulièrement difficile à réaliser dans la fabrication à petite échelle1. Le coût du temps, du travail et des assurances de qualité est amplifié lorsque chaque lot de cellules ne produit que quelques doses pour un patient au lieu de centaines ou de milliers. Contrairement aux thérapies cellulaires allogéniques dans lesquelles les processus de fabrication s'apparentent davantage à la production d'anticorps et de protéines recombinantes, les thérapies cellulaires autologues sont généralement produites sous forme d'opérations à petite échelle1. Comme un phénomène relativement nouveau dans la fabrication biopharmaceutique2, les options pour le traitement des cellules à petite échelle sont actuellement assez limitées.
L'échange de tampons est essentiel à la fabrication de cellules. C'est l'un des processus en aval où les cellules sont retirées des cultures et concentrées pour la cryoconservation ou l'infusion. À l'heure actuelle, la fabrication de petites cellules applique souvent des procédés semblables à ceux du milieu de la recherche universitaire et s'appuie sur des salles blanches spécialisées pour maintenir la stérilité3. Les processus manuels en aval utilisent souvent des centrifugeuses de banc pour granuler et resuspendre les cellules pour la réduction du volume et l'échange de tampons. Ces procédés ouverts sont coûteux (c.-à-d., la main-d'œuvre et l'entretien de la pièce propre) et ont une capacité de fabrication limitée, qui ne sont pas idéales pour la production commerciale2,3.
La mise en œuvre de l'automatisation a été proposée comme solution pour améliorer l'efficacité de la fabrication et réaliser des productions à l'échelle commerciale2. La stérilité ne peut pas être atteinte dans les produits à base de cellules par des méthodes traditionnelles utilisées pour les produits biologiques, tels que l'irradiation gamma ou la filtration terminale. Au lieu de cela, un système fermé automatisé est déployé pour réduire les risques de contamination et les opérateurs comptent sur des salles propres pour maintenir la stérilité4. L'automatisation des processus aborde également la question de l'évolutivité en ayant plusieurs systèmes fonctionnant en parallèle (échelle) ou en augmentant la capacité de traitement d'un appareil individuel (mise à l'échelle), ce qui minimise la variabilité entre les opérateurs. En outre, l'analyse de modélisation des coûts des thérapies autologues suggère que l'automatisation peut réduire le coût de fabrication5,6. Cependant, aucun avantage de coût n'a été trouvé dans un essai clinique autologous de cellules souches où une plate-forme automatisée de fabrication a été employée7,suggérant que l'avantage de coût de l'automatisation peut dépendre du processus individuel de fabrication.
Il existe différentes stratégies dans lesquelles l'automatisation peut être introduite dans un processus de fabrication existant. Cela peut être réalisé soit en mettant en œuvre une plate-forme entièrement intégrée, soit en tant que chaîne de traitement modulaire. Il existe plusieurs plates-formes entièrement intégrées disponibles dans le commerce pour la fabrication de cellules autologues, telles que CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) et Quantum (Terumo BCT). Ces plates-formes intégrées, souvent décrites comme « GMP-in-a-box », ont peu de demandes d'infrastructure et sont faciles à utiliser. Toutefois, la capacité de fabrication d'une configuration entièrement intégrée peut être limitée par l'incubateur attaché au système. Par exemple, la capacité de culture de Prodigy est limitée à sa chambre8 de 400 ml et la cartouche Quantum a une surface limitante fixée à 2,1 m2 (équivalent à 120 flacons T175)7, ce qui peut ne pas être suffisant pour les patients nécessitant des doses cellulaires plus élevées9,10. En outre, Prodigy et Quantum ont un attribut commun qui limite leur utilisation: l'unité opérationnelle est occupée par un seul lot de cellules tout au long de la période d'expansion cellulaire, limitant ainsi le nombre de lots qui peuvent être fabriqués par chaque unité11. L'approche modulaire de l'automatisation est de créer une chaîne de fabrication avec plusieurs unités modulaires qui simule le processus de fabrication commerciale12,13. Cette approche, qui sépare le dispositif de culture du dispositif de lavage de cellules, peut ainsi maximiser l'efficacité de fabrication. Un dispositif de traitement idéal serait celui qui est adaptable et évolutif aux besoins de fabrication12.
