Summary
שיטה זו מתארת את השימוש במודל העכבר R26R-קונפטי (קונפטי) כדי לחקור רקמות מינרליזציה, כיסוי כל הצעדים מאסטרטגיית הרבייה ועד לאפשרות התמונה. כלול הוא פרוטוקול כללי שניתן להחילם על כל הרקמות הרכות ופרוטוקול שהשתנה שניתן להחילם על רקמות מינרליזציה.
Abstract
תיוג תא בודד בגוף כדי לפקח איזה סוגי תאים זה יכול לתת עלייה ולעקוב אחר הגירה שלה דרך האורגניזם או לקבוע אריכות הימים שלה יכול להיות דרך רבת עוצמה כדי לחשוף מנגנונים של פיתוח רקמות ותחזוקה. אחד הכלים החשובים ביותר הזמינים כעת לניטור תאים בvivo הוא מודל העכבר הקונפטי. מודל קונפטי יכול לשמש לתווית גנטית תאים בודדים בעכברים חיים עם חלבונים פלורסנט שונים באופן ספציפי סוג תא ולפקח על גורלם, כמו גם את גורלם של הצאצאים שלהם לאורך זמן, בתהליך שנקרא מעקב גנטי שבטים או מעקב שושלת שבטים. מודל זה נוצר כמעט לפני עשור, תרם הבנה משופרת של תהליכים ביולוגיים רבים, במיוחד קשור לביולוגיה תא גזע, פיתוח, וחידוש של רקמות מבוגרים. עם זאת, שמירה על אות פלורסנט עד איסוף התמונה ולכידת סימולטני של אותות פלורסנט שונים היא מאתגרת טכנית, במיוחד עבור רקמות מינרליזציה. פרסום זה מתאר פרוטוקול צעד-אחר-צעד לשימוש במודל קונפטי כדי לנתח את הסחוס של לוחית הצמיחה שניתן למרוח על כל רקמה מינרליזציה או לא מינרליזציה.
Introduction
שיטות משופרות לניטור התנהגות התא רצוי כדי להגביר את היעילות הניסיונית בעת שימוש בדגמי חיות. אחת הגישות האינפורמטיביות ביותר כדי לפקח על התנהגות התא ב vivo הוא מעקב השושלת השבטיים עם זנים מרובי צבעים עכבר הכתב1, כולל בשימוש נרחב R26R-קונפטי (קונפטי) עכבר2. על ידי תיוג גנטי תאים בודדים עם חלבונים פלורסנט ובעקבות תאים אלה לאורך זמן, חוקרים בתחומים רבים השתמשו בעכבר קונפטי כדי לחשוף תובנות להמון של מערכות ביולוגיות שונות.
העכבר קונפטי הוא מערכת מבוססת loxP העיתונאי שבו שילוב של דנ א התלויים של ה-DNA גורם הביטוי הקבוע של אחד מכמה חלבונים פלורסנט אפשרי בצורה סטוכסטית2. אלל R26R-קונפטי כולל את היזם באופן אוביקאני הביע, אשר שוכנת מיד במעלה הזרם שלloxp-מוקףמשניהקלטת 2, אשר רצף פוליאדלציה מסיים שעתוק3, ואחריו ה ברייבוו 2.1 מבנה4 מכאן, שילוב של היצור-מתווך מחדש בו מחילה את הקלטת ניאוRומוביל לייצור של חלבונים פלורסנט מסוימים בהתאם לחלקים של המבנה 2.1 ברייברכיו הם החוצה. תכונה זו הופכת את העכבר קונפטי מאוד להתאמה משום שהוא יכול לשמש כדי למקד את כל האוכלוסייה התאית בעכבר שעבורו זן מסוים של היצור זמין. החצייה של זן ספציפי לרקמה מסוימת עם זן R26R-קונפטי מספק ספציפיות של תיוג. עם זאת, זן היצור צריך גם להיות inducible (g., creert או CreERT2, אשר דורשים כריכת טממוקסיפן כדי לאפשר להם להיכנס לגרעין ולגרום DNA רקומבינציה5) כך תיוג ניתן להשיג בנקודות זמן שצוינו. לפיכך, ניתן לתייג את האוכלוסייה התאית על-ידי הזרקת הצאצאים של התוצאה החיובית/קונפטי עם טממוקסיפן בזמן הרצוי ומעקב לגיל מסוים, כאשר ניתן לאסוף את רקמות הריבית לצורך ניתוח. לאחר עיבוד רקמות, התאים fluorescently המסומנים באופן ישיר ניתן לדמיין במישרין על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית כך הצאצא של כל תא בתווית בתחילה ניתן להפריד מן הצאצאים שנוצרו על ידי כל תא תווית אחרת מבוסס על פלורסנט ספציפיים שלהם תוויות, ובכך לאפשר הclonality להיות מוערך (כלומר, מעקב גנטי שבטים).
בשל הגמישות של המודל קונפטי, הוא הוחל ללמוד פיתוח ותחזוקה של רקמות שונות רבות בריאות ומחלות2,6,7,8,9, 10,11. אחת הדרכים הנפוצות להשתמש במודל היא לתייג אוכלוסיה מסוימת של תאים ולקבוע באילו רקמות הם (ו/או צאצאם) תרמו. אחד כזה ממצא באמצעות גישה זו היה כי השן הבוגרת מורכבת של תאים עם מקור גליה6. יישום נוסף של המודל הוא לחקור את תאי גזע הומאוסטזיס. לדוגמה, המודל קונפטי חשף כי תאי גזע נישות בתוך המעי קריפטטים בהדרגה להיות חד שבטיים כי כמה שיבוטים תא גזע דומיננטיים במהלך התחרות בין תאי גזע2. המודל יכול לשמש גם כדי להעריך את התפשטות התאים, אשר שימושי במיוחד עבור הלומדים באופן איטי חלוקת תאים. לדוגמה, היווצרות שבטים בסחוס הפרקולארית12 הוערך, ואת ההשפעות לטווח קצר של היריב קיפוד על צלחת הצמיחה כונדרוציטים בעכברים ישנים חמישה שבועות נחקרו13.
