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Developmental Biology

खनिजीकृत ऊतकों का अध्ययन करने के लिए Confetti माउस का उपयोग कर क्लोनल आनुवंशिक अनुरेखण

Published: October 23, 2019 doi: 10.3791/60424
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet, 2Institute for Regenerative Medicine, Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), 3Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet and Pediatric Endocrinology Unit, Karolinska University Hospital

Summary

इस विधि खनिज ऊतकों का अध्ययन करने के लिए R26R-Confetti (Confetti) माउस मॉडल के उपयोग का वर्णन करता है, छवि अधिग्रहण करने के लिए प्रजनन रणनीति से सभी चरणों को कवर. शामिल एक सामान्य प्रोटोकॉल है कि सभी नरम ऊतकों और एक संशोधित प्रोटोकॉल है कि खनिज ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है के लिए लागू किया जा सकता है.

Abstract

शरीर में एक व्यक्तिगत कोशिका लेबलिंग की निगरानी करने के लिए जो सेल प्रकार यह करने के लिए वृद्धि दे सकते हैं और जीव के माध्यम से अपने प्रवास को ट्रैक या इसकी लंबी उम्र का निर्धारण ऊतक विकास और रखरखाव के तंत्र प्रकट करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका हो सकता है. सबसे महत्वपूर्ण उपकरण वर्तमान में vivo में कोशिकाओं की निगरानी के लिए उपलब्ध में से एक Confetti माउस मॉडल है. Confetti मॉडल आनुवंशिक रूप से एक सेल प्रकार विशेष तरीके से विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ चूहों में रहने वाले चूहों में व्यक्तिगत कोशिकाओं लेबल और उनके भाग्य की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही समय के साथ उनकी संतान के भाग्य, एक प्रक्रिया में क्लोनल आनुवंशिक अनुरेखण या कहा जाता है क्लोनल वंश अनुरेखण. इस मॉडल को लगभग एक दशक पहले उत्पन्न किया गया था और कई जैविक प्रक्रियाओं की एक बेहतर समझ में योगदान दिया है, विशेष रूप से स्टेम सेल जीव विज्ञान से संबंधित, विकास, और वयस्क ऊतकों के नवीकरण. हालांकि, जब तक छवि संग्रह और विभिन्न फ्लोरोसेंट संकेतों का एक साथ कब्जा फ्लोरोसेंट संकेत के संरक्षण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से खनिज ऊतक के लिए. यह प्रकाशन विकास प्लेट उपास्थि है कि किसी भी mineralized या nonminralized ऊतक के लिए लागू किया जा सकता का विश्लेषण करने के लिए Confetti मॉडल का उपयोग करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.

Introduction

बेहतर तरीकों सेल व्यवहार की निगरानी करने के लिए जब पशु मॉडल का उपयोग प्रयोगात्मक दक्षता बढ़ाने के लिए वांछनीय हैं। विवो में सेल व्यवहार पर नजर रखने के लिए सबसे जानकारीपूर्ण दृष्टिकोणमें से एक बहुरंगा रिपोर्टर माउस उपभेदों 1 के साथ क्लोनल वंश अनुरेखणहै,व्यापक रूप से इस्तेमाल किया R26R-Confetti (Confetti) माउस2सहित. फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से लेबलिंग और समय के साथ उन कोशिकाओं का पालन करके, कई क्षेत्रों में शोधकर्ताओं ने Confetti माउस का इस्तेमाल किया है विभिन्न जैविक प्रणालियों की एक भीड़ में अंतर्दृष्टि प्रकट.

