Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Автоматизированная центробежная система Counterflow для мелкомасштабной обработки ячеек

Published: December 12, 2019 doi: 10.3791/60423

Summary

Автоматизация является ключом к наращиванию масштабов и управлению затратами в производстве ячеек. Данная рукопись описывает использование устройства обработки центробежных клеток против потока для автоматизации буферного обмена и шагов концентрации клеток для мелкомасштабной биообработки.

Abstract

Успешная коммерциализация генной и клеточной терапии требует производственных процессов, которые являются экономически эффективными и масштабируемыми. Обмен буферами и концентрация продукта являются важными компонентами для большинства производственных процессов. Однако на ранних стадиях разработки продукта эти шаги часто выполняются вручную. Ручная тупиковая центробежка для буферного обмена является трудоемкой, дорогостоящей и не масштабируемой. Закрытая автоматизированная система может эффективно устранить этот трудоемкий шаг, но реализация может быть сложной задачей. Здесь мы описываем недавно разработанное устройство обработки ячеек, которое подходит для обработки ячеек малого и среднего масштаба и направлено на преодоление разрыва между ручной обработкой и крупномасштабной автоматизацией. Этот протокол может быть легко применен к различным типам и процессам клеток путем изменения скорости потока и скорости центрифугирования. Наш протокол продемонстрировал высокое восстановление клеток с более коротким временем обработки по сравнению с ручным процессом. Клетки, извлеченные из автоматизированного процесса, также поддерживали скорость распространения. Устройство может быть применено в качестве модульного компонента в закрытом производственном процессе для размещения таких этапов, как буферный обмен, формулировка ячейки и криоконсервация.

Introduction

Ландшафт современной медицины быстро преобразился благодаря последним разработкам в области генной и клеточной терапии (GCT). Будучи одной из наиболее быстро растущих областей в области трансляционных исследований, сектор GCT также сталкивается с уникальными и беспрецедентными проблемами. В дополнение к надежным клиническим результатам, эффективные и экономически эффективные производственные процессы имеют важное значение для коммерческого успеха GCT, который особенно трудно достичь в мелкомасштабной обрабатывающей промышленности1. Стоимость времени, труда и гарантий качества увеличивается, когда каждая партия клеток производит только несколько доз на одного пациента, а не сотни или тысячи. В отличие от аллогенной клеточной терапии, в которой производственные процессы больше похожи на производство антител и рекомбинантных белков, аутологичные клеточные методы лечения, как правило, производятся как мелкомасштабные операции1. Как относительно новое явление в биофармацевтическом производстве2, варианты мелкомасштабной обработки клеток в настоящее время весьма ограничены.

Буферный обмен имеет важное значение для производства клеток. Это один из процессов, происходящих вниз по течению, где клетки удаляются из культурных носителей и концентрируются для криоконсервации или инфузии. В настоящее время мелкомасштабное производство клеток часто применяется процессы, аналогичные тем, которые в академических исследований настройки и опирается на специализированные чистые комнаты для поддержания бесплодия3. Ручные процессы вниз по течению часто используют центрифуги скамейки для гранул и повторной работы ячеек для уменьшения объема и буферного обмена. Эти открытые процессы являются дорогостоящими (т.е. обслуживание рабочей силы и чистой комнаты) и имеют ограниченные производственные мощности, которые не являются идеальными для коммерческого производства2,3.