La technologie de centrifugation de contre-flux (CFC), qui remonte aux années 1970, a eu une longue histoire dans le traitement cellulaire14. Il atteint la concentration cellulaire et la séparation en équilibrant la force centrifuge avec une force de contre-flux. Typiquement, une suspension cellulaire entre de l'extrémité étroite d'une chambre cellulaire sous un débit constant alors qu'elle est soumise à une force centrifuge (figure 1A). Le flux du fluide est exercé dans la direction opposée à la force centrifuge. C'est ce qu'on appelle la force de contre-flux, qui forme un gradient dans la chambre cellulaire. La force de contre-flux diminue alors que la chambre cellulaire s'élargit loin de la pointe de la chambre cellulaire en forme de cône. Les cellules avec une densité plus élevée et un diamètre plus grand ont un taux de sédimentation plus élevé, et ainsi elles atteignent l'équilibre de force vers la pointe de la chambre cellulaire en forme de cône. Les particules plus petites peuvent atteindre l'équilibre vers la base de la chambre ou être trop petites pour être retenues dans la chambre et seront emportées. La technologie CFC est surtout connue pour son application dans le traitement des produits d'apheresis sanguin, tels que l'isolation des monocytes pour les thérapies cellulaires dendritiques15,16. En termes d'échange de tampons, la technologie CFC n'a été appliquée que dans la fabrication à grande échelle17 et n'a pas encore été utilisée pour la fabrication à plus petite échelle de thérapies cellulaires autologues.
Pour répondre au besoin d'un dispositif approprié pour la fabrication de cellules à petite échelle, un dispositif cFC automatisé (Voir tableau des matériaux),a été récemment développé18. Le dispositif automatisé de traitement cellulaire utilise la technologie de centrifugation de contre-flux pour enlever les débris cellulaires et faciliter l'échange de tampons. L'appareil effectue un échange de mémoire tampon avec un kit à usage unique qui peut être relié stérile à un sac de transfert de cellules, ce qui permet aux cellules d'être traitées dans un système stérile et fermé. Ici, nous étudions l'utilisation d'un dispositif centrifuge de contre-flux pour effectuer l'échange de tampons dans les cultures cellulaires de mammifères dans des protocoles automatisés. Dans cette étude, nous avons testé le protocole d'échange de tampons à l'aide de cellules Jurkat et de cellules stromal mésenchymales (MSCs) pour modéliser les types de cellules non adhérentes et adhérentes, respectivement. Les cellules Jurkat sont des lymphocytes T immortalisés souvent utilisés pour l'étude de la leucémie t cellulaire aigue19,20. Les MSC sont des cellules souches adultes qui ont été étudiées dans le domaine des essais cliniques chez l'homme pour un large éventail de maladies9.
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Protocol
1. Préparation des réactifs et des cellules pour l'échange de tampons
- Préparer des tampons (voir Tableau des matériaux) dans une hotte à débit laminaire de classe 2. À l'aide d'une seringue et d'un assemblage d'aiguilles, retirer 50 ml de solution saline d'un sac salin de 500 ml. Remplacez cela par 50 ml d'albumine de sérum humain (HSA) pour faire 2% HSA en salin, qui servira de tampon de lavage.
- Retirez les cellules des vaisseaux de culture et effectuez un nombre cellulaire pour déterminer la quantité et la viabilité des cellules de départ par exclusion bleue trypan. Chargez les cellules dans un sac de transfert.
