Summary
Cette méthode décrit l'utilisation du modèle de souris R26R-Confetti (Confetti) pour étudier les tissus minéralisés, couvrant toutes les étapes de la stratégie de reproduction aux acquisitions d'images. Inclus est un protocole général qui peut être appliqué à tous les tissus mous et un protocole modifié qui peut être appliqué aux tissus minéralisés.
Abstract
L'étiquetage d'une cellule individuelle dans le corps pour surveiller les types de cellules qu'elle peut donner lieu à et suivre sa migration à travers l'organisme ou de déterminer sa longévité peut être un moyen puissant de révéler les mécanismes de développement et d'entretien des tissus. L'un des outils les plus importants actuellement disponibles pour surveiller les cellules in vivo est le modèle de souris Confetti. Le modèle Confetti peut être utilisé pour étiqueter génétiquement les cellules individuelles chez les souris vivantes avec diverses protéines fluorescentes d'une manière spécifique au type cellulaire et surveiller leur sort, ainsi que le sort de leur progéniture au fil du temps, dans un processus appelé traçage génétique clonal ou tracé de lignée clonal. Ce modèle a été créé il y a près de dix ans et a contribué à améliorer la compréhension de nombreux processus biologiques, en particulier liés à la biologie des cellules souches, au développement et au renouvellement des tissus adultes. Cependant, la préservation du signal fluorescent jusqu'à la collecte d'images et la capture simultanée de divers signaux fluorescents est techniquement difficile, en particulier pour les tissus minéralisés. Cette publication décrit un protocole étape par étape pour l'utilisation du modèle Confetti pour analyser le cartilage de plaque de croissance qui peut être appliqué à n'importe quel tissu minéralisé ou non minéralisé.
Introduction
Des méthodes améliorées pour surveiller le comportement cellulaire sont souhaitables pour augmenter l'efficacité expérimentale lors de l'utilisation de modèles animaux. Une des approches les plus informatives pour surveiller le comportement cellulaire in vivo est la lignée cloaque traçant avec des souches de souris journalistemulticolores 1, y compris la souris R26R-Confetti (Confetti) largement utilisé2. En étiquetant génétiquement les cellules individuelles avec des protéines fluorescentes et en suivant ces cellules au fil du temps, les chercheurs dans de nombreux domaines ont utilisé la souris Confetti pour révéler des idées sur une multitude de différents systèmes biologiques.
La souris Confetti est un système de journaliste à base de loxP dans lequel la recombinaison d'ADN dépendante de Cre provoque l'expression permanente de l'une des nombreuses protéines fluorescentes possibles d'une manière stochastique2. L'allèle R26R-Confetti comprend le promoteur CAGG, omniprésent, qui se trouve immédiatement en amont d'un NeoR-cassette2à flanc de loxP, dont la séquence de polyadenylation met fin à la transcription3,suivie de la Brainbow 2.1 construction4. Ainsi, la recombinaison à médiation cre excise simultanément la cassette NeoRet conduit à la production de certaines protéines fluorescentes selon les parties de la construction Brainbow 2.1 sont excisées. Cette fonctionnalité rend la souris Confetti extrêmement adaptable car elle peut être utilisée pour cibler n'importe quelle population cellulaire dans une souris pour laquelle une souche Cre spécifique est disponible. Le croisement d'une souche Cre spécifique aux tissus avec la souche R26R-Confetti fournit la spécificité de l'étiquetage. Cependant, la souche Cre doit également être inductible (par exemple, CreERT ou CreERT2, qui nécessitent une liaison tamoxifène pour leur permettre d'entrer dans le noyau et d'induire une recombinaison d'ADN5) de sorte que l'étiquetage peut être atteint à des moments précis. Ainsi, une population cellulaire peut être étiquetée en injectant la progéniture CreERT-positive/Confetti-positive résultante avec le tamoxifène au point désiré et suivi à un certain âge, quand les tissus d'intérêt peuvent être rassemblés pour l'analyse. Après le traitement des tissus, les cellules étiquetées fluorescentes peuvent être directement visualisées par microscopie confocale de sorte que la progéniture de chaque cellule initialement étiquetée peut être séparée de la progéniture générée par toute autre cellule étiquetée en fonction de leur fluorescent spécifique permettant ainsi d'évaluer la clonnalité (c.-à-d. le tracé génétique clonal).