Внедрение автоматизации было предложено в качестве решения для повышения эффективности производства и достижения коммерческих производств2. Стерильность не может быть достигнута в клеточных продуктах с помощью традиционных методов, используемых для биопрепаратов, таких как гамма-облучение или терминальная фильтрация конца. Вместо этого, автоматизированная закрытая система развернута для снижения риска загрязнения и операторов, полагающих на чистые помещения для поддержания стерильности4. Автоматизация процессов также решает проблему масштабируемости, либо имея несколько систем, работающих параллельно (масштабирование), либо увеличивая вычислительную мощность отдельного устройства (масштабирование), что, в свою очередь, сводит к минимуму изменчивость между операторами. Кроме того, анализ затрат моделирования аутологичных методов лечения позволяет предположить, что автоматизация может снизить затраты на производство5,6. Тем не менее, никакой выгоды не было найдено в аутологичном клиническом испытании стволовых клеток, где автоматизированная производственная платформа была использована7, предполагая, что рентабельность автоматизации может зависеть от индивидуального производственного процесса.

Существуют различные стратегии, в которых автоматизация может быть введена в существующий производственный процесс. Этого можно достичь либо путем внедрения полностью интегрированной платформы, либо модульной цепочки обработки. Есть несколько полностью интегрированных платформ, коммерчески доступных для аутологического производства клеток, таких как CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Кокон (Octane Biotech) и Квантовая (Terumo BCT). Эти интегрированные платформы, которые часто называют «GMP-in-a-box», имеют низкие требования к инфраструктуре и просты в эксплуатации. Однако производственные мощности полностью интегрированной установки могут быть ограничены инкубатором, подключенным к системе. Например, культивирование мощности Prodigy ограничено его 400 мл камеры8 и квантовый картридж имеет предельную площадь поверхности установлен 2,1 м2 (эквивалент 120 T175 колбы)7, которые не могут быть достаточными для пациентов, нуждающихся в более высоких дозах клеток9,10. Кроме того, Prodigy и Квантовая имеют общий атрибут, который ограничивает их использование: операционная единица занята одной партии ячеек на протяжении всего периода расширения ячейки, тем самым ограничивая количество партий, которые могут быть изготовлены каждой единицей11. Модульный подход к автоматизации заключается в создании производственной цепочки с несколькими модульными агрегатами, которая имитирует коммерческий производственный процесс12,13. Этот подход, который отделяет прибор культуры от прибора мытья клетки, может таким образом увеличить эффективность изготавливания. Идеальным устройством обработки будет устройство, адаптируемое и масштабируемое для производственных потребностей12.

Технология Counterflow centrifugation (CFC), которая восходит к 1970-м годы, имеет долгую историю в обработке клеток14. Он достигает концентрации клеток и разделения, балансируя центробежную силу с силой контрпотока. Как правило, суспензия ячейки входит из узкого конца камеры клетки при постоянной скорости потока при условии центробежной силы(рисунок 1А). Поток жидкости оказывается в противоположном направлении к центробежной силе. Это называется силой встречного потока, которая образует градиент в ячейке. Сила контрпотока затем уменьшается по мере того как камера клетки расширяет далеко от кончика конус-образной камеры клетки. Клетки с более высокой плотностью и большим диаметром имеют более высокую скорость осадка, и таким образом они достигают силового равновесия к кончику конусообразной клеточной камеры. Меньшие частицы могут достичь равновесия к основанию камеры или быть слишком малы, чтобы быть сохранены в камере и будут смыты. Технология CFC в основном известна своим применением в обработке продуктов афересеза крови, таких как изолирующие моноциты для дендритной клеточной терапии15,16. С точки зрения буферного обмена, технология ХФУ применяется только в крупномасштабном производстве17 и до сих пор не используется для меньшего масштаба производства аутологичной клеточной терапии.