Confetti माउस एक loxP आधारित रिपोर्टर प्रणाली है जिसमें Cre निर्भर डीएनए पुनर्संयोजन एक stochastic तरीके से कई संभव फ्लोरोसेंट प्रोटीन में से एक की स्थायी अभिव्यक्ति का कारण बनता है2. R26R-Confetti allele सर्वव्यापक व्यक्त CAGG प्रमोटर, जो तुरंत एक loxP-फ्लैंक्ड नवआर-कैसेट2के ऊपर स्थित है, जिसका polyadenylation अनुक्रम प्रतिलेखनसमाप्त3 , उसके बाद शामिल Brainbow 2.1 निर्माण4| इसलिए, क्रे-मध्यस्थ पुनर्संयोजन एक साथनियो आर-कैसेट को बढ़ाता है और कुछ फ्लोरोसेंट प्रोटीनों के उत्पादन की ओर जाता है, जिसके आधार पर बीरेनबो 2.1 निर्माण के कुछ हिस्सों को निकाला जाता है। यह सुविधा Confetti माउस अत्यंत अनुकूलनीय बनाता है क्योंकि यह एक माउस में किसी भी सेलुलर आबादी को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जिसके लिए एक विशिष्ट क्रे तनाव उपलब्ध है. R26R-Confetti तनाव के साथ एक ऊतक-विशिष्ट क्रे तनाव के पार लेबलिंग की विशिष्टता प्रदान करता है. हालांकि, क्रेज़ भी प्रेरक होना चाहिए (जैसे, CreERT या CreERT2, जो tamoxifen बाध्यकारी की आवश्यकता के लिए उन्हें नाभिक में प्रवेश करने के लिए और डीएनए पुनर्संयोजन प्रेरित करने की अनुमति5)ताकि लेबलिंग निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर प्राप्त किया जा सकता है. इस प्रकार, एक सेलुलर जनसंख्या परिणामी CreERT-positive/Confetti-सकारात्मक संतानों को वांछित समय बिंदु पर tamoxifen के साथ इंजेक्शन लगाकर लेबल किया जा सकता है और एक निश्चित उम्र के लिए ट्रैक किया जा सकता है, जब ब्याज के ऊतकों को विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता है। ऊतक प्रसंस्करण के बाद, फ्लोरोसेंट लेबल कोशिकाओं को सीधे confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जा सकती है ताकि प्रत्येक शुरू में लेबल सेल की संतान उनके विशिष्ट फ्लोरोसेंट के आधार पर किसी भी अन्य लेबल सेल द्वारा उत्पन्न संतान से अलग किया जा सकता है लेबल, जिससे क्लोनलिटी का मूल्यांकन किया जा करने के लिए अनुमति देता है (यानी, क्लोनल आनुवंशिक अनुरेखण).

कॉन्फेटी मॉडल के लचीलेपन के कारण, यह स्वास्थ्य और रोग2,6,7,8,9में कई विभिन्न ऊतकों के विकास और रखरखाव के अध्ययन के लिए लागू किया गया है, 10,11. मॉडल का उपयोग करने के लिए एक आम तरीका कोशिकाओं की एक निश्चित आबादी लेबल और निर्धारित करने के लिए जो ऊतकों वे (और / इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए ऐसा ही एक निष्कर्ष यह था कि वयस्क दांत में ग्लिल मूल 6 वाली कोशिकाएं होतीहैं. मॉडल का एक अन्य आवेदन स्टेम सेल homeostasis का अध्ययन करने के लिए है. उदाहरण के लिए, Confetti मॉडल से पता चला कि आंतों crypts में स्टेम सेल niches धीरे-धीरे monoclonal हो क्योंकि कुछ स्टेम सेल क्लोन स्टेम सेल2के बीच प्रतिस्पर्धा के दौरान प्रमुख हैं. मॉडल भी सेल प्रसार है, जो धीरे धीरे विभाजित कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, आर्टिकुलर उपास्थि12 में क्लोनल गठन का मूल्यांकन किया गया था, और पांच सप्ताह पुराने चूहों में विकास प्लेट कोन्ड्रोसाइट्स पर एक हेजहॉग विरोधी के अल्पकालिक प्रभाव का अध्ययन किया गया13.