En raison de la flexibilité du modèle Confetti, il a été appliqué pour étudier le développement et l'entretien de nombreux tissus différents dans la santé et la maladie2,6,7,8,9, 10,11. Une façon courante d'utiliser le modèle est d'étiqueter une certaine population de cellules et de déterminer les tissus auxquels elles (et/ou leur progéniture) ont contribué. Une telle conclusion utilisant cette approche était que la dent adulte est composée des cellules avec une origine gliale6. Une autre application du modèle est d'étudier l'homéostasie des cellules souches. Par exemple, le modèle Confetti a révélé que les niches de cellules souches dans les cryptes intestinales deviennent progressivement monoclonal parce que certains clones de cellules souches sont dominants lors de la compétition entre les cellules souches2. Le modèle peut également être utilisé pour évaluer la prolifération cellulaire, ce qui est particulièrement utile pour étudier les cellules qui se divisent lentement. Par exemple, la formation clonale dans le cartilage articulaire12 a été évaluée, et les effets à court terme d'un antagoniste de hérisson sur des chondrocytes de plaque de croissance dans les souris vieilles de cinq semaines ont été étudiés13.
Malgré la relative simplicité du modèle Confetti, le signal fluorescent peut être techniquement difficile à préserver jusqu'à la collecte d'images, en particulier lors de l'analyse des tissus minéralisés. Ici, le protocole décrit un modèle optimisé pour utiliser la souris Confetti avec l'os postnatal (jusqu'à 6 mois d'âge), permettant aux protéines fluorescentes d'être directement visualisées par microscopie confocale sans avoir besoin d'immunodétection. Ce protocole simplifié peut être appliqué aux tissus non minéralisés. En outre, est inclus une description de la façon de stocker les échantillons afin de préserver le signal fluorescent pour une période prolongée d'au moins 3 ans. Un aperçu du protocole est présenté à la figure 1.
Protocol
Tous les travaux sur la souris ont été approuvés par le Comité d'éthique sur les expériences animales (Comité de Stockholm Nord/Norra Djurf-ksetiska Nâmd) et menés conformément aux Dispositions et lignes directrices de l'Agence suédoise pour les animaux pour l'expérimentation animale.
1. Élevage de souris
- Pour générer la souche, traverser la souris R26R-Confetti avec la ligne d'intérêt Cre. Soudre les chiots à l'âge de 21 jours.
REMARQUE : Les souris peuvent être utilisées pour la reproduction à partir d'environ 8 semaines d'âge, ou selon les directives locales. Le génotypage (non décrit ici) peut être effectué à partir de biopsies recueillies au sœur. L'âge du sœur peut être ajusté selon les directives locales.
2. Étiquetage des confettis
REMARQUE : Cette stratégie d'étiquetage est appropriée pour les souches inductibles de cre de tamoxifène.
- Préparer une solution allant jusqu'à 2,5 mg/mL de tamoxifène dans de l'huile de maïs dans une bouteille en verre. Dissoudre en chauffant jusqu'à 37 oC dans un four jusqu'à 60 min, en agitant toutes les 5 min à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que la poudre soit dissoute.
REMARQUE : Pour une augmentation des doses de tamoxifène, des solutions allant jusqu'à 20 mg/mL peuvent être préparées à l'aide de cette méthode. - Conserver à 4 oC jusqu'à 3 mois, à l'abri de la lumière.
- Induire la recombinaison en administrant 50 'L de 2.5 mg/mL de tamoxifène dissous dans l'huile de maïs intrapéritone le premier jour postnatal (P1).
REMARQUE : En principe, le tamoxifène peut être administré à tout âge, dès la génération F1. La dose de tamoxifène doit être variée en fonction de l'expression Cre, l'âge de la souris, et l'application expérimentale. Vous trouverez de plus amples renseignements dans la section discussion. Les souris négatives de Cre traitées de la même manière peuvent être employées comme commande négative pour des signaux fluorescents de Confetti.
ATTENTION : Assurez-vous que les préposés aux animaux sont avertis de l'utilisation du tamoxifène et que les matériaux de cage sont éliminés conformément aux directives locales en matière d'environnement et de sécurité.
3. Collection de tissus
- Euthanasier les souris le jour postnatal 27 (P27) en remplissant graduellement l'espace contenant les souris avec du dioxyde de carbone jusqu'à au moins 80% par volume et en maintenant cette concentration pendant 3 min. Effectuer la dislocation cervicale. Gardez les souris sur la glace pendant la dissection des autres animaux.
- Disséquez le tissu d'intérêt. Décrit ci-dessous est un protocole pour recueillir les plaques de croissance fémorale tibiale proximale et distales et le cartilage articulaire du genou, approprié pour des souris postnatales jusqu'à l'âge de 6 mois.
- Enlever la peau autour des membres postérieurs jusqu'au pied, à l'aide de ciseaux pointus et de forceps dentés.
- Couper grossièrement le muscle et les tissus adipeux des jambes avec des ciseaux pointus.