Для удовлетворения потребности в подходящем устройстве для мелкомасштабного производства ячеек, автоматизированное устройство ХФУ (см. Таблица материалов), был недавно разработан18. Автоматизированное устройство обработки клеток использует технологию центрифугирования контрпотока для удаления мусора и облегчения буферного обмена. Устройство выполняет буферный обмен с одноразовым набором, который может быть стерильным подключен к сумке для передачи ячейки, что позволяет обрабатывать ячейки в стерильной, закрытой системе. Здесь мы исследуем использование центробежного устройства противпотока для выполнения буферного обмена в культурах клеток млекопитающих в автоматизированных протоколах. В этом исследовании мы протестировали протокол буферного обмена с использованием ячеек Jurkat и мезенхимальных стромальных ячеек (MSC) для моделирования типов неприверженных и придерживающихся клеток, соответственно. Клетки jurkat увековечены Т-клетки часто используются для изучения острого Т-клеточного лейкоза19,20. MSCs взрослые стволовые клетки, которые были изучены в клинических испытаниях на людях для широкого спектра заболеваний9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка реагентов и ячеек для буферного обмена

  1. Подготовка буферов (см. Таблица материалов) в классе 2 ламинарный капот потока. Используя шприц и игольную сборку, удалите 50 мл соблюй раствора из солен-мешка 500 мл. Замените это с 50 мл 20% человеческого сыворотки альбумина (HSA), чтобы сделать 2% HSA в сольном, который будет служить в качестве буфера стирки.
  2. Удалите клетки из сосудов культуры и выполнить количество клеток, чтобы определить количество исходных клеток и жизнеспособность путем трипан синий исключение. Загрузите клетки в сумку для передачи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе юркатные клетки культивировались в RPMI, а МСК культивировались в DMEM:F12. Оба носителя были дополнены 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% антибиотико-антимикотический раствор. Клетки были культивированы при 37 градусах Цельсия с 5% CO2. Для MSCs или адептов клеток, добавить фермент пищеварения (например, трипсин) в культуре сосудов для того, чтобы отделить клетки, и утолить культуры средств массовой информации, как только клетки отделены. В этом протоколе использовалась сумка для передачи, поскольку ячейки были расширены в сосудах культуры. Однако, если клетки культивируются в мешке культуры клеток, он может быть непосредственно подключен к одноразовому набору через стерильную сварку трубки. В этом протоколе для каждого запуска использовались 3 х 107 юркатных ячеек или 1 x 107 МСК, где ячейки были приостановлены в 40 мл культурных носителей.
    1. Загрузите клетки в мешок передачи (см. Таблица материалов)с помощью шприца и иглы сборки, если стерильная трубка сварщика доступна для подключения передачи мешок для одного использования комплект обработки.
    2. Кроме того, используйте пару автоматических ножниц, чтобы сократить соединительной трубки с около 10 см оставаясь прилагается к передаче мешок и добавить женский разъем Luer в конце трубки. Используйте шприц, чтобы аспирировать клетки и носители, а затем подключить шприц к разъему Luer и загрузить ячейки в сумку передачи.
  3. Подключите мешок, содержащий клетки, мыть буфер мешок, содержащий 500 мл мыть явки буферподготовлен в шаге 1.1, мешок отходов, и сбор шприца для одноразовых комплект(Рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соединительное положение каждой сумки зависит от настроек в программе. В этом протоколе мы подключили мешок отходов в положении А, вымойте буфер в положении B, сотовый мешок в позициях D и F, и сбор шприца в положении H(Рисунок 1C).

2. Программа автоматизированного протокола обмена буферами

  1. Откройте графический пользовательский интерфейс (GUI) устройства и нажмите кнопку"START"на ноутбуке или планшете. Затем "Открыть" существующий протокол или нажмите "Новый", чтобы создать новый.
  2. Используйте кнопку«Вперед»и«Назад»,чтобы перемещаться по каждому шагу, выберите клапаны, которые будут открыты/закрыты, центробежная скорость, скорость насоса, направление насоса и триггеры действий. Параметры для каждого шага суммируются в таблице 1. Затем сохраните протокол.