Confetti मॉडल के रिश्तेदार सादगी के बावजूद, फ्लोरोसेंट संकेत तकनीकी रूप से छवि संग्रह तक बनाए रखने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, विशेष रूप से जब खनिज ऊतकों का विश्लेषण. यहाँ, प्रोटोकॉल प्रसव के बाद की हड्डी के साथ Confetti माउस का उपयोग करने के लिए एक अनुकूलित मॉडल का वर्णन करता है (उम्र के 6 महीने तक), फ्लोरोसेंट प्रोटीन को सक्षम करने के लिए सीधे इम्यूनोडिटेक्शन के लिए आवश्यकता के बिना confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की. यह सरलीकृत प्रोटोकॉल गैर खनिजीकृत ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, शामिल कैसे नमूने स्टोर करने के लिए कम से कम 3 साल की एक लंबी अवधि के लिए फ्लोरोसेंट संकेत की रक्षा के लिए एक विवरण है. प्रोटोकॉल की एक रूपरेखा चित्र 1में प्रस्तुत की गई है।

Protocol

सभी माउस काम पशु प्रयोगों पर नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (Stockholm उत्तर समिति /Norra Dzurf[rs]ksetiska N]md) और स्वीडिश पशु एजेंसी के प्रावधानों और पशु प्रयोग के लिए दिशानिर्देश के अनुसार आयोजित किया गया.

1. माउस प्रजनन

  1. तनाव उत्पन्न करने के लिए, ब्याज की Cre लाइन के साथ R26R-Confetti माउस को पार. 21 दिनों की उम्र में पिल्ले को कम करें।
    नोट: चूहे उम्र के लगभग 8 सप्ताह से प्रजनन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या स्थानीय दिशा निर्देशों के अनुसार. Genotyping (यहाँ वर्णित नहीं) weaning पर एकत्र बायोप्सी से किया जा सकता है. weaning में उम्र स्थानीय दिशा निर्देशों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है.

2. कंफ़ेद्दी लेबलिंग

नोट: यह लेबलिंग रणनीति tamoxifen inducable क्रेसुलेस के लिए उपयुक्त है.

  1. कांच की बोतल में मकई के तेल में 2.5 मिलीग्राम/एमएल टैमोक्सीफेन तक का घोल तैयार कीजिए। 60 मिनट तक के लिए एक ओवन में 37 डिग्री सेल्सियस को गर्म करके भंग, पाउडर भंग कर दिया है जब तक एक भंवर का उपयोग कर हर 5 मिनट आंदोलन.
    नोट: tamoxifen की बढ़ी हुई खुराक के लिए, समाधान अप करने के लिए 20 mg/mL इस विधि का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है.
  2. 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, प्रकाश से सुरक्षित।
  3. पहले प्रसवोत्तर दिन (पी 1) पर कॉर्न तेल में भंग 2.5 मिलीग्राम/एमएल टैमोक्सीफेन के 50 डिग्री एल के प्रशासन द्वारा पुनर्संयोजन को प्रेरित करें।
    नोट: सिद्धांत रूप में, tamoxifen किसी भी उम्र में प्रशासित किया जा सकता है, के रूप में जल्दी F1 पीढ़ी के रूप में. Tamoxifen की खुराक क्रे अभिव्यक्ति के आधार पर अलग किया जाना चाहिए, माउस उम्र, और प्रयोगात्मक आवेदन. अधिक जानकारी चर्चा अनुभाग में पाया जा सकता है. एक ही रास्ते में इलाज नकारात्मक चूहों क्रे Confetti फ्लोरोसेंट संकेतों के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
    चेतावनी: सुनिश्चित करें कि पशु संचालकों tamoxifen उपयोग की चेतावनी दी है और यह सुनिश्चित करें कि पिंजरे सामग्री स्थानीय पर्यावरण और सुरक्षा के दिशा निर्देशों के अनुसार निपटा रहे हैं.

