Summary
Automatisering er nøkkelen til oppskalering og kostnadsstyring i celle produksjon. Dette manuskriptet beskriver bruken av en motstrøm sentrifugal celle prosesserings anordning for automatisering av buffer utveksling og celle konsentrasjons trinn for småskala bioprosessering.
Abstract
Vellykket kommersialisering av gen-og cellebasert behandling krever produksjonsprosesser som er kostnadseffektive og skalerbare. Buffer utveksling og produkt konsentrasjon er vesentlige komponenter for de fleste produksjonsprosesser. I de tidlige stadiene av produktutviklingen utføres imidlertid disse trinnene ofte manuelt. Manuelle Dead-End-sentrifugering for buffer utveksling er arbeidsintensiv, kostbar og ikke skalerbar. Et lukket, automatisert system kan effektivt eliminere dette arbeidskrevende trinnet, men implementeringen kan være utfordrende. Her beskriver vi en nyutviklet celle prosessering enhet som er egnet for små og mellom store celle prosessering og har som mål å bygge bro over gapet mellom manuell prosessering og stor skala automatisering. Denne protokollen kan enkelt brukes på ulike celletyper og prosesser ved å endre strømningshastighet og sentrifugering hastighet. Vår protokoll demonstrerte høy celle gjenvinning med kortere behandlingstid i forhold til den manuelle prosessen. Celler utvinnes fra den automatiserte prosessen også opprettholdt deres spredning priser. Enheten kan brukes som en modulær komponent i en lukket produksjonsprosess for å imøtekomme trinn som buffer utveksling, celle formulering og kryonisk bevaring.
Introduction
Landskapet av moderne medisin har forvandlet raskt gjennom den siste utviklingen i genet og celle-baserte terapier (GCT). Som en av de raskest voksende feltene innen translational forskning, står GCT-sektoren også overfor unike og enestående utfordringer. I tillegg til robuste kliniske utfall er effektive og kostnadseffektive produksjonsprosesser avgjørende for den kommersielle suksessen til GCT, noe som er spesielt vanskelig å oppnå i småskala produksjon1. Kostnaden for tid, arbeid og kvalitet forsikringer er forstørret når hver gruppe av celler bare produserer noen få doser for en pasient i stedet for hundrevis eller tusenvis. I motsetning til allogene celle terapier der produksjonsprosessene er mer beslektet med produksjonen av antistoffer og rekombinant proteiner, er autologous celle terapier vanligvis produsert som småskala operasjoner1. Som et relativt nytt fenomen i biofarmasøytisk produksjon2, alternativer for småskala celle behandling er for tiden ganske begrenset.
Buffer utveksling er viktig for celle produksjon. Det er en av de nedstrøms prosesser der cellene er fjernet fra kultur Media og konsentrert for kryonisk bevaring eller infusjon. For tiden gjelder småskala celle produksjon ofte prosesser som ligner på de i akademisk forskning innstillingen og er avhengig av spesialiserte rene rom for å opprettholde sterilitet3. Manuelle nedstrøms prosesser bruker ofte stasjonære sentrifuger til pellets og resuspend celler for volumreduksjon og buffer utveksling. Disse åpne prosessene er kostbare (dvs. arbeid og ren rom vedlikehold) og har begrenset produksjonskapasitet, som ikke er ideelle for kommersiell produksjon2,3.
Implementering av automatisering har blitt foreslått som en løsning for å forbedre produksjonseffektiviteten og oppnå kommersielle skala produksjoner2. Sterilitet kan ikke oppnås i celle-baserte produkter gjennom tradisjonelle metoder som brukes for biologiske, som gamma bestråling eller Terminal end filtrering. I stedet distribueres et automatisert lukket system for å redusere risikoen for forurensning og operatører som er avhengige av rene rom for å opprettholde sterilitet4. Prosessautomatisering løser også problemet med skalerbarhet ved at du enten har flere systemer som kjører parallelt (skalering) eller øker Prosesseringskapasiteten til en individuell enhet (oppskalering), noe som igjen minimerer variasjonen mellom operatørene. Dessuten antyder kostnads modellerings analyse av autologous behandling at automatisering kan redusere kostnadene ved produksjon5,6. Imidlertid ble det ikke funnet noen kostnadsfordel i en klinisk studie av autologous stamceller der en automatisert produksjonsplattform ble brukt7, noe som tyder på at kostnadsfordelen ved automatisering kan avhenge av den enkelte produksjonsprosessen.