3. Настройка машины

  1. Поместите одноразовый набор обработки на машине и повесить подключенные сумки соответственно. Нажмите на красную кнопку"Стоп/Перезагрузка",чтобы сбросить все клапаны в закрытое положение по умолчанию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Машина будет выполнять тест, когда дверь закрыта, чтобы убедиться, что комплект был помещен правильно и что все клапаны функционируют надлежащим образом.
  2. Подключите графический интерфейс к процессору и нажмите кнопку"Подключите". Затем загрузите сохраненную программу. Когда загорается зеленая кнопка«Игра»,это указывает на то, что протокол готов к запуску.
  3. Откройте ручные зажимы для трубки сумки для передачи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если оператор забудет открыть зажимы, устройство остановится и появится предупреждение датчика давления. Нажмите кнопку«Стоп»,чтобы сбросить устройство и открыть зажимы, чтобы начать снова.

4. Автоматизированный буферный обмен

  1. Пресса"Начало",чтобы инициировать программу буферного обмена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы вручную изменить автоматизированный процесс, нажмите кнопку«Следующая»,чтобы перейти к следующему шагу, прежде чем достичь«Триггера»или нажмите«Пауза»,чтобы приостановить процесс. Это позволит рециркулировать клетки через комплект, сохраняя при этом только клапаны J и K открытыми(рисунок 1C).
  2. В конце шага автоматизации 6(таблица 1),процесс будет приостанавливаться, когда воздух в ныне опустевом мешке вызывает датчик пузыря. Нажмите "Далее", чтобы переместить процесс на следующий шаг, если мешок действительно пуст, или нажмите "Пауза ",чтобы возобновить обработку, если датчик был вызван пузырь в линии.

5. Сбор и отбор проб клеток

  1. Когда автоматизированный процесс закончен, закройте все зажимы труб. Откройте дверь и выняйте одноразовый комплект из устройства. Отключите шприц для сбора ячеек для последующих процессов. Возьмите образец собранных ячеек для подсчета клеток и проверки жизнеспособности (см. шаг 6.2).

6. Проверка процесса

  1. Выполняйте эксперименты управления с помощью ручного протокола обмена буфером.
    1. Центрифуги подвески клеток на 200 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и resuspend клетки с 30 мл буфера мытья клеток. Centrifuge подвески ячейки снова на 200 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и resuspend клетки с 10 мл буфера мытья клеток.
  2. Выполняйте подсчет клеток с помощью промо-экспресса синий вывод о том, чтобы оценить жизнеспособность клеток с помощью автоматизированного счетчика клеток.
  3. Выполните оценку МТС для количественной оценки пролиферации клеток на 2, 24 и 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ МТС был выполнен на 96 хорошо ткани культуры пластины в соответствии с инструкциями производителя. После процесса обмена буфером было покрыто 100 букв ел-ликот средств массовой информации клеточной культуры (содержащее 10 000 ячеек джурката или 1500) на одну скважину. В каждый момент времени в каждую скважину добавляли 20 реагентов МТС и инкубировали по 2 ч при 37 градусах Цельсия. Абсорбция оценивалась в 490 нм с помощью считывателя пластин.
  4. Выполните функциональные анализы, чтобы сравнить влияние автоматизированного процесса по сравнению с ручным процессом на ячейки Jurkat и функцию MSC.
    1. Культура юркатных клеток в 96-колодчатой пластине при плотности 1 х 106 клеток/мл стимулируется 50 нг/мЛ форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA) и 1 мкг/мл иономицина (коктейль для клеточной стимуляции) в DMEM:F12 СМИ, содержащие 10% плодовой сыворотки (FBS) для 24 h. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
    2. Измерьте производство интерлейкина-2 из культуры супернатанта с помощью анализа ELISA на основе бисера (см. Таблица материалов)в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Культура MSCs в 12 хорошо пластины при плотности 10000 клеток / см2 в 1 мл DMEM: F12 сми, содержащие 10% FBS дополнены интерферон-50 единиц / мл для 48 ч. Соберите супернатант для цинюренина концентрации анализ для измерения индолеамина 2,3-диоксигена (IDO) ферментной активности MSCs .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом протоколе мы использовали ячейки Jurkat и MSC в качестве репрезентативных примеров для демонстрации автоматизированного процесса обмена буферами. В ходе процесса, jurkat клетки и MSCs разделяют те же шаги обработки с различиями в центробежной силы и скорости насоса, которые контролируют скорость потока (Таблица 1). На рисунке 2 показаны репрезентативные изображения, снятые камерой о том, как жидкое клеточное ложе может появиться в процессе обмена буфером. Как правило, жидкостная клеточная кровать будет напоминать изображение на рисунке 2А,где клетки накапливаются в середине и к передней части конуса с небольшим пространством на кончике камеры, где клетки не накапливаются и отверстие ячейки загрузки вход виден. Сжимающая сярют -тлк может быть сжата(рисунок 2B)при введении нового буфера, который находится на другой вязкости или плотности. В этом протоколе скорость насоса была снижена с 30-35 мл/мин до 20 мл/мин в начале стирки. После того, как камера была заполнена новым буфером, скорость насоса была возвращена в нормальное русло, чтобы предотвратить пеллетные клетки на кончике камеры. Высокая скорость потока(рисунок 2C) может быть применена для выбора для живых клеток, потому что мертвые клетки меньше и легче и могут быть вытеснены из камеры за счет увеличения скорости потока.