למרות הפשטות היחסית של מודל קונפטי, אות פלורסנט יכול להיות מאתגרת טכנית כדי לשמר עד אוסף התמונות, במיוחד בעת ניתוח רקמות מינרליזציה. כאן, הפרוטוקול מתאר מודל ממוטב להשתמש בעכבר קונפטי עם עצם לאחר הלידה (עד 6 חודשים של גיל), המאפשר חלבונים פלורסנט להיות במישרין דמיינו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד ללא צורך בזיהוי חיסוני. ניתן להחיל פרוטוקול מפושט זה על רקמות שאינן מינרליזציה. יתר על כן, כולל תיאור של כיצד לאחסן את הדגימות כדי לשמר את האות פלורסנט לתקופה ממושכת של לפחות 3 שנים. חלוקה לרמות של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
Protocol
כל העבודה בעכבר אושרה על ידי ועדת אתית על ניסויים בעלי חיים (ועדת שטוקהולם צפון/Norra Dörtiska Nämd) ובוצעו בהתאם הוראות הסוכנות לבעלי חיים שוודית ́s הנחיות לניסויים בבעלי חיים.
1. רבייה של העכבר
- כדי ליצור את הנבג, חצה את העכבר R26R-קונפטי עם קו הריבית של היין. . לגמול את הגורים בגיל 21
הערה: ניתן להשתמש בעכברים לצורך רבייה מגיל 8 שבועות, או לפי ההנחיות המקומיות. הקלדה (לא מתוארת כאן) ניתן לבצע מתוך ביופסיות שנאספו בגמילה. הגיל בגמילה יכול להיות מותאם לפי ההנחיות המקומיות.
2. מדבקת קונפטי
הערה: זו אסטרטגיה תיוג מתאים טמוקסיפן inducible הזנים.
- הכינו פתרון של עד 2.5 מ"ג/מ"ל טמוקסיפן בשמן תירס בבקבוק זכוכית. התמוססות באמצעות חימום ל-37 ° c בתנור למשך עד 60 דקות, מתוך כל 5 דקות באמצעות מערבולת עד שהאבקה מתמוססת.
הערה: עבור מינונים מוגברת של טמוקסיפן, פתרונות עד 20 מ"ג/mL ניתן להכין באמצעות שיטה זו. - חנות ב -4 ° c עד 3 חודשים, מוגן מפני אור.
- לגרום שילוב מחדש על ידי ניהול 50 μl של 2.5 mg/mL טמוקסיפן מומס intraperitoneally שמן תירס ביום הראשון לאחר הלידה (P1).
הערה: בעיקרון, ניתן לערוך את טמוקסיפן בכל גיל, מוקדם ככל הדור F1. המינון של טמוקסיפן צריך להיות מגוון מבוסס על ביטוי היצור, גיל העכבר, ויישום ניסיוני. מידע נוסף ניתן למצוא בסעיף הדיונים. יצורים שליליים שטופלו באותו אופן יכול לשמש כפקד שלילי עבור אותות פלורסנט קונפטי.
התראה: הקפדה על מטפלים בבעלי חיים מוזהרים מהשימוש בטמוקסיפן ומבטיחים שחומרי הכלוב מושלך על פי הנחיות הסביבה והבטיחות המקומיות.
3. אוסף רקמות
- עכברים המתת חסד על יום לידה 27 (P27) על ידי מילוי בהדרגה את החלל המכיל את העכברים עם דו תחמוצת הפחמן עד לפחות 80% על ידי נפח ושמירה על ריכוז זה עבור 3 דקות. לבצע פריקה צוואר הרחם. לשמור על העכבר על הקרח במהלך הניתוח של החיות האחרות.
- . מנתח את רקמת העניין המתואר להלן פרוטוקול לאיסוף לוחיות הצמיחה הקרובים ביותר והירך התיכון והסחוס העצמי של הברך, מתאים לעכברים לאחר הלידה עד גיל 6 חודשים.
- להסיר את העור סביב הגפיים האחוריות ככל הרגל, באמצעות מספריים חדים מלקחיים שיניים.
- בערך לקצץ את השריר ואת רקמת השומן מהרגליים עם מספריים חדים.
הערה: אל תנקה את העצמות בצורה מושלמת, מכיוון שהרקמות המקיפות מספקות תמיכה מבנית כלשהי, אך הקפד להסיר את כל העור. - באמצעות אזמל, חותכים את הרקמה הרך שבו החלק העליון של הרגל פוגש את הגוף עד הראש הירך הוא גלוי, ואז לחתוך את הרצועות במפרק הירך כדי להסיר את הרגל.
הערה: לחלופין, אם לא ניתן למצוא את ראש הירך, לחתוך דרך עצם הירך קרוב הירך עם מספריים חזקים. - לנתח את הרגל משאר הרגל באמצעות אזמל או מספריים חדים.