Det finnes ulike strategier der automatisering kan innføres i en eksisterende produksjonsprosess. Dette kan oppnås enten ved å implementere en fullt integrert plattform eller en modulær-basert prosesskjede. Det finnes flere fullt integrerte plattformer kommersielt tilgjengelig for autologous celle produksjon, for eksempel CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (oktan Biotech), og Quantum (TERUMO BCT). Disse integrerte plattformene, som ofte beskrives som "GMP-in-a-Box", har lave krav til infrastruktur og er enkle å betjene. Produksjonskapasiteten til et fullt integrert oppsett kan imidlertid begrenses av inkubator festet til systemet. For eksempel, den dyrking kapasitet vidunderbarn er begrenset til sin 400 ml kammer8 og Quantum kassetten har en begrensende areal satt til 2,1 m2 (tilsvarende 120 T175 flasker)7, som kanskje ikke er tilstrekkelig for pasienter som krever høyere celle doser9,10. I tillegg har Prodigy og Quantum en felles egenskap som begrenser deres bruk: den operative enheten er okkupert av en enkelt gruppe med celler i hele celle Utvidelses perioden, og dermed begrense antall partier som kan produseres av hver enhet11. Den modulære tilnærmingen til automatisering er å opprette en produksjons kjede med flere modulære enheter som simulerer den kommersielle produksjonsprosessen12,13. Denne tilnærmingen, som skiller kulturen enheten fra cellen vaskemaskin, kan dermed maksimere produksjonseffektivitet. En ideell prosesseringsenhet vil være en som er tilpasningsdyktig og skalerbar til produksjon behov12.
Motstrøm sentrifugering (CFC) teknologi, som dateres tilbake til 1970-tallet, har hatt en lang historie i celle prosessering14. Den oppnår celle konsentrasjon og separasjon ved å balansere sentrifugalkraften med en motstrøm kraft. Vanligvis kommer en celle suspensjon fra den smale enden av en celle kammer under en konstant strømningshastighet mens utsatt for en sentrifugalkraft (figur 1a). Flyten av væsken utøves i motsatt retning av sentrifugalkraften. Dette kalles motstrøm kraft, som danner en gradient i celle kammeret. Den motstrøm kraften synker da celle kammeret utvider seg bort fra tuppen av membran-formede celle kammeret. Celler med høyere tetthet og større diameter har en høyere sedimentering hastighet, og dermed de når styrke likevekt mot spissen av kjegle-formede celle kammeret. Mindre partikler kan nå likevekt mot bunnen av kammeret eller være for liten til å bli beholdt i kammeret og vil bli vasket bort. Den CFC teknologien er mest kjent for sin anvendelse i behandling av blod aferese produkter, for eksempel isolere monocytter for dendrittiske celle terapi15,16. Når det gjelder buffer utveksling, har CFC-teknologien bare blitt anvendt i Storskalaproduksjon17 og har ennå ikke blitt brukt for mindre skala produksjon av autologous celle terapier.
For å møte behovet for en egnet enhet for småskala celle produksjon, en automatisert CFC enhet (se tabell over materialer), ble nylig utviklet18. Det automatisert cellen bearbeiding apparat bruker motstrøm sentrifugering teknologien å fjerne cellen rusk og Letter buffer bytte. Enheten utfører buffer utveksling med en enkelt-bruk kit som kan være sterile-koblet til en celle overføring bag, som gjør at cellene skal behandles i et sterilt, lukket system. Her undersøker vi bruken av en motstrøm sentrifugal anordning for å utføre buffer utveksling i pattedyr cellekulturer i automatiserte protokoller. I denne studien, testet vi buffer utvekslings protokoll bruker Jurkat celler og mesenchymal stromal celler (MSCs) til modell nonadherent og tilhenger celletyper, henholdsvis. Jurkat celler er udødeliggjort T celler som ofte brukes til studiet av akutt T celle leukemi19,20. MSCs er voksne stamceller som har blitt studert i Human kliniske studier for et bredt spekter av sykdommer9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av reagenser og celler for buffer utveksling
- Klargjør buffere (se tabell over materialer) i en klasse 2 laminær Flow Hood. Ved hjelp av en sprøyte og nål montering, Fjern 50 mL saltoppløsning fra en 500 mL saltvanns pose. Erstatt dette med 50 mL av 20% humant serum albumin (HSA) å gjøre 2% HSA i saltvann, som vil tjene som vaskebuffer.