Автоматизированный процесс буферного обмена был достигнут путем сначала концентрации клеток, а затем введения буфера стирки, который был около 10x объема жидкостной клеточной кровати. Затем ячейки были сформулированы до нужного объема. Эти три этапа обработки были разработаны в том, чтобы следовать тем же принципам, что и ручной буферный обмен. Как правило, двухцикловая центрифугация (200 х г,5 мин) используется для выполнения ручного буферного обмена, в котором клетки гранулируются для концентрации, повторно стираются, затем центрифугируются снова и переоходят на конечный объем. Время обработки автоматизированных процессов было короче по сравнению с ручными(рисунок 3). Скорость восстановления между ручными и автоматизированными процессами была одинаковой как для ячеек Jurkat, так и для MSC, и жизнеспособность клеток не была затронута процессом(рисунок 4). Качество клеток было проверено с помощью пролиферации клеток (MTS assay) и производства цитокинов/ферментов. Восстановленные клетки показали аналогичные показатели пролиферации между руководством и автоматизированными процессами(рисунок 5А). Уровень производства интерлейкина-2 из ячеек Jurkat и IDO активность MSCs также были сопоставимы между двумя группами(рисунок 5B и 5C).

Номер шага Описание Открытые клапаны Скорость центрифуги (г) Скорость насоса (мл/мин) Триггеры
1 Прайм-трубка от B до A A, B, K 10 50 Объем: 45 мл
2 Заполните пузырь ловушка от А до Б A, B, K 100 50 (обратный) Объем: 10 мл
3 Премьер трубки от А до D A, D, K 100 50 (обратный) Объем: 2 мл
4 Премьер трубки J в K J, K 100 50 Объем: 3 мл
5 Нагрузка ячейки - первоначальный старт D к G D, K, G 1600 (Jurkat) 1500 (MSCs) 25 (Джуркат) 30 (MSCs) Объем: 100 мл
6 Загружайте ячейки с пузырем, обнаруживая «При обнаружении пузыря/пустых труб, программа будет приостанавливаться и ждать команды оператора, нажимать «паузу» или «следующий» A, D, K последний шаг 30 (Джуркат) 35 (MSCs) Датчик пузыря D
7 Пустые оставшиеся носители на трубе порта D A, D, K последний шаг последний шаг Объем: 1,5 мл
8 Вымойте клетки 1 A, B, K последний шаг 20 Объем: 20 мл
9 Наращивание скорости мытья A, B, K последний шаг 35 Таймер: 5 секунд скорость ramping
10 Вымойте клетки 2 A, B, K последний шаг последний шаг Объем: 20 мл
11 Подготовка к сбору урожая J, K последний шаг последний шаг Таймер: 2 секунды
12 Восстановление клеток для вывода и разбавления целевого объема B, J, K последний шаг 60 (Обратный) Объем: 10 мл
Примечание: «Последний шаг» — это параметр для центрифугии скорости и скорости насоса в графическом интерфейсе.