REMARQUE: Ne pas nettoyer les os parfaitement, parce que les tissus environnants fournissent un certain soutien structurel lors de la section, mais assurez-vous que toute la peau est enlevée. - À l'aide d'un scalpel, couper à travers le tissu mou où le haut de la jambe rencontre le corps jusqu'à ce que la tête fémorale est visible, puis couper les ligaments de l'articulation de la hanche pour enlever la jambe.
REMARQUE: Alternativement, s'il n'est pas possible de trouver la tête fémorale, couper à travers le fémur près de la hanche avec des ciseaux forts. - Disséquer le pied du reste de la jambe à l'aide d'un scalpel ou de ciseaux pointus.
4. Fixation et traitement des tissus
REMARQUE : Sur la base du tissu d'intérêt, suivez l'un des deux protocoles détaillés ci-dessous (4,1 pour les tissus mous ou 4,2 pour les tissus de souris minéralisés de plus de 45 jours, comme détaillé ci-dessous). Pour les deux méthodes, entreposez les échantillons disséqués dans la solution saline tamponnée (PBS) de 3,7 % sur la glace tout en disséquant les animaux restants.
- Pour les tissus mous et le tibia minéralisé et la fémora jusqu'à l'âge d'environ P45, fixer le tissu dans le formaldéhyde pré-refroidi 3,7% / PBS pendant 6 h, rouler doucement sur un rotateur à 4 oC. Utilisez un volume au moins 10 fois supérieur à celui du tissu. Continuer directement à l'étape 4.3.
- Pour les tissus minéralisés, y compris le tibia et le fémora de plus d'environ P45, une étape de décalcification est nécessaire.
- Préparer 1 L de 10% EDTA/dH2O solution avec le pH ajusté à 8,05 en utilisant de l'hydroxyde de sodium. Ensuite, diluer le formaldéhyde à 3,7% en utilisant cette solution. La concentration de travail de l'EDTA sera de 9%.
- Fixer le tissu en plaçant dans le formaldéhyde pré-refroidi 3,7% / PBS pendant la nuit, en roulant doucement sur un rotateur à 4 oC.
- Placez le tissu dans une solution de formaldéhyde prérefroidi e 3,7 % /9 % EDTA/dH2O (pH 8,05), et tournez doucement à 4 oC dans un volume d'au moins 10 fois supérieur à celui du tissu. Répétez cette étape en plaçant les os dans le formaldéhyde frais et prérefroidi de 3,7 % /9 % EDTA/dH2O pour 3x au cours des 48 prochaines heures.
REMARQUE : Cette décalcification courte est suffisante pour permettre la section du fémur et des os de tibia des souris jusqu'à 6 mois. Pour les tissus plus densément minéralisés, une décalcification supplémentaire peut être nécessaire pour améliorer l'histologie.
- Transférer le tissu dans un saccharose pré-réfrigéré de 30 %/dH2O. Assurez-vous de remplir le récipient à ras bord, et tournez doucement pendant la nuit à 4 oC. Utilisez un volume au moins 10 fois supérieur à celui du tissu. Le tissu flotte souvent lorsqu'il est placé dans cette solution et s'enfonce au fond de la bouteille le matin.
- Pour enlever la solution résiduelle de saccharose, lavez brièvement le tissu en le retirant de la solution de saccharose avec des forceps et en couvrant complètement l'échantillon avec environ 5 ml de composé optimal de température de coupe (OCT) pendant plusieurs secondes.
- Remplissez un cryomold préétiqueté avec oct et placez le tissu au fond. Travaillez rapidement pour éviter les échantillons assis à température ambiante trop longtemps.
REMARQUE : Il est important de placer l'échantillon dans une orientation pratique pour l'étape de sectionnement. Pour augmenter les chances de sectionner à travers des colonnes entières de plaque de croissance après traçage avec Col2CreERT:Confetti, placez le côté médial vers le bas en utilisant la tête fémorale comme guide, et placez l'échantillon aussi plat au fond du moule que possible. - Intégrer l'échantillon en plaçant le moule sur la glace sèche et en attendant que l'OCT se solidifie entièrement. Placez les cryomolds aussi plats que possible pour éviter le mouvement/glissement du tissu dans le moule. Une fois terminés, entreposer les échantillons à -20 oC, s'ils ne sont pas utilisés immédiatement.
REMARQUE: Utiliser dans les 12 semaines, parce qu'avec l'âge les blocs deviennent plus difficiles à section.
5. Sectionnement
REMARQUE : Effectuer la cryosection à l'aide d'un cryostat avec des lames jetables adaptées aux tissus durs. N'importe quel cryostat standard est approprié.