- Fjern cellene fra kultur fartøyene og utfør en celle telling for å bestemme Start celle antallet og levedyktigheten ved å trypan blå eksklusjon. Legg cellene i en overførings pose.
Merk: i denne protokollen Jurkat celler ble kultivert i RPMI og MSCs ble kultivert i DMEM: F12. Begge mediene ble supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS) og 1% antibiotika-Antimykotisk løsning. Celler ble kultivert ved 37 ° c med 5% CO2. For MSCs eller tilhenger celler, legge til en fordøyelse enzym (f. eks, Trypsin) inn i kulturen fartøy for å løsne cellene, og slukke med kultur medier når cellene er løsrevet. En overførings pose ble brukt i denne protokollen fordi cellene ble utvidet i kultur fartøy. Men hvis cellene er kultivert i en cellekultur pose, kan den kobles direkte til en gangs sett via steril rørsveising. I denne protokollen, enten 3 x 107 Jurkat celler eller 1 x 107 MSCs ble brukt for hver kjøre, der cellene ble suspendert i 40 ml kultur medier.- Legg celler i en overførings pose (se tabell over materialer) ved hjelp av en sprøyte og nål montering hvis en steril rør sveiser er tilgjengelig for å koble overførings posen til engangsbruk behandling kit.
- Alternativt kan du bruke et par autoklaveres saks for å kutte forbindelsesslangen med rundt 10 cm remainining festet til overførings posen og legge til en kvinnelig luer-kontakt til enden av slangen. Bruk en sprøyte for å aspirer celler og medier, koble deretter sprøyten til luer-kontakten og lastceller til overførings posen.
- Koble posen som inneholder cellene, vaskebuffer posen som inneholder 500 mL vaskebuffer fremstilt i trinn 1,1, avfalls posen, og samle sprøyten til ett-Bruk Kit (figur 1B).
Merk: forbindelses posisjonen til hver pose avhenger av innstillingene i programmet. I denne protokollen har vi koblet til avfalls posen i posisjon A, vaskebuffer i posisjon B, celle posen ved posisjonene D og F, og oppsamlings sprøyte i posisjon H (figur 1C).
2. program for automatisert buffer utveksling protokoll
- Åpne det grafiske brukergrensesnittet (GUI) for enheten, og trykk på "StarT"-knappen på en bærbar PC eller et nettbrett. Deretter "Åpne" en eksisterende protokoll eller trykk "ny" for å opprette en ny.
- Bruk "Forward" og "bakover"-knappen for å navigere gjennom hvert trinn, velger ventilene som skal åpnes/lukkes, sentrifugal hastighet, pumpehastighet, pumpe retning, og handling triggere. Innstillingene for hvert trinn oppsummeres i tabell 1. Deretter lagrer protokollen.
3. sette opp maskinen
- Plasser en gangs behandlings sett på maskinen og heng de tilkoblede posene i henhold til dette. Trykk på den røde "Stop/reset"-knappen for å tilbakestille alle ventiler til standard lukket stilling.
Merk: maskinen vil utføre en test når døren er lukket for å sikre at settet er riktig plassert, og at alle ventilene fungerer som de skal. - Koble GUI til behandlingsenheten og trykk på "Connect"-knappen. Deretter laster du ned det lagrede programmet. Når den grønne "Play"-knappen lyser opp, indikerer det at protokollen er klar til å starte.
- Åpne de manuelle klemmene for transport pose slangen.
Merk: Hvis operatøren glemmer å åpne klemmene, vil enheten stoppe og trykksensor advarselen vises. Trykk på "Stop"-knappen for å nullstille enheten og åpne klemmene for å starte på nytt.
4. automatisert buffer utveksling
- Trykk på "Start" for å starte buffer utvekslingsprogrammet.