Таблица 1: Автоматизированная настройка GUI обмена буфером для ячеек Jurkat и MSC.

Figure 1
Рисунок 1: Система обработки центробежных клеток Counterflow. (A) Схема, иллюстрирующая принцип центрифугации контрпотока. Сила контрпотока присутствует в градиенте внутри клеточной камеры. В то время как центрифугирование (серая стрелка), клетки с большими диаметрами получают более высокую силу осадки, в которой клетки достигают равновесия силы к узкому концу камеры, образуя жидкостную клетку кровати. Сотовый мусор и мелкие частицы, которые слишком малы, чтобы оставаться в камере смываются. (B) Система центробежной обработки контрпотока состоит из процессорного устройства и одноразового набора обработки. (C) Конфигурация одноразового комплекта для протокола обмена буфером. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Флуидизированная клеточная кровать в камере клеток. Репрезентативные изображения жидкостной клеточной кровати под(A)среднего, (B) низким, и (C) высокой скоростью потока. Пунктирная линия указывает на область жидкой клеточной кровати в камере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Сравнение времени обработки клеток ячеек Jurkat и MSCs с ручной и автоматизированной обработкой. (n 3-4 в каждой группе, данные представлены как средние SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Сравнение жизнеспособности клеток и восстановления живых клеток юркатов и МСК с помощью ручной и автоматизированной обработки. Жизнеспособность клетки (A) и восстановление клетки в реальном маштабе времени (B) были измерены asay исключения trypan синим с помощью автоматизированного счетчика клетки. Восстановление живых клеток было сокращено при отсутствии сыворотки или при обработке только 3 х 106 или 1 x 106 клеток. (n 4-9 в каждой группе, данные представлены как средние SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: пролиферация ячеек и функция ячейки от ручной и автоматизированной обработки. (A)MtS асссис юркат ячеек и MSCs были выполнены на 2, 24, и 48 ч после буферного обмена. Качество восстановленных клеток оценивалось производством Интерлейкина-2 из клеток Jurkat(B),и активностью IDO в МСК(C). (n 4-8 в каждой группе, данные представлены как средние SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Флудизированная стабильность клеточной кровати с различной скоростью потока. Для каждого типа клеток были выполнены два процесса. В одном процессе, либо 3 х 107 Jurkat клеток или 1 х 107 MSCs. Во втором процессе было использовано 10x количество ячеек. В обоих процессах, 10 мл клеточной элутриат был собран из порта A с различными скоростями потока, используя центрифугию скорости, указанной в этом протоколе (1600 х г для клеток Jurkat и 1500 х г для MSC). Количество клеток в элютриате было определено и представлено в процентах от общего количества клеток, загруженных в камере. (n No 3 для каждой группы, данные представлены как средние SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанный автоматизированный протокол обмена буфером прост и удобен для пользователя. Тем не менее, есть несколько ключевых шагов в этом протоколе, которые имеют решающее значение и требуют особого внимания. По нашему опыту, при обработке более крупных клеток, таких как MSC (средний диаметр 10-15 мкм) каждый запуск должен включать по крайней мере 1 х 107 клеток для достижения оптимального восстановления клеток (Рисунок 4B). Обработка небольших клеток, таких как клетки Jurkat (средний диаметр 10 мкм), требует около 3 х 107 клеток для достижения стабильной жидкостной клеточной кровати(рисунок 4B). Когда число клеток слишком низкое, клетки, скорее всего, будут удалены из жидкостной кровати, что повлияет на окончательное восстановление клеток. Кроме того, мы сравнили скорость потери ячейки на разных скоростях насоса при применении постоянной центробежной скорости. Здесь мы заметили, что потеря клеток увеличилась с скоростью потока(Рисунок 6), что связано с растущей нестабильностью жидкости кровать при более высоких скоростях потока. Тем не менее, процент потери клеток был ниже, когда 10x количество клеток были загружены в камеру, что свидетельствует о том, что более высокая скорость насоса может быть применен при обработке большего числа клеток, чтобы быстрее обработки. В шаге 5 процесса, 100 мл культурных носителей была рециркулирована из камеры обратно в мешок передачи клеток, чтобы позволить жидкостной кровати, чтобы сформировать и стабилизироваться до сокращения объема и буферобмена обмена. Если концентрация клеток низкая (например, ниже 0,2 х 10 6/мл), возможно, потребуется расширить этап рециркуляции, чтобы позволить достаточное количество клеток сформировать жидкостную клеточную кровать. Аналогичным образом, если концентрация клетки высока, шаг рециркуляции может быть сокращен.