REMARQUE : Dans ce protocole, les cellules Jurkat ont été cultivées dans le RPMI et les MSC ont été cultivés dans DMEM:F12. Les deux médias ont été complétés avec 10% de sérum bovin foetal (FBS) et 1% de solution antibiotique-antimycotique. Les cellules ont été cultivées à 37 oC avec 5 % de CO2. Pour les MSC ou les cellules adhérentes, ajoutez une enzyme de digestion (par exemple, la trypsine) dans les vaisseaux de culture afin de détacher les cellules, et étancher avec le média de culture une fois que les cellules sont détachées. Un sac de transfert a été utilisé dans ce protocole parce que les cellules ont été élargies dans les vaisseaux de culture. Cependant, si les cellules sont cultivées dans un sac de culture cellulaire, il peut être directement connecté au kit à usage unique via le soudage à tube stérile. Dans ce protocole, soit 3 x 107 cellules Jurkat ou 1 x 107 MSC ont été utilisés pour chaque course, où les cellules ont été suspendues dans 40 ml de médias de culture.- Chargez les cellules dans un sac de transfert (voir Tableau des matériaux) à l'aide d'une seringue et d'un assemblage d'aiguilles si un soudeur à tube stérile est disponible pour connecter le sac de transfert au kit de traitement à usage unique.
- Alternativement, utilisez une paire de ciseaux autoclaved pour couper le tube de raccordement avec environ 10 cm restant attaché au sac de transfert et ajouter un connecteur femelle Luer à l'extrémité de la tuyauterie. Utilisez une seringue pour aspirer les cellules et les médias, puis connectez-la au connecteur Luer et chargez les cellules au sac de transfert.
- Connectez le sac contenant les cellules, lavez le sac tampon contenant 500 ml de tampon de lavage préparé à l'étape 1.1, le sac à déchets et la seringue de collecte à la trousse à usage unique (figure 1B).
REMARQUE : La position de connexion de chaque sac dépend des paramètres du programme. Dans ce protocole, nous avons relié le sac à déchets à la position A, lavons le tampon à la position B, le sac cellulaire aux positions D et F, et la seringue de collecte à la position H (Figure 1C).
2. Programme pour le protocole automatisé d'échange de mémoires tampons
- Ouvrez l'interface utilisateur graphique (INTERFACE) de l'appareil et appuyez sur le bouton «START» sur un ORDINATEUR ou une tablette portable. Puis "Ouvrez" un protocole existant ou appuyez sur "New" pour en créer un nouveau.
- Utilisez le bouton «Forward» et «Backward» pour naviguer à travers chaque étape, sélectionnez les vannes à ouvrir/fermées, la vitesse centrifuge, la vitesse de la pompe, la direction de la pompe et les déclencheurs d'action. Les paramètres de chaque étape sont résumés dans le tableau 1. Alors enregistrez le protocole.
3. Mise en place de la machine
- Placez le kit de traitement à usage unique sur la machine et accrochez les sacs connectés en conséquence. Appuyez sur le bouton rouge "Stop/Reset" pour réinitialer toutes les vannes dans la position fermée par défaut.
REMARQUE : La machine effectuera un essai lorsque la porte est fermée pour s'assurer que le kit a été placé correctement et que toutes les vannes fonctionnent correctement. - Connectez l'interface graphique à l'appareil de traitement et appuyez sur le bouton «Connect». Téléchargez ensuite le programme enregistré. Lorsque le bouton vert "Play" s'allume, il indique que le protocole est prêt à démarrer.
- Ouvrez les pinces manuelles pour le tube du sac de transfert.
REMARQUE : Si l'opérateur oublie d'ouvrir les pinces, l'appareil s'arrête et l'avertissement du capteur de pression apparaîtra. Appuyez sur le bouton "Stop" pour réinitialer l'appareil et ouvrez les pinces pour recommencer.
4. Échange de mémoire tampon automatisé
- Appuyez sur "Démarrer" pour lancer le programme d'échange de tampons.
REMARQUE : Pour modifier manuellement le processus automatisé, appuyez sur le bouton «Suivant» pour passer à l'étape suivante avant d'atteindre le «Déclencheur» ou appuyez sur «Pause» pour mettre le processus en attente. Cela recirculera les cellules à travers le kit tout en gardant seulement les valves J et K ouvertes (Figure 1C). - À la fin de l'étape d'automatisation 6 (tableau 1), le processus s'arrêtera lorsque l'air dans le sac maintenant vidé déclenche le capteur de bulles. Appuyez sur "Suivant" pour passer à l'étape suivante si le sac est bien vide, ou appuyez sur "Pause" pour reprendre le traitement si le capteur a été déclenché par une bulle dans la ligne.