4. קיבוע רקמות ועיבוד
הערה: בהתבסס על רקמת הריבית, בצע את אחד משני הפרוטוקולים המפורטים להלן (4.1 עבור רקמות רכות או 4.2 עבור רקמות עכבר מינרליזציה מעל גיל של כ 45 ימים, כמפורט להלן). עבור שתי השיטות, לאחסן את הדגימות גזור ב-3.7% פורמלדהיד/פוספט באגירה מלוחים (PBS) פתרון על הקרח בזמן מנתח את שאר החיות.
- עבור רקמות רכות ומינרליזציה ולפטואה עד גיל של כ P45, לתקן את הרקמה ב מקורר 3.7% פורמלדהיד/PBS עבור 6 h, מתגלגל בעדינות על מסובבי ב 4 ° c. השתמש באמצעי אחסון לפחות 10x גדול יותר מאשר זה של הרקמה. המשך ישירות לשלב 4.3.
- עבור רקמות מינרליזציה, כולל החיברות והפמורה מעל גיל P45, נדרש שלב הדאלסימפיקציה.
- להכין 1 L של 10% EDTA/dH2O פתרון עם pH מותאם 8.05 באמצעות נתרן הידרוקסיד. הבא, לדלל את פורמלדהיד כדי 3.7% באמצעות פתרון זה. ריכוז העבודה של EDTA יהיה 9%.
- תקן את הרקמה על ידי הצבת לתוך מקורר 3.7% פורמלדהיד/PBS לילה, מתגלגל בעדינות על מסובבי ב 4 ° c.
- מניחים את הרקמה לתוך מקורר 3.7% פורמלדהיד/9% EDTA/dH2O פתרון (pH 8.05), ולסובב בעדינות ב 4 ° c בכרך לפחות 10x גדול יותר של הרקמה. חזור על שלב זה על ידי הצבת העצמות לתוך טרי, מקורר 3.7% פורמלדהיד/9% EDTA/dH2O עבור 3x מעל 48 h הבאה.
הערה: decalcification קצר זה מספיק כדי לאפשר בנייה של עצמות הירך והשוקה של עד 6 חודשים-עכברים בני. עבור רקמות מינרליזציה בצפיפות נוספת decalcification נוספת עשויה להידרש כדי לשפר את היסטולוגיה.
- העבירו את הרקמה לתוך הקירור 30% סוכרוז/dH2O. הקפידו למלא את המיכל על הקצה, ולסובב בעדינות את הלילה ב -4 ° c. השתמש באמצעי אחסון לפחות 10x גדול יותר מאשר זה של הרקמה. הרקמה לעתים קרובות לצוף כאשר הניח הראשון לתוך הפתרון הזה ולשקוע לתחתית הבקבוק עד הבוקר.
- כדי להסיר את התמיסה השיורית, שטוף בקצרה את הרקמה על ידי הסרתם מפתרון הסוכות עם מלקחיים ומכסה לחלוטין את המדגם בקירוב של כ -5 מ ל של טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) למשך מספר שניות.
- ממלאים cryomold התווית עם OCT ולמקם את הרקמה בתחתית. עבוד במהירות כדי למנוע את הדגימות היושבות בטמפרטורת החדר במשך זמן רב מדי.
הערה: חשוב למקם את המדגם בכיוון נוח עבור השלב המתאים. כדי להגדיל את הסיכויים להציב באמצעות עמודות לוחית צמיחה שלמה לאחר מעקב עם Col2CreERT: קונפטי, למקם את הצד האמצעי הפונה למטה באמצעות ראש הירך כמדריך, ולמקם את המדגם כמו שטוח לתחתית העובש ככל האפשר. - להטביע את המדגם על ידי הצבת העובש על הקרח היבש מחכה OCT כדי לגבש לחלוטין. מניחים את הקריובני שטוח ככל האפשר כדי למנוע תנועה/הזזה של הרקמה בתבנית. לאחר סיום, לאחסן את הדגימות ב-20 ° c, אם הם לא משמשים באופן מיידי.
הערה: השימוש בתוך 12 שבועות, כי עם גיל הבלוקים הופכים קשים יותר לסעיף.
5. המשך המכירה
הערה: ביצוע קריוסטט בהקפאה עם להבים חד פעמיים מתאים לרקמה קשה. כל הקריוסטט סטנדרטי מתאים.
- הסר את הבלוק מהעובש ואבטח אותו לצ על-ידי החלת OCT בין החלק העליון של הבלוק לבין צ'אק וצינון בקריוסטט ב-20 ° c לפחות 5 דקות, כך ש-OCT התחזק לחלוטין.
- לצנן הן את מחזיק המדגם ואת מחזיק הלהב ל-20 ° c ולאחר מכן למקם את המדגם/צ ' אק במחזיק צ'אק ואת הלהב במחזיק להב כדי להאביק עבור כמה דקות.
הערה: הטמפרטורות שצוינו עשויות להיות מגוונות על-ידי מספר תארים, בהתאם לקריוסטט ולרקמת העניין. - השתמש קריוסטט כדי לחתוך את הבלוק ולחתוך חתכים הרקמה של עובי מתאים כדי לאפשר ויזואליזציה של שיבוטים ברקמת הריבית.
- עבור ניתוח לוחית הצמיחה פוסט-לידה, הכינו סעיפים של 30-160 יקרומטר ואספו אותם על השקופיות. חלק מדגמי הקריוסטט עשויים לאפשר רק את אוסף המקטעים העבים באמצעות הגדרת הקיטום.
- האוויר יבש את השקופיות בטמפרטורת החדר עד שהם יבשים לחלוטין.