- Retirez le bloc du moule et fixez-le au mandrin en appliquant l'OCT entre le haut du bloc et le mandrin et le refroidissement dans le cryostat à -20 oC pendant au moins 5 min, de sorte que l'OCT s'est complètement solidifié.
- Prérefroidir à la fois le support de l'échantillon et le porte-lame à -20 oC, puis placer l'échantillon/chuck dans le porte-mandrin et la lame dans le porte-lame pour l'équilibre pendant plusieurs min.
REMARQUE : Les températures spécifiées peuvent varier de plusieurs degrés selon le cryostat et le tissu d'intérêt. - Utilisez le cryostat pour couper le bloc et couper les sections de tissu d'une épaisseur appropriée pour permettre la visualisation des clones dans le tissu d'intérêt.
- Pour l'analyse des plaques de croissance postnatales, préparez des sections de 30 à 160 m et collectez-les sur des diapositives. Certains modèles de cryostat peuvent seulement permettre la collecte de sections épaisses en utilisant le réglage de garniture.
- Sécher à l'air les toboggans à température ambiante jusqu'à ce qu'ils soient complètement secs.
REMARQUE : La durée de cette étape peut varier en fonction des propriétés tissulaires et de l'épaisseur de la section. La température de la pièce est également susceptible d'affecter la vitesse de cette étape. - Entreposez les glissières à -20 oC pendant une durée pouvant aller jusqu'à 36 mois, ou si vous traitez immédiatement, passez à l'étape 6.2.
6. Préparation et montage de diapositives
- Retirer la glissière du congélateur et porter à la température ambiante horizontalement dans un porte-glissière. Laisser toute condensation s'évaporer.
- Retirez l'OCT à l'aide d'une pipette Pasteur pour appliquer doucement le PBS à température ambiante sur la glissière. Plus la section est épaisse, plus le temps est nécessaire. Pour 160 m d'épaisseur, effectuer deux rinçants : incuber une fois pendant 15 min et retirer le liquide, puis appliquer du PBS frais pendant 5 min et retirer le liquide.
REMARQUE : Cette étape consiste à enlever l'OCT et peut être variée en fonction des propriétés tissulaires et de l'épaisseur de la section, le cas échéant. La température de la pièce est susceptible d'affecter la vitesse de cette étape. - Montez les glissières dans une solution de 75 % de 2,2-thiodiéthanol/dH2O à température ambiante avec des feuillets de couverture de 60 mm de long.
REMARQUE : Les glissières peuvent être préparées immédiatement avant l'imagerie, mais le signal fluorescent est stable pendant une semaine et demie s'il est maintenu hors de la lumière dans une chambre humidifiée à 4 oC.
7. Imagerie par microscopie confocale
- Installez le microscope.
- Allumez le microscope et ouvrez le logiciel. Cliquez sur le bouton Système de démarrage.
- Sélectionnez les canaux en cliquant d'abord sur Smart Setup sous l'onglet Acquisition, puis en sélectionnant les trois canaux correspondant à la protéine fluorescente rouge (DP), à la protéine fluorescente jaune (PJJ) et à la protéine fluorescente cyan (CFP) sous le Tête de teinture. Cliquez sur Meilleur signal puis Appliquez pour sélectionner les lasers.
REMARQUE : Le contenu de l'onglet Acquisition est affiché dans le fichier supplémentaire 1A. Si les canaux requis ne sont pas présents, ajoutez-les à l'aide du bouton ''sous le cap Dye. Les informations nécessaires concernant le laser, les longueurs d'onde d'excitation, et la gamme des longueurs d'onde d'émission enregistrées sont montrées pour les trois protéines fluorescentes de Confetti dans le fichier supplémentaire 1B-D. - Sélectionnez l'objectif 20x sous le titre Objectif dans l'onglet Mode acquisition.
- Localiser la plaque de croissance ou tout autre tissu d'intérêt.
- Pour fournir une vue distincte, sélectionnez d'abord le canal De la DP en cliquant sur son nom dans l'onglet Chaînes. Cela provoque l'affichage des détails du canal de la DP dans l'onglet Chemin de lumière. Cliquez sur la case à cocher à côté de T-PMT.
REMARQUE : Le canal T-PMT montre la lumière laser non réfléchie, qui est utilisée pour visualiser les parties non fluorescentes du tissu. - Placez la glissière dans le porte-glissière et placez la plaque de croissance ou tout autre tissu d'intérêt directement entre le chemin lumineux et la lentille objective.
- Afin de simplifier la localisation du tissu, désélectionnez les canaux YFP et CFP en utilisant les cases à cocher sous le cap Tracks de l'onglet Chaînes.