5. Collecte et échantillonnage des cellules
- Lorsque le processus automatisé est terminé, fermez toutes les pinces de tubes. Ouvrez la porte et sortez le kit à usage unique de l'appareil. Débranchez la seringue pour recueillir les cellules pour les processus ultérieurs. Prenez un échantillon des cellules recueillies pour une vérification du nombre cellulaire et de la viabilité (voir l'étape 6.2).
6. Validation du processus
- Effectuez des expériences de contrôle à l'aide d'un protocole d'échange de mémoire tampon manuel.
- Suspension des cellules centrifugeuses à 200 x g pendant 5 min. Jetez le supernatant et suspendez les cellules avec 30 ml de tampon de lavage cellulaire. Centrifuger la suspension cellulaire à nouveau à 200 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant et resuspendre les cellules avec 10 ml de tampon de lavage cellulaire.
- Effectuer le comptage cellulaire par l'intermédiaire de l'essai d'exclusion bleu trypan pour évaluer la viabilité cellulaire à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé.
- Effectuer un rétopit MTS pour quantifier la prolifération cellulaire à 2, 24 et 48 h.
REMARQUE : L'analyse MTS a été effectuée sur une plaque de culture de tissu de puits 96 selon les instructions du fabricant. Un aliquot de 100 L de supports de culture cellulaire (contenant 10 000 cellules Jurkat ou 1 500) par puits a été plaqué après le processus d'échange de tampons. À chaque fois, 20 réagents MTS ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 2 h à 37 oC. L'absorption a été évaluée à 490 nm à l'aide d'un lecteur de plaque. - Effectuez des essais fonctionnels pour comparer l'impact du processus automatisé par rapport au processus manuel sur les cellules Jurkat et la fonction MSC.
- Culture Cellules Jurkat dans une plaque de 96 puits à une densité de 1 x 106 cellules/mL stimulée avec 50 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) et 1 'g/mL ionomycine (cocktail de stimulation cellulaire) dans dMEM:F12 médias contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS) pendant 24 h. Incuber les cellules à 37 oC avec 5 % de CO2.
- Mesurer la production d'interleukine-2 à partir d'un supernatant culturel à l'aide d'un test ELISA à base de perles (voir Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.
- MSCde de culture dans une plaque de 12 puits à la densité de 10.000 cellules/cm2 dans 1 ml de dMEM:F12 médias contenant 10% FBS complété avec l'interféron--50 unités/mL pendant 48 h. Recueillir supernatant pour l'essai de concentration de kynurèrenine pour mesurer l'indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) activité enzymatique des MSCs comme précédemment décrit21.
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Representative Results
Dans ce protocole, nous avons utilisé les cellules Jurkat et les MSC comme exemples représentatifs pour démontrer le processus automatisé d'échange de tampons. Pendant le processus, les cellules Jurkat et les MSC ont partagé les mêmes étapes de traitement avec les différences de force centrifuge et de vitesse de la pompe qui contrôlent le débit (tableau 1). La figure 2 montre des images représentatives capturées par la caméra de la façon dont le lit de cellule fluidisé peut apparaître pendant le processus d'échange de tampons. Typiquement, le lit de cellule fluidisé ressemblera à l'image dans la figure 2A,où les cellules s'accumulent au milieu et vers l'avant du cône avec un petit espace à l'extrémité de la chambre, où les cellules ne s'accumulent pas et l'ouverture de l'entrée de chargement cellulaire est visible. Le lit de cellule fluidisé peut être comprimé (Figure 2B) lors de l'introduction d'un nouveau tampon qui est à une viscosité ou à une densité différente. Dans ce protocole, la vitesse de la pompe a été abaissée de 30 à 35 ml/min à 20 ml/min au début de l'étape de lavage. Une fois que la chambre a été remplie avec le nouveau tampon, la vitesse de la pompe a été ramenée à la normale pour empêcher les cellules de granulement à l'extrémité de la chambre. Un débit élevé (figure 2C) peut être appliqué pour sélectionner les cellules vivantes parce que les cellules mortes sont plus petites et plus légères et peuvent être forcées de sortir de la chambre en augmentant le débit.