הערה: משך שלב זה עשוי להשתנות בהתאם למאפייני הרקמה ועובי המקטע. הטמפרטורה של החדר עלולה גם להשפיע על מהירות שלב זה. - אחסן את השקופיות ב-20 ° צ' עד 36 חודשים, או אם העיבוד מיידי, המשך לשלב 6.2.
6. הכנת שקופיות והרכבה
- הסר את השקופית מהמקפיא והגדל את טמפרטורת החדר בתוך מחזיק שקופית. . הניחו לעיבוי כלשהו להתאדות
- הסר את ה-OCT על-ידי שימוש בפיפטה של פסטר כדי להחיל בעדינות את ה-PBS בטמפרטורת החדר על השקופית. ככל שהמקטע עבה יותר, יידרש זמן רב יותר. עבור 160 יקרומטר מקטעים עבים, לבצע שני rinses: הדגירה פעם אחת 15 דקות ולהסיר את הנוזל, ולאחר מכן להחיל ה-PBS טרי עבור 5 דקות ולהסיר את הנוזל.
הערה: שלב זה הוא להסיר את ה-OCT והוא יכול להיות מגוון בהתבסס על מאפייני הרקמה ועל עובי המקטע, לפי הצורך. הטמפרטורה של החדר עשויה להשפיע על המהירות של שלב זה. - הר את השקופיות בפתרון של 75% 2, 2-התאנואתנול/dH2O בטמפרטורת החדר עם 60 מ"מ מכסה כיסוי ארוך.
הערה: ניתן להכין שקופיות מיד לפני ההדמיה, אך אות הפלורסנט יציב למשך 1 עד 2 שבועות, אם הדבר ממשיך לצאת מהאור בחדר מחולל ב -4 ° c.
7. הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית
- . הגדר את המיקרוסקופ
- הפעל את המיקרוסקופ ופתח את התוכנה. לחץ על הלחצן הפעל מערכת .
- בחר את הערוצים על ידי לחיצה ראשונה על תוכנית ההתקנה החכמה תחת הכרטיסיה רכישה ולאחר מכן בחירת שלושת הערוצים המתאימים חלבון פלורסנט אדום (rfp), חלבון פלורסנט צהוב (yfp), וחלבון פלורסנט ציאן (CFP) תחת ה כותרת צבע . לחץ על האות הטוב ביותר ואז להחיל כדי לבחור את לייזרים.
הערה: התוכן של הכרטיסיה ' רכישה ' מוצג בקובץ משלים 1a. אם הערוצים הדרושים אינם נוכחים, הוסיפו אותם באמצעות הלחצן '+' שמתחת לכותרת הצבע . המידע הדרוש לגבי לייזר, אורכי גל עירור, ומגוון אורכי גל פליטה מוקלט מוצג עבור שלושה חלבונים פלורסצנט בקובץ משלים 1B-D. - בחר את העדשה האובייקטיבית של 20x תחת הכותרת האובייקטיבית בכרטיסיה מצב רכישה .
- לאתר את צלחת הצמיחה או רקמה אחרת של עניין.
- כדי לספק תצוגה מובחנת, בחר תחילה בערוץ RFP על-ידי לחיצה על שמו בכרטיסיה ערוצים . פעולה זו גורמת להצגת פרטי הערוץ RFP בכרטיסיה נתיב אור . לחץ על תיבת השנתות לצד T-PMT.
הערה: ערוץ T-PMT מציג אור לייזר שאינו משתקף, המשמש להמחיש את החלקים הלא-פלואורסצנטי של הרקמה. - מקם את השקופית במחזיק השקופיות ומקם את לוחית הצמיחה או רקמה אחרת של עניין ישירות בין הנתיב האור לבין העדשה האובייקטיבית.
- כדי לפשט את השימוש ברקמה, בטלו את הסימון בערוצים YFP ו-CFP באמצעות השנתות שמתחת לכותרת הלשונית של הערוצים .
- בחר בערוץ T-PMT על-ידי לחיצה על שמו בכותרת הרצועות . לחץ על Live בכרטיסיה רכישה והגדל את הרווח (מאסטר) עבור ערוץ T-PMT כדי להמחיש את מקטע הרקמה על המסך, המוצג בקנה מידה אפור.
- הזז את מיקום השקופית באמצעות ג'ויסטיק כדי לאתר את אזור הריבית, ולאחר מכן התמקד באמצעות כפתור המיקרוסקופ המתאים.
- לחץ על עצור בכרטיסיה רכישה כדי לבטל את חשיפת הלייזר.
- כדי לספק תצוגה מובחנת, בחר תחילה בערוץ RFP על-ידי לחיצה על שמו בכרטיסיה ערוצים . פעולה זו גורמת להצגת פרטי הערוץ RFP בכרטיסיה נתיב אור . לחץ על תיבת השנתות לצד T-PMT.
- הגדירו את פרמטרי ההדמיה.
- השתמש בתיבות השנתות בכרטיסיה ערוצים כדי לבחור אחד מהערוצים ולחץ על Live בכרטיסיה רכישה כדי להציג את התמונה של אותו ערוץ במסך. לאחר מכן, באמצעות לחצן לחיצה שמאלית על העכבר, להתאים את שקופית שקופיות כדי להגדיר את הטווח של אות פלורסנט נפלט שנאסף, כוח הלייזר (הזזה בר תחת כותרת לייזרים ), להשיג (מאסטר) היסט דיגיטלי ב הכרטיסייה ' ערוצים ' כדי להמחיש את התאים המסומנים באמצעות קונפטי על המסך. ערכי קווים מנחים עבור כל הפרמטרים הללו ניתנים בקובץ משלים 1B-D עבור RFP, yfp ו-CFP. השלם את הצעד הזה עבור כל ערוץ, בזה אחר זה.