- Sélectionnez le canal T-PMT en cliquant sur son nom dans le titre Tracks. Cliquez en direct dans l'onglet Acquisition et augmentez le gain (Master) pour le canal T-PMT afin de visualiser la section tissulaire de l'écran, qui est affichée à l'échelle grise.
- Déplacez la position de la glissière à l'aide du joystick pour localiser la région d'intérêt, puis concentrez-vous à l'aide du bouton de microscope approprié.
- Cliquez sur Arrêtez dans l'onglet Acquisition pour désactiver l'exposition au laser.
- Pour fournir une vue distincte, sélectionnez d'abord le canal De la DP en cliquant sur son nom dans l'onglet Chaînes. Cela provoque l'affichage des détails du canal de la DP dans l'onglet Chemin de lumière. Cliquez sur la case à cocher à côté de T-PMT.
- Définir les paramètres d'imagerie.
- Utilisez les cases à cocher dans l'onglet Chaînes pour sélectionner l'un des canaux et cliquez sur Live dans l'onglet Acquisition pour afficher l'image de ce canal sur l'écran. Ensuite, à l'aide du bouton clic gauche sur la souris, ajustez les barres de diapositives pour définir la plage de signal fluorescent émis qui est collecté, la puissance laser (barre de glissement sous le cap Lasers), Gain (Master) et Digital Offset dans le Onglet canaux pour visualiser les cellules étiquetées Confetti sur l'écran. Les valeurs des lignes directrices pour tous ces paramètres sont fournies dans le dossier 1B-D supplémentaire pour la DP, la PJ et le PCAF. Complétez cette étape pour chaque canal, un par un.
REMARQUE : Pour s'assurer que le signal visualisé n'est pas l'autofluorescence, une section d'un animal négatif de Cre peut être employée comme contrôle négatif pendant cette étape. Comme T-PMT a été combiné avec le laser DeP (étape 7.2.1) l'ajustement de la puissance laser pour la DP affectera le signal T-PMT. - Ajustez la taille du trou d'épingle pour augmenter la détection de fluorescence si nécessaire.
REMARQUE : Plus la taille du sténopé est élevée, plus le signal fluorescent est détecté dans la direction Z. Une ligne directrice pour cela est l'unité Airy (AU) qui en résulte, qui est automatiquement indiquée sous l'indicateur Pinhole, où 1 UA est optimale pour la qualité d'imagerie. Augmenter l'UA trop nuira à l'analyse ultérieure, car il devient plus difficile de distinguer les cellules individuelles dans la direction Z). - Vérifiez la configuration pour vous assurer que les signaux enregistrés ne se chevauchent pas.
- Cliquez sur les cases à cocher de l'onglet Chaînes pour sélectionner les trois canaux et appuyez sur le bouton Snap dans l'onglet Acquisition.
- Dans l'image qui en résulte, faites défiler entre les canaux affichés en cliquant sur les cases surlignées bleues au-dessus de chaque canal répertorié dans l'onglet Dimensions. Vérifier manuellement le chevauchement entre les canaux de l'écran. Si les signaux se chevauchent (p. ex., si chaque cellule rouge est également jaune), retournez au début de l'étape 7.3 et répétez, en ajustant les paramètres pour les canaux qui se chevauchent jusqu'à ce qu'ils puissent être distingués les uns des autres. Assurez-vous que pour chaque étiquette (c.-à-d. DP, PJ ou CFP), au moins un clone peut être visualisé qui ne contient qu'une seule des étiquettes.
- Utilisez les cases à cocher dans l'onglet Chaînes pour sélectionner l'un des canaux et cliquez sur Live dans l'onglet Acquisition pour afficher l'image de ce canal sur l'écran. Ensuite, à l'aide du bouton clic gauche sur la souris, ajustez les barres de diapositives pour définir la plage de signal fluorescent émis qui est collecté, la puissance laser (barre de glissement sous le cap Lasers), Gain (Master) et Digital Offset dans le Onglet canaux pour visualiser les cellules étiquetées Confetti sur l'écran. Les valeurs des lignes directrices pour tous ces paramètres sont fournies dans le dossier 1B-D supplémentaire pour la DP, la PJ et le PCAF. Complétez cette étape pour chaque canal, un par un.
- Acquérir l'image.
- Sélectionnez l'onglet Mode d'acquisition pour spécifier la qualité de l'image à l'aide des valeurs de la taille du cadre,de la vitesseet du nombre moyen.
REMARQUE : Les paramètres typiques de ces expériences sont indiqués dans le fichier supplémentaire 1A. La réduction du zoom sous la rubrique Scan Zone dans l'onglet Acquisition peut augmenter le champ de vision sans modifier le temps requis pour l'acquisition d'images. - Dans l'onglet Acquisition, sous le titre D'acquisition dimensionnelle, cliquez sur la case Z-Stack. Ouvrez l'onglet Z-stack pour définir l'intervalle entre les images dans la direction Z à 2,5 m.