Наличие сыворотки в буфере для мытья также имеет решающее значение для восстановления клеток. Предыдущие исследования показали, что гидродинамический стресс может вызвать гибель некротической клетки при отсутствии буферных белков22,23. Динамика потока центробежной системы встречного потока достаточно сложна. В этом протоколе, скорость восстановления клеток снизилась примерно до 70%, когда процесс был выполнен в отсутствие сыворотки(Рисунок 4B). Хотя точный механизм не ясен, наличие сыворотки в культурных носителях или альбумин в буферах стирки удалось смягчить потенциальное механическое повреждение клеток. Для приложений, требующих сывороточных буферов, гидроксиэтил крахмал и декектин 40 являются примерами небелковых добавок, которые часто используются в производстве клеток для защиты от гидродинамического стресса24,25.

Технология центрифугации контрпотока была использована в крупномасштабном биофармацевтическом производстве и переработке продуктов крови17. Применение технологии CFC в мелкомасштабном производстве клеток (т.е. 0,1-10 л) часто ограничивается изоляцией моноядерных клеток от продуктов афереза, таких как Elutra (Terumo BCT)26, в котором требуется дополнительное ручное вмешательство для выполнения шагов по мытью и концентрации. Другие мелкомасштабные платформы обработки клеток включают мембранные системы буферного обмена, такие как LOVO (Fresenius Kabi)27 и вертикальное отделение центрифугации, такие как Sepax (GE Healthcare)28. Хотя это трудно выполнить прямое сравнение между устройствами, одним из преимуществ этого контрпотока центробежного устройства является его способность доставить очень небольшие объемы вывода (минимум 5 мл), который является наименьшим среди имеющихся в настоящее время платформ обработки ячеек. Небольшой объем выхода подходит для таких применений, как формулирование клеток для локальных инъекций29 или настои для новорожденных30. Камера, встроенная в устройство, также является уникальной особенностью, которая обеспечивает визуализацию жидкостной клеточной кровати на этапе разработки процесса.

Одним из ограничений технологии ХФУ является то, что она чувствительна к размеру и плотности клеток. При настройке протокола обмена буфера для другого типа ячейки, представленный здесь, должен служить ориентиром для пользователей для оптимизации в соответствии с их потребностями, имея в виду размер их ячеек, представляющих интерес, и плотность их подвески клеток. Хотя текущий протокол может быть пригоден для обработки до 5 л носителей, время обработки будет существенно увеличено (т.е. 1-2 л). Важно отметить, что влияние длительного времени обработки на качество клеток не было изучено в настоящем исследовании.

Будущие исследования будут оценивать влияние скорости обработки и времени обработки на функции ячейки, чтобы определить максимальную вычислительную мощность устройства. Кроме того, в будущих исследованиях могут быть рассмотрены другие виды применения, такие как удаление диметилсульфида (ДМСО) из криоконсервированных продуктов и селективное удаление мертвых клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SW, IF и DJ являются coO, cTO и генеральным директором Scinogy Pty. Ltd. Доступ к устройству ХФУ также предоставила компания Scinogy.