הערה: כדי להבטיח שהאות הדמיין לא יהיה במצב של קרינה אוטומטית, מקטע מבעל חיים שלילי של היצורים יכול לשמש כפקד שלילי במהלך שלב זה. כמו T-PMT בשילוב עם לייזר RFP (שלב 7.2.1) התאמת כוח הלייזר עבור RFP ישפיע על האות T-PMT. - התאימו את גודל הנקב כדי להגדיל את גילוי הקרינה במקרה הצורך.
הערה: ככל שגודל החור גבוה יותר, האות הפלורסנט יותר מזוהה בכיוון Z. מנחה לכך היא היחידה האוורירית הנובעת (AU), המצוינת באופן אוטומטי מתחת למחוון Pinhole , כאשר 1 AU הוא אופטימלי לאיכות ההדמיה. הגדלת ה-AU הרבה יותר מדי יפגע בניתוח מאוחר יותר, מכיוון שהוא הופך להיות קשה יותר להבחין בין תאים בודדים בכיוון Z). - בדוק את ההתקנה כדי לוודא שאותות מוקלטים אינם חופפים.
- לחץ על תיבות השנתות בכרטיסיה ערוצים כדי לבחור את כל שלושת הערוצים ולחץ על לחצן הצמד בכרטיסיה רכישה .
- בתמונה הנובעת, גלול בין הערוצים המוצגים על-ידי לחיצה על התיבות המסומנות בכחול מעל כל ערוץ מפורט בכרטיסיה מידות . בדוק באופן ידני את החפיפה בין הערוצים שעל המסך. אם האותות חופפים (לדוגמה, אם כל תא אדום הוא גם צהוב), חזור לתחילת שלב 7.3 וחזור על, התאמת הפרמטרים עבור הערוצים החופפים עד שניתן יהיה להבדיל זה מזה. ודא שלכל תווית (כלומר, RFP, YFP או CFP), לפחות שיבוט אחד יכול להיות מדמיינו שמכיל רק אחת מהתוויות.
- השתמש בתיבות השנתות בכרטיסיה ערוצים כדי לבחור אחד מהערוצים ולחץ על Live בכרטיסיה רכישה כדי להציג את התמונה של אותו ערוץ במסך. לאחר מכן, באמצעות לחצן לחיצה שמאלית על העכבר, להתאים את שקופית שקופיות כדי להגדיר את הטווח של אות פלורסנט נפלט שנאסף, כוח הלייזר (הזזה בר תחת כותרת לייזרים ), להשיג (מאסטר) היסט דיגיטלי ב הכרטיסייה ' ערוצים ' כדי להמחיש את התאים המסומנים באמצעות קונפטי על המסך. ערכי קווים מנחים עבור כל הפרמטרים הללו ניתנים בקובץ משלים 1B-D עבור RFP, yfp ו-CFP. השלם את הצעד הזה עבור כל ערוץ, בזה אחר זה.
- לרכוש תמונה.
- בחרו בכרטיסייה ' מצב רכישה ' כדי לציין איכות תמונה בעזרת האפשרות ' גודל מסגרת', ' מהירות' ו'חישוב ממוצע של ערכי מספר ' .
הערה: ההגדרות האופייניות לניסויים אלה מסומנות בקובץ משלים 1A. הפחתת הזום תחת אזור הסריקה כותרת בתוך הכרטיסיה רכישה יכולה להגדיל את שדה התצוגה מבלי לשנות את הזמן הדרוש לרכישת תמונה. - בכרטיסיה רכישה , תחת הכותרת רכישה ממדית , לחץ על תיבת השנתות Z-מחסנית . פתח את הכרטיסיה ' מחסנית z ' כדי להגדיר את המרווח בין תמונות בכיוון Z עד 2.5 μm.
- כדי להגדיר את המיקומים הנכונים, בחר רק את RFP/T-PMT בכרטיסיה ערוצים ולחץ על Live כדי להמחיש את המשובטים האדומות עם חלוקה לעין של הרקמה. הגדר את הפרוסה הראשונה והאחרונה על-ידי לחיצה על הגדר first והגדר האחרונה בפרוסה המתאימה, כוונון המוקד באמצעות כפתור המיקרוסקופ.
- לחץ על הכרטיסיה סרוק את המשבצת בתוך הכרטיסיה רכישה והזן את המספר הכולל של האריחים בכיוונים האופקיים והאנכיים בתיבות המתאימות.
- עבור לכידת תמונה, בחר את כל הערוצים הרצויים בכרטיסיה ערוצים ולאחר מכן לחץ על לחצן הצמד כדי לאסוף תמונה בודדת, או על הלחצן התחל ניסוי כדי לאסוף סריקת מחסנית/אריח Z.
- בחרו בכרטיסייה ' מצב רכישה ' כדי לציין איכות תמונה בעזרת האפשרות ' גודל מסגרת', ' מהירות' ו'חישוב ממוצע של ערכי מספר ' .
- לאחר שהתמונה נרכשה, לחץ על קובץ ולאחר מכן שמור בשם ושמור את התמונה בסוג קובץ השומר על הגדרות המיקרוסקופ ככל האפשר, כדי לאפשר סקירה מאוחרת יותר ושימוש חוזר.
- בצע ניתוח נוסף באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.