Le processus automatisé d'échange de tampons a été réalisé en concentrant d'abord les cellules, puis en introduisant le tampon de lavage, qui était d'environ 10 fois le volume du lit de cellule fluidisé. Les cellules ont ensuite été formulées au volume désiré. Ces trois étapes de traitement ont été conçues pour suivre les mêmes principes qu'un échange manuel de mémoire tampon. Typiquement, une centrifugation à deux cycles (200 x g, 5 min) est utilisée pour effectuer l'échange manuel de tampon, dans lequel les cellules sont granulées pour se concentrer, resuspendues pour se laver, puis centrifugeées à nouveau et remises en suspension au volume final. Le temps de traitement des processus automatisés était plus court que les processus manuels(figure 3). Le taux de récupération entre les processus manuels et automatisés était semblable tant pour les cellules Jurkat que pour les MSC, et la viabilité des cellules n'a pas été affectée par le processus (figure 4). La qualité cellulaire a été vérifiée par la prolifération cellulaire (essai mTS) et la production de cytokine/enzyme. Les cellules récupérées présentaient des taux de prolifération similaires entre les processus manuels et automatisés(figure 5A). Le niveau de production d'interleukine-2 à partir des cellules Jurkat et l'activité des IDO des MSC étaient également comparables entre les deux groupes(figure 5B et 5C).
| Numéro d'étape | Description | Vannes ouvertes | Vitesse centrifugeuse (g) | Vitesse de la pompe (ml/min) | Déclenche | |
| 1 | Tube de premier choix de B à A | A, B, K | 10 | 50 | Volume: 45 ml | |
| 2 | Remplir le piège à bulles de A à B | A, B, K | 100 | 50 (revers) | Volume: 10 ml | |
| 3 | Premier tube a été de A à D | A, D, K | 100 | 50 (revers) | Volume: 2 ml | |
| 4 | Premier tube J à K | J, K | 100 | 50 | Volume: 3 ml | |
| 5 | Cellules de chargement - démarrage initial D à G | D, K, G | 1600 (Jurkat) 1500 (MSCs) | 25 (Jurkat) 30 (MSCs) | Volume: 100 ml | |
| 6 | Charger les cellules avec bulle détecter [À la détection de bulles / tubes vides, le programme va s'arrêter et attendre la commande de l'opérateur, appuyez sur «pause» ou «prochaine»] | A, D, K | - dernière étape | 30 (Jurkat) 35 (MSCs) | Capteur de bulles D | |
| 7 | Videz les supports restants sur le tube du port D | A, D, K | - dernière étape | - dernière étape | Volume: 1.5 ml | |
| 8 | Laver les cellules 1 | A, B, K | - dernière étape | 20 | Volume: 20 ml | |
| 9 | Accélérer la vitesse de lavage | A, B, K | - dernière étape | 35 | Minuterie: 5 secondes de vitesse ramping | |
| 10 | Cellules de lavage 2 | A, B, K | - dernière étape | - dernière étape | Volume: 20 ml | |
| 11 | Préparez-vous à récolter | J, K | - dernière étape | - dernière étape | Minuterie: 2 secondes | |
| 12 | Récupérer les cellules à la sortie et diluer pour cibler le volume | B, J, K | - dernière étape | 60 (Revers) | Volume: 10 ml | |
| Remarque : « dernière étape » est une option de réglage pour la vitesse de centrifage et la vitesse de la pompe dans l'interface graphique. | ||||||
Tableau 1 : Configuration automatisée de l'interface graphique d'échange de tampons pour les cellules Jurkat et les MSC.