Merk: for å manuelt endre den automatiserte prosessen, trykk på "neste"-knappen for å gå til neste trinn før du når "trigger" eller trykk "pause" for å sette prosessen på vent. Dette vil recirculate cellene gjennom settet mens bare ventiler J og K åpen (figur 1C). - På slutten av automatisering trinn 6 (tabell 1), vil prosessen pause når luften i nå tømt posen utløser boblen sensor. Trykk "Next" for å flytte prosessen til neste trinn hvis posen er virkelig tom, eller trykk "pause" for å gjenoppta behandlingen hvis sensoren ble utløst av en boble i linjen.
5. innsamling og prøvetaking cellene
- Når den automatiserte prosessen er ferdig, Lukk alle rør klemmer. Åpne døren og ta én gangs settet ut av enheten. Koble fra sprøyten for å samle inn cellene for etterfølgende prosesser. Ta en prøve av de innsamlede cellene for et celle antall og levedyktighet sjekk (se trinn 6,2).
6. behandle validering
- Utfør kontroll eksperimenter ved hjelp av en manuell buffer utvekslings protokoll.
- Sentrifuger celle fjæring ved 200 x g i 5 min. kast supernatanten og resuspend cellene med 30 ml celle vaskebuffer. Sentrifuger celle fjæringen igjen ved 200 x g i 5 min. kast supernatanten og resuspend cellene med 10 ml celle vaskebuffer.
- Utfør celle telling via den trypan blå ekskluderings analysen for å vurdere celle levedyktighet ved hjelp av en automatisert celle teller.
- Utfør en MTS-analyse for å kvantifisere celle spredning ved 2, 24 og 48 h.
Merk: MTS-analysen ble utført på en 96 brønn vevs kultur i henhold til produsentens anvisninger. En 100 μL alikvot av cellekultur medier (som inneholder 10 000 Jurkat celler eller 1 500) per brønn ble belagt etter buffer utvekslings prosessen. Ved hvert tidspunkt ble 20 μL av MTS-reagenser tilsatt i hver brønn og inkubert for 2 timer ved 37 ° c. Absorbansen ble vurdert ved 490 NM ved bruk av en plate leser. - Utfør funksjonelle analyser for å sammenligne virkningen av den automatiserte prosessen i forhold til den manuelle prosessen på Jurkat-cellene og MSC-funksjonen.
- Kultur Jurkat celler i en 96-brønn plate ved en tetthet på 1 x 106 celler/ml stimulert med 50 ng/ml phorbol 12-isopropylmyristat 13-ACETATE (PMA) og 1 μg/ml ionomycin (celle stimulering cocktail) i DMEM: F12 medier som inneholder 10% fosterets storfe serum (FBS) for 24 h. ruge cellene ved 37 ° c med 5% co2.
- Mål interleukin-2-produksjon fra kultur supernatanten ved hjelp av perle BAS ert ELISA-analysen (se tabell over materialer) i henhold til produsentens instruksjoner.
- Kultur MSCs i en 12 brønn plate ved tettheten av 10 000 celler/cm2 i 1 ml DMEM: F12 Media inneholder 10% FBS supplert med interferon-γ 50 enheter/mL for 48 h. samle supernatanten for kynurenine konsentrasjon analysen å måle indoleamine 2, 3-DIOXYGENASE (Ido) enzym aktivitet av MSCs som tidligere beskrevet21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen, brukte vi Jurkat celler og MSCs som representative eksempler for å demonstrere automatiserte buffer utveksling prosessen. Under prosessen delte Jurkat celler og MSCs de samme behandlingstrinnene med forskjeller i sentrifugalkraften og pumpehastigheten som styrer strømningshastigheten (tabell 1). Figur 2 viser representative bilder tatt av kameraet på hvordan fluidisert celle seng kan vises under buffer utvekslings prosessen. Vanligvis vil fluidisert celle seng ligne bildet i figur 2A, der celler akkumuleres i midten og mot fronten av membranen med en liten plass på tuppen av kammeret, der cellene ikke akkumuleres og åpningen av cellen lasting innløpet er synlig. Den fluidisert celle sengen kan komprimeres (figur 2B) ved innføring av ny buffer som har en annen viskositet eller tetthet. I denne protokollen ble pumpens hastighet senket fra 30 – 35 mL/min til 20 mL/min ved starten av vaske trinnet. Når kammeret var fylt med den nye bufferen, ble pumpen hastigheten tilbake til det normale for å hindre pelleting celler på spissen av kammeret. En høy strømningshastighet (figur 2C) kan brukes til å velge for levende celler fordi døde celler er mindre og lettere og kan bli tvunget ut av kammeret ved å øke strømningshastigheten.