Representative Results
כדי לתייג כונדרוציטים בסחוס החותם ולדמיין את התפשטות המשובטים שלהם עם הגיל באמצעות מינהל טמוקסיפן על P1, Col2CreERT: עכברים קונפטי סומנו, ואת הגפיים האחוריות שלהם נאספו על P27. החלק המרכזי נקבע על ידי המחשה ברצועה הצולבת (איור 2 א) ושיבוטים בצלחת הצמיחה האבובית הראשי של העיר היו דמיינו (איור 2a). נתונים אלה מראים כי תאים בודדים שהיו Col2-חיוביים על P1 והפך מתויג עם חלבונים פלורסנט כאשר טמוקסיפן היה מנוהל, עברו הרחבת שבטים, ולאחר מכן נשאר בצלחת הצמיחה עד P27. ניתן לראות את השינויים הראשוניים בהרחבת המשובטים מנקודת זמן התפתחותית דומה באיור 1 של הפרסום האחרון13.
כדי להעניק דוגמה לאות הפלורסנט לאחר אחסון לטווח ארוך (שלב 5.5), המקטע שנאסף אוחסן מיד לאחר (ראה איור 2א, ב) במשך יותר מ-3 שנים לפני שהיה מוכן ומחושב (איור 2c, וידאו 1) .
כדי להדגים מספר בעיות נפוצות בפרוטוקול, מקטע שנותק במהלך שלב ההקפאה מוצג באיור 3A. אזור המקטע (בין לוחית הצמיחה והסחוס הפרקולארית) התרחב באיור 3B מראה כי מינון זה של טמוקסיפן מוביל לרמה כזו גבוהה של שילוב מחדש באזור זה כי זה היה למנוע ניתוח שבטים.
איור 1: סקירה ניסויית. תרשים זרימה המסכם את שלבי המפתח בשיטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: קונפטי תמונות מתוך Col2CreERT: עכבר קונפטי. (א) דגימות של Col2CreERT: עכברי קונפטי עובדו ללא הדקיפיקציה או בשלב האחסון לטווח הארוך. החלק המרכזי היה ממוקם ברצועה הצולבת כסמן. תמונה זו היה דמיינו באמצעות לסרוק אריח לאחר גילוי RFP עם T-PMT (סרגל קנה מידה = 300 μm). (ב) עמודות שבטים מוצגים בתוך השוקה האבובית של צלחת הצמיחה לעין (א), לאחר שחזור תלת-ממד. (ג) שקופית סמוכה לזה המוצגת ב (א) ו-(ב) שנערך באחסון לטווח ארוך במשך יותר מ -3 שנים עובדו עבור דימות ושחזור תלת-ממדי. RFP, YFP ו-CFP מוצגים ב (ב) ו-(ג) (סולם מייצגי פעילויות = 50 μm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אתגרים בעת שימוש בשיטה. (א) קווי מקווקו לבן מתווה פיצול במקטע באמצעות צלחת הצמיחה של Col2CreERT: עכברים קונפטי (סרגל קנה מידה = 50 μm). האזור בתוך התיבה הלבנה מוצג ב (ב) (סרגל קנה מידה = 25 μm). RFP, YFP, ו-CFP מוצגים בשני הפאנלים, ואת אור לייזר שאינו משתקף (T-PMT) ערוץ מוצג גם ב (א) כדי להמחיש את הרקמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: שחזור תלת מימדי של צלחת צמיחה מ Col2CreERT: עכבר קונפטי. שקופית שהוכנה מ Col2CreERT: עכבר קונפטי הוחזק באחסון לטווח ארוך לאחר המשך יותר מ 3 שנים, ולאחר מכן מעובד עבור הדמיה. שחזור תלת מימדי נערך באופן אוטומטי עם תוכנת ניתוח תמונה ומיוצא כווידאו. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
קובץ משלים 1: הגדרת אופיינית של המיקרוסקופ קונפוקלית וקד. (א) הפקדים העיקריים הקיימים בכרטיסיה רכישה .(ב-למעלה) הפרמטרים לייזר, העירור אורך הגל, ומגוון אורכי גל פליטה מוקלט מוצגים עבור שלושה חלבונים פלורסצנט. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
מודל קונפטי שימש בהרחבה כדי ללמוד רקמות סחוס מינרליזציה12,13,14 כדי לתאר את הפרוטוקול אופטימיזציה. קונפטי עכברים2 עם עותק אחד או שני עותקים של אלל R26R-קונפטי יכול לשמש לרבייה וניסויים. שילוב מחדש של עכברים עם אלל אחד של במחקר ב2.1 לבנות ייתן ארבע תוויות פוטנציאליות: חלבון פלורסנט אדום (rfp, cytoplasmic), חלבון פלורסנט צהוב (yfp, cytoplasmic), חלבון פלורסנט ציאן (CFP, מקומי מקומית), וירוק חלבון פלורסנט (GFP, גרעין-מקומי), ואילו שילוב מחדש בעכברים homozygous קונפטי (כלומר, המכיל שני עותקים של המוח 2.1 לבנות) ייתן 10 פלטי צבע אפשריים (RFP + RFP, rfp + YFP, RFP + CFP, RFP + מעלה, yfp + בfp, yfp + CFP, FP + GFP, CFP + CFP, CFP + GFP, GFP + GFP. עם זאת, בגלל הכריתה DNA והיפוך האירועים מתרחשים בצורה סטוכסטית, שילוב מחדש כדי לייצר GFP מתרחשת רק חלק קטן של תאים, כפי שדווח קודם לכן2, ולכאורה שונה על-ידי סוג תא או קוהיצור בשימוש2, 12,13. מכאן, בהתחשב בהתרחשות נמוכה של אירועים שילוב מחדש המוביל ביטוי GFP, שישה פלטי צבע הם הנפוצים ביותר בעכברים homozygous קונפטי.
שיקול חשוב כאשר תכנון ניסויים עם עכבר קונפטי הוא למצוא זן המתאים של היצור. ראשון, מאז כולל של קונפטי יש מספר אתרי loxP, אירוע אחד שילוב מחדש לא ממנוע השני4. משמעות הדבר היא שאם תא מסומן ומתחלק להפקת שיבוט של צבע אחד, אירוע שילוב חוזר שני באחד מתאי בתו יפיק צבע שונה, ובכך מסווה את הרחבת השבטים האמיתית. Thus, זנים noninducible, שבו האנזים הוא תמיד פעיל אם היזם המתאים פעיל, לא מומלץ. שנית, בזנים מסוימים את הביטוי של היצור recombinase לעתים קרובות מגיע על חשבון של חלבון אנדוסוגני, ובכך ליצור פנוטיפ משלו (למשל, עבור Prg4-GFPCreERT2 נקישה העכבר למתח שבו עכברים הנמל שני האללים של היצורים15), אז עותק אחד של אלל של היצור הוא רצוי. בכל הניסויים המתוארים, עותק אחד של Col2CreERT16 נישא על ידי הזכר או ההורה הנשי כדי ליצור Col2CreERT: הקונפטי עכברים, כמתואר13. לאחר מכן, הספציפיות של קו היצור לסוג התא של עניין היא שיקול חשוב. לדוגמה, Col2CreERT הוא כchondrocyte ספציפי, אבל תוויות מספר אוכלוסיות נפרדות של כונדרוציטים בתוך הסחוס מוקדם לאחר הלידה17. לבסוף, הפעילות של זנים שונים של היצור יכול לשנות במידה ניכרת עם גיל החיות, כמו פעילות אנדוגניים של היזם מנוצל עבור שינויים ביטוי היצור, גם בתאים מאותו סוג (למשל, Prg4-GFPCreERT2, אשר יכול לדרוש הגדלת מספר מינונים של טמוקסיפן כדי לתייג תאי אזור שטחיים כעכברים בגיל15).
מספר התאים שכותרתו ישתקף על ידי כמות טממוקסיפן נתון, אז זה לא תמיד רצוי לתת את המינון המקסימלי, כי הבחנה שיבוטים אחד מהשני עשוי להיות קשה. בגלל הביטוי היצור שונה תחת התקנה של יזמים שונים כמו גם עם הגיל, מינון טמוקסיפן יהיה צורך לכוונן כדי למטב את התיוג. חשוב לציין כי התאים אינם פלורסנט מיד על מפעיל שילוב, כי הזמן נדרש עבור שילוב מחדש להתרחש ואת החלבונים כתוצאה מפלורסנט לצבור מספיק עבור הדמיה. יש צורך במגוון רחב של שעות (בין 24 ל-72 ש ח), שנראה כמושפע מקו היצור, סוג התא וגיל החיות. מאז טמוקסיפן יכול להיות פעיל ביולוגית זמן רב לאחר מינהל18 זה תמיד מומלץ לבדוק ביסודיות את היעילות שילוב מחדש בכל דגם.
במהלך השלב המיקרוסקופיה, עירור החלבונים הפלורסצנט מחייבת חדירת הרקמה באור לייזר. בגלל רקמות שונות יש מאפיינים שונים, אור לייזר עלול לא לחדור 160 יקרומטר חלקים עבים של כל הרקמות. עם זאת, חלקים עבים כאלה ניתן להשתמש עבור סחוס לוחית הצמיחה, כפי שנעשה בשימוש באיור 2, איור 3. שימו לב כי כל מיקרוסקופ שונה, ולא סביר שההגדרות המתוארות (קובץ משלים 1) יפעלו באופן מושלם ללא התאמות קלות. אחד האתגרים העיקריים הוא להבדיל בין חלבונים פלורסנט שונים כדי להבטיח כי אין זיהום מערוץ אחד למשנהו. לדוגמה, האות בערוץ YFP שנגרם על-ידי הזריחה הבאה מ-GFP חופפת בין ערוצי YFP ו-RFP. יש לבדוק בקפידה גם את ערוצי YFP ו-CFP. ניתן לעשות זאת במספר דרכים. ראשית, טווח הפליטה של אורכי גל אור פלורסנט הנרשמים עבור כל חלבון פלורסנט ניתן לצמצם. שנית, כוונון כוח הלייזר בשילוב עם הרווח הדיגיטלי יכול למטב את האות. במחקר זה שלבים אלה היו מספיקים, אבל הם סומכים על אות פלורסנט חזק. משמעות הדבר היא כי בתאוריה, עיבוד רקמות לא יעיל יכול להפחית את הפעילות של חלבונים פלורסנט, או מקור חלש לייזר אור יכול לפגוע הפרדת הערוץ.
אחד היתרונות של העכבר קונפטי הוא שזה יכול להיות משולב עם מספר גדול של זנים מוטאנטים גנטית זמינים כך ההשפעה של גנים ספציפיים על דינמיקה שבטים ניתן ללמוד10,11,12 ,13,14,19,20. אם כי עם כמה הגבלות לדוגמה, שילוב מחדש של אלטלס הקונפטי והגן של הריבית אינו יכול להיות מופרד בעת שימוש במוטציות מבוססות-שושלת שבטים משולבים עם מעקב אחר השושלת. למרות זאת, כגון שילוב אירועים מחדש יכול להיות יעיל10,14,20. לדוגמה, אפשרות זו שימש כדי לחקור את מספר התא מוגבר באזור מנוחה של עכברים בעקבות כונדרולידה הספציפי אבלציה של TSC1 בלוח הצמיחה21 וחשף את הקשר בין השבטים בין תאים אלה לאורך זמן 13. בנוסף, ניתוח שבטים ספציפיים לרקמה באמצעות עכברי קונפטי יכול לשמש עם עכברים שאינם מבוססי loxp מבוסס מוטציה11, ואפשר גם לשלב גישות אלה עם תרופתי8,9 ,13 ו/או מודלים כירורגיים8 כדי לדמיין תגובות שבטים רטבאליות פונקציונלי אחרים. הזדמנויות נוספות עולות כאשר משלבת קונפטי עם תוויות מקטעים עם זיהוי חיסוני של חלבונים אנדוגניים על ידי immunofluorescence. ניתוח כזה מאפשר זיהוי של תאי מעקב והתאמה לשפות אחרות עם סמן ידוע. עם שיטת הקיבוע שתוארה לעיל, ניתן לבצע immunofluorescence ועדיין להמחיש את הקרינה הפלואורסצנטית מחלבונים פלורסנט12,13. עם זאת, בעיתונים שהוזכרו, אחזור אנטיגן לא היה נדרש. שיטות החזרת אנטיגן קשות, כגון רתיחה במאגר ציטראט, מובילה לאובדן מוחלט של מגזרי הקרינה. למרות החלבונים פלורסנט לאחר מכן ניתן להבחין באמצעות נוגדנים22, אובדן של זהות שבטיים יכול להתרחש.
לסיכום, באמצעות מודל קונפטי כדי לתייג תאים ב vivo הוא כלי אינפורמטיבי כדי לנתח את גורלם של תאים אלה לאורך זמן. השיטה המתוארת מספקת דרך מהירה ויעילה להמחיש ישירות ביטוי חלבון פלורסנט ברקמות מינרליזציה.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לד ר יבגני איבאשקין לקבלת ייעוץ מתודולוגי. עבודה זו נתמכת כספית על ידי המועצה למחקר שוודי (א. ס. ג), הקרן המדעית הרוסית (להעניק #19-15-00241 עולה), מכון Karolinska (A.S.C.), StratRegen קי ו Stiftelsen Konung גוסטב V:s 80-årsfond (A.S.C.), Stiftelsen פרימוראר בארהוסט וסאלוסאפק ברנבארד (P.T.N.), מועצת המלגות הסינית (B.Z.). מיקרוסקופ הקונמוקד מומן על ידי קרן קנוט ואליס ולנברג.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
| 60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | |
| Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
| Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
| Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
| EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
| Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
| Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
| Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
| Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
| OCT | Sakura | 102094-104 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| PBS | Gibco | 14200075 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |
References
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Proudfoot, N. J. Ending the message: poly(A) signals then and now. Genes & Development. 25 (17), 1770-1782 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Füllgrabe, A., et al. Dynamics of Lgr6+ Progenitor Cells in the Hair Follicle, Sebaceous Gland, and Interfollicular Epidermis. Stem Cell Reports. 5 (5), 843-855 (2015).
- Lazzeri, E., et al. Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury. Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Yoo, Y. A., et al. The Role of Castration-Resistant Bmi1+Sox2+ Cells in Driving Recurrence in Prostate Cancer. Journal of the National Cancer Institute. 111 (3), 311-321 (2018).
- McConnell, A. M., et al. p53 Regulates Progenitor Cell Quiescence and Differentiation in the Airway. Cell Reports. 17 (9), 2173-2182 (2016).
- Li, L., et al. Superficial cells are self-renewing chondrocyte progenitors, which form the articular cartilage in juvenile mice. Faseb Journal. 31 (3), 1067-1084 (2017).
- Newton, P. T., et al. A radical switch in clonality reveals a stem cell niche in the epiphyseal growth plate. Nature. 567 (7747), 234-238 (2019).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, 25902 (2017).
- Kozhemyakina, E., et al. Identification of a Prg4-expressing articular cartilage progenitor cell population in mice. Arthritis Rheumatology. 67 (5), 1261-1273 (2015).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreERT to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Developmental Dynamics. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
- Reinert, R. B., et al. Tamoxifen-Induced Cre loxP Recombination Is Prolonged in Pancreatic Islets of Adult Mice. PloS One. 7 (3), 33529 (2012).
- Kim, I. S., et al. In vitro response of primary human bone marrow stromal cells to recombinant human bone morphogenic protein-2 in the early and late stages of osteoblast differentiation. Development, Growth & Differentiation. 50 (7), 553-564 (2008).
- Fang, X., Gyabaah, K., Nickkholgh, B., Cline, J. M., Balaji, K. C. Novel In Vivo model for combinatorial fluorescence labeling in mouse prostate. The Prostate. 75 (9), 988-1000 (2015).
- Newton, P. T., Xie, M., Medvedeva, E. V., Sävendahl, L., Chagin, A. S. Activation of mTORC1 in chondrocytes does not affect proliferation or differentiation, but causes the resting zone of the growth plate to become disordered. Bone Reports. 8, 64-71 (2018).
- Xie, M., et al. Schwann cell precursors contribute to skeletal formation during embryonic development in mice and zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (30), 15068-15073 (2019).