Figure 1 : Système de traitement centrifuge de contre-flux de cellules. (A) Un diagramme schématique illustrant le principe de la centrifugation de contre-flux. La force de contre-flux est présente dans un gradient à l'intérieur de la chambre cellulaire. Tandis que le centrifuging (flèche grise), les cellules avec de plus grands diamètres reçoivent une force de sédimentation plus élevée, dans laquelle les cellules atteignent l'équilibre de force vers l'extrémité étroite de la chambre, formant un lit de cellule fluidisé. Les débris cellulaires et les petites particules qui sont trop petites pour rester dans la chambre sont emportés. (B) Le système de traitement centrifuge de contre-flux se compose du dispositif de traitement et du kit de traitement à usage unique. (C) Configuration du kit à usage unique pour le protocole d'échange de mémoire tampon. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Lit de cellule fluidisé dans la chambre cellulaire. Images représentatives d'un lit de cellule fluidisé sous (A) milieu, (B) faible, et (C) débit élevé. La ligne pointillée indique la zone du lit de cellule fluidisé dans la chambre. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Comparaison du temps de traitement cellulaire des cellules Jurkat et des MSC avec le traitement manuel et automatisé. (n '3'4 dans chaque groupe, les données sont présentées comme moyennes et SD). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Comparaison de la viabilité cellulaire et de la récupération des cellules vivantes des cellules Jurkat et des MSC avec un traitement manuel et automatisé. La viabilité cellulaire (A) et la récupération des cellules vivantes (B) ont été mesurées par essai d'exclusion bleu trypan à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé. La récupération vivante de cellules a été réduite en l'absence de sérum ou quand seulement 3 x 106 ou 1 x 106 cellules ont été traitées. (n '4'9 dans chaque groupe, les données sont présentées comme moyennes et SD). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Prolifération cellulaire et fonction cellulaire à partir du traitement manuel et automatisé. (A) L'adjudant MTS des cellules Jurkat et des MSC ont été effectués à 2, 24 et 48 h après l'échange de tampons. La qualité des cellules récupérées a été quantifiée par la production d'Interleukin-2 à partir des cellules Jurkat (B), et l'activité de l'ODI dans les MSC (C). (n '4'8 dans chaque groupe, les données sont présentées comme moyennes et SD). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Stabilité des lits de cellules fluidisées à divers débits. Deux processus ont été exécutés pour chaque type de cellule. Dans un processus, soit 3 x 107 cellules Jurkat ou 1 x 107 MSCs. Dans le deuxième processus, 10 fois le nombre de cellules ont été utilisés. Dans les deux processus, 10 ml d'élutriate cellulaire ont été prélevés dans le port A à divers débits à l'aide de la vitesse de centrifage indiquée dans ce protocole (1 600 x g pour les cellules Jurkat et 1 500 x g pour les MSC). Le nombre de cellules dans l'élutioté a été déterminé et présenté en pourcentage de la quantité totale de cellules chargées dans la chambre. (n ' 3 pour chaque groupe, les données sont présentées comme moyennes et SD). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole d'échange de mémoire tampon automatisé décrit est simple et convivial. Néanmoins, il y a quelques étapes clés dans ce protocole qui sont critiques et nécessitent une attention particulière. D'après notre expérience, lors du traitement de cellules plus grandes telles que les MSC (diamètre moyen de 10 à 15 m), chaque course devrait inclure au moins 1 x 107 cellules pour atteindre une récupération optimale des cellules (Figure 4B). Le traitement de cellules plus petites, telles que les cellules Jurkat (diamètre moyen de 10 m), nécessite environ 3 x 107 cellules pour obtenir un lit cellulaire fluidisé stable(figure 4B). Lorsque le nombre de cellules est trop faible, les cellules sont plus susceptibles d'être retirées du lit fluidisé, ce qui affectera la récupération cellulaire finale. En outre, nous avons comparé les taux de perte cellulaire à différentes vitesses de pompe lorsqu'une vitesse centrifuge constante est appliquée. Ici, nous avons observé que la perte cellulaire a augmenté avec le débit (figure 6), qui est due à l'instabilité croissante du lit fluidisé à des débits plus élevés. Cependant, le pourcentage de perte cellulaire était plus faible lorsque 10fois le nombre de cellules ont été chargés dans la chambre, ce qui suggère qu'une vitesse de pompe plus élevée peut être appliquée lors du traitement d'un plus grand nombre de cellules pour permettre un traitement plus rapide. À l'étape 5 du processus, 100 ml de supports culturels ont été recirculés de la chambre vers le sac de transfert de cellules pour permettre au lit fluidisé de se former et de se stabiliser avant la réduction du volume et l'échange de tampons. Si la concentration cellulaire est faible (p. ex., en dessous de 0,2 x 106/mL), l'étape de recirculation peut devoir être prolongée pour permettre à suffisamment de cellules de former le lit de la cellule fluidisée. De même, si la concentration cellulaire est élevée, l'étape de recirculation peut être raccourcie.
La présence de sérum dans le tampon de lavage est également essentielle pour la récupération cellulaire. Des études antérieures ont montré que le stress hydrodynamique peut causer la mort des cellules nécrotiques en l'absence de protéines tampons22,23. La dynamique de flux du système centrifuge de contre-flux est assez complexe. Dans ce protocole, les taux de récupération cellulaire sont tombés à environ 70 % lorsque le processus a été effectué en l'absence de sérum (figure 4B). Bien que le mécanisme exact n'est pas clair, la présence de sérum dans les médias de culture ou l'albumine dans les tampons de lavage a été en mesure d'atténuer les dommages mécaniques potentiels aux cellules. Pour les applications nécessitant des tampons sans sérum, l'amidon hydroxyhyl et le dextran 40 sont des exemples d'additifs non protéiques qui sont souvent utilisés dans la fabrication de cellules pour se protéger contre le stress hydrodynamique24,25.
La technologie de centrifugation de contre-flux a été utilisée dans la fabrication biopharmaceutique à grande échelle et le traitement des produits sanguins17. Les applications de la technologie CFC dans la fabrication de cellules à petite échelle (c.-à-d. 0,1 à 10 L) sont souvent limitées à l'isolation des cellules mononucléaires des produits d'apheresis, comme l'Elutra (Terumo BCT)26, dans lequel une intervention manuelle supplémentaire est nécessaire pour effectuer des étapes de lavage et de concentration. D'autres plates-formes de traitement cellulaire à petite échelle comprennent des systèmes d'échange tampon à base de filtration membranaire tels que le LOVO (Fresenius Kabi)27 et la séparation verticale de centrifugation comme le Sepax (GE Healthcare)28. Bien qu'il soit difficile d'effectuer une comparaison directe entre les appareils, l'un des avantages de ce dispositif centrifuge de contre-flux est sa capacité à fournir de très petits volumes de sortie (minimum 5 mL), qui est le plus petit parmi les plates-formes de traitement cellulaire actuellement disponibles. Le petit volume de sortie convient à des applications telles que la formulation de cellules pour les injections locales29 ou les perfusions pour les nouveau-nés30. La caméra intégrée dans l'appareil est également une caractéristique unique qui fournit la visualisation du lit de cellule fluidisé au cours de l'étape de développement du processus.
L'une des limites de la technologie CFC est qu'elle est sensible à la taille et à la densité des cellules. Lors de la mise en place d'un protocole d'échange de tampons pour un type de cellule différent, le protocole présenté ici devrait servir de ligne directrice pour les utilisateurs à optimiser en fonction de leurs besoins, en gardant à l'esprit la taille de leurs cellules d'intérêt et la densité de leur suspension cellulaire. Bien que le protocole actuel soit utilisable pour le traitement jusqu'à 5 L de supports, le délai de traitement sera considérablement prolongé (c.-à-d., 1 à 2 h). Il est important de noter que l'impact du temps de traitement prolongé sur la qualité des cellules n'a pas été examiné dans la présente étude.
De futures études évalueront l'impact de la vitesse de traitement et du temps de traitement sur la fonction cellulaire afin de déterminer la capacité de traitement maximale de l'appareil. En outre, de futures études pourraient explorer d'autres applications telles que l'élimination du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) des produits cryoconservés et l'élimination sélective des cellules mortes.
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Disclosures
SW, IF et DJ sont COO, CTO et CEO de Scinogy Pty. Ltd. L'accès au dispositif CFC a également été fourni par Scinogy.
Acknowledgments
Ce travail est appuyé par le Programme de soutien à l'infrastructure opérationnelle du gouvernement de l'État de Victoria et le bon de technologie du gouvernement victorien fourni par le ministère du Développement économique, de l'Emploi, des Transports et des Ressources. RL est le récipiendaire d'une bourse de perfectionnement professionnel du Conseil national de la santé et de la recherche médicale. AL est le récipiendaire d'un Australian Postgraduate Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 | |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C | |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 | |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A | |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A | |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A | |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A | |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS | |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
References
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