- Pour définir les emplacements corrects, sélectionnez uniquement la DP/T-PMT dans l'onglet Chaînes et cliquez sur Live pour visualiser les clones rouges avec un contour visible du tissu. Réglez la première et la dernière tranche en cliquant sur Set First et Set Last sur la tranche correspondante, en ajustant la mise au point à l'aide du bouton du microscope.
- Cliquez sur l'onglet Tile Scan dans l'onglet Acquisition et entrez le nombre total de tuiles dans les directions horizontales et verticales dans les cases respectives.
- Pour la capture d'image, sélectionnez tous les canaux souhaités dans l'onglet Chaînes, puis cliquez sur le bouton Snap pour collecter une seule image, ou le bouton Démarrer l'expérience pour collecter une pile Z / analyse de la vignette.
- Sélectionnez l'onglet Mode d'acquisition pour spécifier la qualité de l'image à l'aide des valeurs de la taille du cadre,de la vitesseet du nombre moyen.
- Une fois l'image acquise, cliquez sur Fichier puis Enregistrez-vous as et enregistrez l'image dans un type de fichier qui conserve autant d'informations sur les paramètres du microscope que possible, pour permettre un examen ultérieur et une réutilisation.
- Effectuez une analyse plus approfondie à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images.
Representative Results
Pour étiqueter des chondrocytes dans le cartilage épiphysher et visualiser leur expansion clonale avec l'âge utilisant l'administration de tamoxifène sur P1, les souris de Col2CreERT :Confetti ont été étiquetées, et leurs pattes postérieures ont été rassemblées sur P27. La section centrale a été déterminée en visualisant le ligament croisé (figure 2A) et les clones de la plaque de croissance tibiale proximale ont été visualisés (figure 2B). Ces données montrent que les cellules individuelles qui étaient Col2-positives sur P1 et sont devenues étiquetées avec des protéines fluorescentes de Confetti quand le tamoxifène a été administré, ont subi l'expansion clonale, et plus tard sont restées dans la plaque de croissance jusqu'à P27. Les changements initiaux dans l'expansion clonale à partir d'un point de temps de développement similaire peuvent être vus dans la figure 1 d'une publication récente13.
Pour donner un exemple du signal fluorescent après stockage à long terme (étape 5.5), la section recueillie a été stockée immédiatement après (voir la figure 2A,B) pendant plus de 3 ans avant d'être préparée et imagetée (Figure 2C, Vidéo 1) .
Pour démontrer certains problèmes courants avec le protocole, une section cassée au cours de l'étape de cryosection est montrée dans la figure 3A. La région de la section (entre la plaque de croissance et le cartilage articulaire) élargie à la figure 3B montre que cette dose de tamoxifène conduit à un tel niveau de recombinaison dans ce domaine qu'elle empêcherait l'analyse clonale.
Figure 1 : Aperçu expérimental. Graphique de flux résumant les étapes clés de la méthode. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Images de confettis d'une souris Col2CreERT:Confetti. (A) Des échantillons de souris Col2CreERT:Confetti ont été traités sans décalcification ou l'étape de stockage à long terme. La section centrale a été localisée utilisant le ligament croisé comme marqueur. Cette image a été visualisée à l'aide d'une tomodensitome après avoir détecté la DP avec T-PMT (barre d'échelle de 300 m). (B) Les colonnes clonales sont montrées dans le tibia proximal de la plaque de croissance visible dans (A), après reconstruction 3D. (C) Une diapositive adjacente à celle montrée dans (A) et (B) maintenu dans le stockage à long terme pendant plus de 3 ans a été traitée pour l'imagerie et la reconstruction 3D. La DP, la PJ et la PCP sont indiquées dans (B) et (C) (barres d'échelle de 50 m). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Défis lors de l'utilisation de la méthode. (A) Les lignes pointillées blanches décrivent une fente dans la section à travers la plaque de croissance de Col2CreERT:Confetti souris (barre d'échelle de 50 'm). La zone à l'intérieur de la boîte blanche est indiquée dans (B) (barre d'échelle de 25 m). La DP, la PJ et la PCP sont affichées dans les deux panneaux, et le canal de lumière laser non réfléchie (T-PMT) est également montré dans (A) pour visualiser le tissu. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Vidéo 1 : Reconstruction tridimensionnelle d'une plaque de croissance de Col2CreERT: Souris confettis. Une diapositive préparée à partir d'un Col2CreERT: Souris confetti a été maintenu dans le stockage à long terme après la section pendant plus de 3 ans, puis traitées pour l'imagerie. La reconstruction tridimensionnelle a été effectuée automatiquement avec un logiciel d'analyse d'images et exportée sous forme de vidéo. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