Acknowledgments

Эта работа поддерживается Викторианской правительством оперативной программы поддержки инфраструктуры, а также викторианской правительства технологии ваучер, предоставляемый Департаментом экономического развития, рабочих мест, транспорта и ресурсов. RL является получателем Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Карьера развития стипендий. AL является лауреатом Австралийской премии последипломного образования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 ml Luer lock syringes BD 302830
20% Human serum albumin (HSA) CSL Behring AUST R 46283
4-(Dimethylamino)benzaldehyde Sigma-Aldrich 156477-25g
500ml IV saline bag Fresenius Kabi K690521
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240112
Automated cell counter (Countess) Thermo Fisher Scientific N/A
Cell counting chamber slides Thermo Fisher Scientific C10228
Cell stimulation cocktail (500x) Thermo Fisher Scientific 00-4970-93
Cell transfer bags Terumo T1BBT060CBB
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3582
Centrifuge Eppendorf 5810R
DMEM: F12 media Thermo Fisher Scientific 11320082
EnVision plate Reader Perkin Elmer N/A
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 10099141
Human Interleukin 2 (IL2) Kit Perkin Elmer Al221C
Luer (female) fittings CPC LF41
PC laptop or PC tablet device ASUS N/A
Plate reader (SpectraMax i3) Molecular Device N/A
Recombinant Human IFN-γ PeproTech 300-02
Rotea counterflow centrifuge cell processing device Scinogy N/A
Rotea single-use processing kit Scinogy N/A
RPMI media Thermo Fisher Scientific 11875119
Surgical scissors ProSciTech 420SS
Trichloroacetic acide Sigma-Aldrich T6399-250g
Trypan Blue stain Thermo Fisher Scientific T10282
Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) Thermo Fisher Scientific 12604013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
  2. Hampson, B., Ceccarelli, J. Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here? BioProcess International. 14 (4), (2016).
  3. Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. Mapping success for commercial cell therapy manufacturing. BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).
  4. Heathman, T. R., et al. The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges. Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).
  5. Lipsitz, Y. Y., et al. A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products. Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).
  6. Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2. BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).
  7. Hanley, P. J., et al. Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System. Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).
  8. Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like? Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).
  9. Galipeau, J., Sensebe, L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
  10. Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry? Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).
  11. James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
  12. Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies. Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).
  13. Rafiq, Q. A. Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture. Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).
  14. Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE). Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).
  15. Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra™) for clinical-scale generation of dendritic cells. Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).
  16. Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study. Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).
  17. Whitford, W. G. Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. Subramanian, G. , (2014).
  18. Scinogy. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH & CONCENTRATION. , https://www.scinogy.com/projects (2019).
  19. Yu, D., et al. Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule. Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).
  20. Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways. Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).
  21. Ling, W., et al. Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment. Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).
  22. Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).
  23. Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
  24. Zhu, F., et al. Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products. Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).
  25. Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch. Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).
  26. Stroncek, D. F., et al. Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies. Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).
  27. Mfarrej, B., et al. Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts. Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).
  28. Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation. Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).
  29. Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).
  30. Lim, R., et al. First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study. Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).

Tags

Биоинженерия Выпуск 154 центрифуга встречного потока буферный обмен производство клеток автоматизированная биообработка процесс вниз по течению мезенхимальные стволовые клетки
Автоматизированная центробежная система Counterflow для мелкомасштабной обработки ячеек
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, A., Wilson, S., Fitzpatrick, I., More

Li, A., Wilson, S., Fitzpatrick, I., Barabadi, M., Chan, S. T., Krause, M., Kusuma, G. D., James, D., Lim, R. Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing. J. Vis. Exp. (154), e60423, doi:10.3791/60423 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter