Summary
La automatización es clave para aumentar el escalado y la gestión de costos en la fabricación de células. Este manuscrito describe el uso de un dispositivo de procesamiento de células centrífugas de contraflujo para automatizar los pasos de intercambio de búferes y concentración celular para el bioprocesamiento a pequeña escala.
Abstract
La comercialización exitosa de terapias basadas en genes y células requiere procesos de fabricación rentables y escalables. El intercambio de búferes y la concentración del producto son componentes esenciales para la mayoría de los procesos de fabricación. Sin embargo, en las primeras etapas del desarrollo del producto, estos pasos a menudo se realizan manualmente. La centrifugación sin salida manual para el intercambio de búferes es laboriosa, costosa y no escalable. Un sistema automatizado cerrado puede eliminar eficazmente este paso laborioso, pero la implementación puede ser difícil. Aquí, describimos un dispositivo de procesamiento celular recientemente desarrollado que es adecuado para el procesamiento de células a pequeña y mediana escala y tiene como objetivo cerrar la brecha entre el procesamiento manual y la automatización a gran escala. Este protocolo se puede aplicar fácilmente a varios tipos y procesos de células modificando el caudal y la velocidad de centrifugación. Nuestro protocolo demostró una alta recuperación de células con tiempos de procesamiento más cortos en comparación con el proceso manual. Las células recuperadas del proceso automatizado también mantuvieron sus tasas de proliferación. El dispositivo se puede aplicar como un componente modular en un proceso de fabricación cerrado para adaptarse a pasos como el intercambio de búferes, la formulación de células y la criopreservación.
Introduction
El panorama de la medicina moderna se ha transformado rápidamente a través de los recientes desarrollos en terapias genéticas y basadas en células (GCT). Como uno de los campos de más rápido crecimiento en la investigación traslacional, el sector GCT también se enfrenta a desafíos únicos y sin precedentes. Además de los resultados clínicos sólidos, los procesos de fabricación eficientes y rentables son esenciales para el éxito comercial de GCT, que es particularmente difícil de lograr en la fabricación a pequeña escala1. El costo del tiempo, la mano de obra y las garantías de calidad se magnifican cuando cada lote de células solo produce unas pocas dosis para un paciente en lugar de cientos o miles. A diferencia de las terapias celulares alogénicas en las que los procesos de fabricación son más parecidos a la producción de anticuerpos y proteínas recombinantes, las terapias celulares autólogas se producen típicamente como operaciones a pequeña escala1. Como fenómeno relativamente nuevo en la fabricación biofarmacéutica2, las opciones para el procesamiento celular a pequeña escala son actualmente bastante limitadas.
El intercambio de búferes es esencial para la fabricación celular. Es uno de los procesos posteriores donde las células se eliminan de los medios de cultivo y se concentran para la criopreservación o la infusión. Actualmente, la fabricación de células a pequeña escala a menudo aplica procesos similares a los del entorno de investigación académica y se basa en salas limpias especializadas para mantener la esterilidad3. Los procesos manuales aguas abajo a menudo utilizan centrífugas de sobremesa para peletizar y resuspender células para la reducción de volumen y el intercambio de búferes. Estos procesos abiertos son costosos (es decir, trabajo y mantenimiento de salas limpias) y tienen una capacidad de fabricación limitada, que no son ideales para la producción comercial2,3.
La implementación de la automatización se ha propuesto como una solución para mejorar la eficiencia de fabricación y lograr producciones a escala comercial2. La esterilidad no se puede lograr en productos a base de células a través de métodos tradicionales utilizados para los productos biológicos, como la irradiación gamma o la filtración terminal. En su lugar, se despliega un sistema cerrado automatizado para reducir los riesgos de contaminación y los operadores que dependen de salas limpias para mantener la esterilidad4. La automatización de procesos también aborda el problema de la escalabilidad al tener varios sistemas ejecutándose en paralelo (escalado horizontal) o aumentando la capacidad de procesamiento de un dispositivo individual (escalado vertical), lo que a su vez minimiza la variabilidad entre los operadores. Además, el análisis de modelado de costes de terapias autólogas sugiere que la automatización puede reducir el coste de fabricaciónde 5,6. Sin embargo, no se encontró ningún beneficio de costo en un ensayo clínico autólogo de células madre donde se utilizó una plataforma de fabricación automatizada7,lo que sugiere que el costo beneficio de la automatización puede depender del proceso de fabricación individual.
Existen diferentes estrategias en las que la automatización se puede introducir en un proceso de fabricación existente. Esto se puede lograr mediante la implementación de una plataforma totalmente integrada o una cadena de procesamiento modular. Hay varias plataformas totalmente integradas disponibles comercialmente para la fabricación de células autólogas, como CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) y Quantum (Terumo BCT). Estas plataformas integradas, que a menudo se describen como "GMP-in-a-box", tienen bajas demandas de infraestructura y son fáciles de operar. Sin embargo, la capacidad de fabricación de una configuración totalmente integrada puede estar restringida por la incubadora conectada al sistema. Por ejemplo, la capacidad de cultivo de Prodigy se limita a su cámarade 400 ml 8 y el cartucho Quantum tiene una superficie limitante establecida en 2,1 m2 (equivalente a 120 matraces T175)7, que puede no ser suficiente para pacientes que requieren dosis celulares más altas9,10. Además, Prodigy y Quantum tienen un atributo común que limita su uso: la unidad operativa está ocupada por un solo lote de celdas durante todo el período de expansión de la célula, limitando así el número de lotes que pueden ser fabricados por cada unidad11. El enfoque modular de la automatización es crear una cadena de fabricación con múltiples unidades modulares que simula el proceso de fabricación comercial12,13. Este enfoque, que separa el dispositivo de cultivo del dispositivo de lavado celular, puede maximizar así la eficiencia de fabricación. Un dispositivo de procesamiento ideal sería uno que sea adaptable y escalable a las necesidades de fabricación12.
La tecnología de centrifugación de contraflujo (CFC), que se remonta a la década de 1970, ha tenido una larga historia en el procesamiento celular14. Logra la concentración y separación celular equilibrando la fuerza centrífuga con una fuerza de contraflujo. Típicamente, una suspensión celular entra desde el extremo estrecho de una cámara celular bajo un caudal constante mientras está sujeta a una fuerza centrífuga(Figura 1A). El flujo del fluido se ejerce en la dirección opuesta a la fuerza centrífuga. Esto se conoce como la fuerza de contraflujo, que forma un gradiente dentro de la cámara celular. La fuerza de contraflujo disminuye a medida que la cámara celular se ensancha lejos de la punta de la cámara celular en forma de cono. Las células con mayor densidad y diámetro más grande tienen una mayor tasa de sedimentación, y por lo tanto alcanzan el equilibrio de fuerza hacia la punta de la cámara celular en forma de cono. Las partículas más pequeñas pueden alcanzar el equilibrio hacia la base de la cámara o ser demasiado pequeñas para ser retenidas en la cámara y serán lavadas. La tecnología CFC es principalmente conocida por su aplicación en el procesamiento de productos de aféresis sanguínea, tales como el isolating monocitos para terapias de células dendríticas15,16. En términos de intercambio de búferes, la tecnología CFC sólo se ha aplicado en la fabricación a gran escala17 y todavía no se ha utilizado para la fabricación a menor escala de terapias celulares autólogas.
Para hacer frente a la necesidad de un dispositivo adecuado para la fabricación de células a pequeña escala, se desarrolló recientemente un dispositivo CFC automatizado (Ver Tabla de Materiales),18. El dispositivo automatizado de procesamiento de celdas utiliza la tecnología de centrifugación de contraflujo para eliminar los desechos celulares y facilitar el intercambio de búferes. El dispositivo realiza el intercambio de búferes con un kit de un solo uso que se puede conectar estérilmente a una bolsa de transferencia de celda, lo que permite que las células se procesen dentro de un sistema estéril y cerrado. Aquí, investigamos el uso de un dispositivo centrífugo de contraflujo para realizar el intercambio de búferes en cultivos celulares de mamíferos en protocolos automatizados. En este estudio, probamos el protocolo de intercambio de búferes utilizando células Jurkat y células estromales mesenquimales (MSC) para modelar tipos de células no adherentes y adherentes, respectivamente. Las células de Jurkat son células T inmortalizadas a menudo utilizadas para el estudio de la leucemia aguda de células T19,20. Los MSC son células madre adultas que se han estudiado en ensayos clínicos en humanos para una amplia gama de enfermedades9.
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Protocol
1. Preparación de reactivos y células para el intercambio de tampón
- Prepare los búferes (consulte Tabla de materiales)en una campana de flujo laminar de clase 2. Con una jeringa y un conjunto de agujas, retire 50 ml de solución salina de una bolsa salina de 500 ml. Reemplace esto con 50 ml de albúmina sérica humana (HSA) al 20% para hacer un 2% de HSA en solución salina, que servirá como tampón de lavado.
- Quite las celdas de los recipientes de cultivo y realice un recuento de celdas para determinar la cantidad y viabilidad de la celda inicial mediante la exclusión azul de trypan. Cargue las celdas en una bolsa de transferencia.
NOTA: En este protocolo, las células Jurkat se cultivaban en RPMI y las MSC se cultivaban en DMEM:F12. Ambos medios se complementaron con un 10% de suero bovino fetal (FBS) y una solución antibiótica-antimética al 1%. Las células se cultivaban a 37 oC con un 5% de CO2. Para los CPSC o células adherentes, agregue una enzima de digestión (por ejemplo, trippsina) en los vasos de cultivo para separar las células, y sople con medios de cultivo una vez que las células estén separadas. En este protocolo se utilizó una bolsa de transferencia porque las células se expandieron en recipientes de cultivo. Sin embargo, si las células se cultivan en una bolsa de cultivo celular, se puede conectar directamente al kit de un solo uso a través de soldadura de tubo estéril. En este protocolo, se utilizaron 3 x 107 células Jurkat o 1 x 107 MSC para cada ejecución, donde las celdas se suspendieron en 40 ml de medios de cultivo.- Cargue las células en una bolsa de transferencia (consulte Tabla de materiales)utilizando una jeringa y un conjunto de agujas si hay un soldador de tubo estéril disponible para conectar la bolsa de transferencia al kit de procesamiento de un solo uso.
- Alternativamente, utilice un par de tijeras autoclavedas para cortar el tubo de conexión con alrededor de 10 cm restantes unidos a la bolsa de transferencia y agregue un conector Luer hembra al extremo del tubo. Utilice una jeringa para aspirar células y medios y, a continuación, conecte la jeringa al conector Luer y cargue las células a la bolsa de transferencia.
- Conecte la bolsa que contiene las células, la bolsa tampón de lavado que contiene 500 ml de tampón de lavado preparado en el paso 1.1, la bolsa de desecho y la jeringa de recogida al kit de un solo uso(Figura 1B).
NOTA: La posición de conexión de cada bolsa depende de la configuración del programa. En este protocolo, conectamos la bolsa de residuos en la posición A, el tampón de lavado en la posición B, la bolsa de celda en las posiciones D y F, y la jeringa de recogida en la posición H(Figura 1C).
2. Programa para el protocolo automatizado de intercambio de búferes
- Abra la interfaz gráfica de usuario (GUI) del dispositivo y pulse el botón "START" en un ordenador portátil o tableta. A continuación, "Abrir" un protocolo existente o pulse "Nuevo" para crear uno nuevo.
- Utilice el botón"Adelante"y"Atrás"para navegar por cada paso, seleccionar las válvulas que se abrirán/cerrarán, la velocidad centrífuga, la velocidad de la bomba, la dirección de la bomba y los disparadores de acción. La configuración de cada paso se resume en la Tabla 1. A continuación, guarde el protocolo.
3. Configuración de la máquina
- Coloque el kit de procesamiento de un solo uso en la máquina y cuelgue las bolsas conectadas en consecuencia. Pulse el botón rojo "Stop/Reset"para restablecer todas las válvulas en la posición cerrada predeterminada.
NOTA: La máquina realizará una prueba cuando la puerta esté cerrada para asegurarse de que el kit se ha colocado correctamente y de que todas las válvulas funcionan correctamente. - Conecte la GUI al dispositivo de procesamiento y pulse el botón"Conectar". A continuación, descargue el programa guardado. Cuando se ilumina el botón verde"Reproducir",indica que el protocolo está listo para iniciarse.
- Abra las abrazaderas manuales para el tubo de la bolsa de transferencia.
NOTA: Si el operador olvida abrir las abrazaderas, el dispositivo se detendrá y aparecerá la advertencia del sensor de presión. Pulse el botón"Detener"para reiniciar el dispositivo y abrir las abrazaderas para volver a arrancar.
4. Intercambio automatizado de búferes
- Pulse "Start" para iniciar el programa de intercambio de búferes.
NOTA: Para alterar manualmente el proceso automatizado, pulse el botón"Siguiente"para pasar al siguiente paso antes de alcanzar el "Trigger" o pulse "Pause" para poner el proceso en espera. Esto recirculará las células a través del kit manteniendo abiertas solo las válvulas J y K(Figura 1C). - Al final del paso de automatización 6(Tabla 1), el proceso se detendrá cuando el aire en la bolsa ahora vaciada active el sensor de burbujas. Pulse "Next" para mover el proceso al siguiente paso si la bolsa está realmente vacía, o pulse "Pause" para reanudar el procesamiento si el sensor fue activado por una burbuja en la línea.
5. Recolectar y tomar muestras de las células
- Cuando finalice el proceso automatizado, cierre todas las abrazaderas de tubo. Abra la puerta y saque el kit de un solo uso del dispositivo. Desconecte la jeringa para recoger las células para los procesos posteriores. Tome una muestra de las celdas recopiladas para una comprobación de recuento y viabilidad de celdas (consulte el paso 6.2).
6. Validación del proceso
- Realice experimentos de control mediante un protocolo de intercambio de búfer manual.
- Suspensión de células centrífugas a 200 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 30 ml de tampón de lavado celular. Centrifugar de nuevo la suspensión celular a 200 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 10 ml de tampón de lavado celular.
- Realice el recuento de celdas a través del ensayo de exclusión azul trypan para evaluar la viabilidad celular mediante un contador de celdas automatizado.
- Realice un ensayo MTS para cuantificar la proliferación celular a 2, 24 y 48 h.
NOTA: El ensayo MTS se realizó en una placa de cultivo de tejido de 96 pozos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una alícuota de 100 ol de medios de cultivo celular (que contiene 10.000 células Jurkat o 1.500) por pozo se platearon después del proceso de intercambio de búferes. En cada punto de tiempo, se añadieron 20 l de reactivos MTS en cada poca y se incubaron durante 2 h a 37 oC. La absorbancia se evaluó a 490 nm utilizando un lector de placas. - Realice ensayos funcionales para comparar el impacto del proceso automatizado con el proceso manual en las células Jurkat y la función MSC.
- Cultivo de células Jurkat en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 x 106 células/ml estimulada con 50 ng/ml phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) y 1 g/ml de ionomicina (cóctel de estimulación celular) en medios DMEM:F12 que contienen 10% suero bovino fetal (FBS) durante 24 h. Incubar las células a 37oC con 5%co2.
- Mida la producción de interleucina-2 a partir del sobrenadante de cultivo utilizando el ensayo ELISA basado en perlas (ver Tabla de Materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Cultivo MSCs en una placa de 12 pocillos a la densidad de 10.000 celdas/cm2 en 1 mL de medios DMEM:F12 que contienen 10% FBS complementado con interferón 50 unidades/ml durante 48 h. Recoger supernadante para el ensayo de concentración de kynurenina para medir la indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) actividad enzimática de mSCs como se describió anteriormente21.
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Representative Results
En este protocolo, utilizamos células Jurkat y MSC como ejemplos representativos para demostrar el proceso automatizado de intercambio de búferes. Durante el proceso, las células y los MC de Jurkat compartieron los mismos pasos de procesamiento con diferencias en la fuerza centrífuga y la velocidad de la bomba que controlan el caudal (Tabla 1). La Figura 2 muestra imágenes representativas capturadas por la cámara de cómo puede aparecer el lecho celular fluidizado durante el proceso de intercambio de búferes. Típicamente, el lecho celular fluidizado se asemejará a la imagen en la Figura 2A,donde las células se acumulan en el medio y hacia la parte frontal del cono con un pequeño espacio en la punta de la cámara, donde las células no se acumulan y la abertura de la entrada de carga de celda es visible. El lecho de celda fluidizado se puede comprimir(Figura 2B)al introducir un nuevo tampón que tenga una viscosidad o densidad diferentes. En este protocolo, la velocidad de la bomba se redujo de 30-35 mL/min a 20 mL/min al inicio del paso de lavado. Una vez que la cámara se llenó con el nuevo búfer, la velocidad de la bomba volvió a la normalidad para evitar que las células de peletización en la punta de la cámara. Se puede aplicar un alto caudal(Figura 2C) para seleccionar celdas vivas porque las células muertas son más pequeñas y ligeras y se pueden forzar a salir de la cámara aumentando el caudal.
El proceso automatizado de intercambio de tampón se logró concentrando primero las células, luego introduciendo el tampón de lavado, que era alrededor de 10 veces el volumen del lecho celular fluidizado. Las células fueron formuladas al volumen deseado. Estos tres pasos de procesamiento se diseñaron para seguir los mismos principios que un intercambio de búfer manual. Típicamente, una centrifugación de dos ciclos (200 x g, 5 min) se utiliza para realizar el intercambio manual de tampón, en el que las células se peletizan para concentrarse, se resuspenden para lavar, luego se centrifufican de nuevo y se resuspenden al volumen final. El tiempo de procesamiento de los procesos automatizados fue más corto en comparación con los manuales(Figura 3). La tasa de recuperación entre los procesos manuales y automatizados fue similar tanto para las células Jurkat como para los MSC, y la viabilidad celular no se vio afectada por el proceso(Figura 4). La calidad celular se verificó mediante la proliferación celular (ensayo MTS) y la producción de citoquinas/enzimas. Las células recuperadas mostraron tasas de proliferación similares entre el manual y los procesos automatizados(Figura 5A). El nivel de producción de interleucina-2 a partir de células Jurkat y la actividad de LA ODE de los MSC también fueron comparables entre los dos grupos(Figura 5B y 5C).
| Número de paso | Descripción | Válvulas abiertas | Velocidad de centrífuga (g) | Velocidad de la bomba (ml/min) | desencadenantes | |
| 1 | Tubo Prime de B a A | A, B, K | 10 | 50 | Volumen: 45 ml | |
| 2 | Rellenar trampa de burbujas de A a B | A, B, K | 100 | 50 (retroceso) | Volumen: 10 ml | |
| 3 | Tubo Prime de La A a La D | A, D, K | 100 | 50 (retroceso) | Volumen: 2 ml | |
| 4 | Tubo Prime J a K | J, K | 100 | 50 | Volumen: 3 ml | |
| 5 | Células de carga – inicio inicial D a G | D, K, G | 1600 (Jurkat) 1500 (MSCs) | 25 (Jurkat) 30 (MSCs) | Volumen: 100 ml | |
| 6 | Cargar celdas con detección de burbujas [Al detectar burbujas/tubos vacíos, el programa se detendrá y esperará el comando del operador, pulse 'pausa' o 'siguiente'] | A, D, K | • último paso | 30 (Jurkat) 35 (MSCs) | Sensor de burbujas D | |
| 7 | Medios restantes vacíos en el tubo del puerto D | A, D, K | • último paso | • último paso | Capacidad: 1,5 ml | |
| 8 | Células de lavado 1 | A, B, K | • último paso | 20 | Volumen: 20 ml | |
| 9 | Aumentar la velocidad de lavado | A, B, K | • último paso | 35 | Temporizador: 5 segundos de aceleración de velocidad | |
| 10 | Células de lavado 2 | A, B, K | • último paso | • último paso | Volumen: 20 ml | |
| 11 | Prepárese para cosechar | J, K | • último paso | • último paso | Temporizador: 2 segundos | |
| 12 | Recuperar células para generar y diluir al volumen objetivo | B, J, K | • último paso | 60 (Invertir) | Volumen: 10 ml | |
| Nota: el último paso es una opción de ajuste para la velocidad de centrifugación y la velocidad de la bomba en la GUI. | ||||||
Tabla 1: Configuración automatizada de la GUI del intercambio de búferes para células Jurkat y MSC.
Figura 1: Sistema de procesamiento de células centrífugas de contraflujo. (A) Un diagrama esquemático que ilustra el principio de centrifugación de contraflujo. La fuerza de contraflujo está presente en un gradiente dentro de la cámara celular. Mientras centrifugar (flecha gris), las células con diámetros más grandes reciben una fuerza de sedimentación más alta, en la que las células alcanzan el equilibrio de fuerza hacia el extremo estrecho de la cámara, formando un lecho celular fluidizado. Los desechos celulares y las partículas pequeñas que son demasiado pequeñas para permanecer en la cámara se lavan. (B) El sistema de procesamiento centrífugo de contraflujo consiste en el dispositivo de procesamiento y el kit de procesamiento de un solo uso. (C) La configuración del kit de un solo uso para el protocolo de intercambio de búferes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Lecho celular fluidizado en la cámara celular. Imágenes representativas de un lecho de celda fluidizado bajo (A) medio, (B) bajo, y (C) alto caudal. La línea punteada indica el área del lecho celular fluidizado dentro de la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación del tiempo de procesamiento celular de células Y MSCs de Jurkat con procesamiento manual y automatizado. (n 3–4 en cada grupo, los datos se presentan como media sd). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comparación de la viabilidad celular y la recuperación de células vivas de células Jurkat y MSCs con procesamiento manual y automatizado. La viabilidad celular (A) y la recuperación de células vivas (B) se midieron mediante un ensayo de exclusión azul trypan utilizando un contador de células automatizado. La recuperación de células vivas se redujo en ausencia de suero o cuando solo se procesaron 3 x 106 o 1 x 106 células. (n 4–9 en cada grupo, los datos se presentan como media sd). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Proliferación celular y función celular a partir del procesamiento manual y automatizado. (A) El ensayo MTS de células Y MSCs de Jurkat se realizó a las 2, 24 y 48 h después del intercambio de búferes. La calidad de las células recuperadas se cuantificó mediante la producción de Interleucina-2 a partir de células Jurkat(B),y la actividad de la ODOC en los MSC(C). (n 4–8 en cada grupo, los datos se presentan como media sd). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Estabilidad del lecho celular fluidizado a varios caudales. Se realizaron dos procesos para cada tipo de celda. En un proceso, 3 x 107 células Jurkat o 1 x 107 MSCs. En el segundo proceso, se utilizó 10 veces el número de celdas. En ambos procesos, 10 mL de elutriato celular se recogieron del puerto A a varios caudales utilizando la velocidad de centrifugación indicada en este protocolo (1.600 x g para las células Jurkat y 1.500 x g para los MSC). El número de células en el elutriate se determinó y se presentó como porcentaje de la cantidad total de células cargadas en la cámara. (n. 3 para cada grupo, los datos se presentan como media sD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo de intercambio de búfer automatizado descrito es simple y fácil de usar. Sin embargo, hay algunos pasos clave en este protocolo que son críticos y requieren una atención particular. En nuestra experiencia, al procesar celdas más grandes como los MSC (diámetro medio de 10–15 m) cada ejecución debe incluir al menos 1 x 107 celdas para lograr una recuperación celular óptima(Figura 4B). El procesamiento de células más pequeñas, como las células Jurkat (promedio de 10 m de diámetro), requiere alrededor de 3 x 107 células para lograr un lecho celular fluidizado estable(Figura 4B). Cuando el número de célula es demasiado bajo, es más probable que las células se retiren del lecho fluidizado, lo que afectará la recuperación celular final. Además, comparamos las tasas de pérdida de células a diferentes velocidades de la bomba cuando se aplica una velocidad centrífuga constante. Aquí, observamos que la pérdida de células aumentó con el caudal(Figura 6),que se debe a la creciente inestabilidad del lecho fluidizado a caudales más altos. Sin embargo, el porcentaje de pérdida de células fue menor cuando 10 veces el número de células se cargaron en la cámara, lo que sugiere que se puede aplicar una mayor velocidad de la bomba al procesar un mayor número de celdas para permitir un procesamiento más rápido. En el paso 5 del proceso, 100 ml de medios de cultivo fueron recirculados de la cámara de vuelta a la bolsa de transferencia celular para permitir que el lecho fluidizado se formara y estabilizara antes de la reducción del volumen y el intercambio de tampón. Si la concentración celular es baja (por ejemplo, por debajo de 0,2 x 106/ml), es posible que sea necesario ampliar el paso de recirculación para permitir que suficientes células formen el lecho celular fluidizado. Del mismo modo, si la concentración celular es alta, el paso de recirculación se puede acortar.
La presencia de suero en el tampón de lavado también es crítica para la recuperación celular. Estudios anteriores han demostrado que el estrés hidrodinámico puede causar la muerte celular necrótica en ausencia de proteínas amortiguadoras22,23. La dinámica de flujo del sistema centrífugo de contraflujo es bastante compleja. En este protocolo, las tasas de recuperación celular bajaron a alrededor del 70% cuando el proceso se realizó en ausencia de suero(Figura 4B). Aunque el mecanismo exacto no está claro, la presencia de suero en los medios de cultivo o albúmina en los tampones de lavado fue capaz de mitigar el daño mecánico potencial a las células. Para aplicaciones que requieren tampones libres de suero, el almidón de hidroxietilo y el dextran 40 son ejemplos de aditivos no proteicos que se utilizan a menudo en la fabricación celular para proteger contra la tensión hidrodinámica24,25.
La tecnología de centrifugación de contraflujo se ha utilizado en la fabricación biofarmacéutica a gran escala y el procesamiento de productos sanguíneos17. Las aplicaciones de la tecnología CFC en la fabricación de células a pequeña escala (es decir, 0,1–10 L) a menudo se limitan a aislar células mononucleares de productos de aféresis, como el Elutra (Terumo BCT)26,en el que se requiere una intervención manual adicional para realizar pasos de lavado y concentrado. Otras plataformas de procesamiento celular a pequeña escala incluyen sistemas de intercambio de tampón basados en filtración por membrana como el LOVO (Fresenius Kabi)27 y la separación de centrifugación vertical como el Sepax (GE Healthcare)28. Aunque es difícil realizar una comparación directa entre dispositivos, una de las ventajas de este dispositivo centrífugo de contraflujo es su capacidad para entregar volúmenes de salida muy pequeños (mínimo 5 ml), que es el más pequeño entre las plataformas de procesamiento celular disponibles actualmente. El pequeño volumen de salida es adecuado para aplicaciones tales como la formulación de células para inyecciones locales29 o infusiones para neonatos30. La cámara integrada en el dispositivo también es una característica única que proporciona la visualización del lecho celular fluidizado durante la etapa de desarrollo del proceso.
Una de las limitaciones de la tecnología CFC es que es sensible al tamaño y la densidad de las células. Al configurar un protocolo de intercambio de búfer para un tipo de celda diferente, el protocolo presentado aquí debe servir como una guía para que los usuarios optimicen de acuerdo con sus necesidades, teniendo en cuenta el tamaño de sus células de interés y la densidad de su suspensión celular. Aunque el protocolo actual es utilizable para procesar hasta 5 L de medios, el tiempo de procesamiento se extenderá sustancialmente (es decir, 1-2 h). Es importante tener en cuenta que el impacto del tiempo de procesamiento extendido en la calidad de la célula no se ha examinado en este estudio actual.
Los estudios futuros evaluarán el impacto de la velocidad de procesamiento y el tiempo de procesamiento en la función celular para determinar la capacidad máxima de procesamiento del dispositivo. Además, estudios futuros pueden explorar otras aplicaciones como la eliminación de dimetil sulfóxido (DMSO) de productos crioconservados y la eliminación selectiva de células muertas.
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Disclosures
SW, IF y DJ son COO, CTO y CEO de Scinogy Pty. El acceso al dispositivo CFC también fue proporcionado por Scinogy.
Acknowledgments
Este trabajo cuenta con el apoyo del Programa de Apoyo a la Infraestructura Operativa del Gobierno Victoriano y el Bono tecnológico del Gobierno Victoriano proporcionado por el Departamento de Desarrollo Económico, Empleo, Transporte y Recursos. RL es el receptor de una Beca de Desarrollo Profesional del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica. AL es el ganador de un Premio de Posgrado de Australia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 | |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C | |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 | |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A | |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A | |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A | |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A | |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS | |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
References
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