Den automatiserte prosessen med buffer utveksling ble oppnådd ved først å konsentrere cellene, og deretter innføre vaskebuffer, som var rundt 10x av volumet av fluidisert celle seng. Cellene ble deretter formulert til ønsket volum. Disse tre behandlingstrinnene ble utformet for å følge de samme prinsippene som en manuell buffer utveksling. Vanligvis er en to-syklus sentrifugering (200 x g, 5 min) brukes til å utføre manuell buffer utveksling, der cellene er pelleted å konsentrere seg, resuspendert å vaske, deretter sentrifugert igjen og resuspendert til det endelige volumet. Behandlingstiden for de automatiserte prosessene var kortere sammenlignet med de manuelle (Figur 3). Oppgangen rate mellom manuelle og automatiserte prosesser var lik for både Jurkat celler og MSCs, og celle levedyktighet ble ikke påvirket av prosessen (Figur 4). Celle kvaliteten ble verifisert av celle spredning (MTS-analyse) og cytokin/enzym produksjon. De gjenopprettede cellene viste tilsvarende sprednings rater mellom manualen og de automatiserte prosessene (figur 5A). Nivået av interleukin-2 produksjon fra Jurkat celler og IDO aktivitet av MSCs var også sammenlignbare mellom de to gruppene (figur 5B og 5C).
| Trinn nummer | Beskrivelse | Åpne ventiler | Sentrifugehastighet (g) | Pumpehastighet (ml/min) | Utløsere | |
| 1 | Førsteklasses slange fra B til A | A, B, K | 10 | 50 | Volum: 45 ml | |
| 2 | Fyll boble felle fra A til B | A, B, K | 100 | 50 (motsatt) | Volum: 10 ml | |
| 3 | Førsteklasses slange A til D | A, D, K | 100 | 50 (motsatt) | Volum: 2 ml | |
| 4 | Førsteklasses slange J til K | J, K | 100 | 50 | Volum: 3 ml | |
| 5 | Lastceller – første start D til G | D, K, G | 1600 (Jurkat) 1500 (MSCs) | 25 (Jurkat) 30 (MSCs) | Volum: 100 ml | |
| 6 | Lastceller med boble oppdage [ved påvisning av boble/tomme rør, vil programmet pause og vente på operatørens kommando, trykk ' pause ' eller ' neste '] | A, D, K | = siste trinn | 30 (Jurkat) 35 (MSCs) | Boble sensor D | |
| 7 | Tøm gjenværende Media på port D-røret | A, D, K | = siste trinn | = siste trinn | Volum: 1,5 ml | |
| 8 | Vask celler 1 | A, B, K | = siste trinn | 20 | Volum: 20 ml | |
| 9 | Gradvis oppbygging av vaske hastighet | A, B, K | = siste trinn | 35 | Timer: 5 sekunder hastighet gradvis | |
| 10 | Vask celler 2 | A, B, K | = siste trinn | = siste trinn | Volum: 20 ml | |
| 11 | Forbered innhøsting | J, K | = siste trinn | = siste trinn | Timer: 2 sekunder | |
| 12 | Gjenopprette celler til produksjon og fortynne å målrette volumet | B, J, K | = siste trinn | 60 (omvendt) | Volum: 10 ml | |
| Merk: ' = siste trinn ' er en innstilling alternativ for sentrifugering hastighet og pumpehastighet i GUI. | ||||||
Tabell 1: automatisert buffer utveksling GUI-oppsett for Jurkat-celler og MSCs.