Fichier supplémentaire 1 : configuration typique du microscope confocal. (A) Les principaux contrôles présents dans l'onglet Acquisition. (B-D) Les paramètres laser, la longueur d'onde de l'excitation et la gamme des longueurs d'onde d'émission enregistrées sont indiqués pour trois protéines fluorescentes Confetti. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Le modèle de confetti a été employé intensivement pour étudier les tissus minéralisés de cartilage12,13,14 et pour décrire le protocole optimisé. Les sourisconfettis 2 avec une copie ou deux copies de l'allèle R26R-Confetti peuvent être utilisées pour la reproduction et les expériences. La recombinaison chez les souris avec un allèle de la construction Brainbow 2.1 donnera quatre étiquettes potentielles : protéine fluorescente rouge (RP, cytoplasmique), protéine fluorescente jaune (YFP, cytoplasmique), protéine fluorescente cyan (CFP, membrane-localisée), et verte protéines fluorescentes (GFP, noyaux localisés), tandis que la recombinaison chez les souris homozygotes confettis (c.-à-d., contenant deux copies de la construction Brainbow 2.1) donnera 10 sorties de couleurs possibles (RFP-RFP, RFP-YFP, RFP, PFP, PDP, YFP-YFP, YFP GFP, CFP-CFP, CFP-GFP, GFP-GFP). Cependant, parce que les événements d'excision et d'inversion d'ADN se produisent d'une manière stochastique, la recombinaison pour produire le GFP se produit dans seulement une petite fraction de cellules, comme précédemment rapporté2, et diffère apparemment par type de cellule ou ligne de cre utilisé2, 12,13. Par conséquent, étant donné la faible occurrence des événements de recombinaison menant à l'expression de GFP, six sorties de couleur sont les plus communes dans les souris homozygotes de confetti.
Une considération importante lors de la planification des expériences avec la souris Confetti est de trouver une souche Cre approprié. Tout d'abord, puisque l'allèle Confetti a plusieurs sites loxP, un événement de recombinaison n'exclut pas un deuxième4. Cela signifie que si une cellule est étiquetée et se divise pour produire un clone d'une couleur, un deuxième événement de recombinaison dans l'une de ses cellules filles générerait une couleur différente, masquant ainsi la véritable expansion clonale. Ainsi, les souches Cre non inducibles, où l'enzyme est toujours active si le promoteur correspondant est actif, ne sont pas conseillées. Deuxièmement, dans certaines souches, l'expression de Cre recombinase se fait souvent au détriment d'une protéine endogène, créant ainsi un phénotype qui lui est propre (p. ex., pour la souche de souris knock-in Prg4-GFPCreERT2 dans laquelle les souris abritent deux allèles Cre15), donc une seule copie de l'allèle Cre est souhaitable. Dans toutes les expériences décrites, une seule copie du Col2CreERT16 a été portée par le mâle ou le parent femelle pour générer des souris Col2CreERT:Confetti, comme décrit13. Ensuite, la spécificité de la ligne Cre au type de cellule d'intérêt est une considération importante. Par exemple, Col2CreERT est chondrocyte-spécifique, mais étiquette plusieurs populations distinctes de chondrocytes dans le cartilage postnatal tôt17. Enfin, l'activité des différentes souches de Cre peut changer considérablement avec l'âge animal, car l'activité endogène du promoteur utilisé pour les changements d'expression Cre, même dans les cellules du même type (par exemple, Prg4-GFPCreERT2, qui peut nécessiter une augmentation nombre de doses de tamoxifène pour étiqueter les cellules de zone superficielle à mesure que les souris ont15 ans).
Le nombre de cellules étiquetées sera reflété par la quantité de tamoxifène donnée, il n'est donc pas toujours souhaitable de donner la dose maximale parce que distinguer les clones les uns des autres peut être difficile. Parce que l'expression Cre variera sous la réglementation des différents promoteurs ainsi qu'avec l'âge, la dose de tamoxifène devra être ajustée pour optimiser l'étiquetage. Il est important de noter que les cellules ne sont pas immédiatement fluorescentes lors du déclenchement de la recombinaison, car il faut du temps pour que la recombinaison se produise et que les protéines fluorescentes qui en résultent s'accumulent suffisamment pour l'imagerie. Un large éventail d'heures (entre 24 et 72 h) est nécessaire, ce qui semble être influencé par la ligne Cre, le type cellulaire et l'âge des animaux. Puisque le tamoxifène peut être biologiquement actif longtemps après administration18 il est toujours conseillé de vérifier soigneusement l'efficacité de recombinaison dans chaque modèle.
Pendant l'étape de microscopie confocale, l'excitation des protéines fluorescentes de Confetti exige la pénétration du tissu par la lumière de laser. Étant donné que différents tissus ont des propriétés différentes, la lumière laser pourrait ne pas pénétrer 160 m d'épaisseur sections de tous les tissus. Cependant, de telles sections épaisses peuvent être utilisées pour le cartilage de plaque de croissance, tel qu'utilisé dans la figure 2, Figure 3. Notez que chaque microscope est différent, et il est peu probable que les paramètres décrits (Fichier supplémentaire 1) fonctionnera parfaitement sans ajustements mineurs. L'un des principaux défis consiste à distinguer les différentes protéines fluorescentes pour s'assurer qu'il n'y a pas de contamination d'un canal à l'autre. Par exemple, le signal dans le canal YFP causé par la fluorescence provenant de GFP se chevauche entre les canaux YFP et DFP. Les canaux YFP et CFP doivent également être soigneusement vérifiés. Cela peut être fait de plusieurs façons. Tout d'abord, la plage d'émission des longueurs d'onde de lumière fluorescente qui sont enregistrées pour chaque protéine fluorescente peut être réduite. Deuxièmement, l'ajustement de la puissance laser en combinaison avec le gain numérique peut optimiser le signal. Dans cette étude, ces étapes étaient suffisantes, mais elles reposent sur un signal fluorescent fort. Cela signifie qu'en théorie, le traitement inefficace des tissus peut réduire l'activité des protéines fluorescentes, ou une faible source de lumière laser peut altérer la séparation du canal.
Un des avantages de la souris Confetti est qu'elle peut être combinée avec un grand nombre de souches génétiquement mutantes qui sont disponibles de sorte que l'impact de gènes spécifiques sur la dynamique clonale peut être étudié10,11,12 ,13,14,19,20, mais avec quelques limitations. Par exemple, la recombinaison des allèles confettis et du gène d'intérêt ne peut pas être séparée lors de l'utilisation de mutants à base de Cre loxP combinés à des tracés de lignée sclonale. Néanmoins, de tels événements de recombinaison coïncidant peuvent être efficaces10,14,20. Par exemple, cette possibilité a été utilisée pour explorer le nombre accru de cellules dans la zone de repos des souris après l'ablation postnatale chondrocyte-spécifique de TSC1 dans la plaque de croissance21 et a indiqué la relation clonale entre ces cellules au fil du temps 13. En outre, l'analyse clonale spécifique aux tissus à l'aide de souris Confetti peut être utilisée avec des souris mutantes non-Cre loxP11, et il est également possible de combiner ces approches avec pharmacologique8,9 ,13 et/ou modèles chirurgicaux8 pour visualiser les réponses clonales à d'autres perturbations fonctionnelles. D'autres occasions se présentent en combinant des sections étiquetées de Confetti avec l'immunodétection des protéines endogènes par immunofluorescence. Une telle analyse permet l'identification des cellules tracées et leur colocalisation avec un marqueur connu. Avec la méthode de fixation décrite ci-dessus, il est possible de mener l'immunofluorescence et encore visualiser la fluorescence des protéines fluorescentes de Confetti12,13. Cependant, dans les documents mentionnés, la récupération d'antigène n'était pas nécessaire. Les méthodes dures de récupération d'antigène, telles que l'ébullition dans le tampon de citrate, mène à une perte complète de fluorescence de confetti. Bien que les protéines fluorescentes Confetti peuvent alors être détectées en utilisant des anticorps22, une perte d'identité clonale peut se produire.
En résumé, l'utilisation du modèle Confetti pour étiqueter les cellules in vivo est un outil informatif pour analyser le sort de ces cellules au fil du temps. La méthode décrite fournit un moyen rapide et efficace de visualiser directement l'expression des protéines fluorescentes dans les tissus minéralisés.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Evgeny Ivashkin pour ses conseils méthodologiques. Ce travail a été soutenu financièrement par le Conseil suédois de la recherche (A.S.C), la Fondation scientifique russe (subvention #19-15-00241 à l'ASC), l'Institut Karolinska (A.S.C.), StratRegen KI et Stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-sfond (A.S.C.), Stiftelsen Frimurare Barnhuset et Sallskapet Barnavard (P.T.N.), Chinese Scholarship Council (B.Z.). Le microscope confocal a été financé par la Fondation Knut et Alice Wallenberg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
| 60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | |
| Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
| Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
| Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
| EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
| Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
| Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
| Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
| Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
| OCT | Sakura | 102094-104 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| PBS | Gibco | 14200075 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |
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