Figur 1: motstrøm sentrifugal celle behandlingssystem. (A) et skjematisk diagram som illustrerer prinsippet om motstrøm sentrifugering. Motstrøm kraften er til stede i en gradient i celle kammeret. Mens sentrifugering (grå pil), celler med større diameter får en høyere sedimentering kraft, der cellene nå tvinge likevekt mot den smale enden av kammeret, danner en fluidisert celle seng. Celle rusk og små partikler som er for små til å forbli i kammeret er vasket bort. (B) motstrøm sentrifugal behandlingssystem består av behandlingsapparatet og en gangs behandlings sett. (C) enkelt bruk Kit-konfigurasjon for buffer Exchange-protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: fluidisert celle seng i celle kammeret. Representative bilder av en fluidisert celle seng under (a) medium, (B) lav, og (C) høy strømningshastighet. Den stiplede linjen indikerer arealet av fluidisert celle seng i kammeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: sammenligning av celle behandlingstid for Jurkat-celler og MSCs med manuell og automatisert behandling. (n = 3 – 4 i hver gruppe, data presenteres som gjennomsnittet ± SD). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: sammenligning av celle levedyktighet og live celle utvinning av Jurkat celler og MSCs med manuell og automatisert behandling. Celle levedyktighet (A) og live celle utvinning (B) ble målt ved trypan blå eksklusjon analysen ved hjelp av en automatisert celle teller. Live celle utvinning ble redusert i fravær av serum eller når bare 3 x 106 eller 1 x 106 celler ble behandlet. (n = 4 – 9 i hver gruppe, data presenteres som gjennomsnittet ± SD). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: celle spredning og celle funksjon fra manuell og automatisert behandling. (A) MTS-analysen av Jurkat celler og MSCs ble utført ved 2, 24, og 48 h etter buffer utveksling. Kvaliteten på gjenopprettede celler ble kvantifisert av interleukin-2 produksjon fra Jurkat celler (B), og Ido aktivitet i MSCs (C). (n = 4 – 8 i hver gruppe, data presenteres som gjennomsnittet ± SD). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: fluidisert-stabilitet ved ulike strømningshastighet. To prosesser ble utført for hver celle type. I en prosess, enten 3 x 107 Jurkat celler eller 1 x 107 MSCs. I den andre prosessen ble 10x antall celler brukt. I begge prosessene ble 10 mL celle elutriate samlet inn fra Port A ved forskjellige strømningsrater ved hjelp av sentrifugering hastigheten angitt i denne protokollen (1 600 x g for Jurkat-celler og 1 500 x g for MSCs). Antall celler i elutriate ble bestemt og presentert som prosentandel av den totale mengden av celler som er lagt i kammeret. (n = 3 for hver gruppe, data presenteres som gjennomsnittet ± SD). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den automatiserte buffer utveksling protokollen er beskrevet er enkel og brukervennlig. Likevel er det noen viktige trinn i denne protokollen som er kritiske og krever spesiell oppmerksomhet. I vår erfaring, når du behandler større celler som MSCs (gjennomsnittlig diameter 10 – 15 μm) hver kjøre bør inneholde minst 1 x 107 celler for å oppnå optimal celle utvinning (Figur 4B). Behandling av mindre celler, for eksempel Jurkat celler (gjennomsnitt ~ 10 μm diameter), krever rundt 3 x 107 celler for å oppnå en stabil fluidisert celle seng (Figur 4B). Når celle nummeret er for lavt, celler er mer sannsynlig å bli fjernet fra fluidisert seng, som vil påvirke den endelige celle utvinning. I tillegg sammenlignet vi celle tap priser ved forskjellige pumpehastigheter når en konstant sentrifugal hastighet påføres. Her observerte vi at celle tapet økte med strømningshastigheten (figur 6), som er på grunn av den økende ustabilitet i fluidisert seng ved høyere strømningsrater. Imidlertid var prosentandelen av celle tap lavere når 10x antall celler ble lastet inn i kammeret, noe som tyder på at en høyere pumpehastighet kan brukes ved behandling av et større antall celler for å tillate raskere behandling. I trinn 5 av prosessen, 100 mL kultur Media ble resirkulert fra kammeret tilbake til cellen overføre posen for å la fluidisert seng å danne og stabilisere før volumreduksjon og buffer utveksling. Hvis celle konsentrasjonen er lav (f.eks. under 0,2 x 106/ml), kan det hende at resirkulerings trinnet må utvides for at nok celler skal danne den fluidisert celle sengen. På samme måte, hvis celle konsentrasjonen er høy, kan resirkulerings trinnet forkortes.
Tilstedeværelsen av serum i vaske bufferen er også avgjørende for celle gjenvinning. Tidligere studier har vist at hydrodynamisk stress kan føre til nekrotisk celle død i fravær av bufring proteiner22,23. Flyten dynamikken i motstrøm sentrifugal systemet er ganske komplisert. I denne protokollen falt celle utvinningsgrad til rundt 70% når prosessen ble utført i fravær av serum (Figur 4B). Selv om den eksakte mekanismen er ikke klart, tilstedeværelsen av serum i kultur Media eller albumin i vaske buffere var i stand til å redusere potensialet mekaniske skader på cellene. For programmer som krever serum frie buffere, hydroxyethyl stivelse og dextran 40 er eksempler på ikke-protein tilsetningsstoffer som ofte brukes i celle produksjon for å beskytte mot hydrodynamisk stress24,25.
Motstrøm sentrifugering teknologi har blitt brukt i stor skala biofarmasøytisk produksjon og blod produkt prosessering17. Anvendelser av CFC teknologi i småskala celle produksjon (dvs. 0.1-10 L) er ofte begrenset til å isolere mononukleære celler fra aferese produkter, slik som Elutra (TERUMO BCT)26, der ytterligere manuell intervensjon er nødvendig for å utføre vask og konsentrere trinn. Andre småskala celle behandling plattformer inkluderer membran filtrering-baserte buffer utveksling systemer som LOVO (Fresenius KABI)27 og vertikal sentrifugering separasjon som SEPAX (GE Healthcare)28. Selv om det er vanskelig å utføre en direkte sammenligning mellom enheter, er en av fordelene med denne motstrøm sentrifugal enheten dens kapasitet til å levere svært små volumer (minimum 5 mL), som er den minste blant tilgjengelige celle behandlings plattformer. Den lille output volumet er egnet for applikasjoner som å formulere celler for lokale injeksjoner29 eller infusjoner for nyfødte30. Kameraet innebygd i enheten er også en unik funksjon som gir visualisering av fluidisert celle seng under prosessen utvikling scenen.
En av begrensningene i CFC teknologien er at den er følsom for størrelsen og tettheten av cellene. Når du setter opp en buffer utveksling protokoll for en annen celle type, protokollen som presenteres her bør tjene som en retningslinje for brukerne å optimalisere i henhold til deres behov, husk størrelsen på deres celler av interesse og tettheten av deres celle suspensjon. Selv om den gjeldende protokollen kan brukes til å behandle opptil 5 L medier, vil behandlingstiden bli betydelig forlenget (dvs. 1 – 2 timer). Det er viktig å merke seg at virkningen av forlenget behandlingstid på celle kvalitet ikke har blitt undersøkt i denne gjeldende studien.
Fremtidige studier vil evaluere effekten av prosesseringshastighet og behandlingstid på celle funksjon for å bestemme den maksimale Prosesseringskapasiteten til enheten. Videre fremtidige studier kan utforske andre programmer som fjerning av dimethyl sulfoxide (DMSO) fra embryo produkter og selektiv fjerning av døde celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SW, IF, og DJ er COO, CTO og CEO i Scinogy Pty. Ltd. Tilgang til CFC enheten ble også levert av Scinogy.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av den viktorianske regjeringens operative infrastruktur support program, og den viktorianske regjeringen teknologi voucher levert av Institutt for økonomisk utvikling, Jobs, transport og ressurser. RL er mottaker av en National Health and Medical Research Council Career Development Fellowship. AL er mottaker av en australsk Postgraduate Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 | |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C | |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 | |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A | |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A | |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A | |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A | |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS | |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
References
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
- Hampson, B., Ceccarelli, J. Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here? BioProcess International. 14 (4), (2016).
- Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. Mapping success for commercial cell therapy manufacturing. BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).
- Heathman, T. R., et al. The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges. Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).
- Lipsitz, Y. Y., et al. A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products. Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2. BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).
- Hanley, P. J., et al. Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System. Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).
- Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like? Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).
- Galipeau, J., Sensebe, L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
- Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry? Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).
- James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
- Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies. Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).
- Rafiq, Q. A. Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture. Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).
- Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE). Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).
- Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra™) for clinical-scale generation of dendritic cells. Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).
- Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study. Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).
- Whitford, W. G. Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. Subramanian, G. , (2014).
- Scinogy. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH & CONCENTRATION. , https://www.scinogy.com/projects (2019).
- Yu, D., et al. Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule. Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).
- Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways. Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).
- Ling, W., et al. Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment. Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).
- Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Zhu, F., et al. Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products. Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).
- Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch. Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).
- Stroncek, D. F., et al. Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies. Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).
- Mfarrej, B., et al. Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts. Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).
- Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation. Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).
- Lim, R., et al. First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study. Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).