3. ऊतक संग्रह

  1. प्रसवोत्तर दिन 27 (P27) पर चूहों को धीरे-धीरे मात्रा से कम से कम 80% तक कार्बन डाइऑक्साइड युक्त अंतरिक्ष को भरने और 3 मिनट के लिए इस एकाग्रता को बनाए रखने के द्वारा यूथेनाइज करें। गर्भाशय ग्रीवा की अव्यवस्था का प्रदर्शन करें। अन्य जानवरों के विच्छेदन के दौरान बर्फ पर चूहों रखें.
  2. ब्याज के ऊतक को अलग करें। नीचे उल्लिखित समीपस्थ टिबियल और दूरस्थ ऊरु विकास प्लेटें और घुटने की संधि उपास्थि, 6 महीने की उम्र तक प्रसव के बाद चूहों के लिए उपयुक्त इकट्ठा करने के लिए एक प्रोटोकॉल है.
    1. तेज कैंची और दांतेदार संदंश का उपयोग करते हुए, पैर के रूप में दूर के रूप में पिछले अंगों के आसपास की त्वचा निकालें।
    2. मोटे तौर पर तेज कैंची के साथ पैरों से मांसपेशियों और वसा ऊतक ट्रिम.
      नोट: हड्डियों को पूरी तरह से साफ न करें, क्योंकि आसपास के ऊतक अनुभागिंग करते समय कुछ संरचनात्मक समर्थन प्रदान करते हैं, लेकिन यह सुनिश्चित करते हैं कि सभी त्वचा को हटा दिया गया है।
    3. एक स्केलपेल का उपयोग करना, नरम ऊतक के माध्यम से कटौती जहां पैर के शीर्ष शरीर से मिलता है जब तक ऊरु सिर दिखाई देता है, तो पैर को हटाने के लिए कूल्हे के संयुक्त में स्नायुबंधन में कटौती।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, अगर यह ऊरु सिर को खोजने के लिए संभव नहीं है, मजबूत कैंची के साथ कूल्हे के करीब femur के माध्यम से कटौती.
    4. स्कैल्पेल या तेज कैंची का उपयोग करके पैर के बाकी हिस्सों से पैर को अलग करें।

4. ऊतक निर्धारण और प्रसंस्करण

नोट: ब्याज के ऊतकों के आधार पर, नीचे विस्तृत दो प्रोटोकॉल में से एक का पालन करें (4.1 नरम ऊतकों के लिए या 4.2 लगभग 45 दिनों की उम्र से अधिक खनिज माउस ऊतकों के लिए, नीचे विस्तृत के रूप में). दोनों विधियों के लिए, शेष जंतुओं को विच्छेद करते समय बर्फ पर 3.7% फार्मेल्डिहाइड/फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस) घोल में विच्छेदित नमूनों को संग्रहित करें।

  1. नरम ऊतकों और खनिज टिबिया और femora लगभग P45 की उम्र तक के लिए, precooled में ऊतक को ठीक 3.7% formaldehyde / ऊतक की तुलना में कम से कम 10x अधिक मात्रा का उपयोग करें। 4.3 कदम करने के लिए सीधे जारी रखें।
  2. लगभग P45 की उम्र से अधिक टिबिया ई और femora सहित खनिज ऊतकों के लिए, एक decalification कदम की आवश्यकता है।
    1. 10% EDTA/dH2O समाधान का 1 ल तैयार करें जिसे सोडियम हाइड्रॉक्साइड का उपयोग करके 8ण्05 में समायोजित किया गया है। इसके बाद, इस समाधान का उपयोग करके फॉर्मेल्डिहाइड को 3.7% तक पतला करें। EDTA के काम एकाग्रता 9% हो जाएगा.
    2. टिश्यू को पहले से कूल्ड 3.7% फॉर्मेल्डिहाइड/पीबीएस में रात भर रखकर ठीक करें, धीरे से 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर रोलिंग।
    3. ऊतक को पूर्वकूलित 3.7% फार्मेल्डिहाइड/9% EDTA/dH2O समाधान (pH 8.05) में रखें, और धीरे से ऊतक की तुलना में कम से कम 10x अधिक मात्रा में 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं। अगले 48 एच पर 3x के लिए ताजा, precooled 3.7% formaldehyde/9% EDTA/dH2O में हड्डियों को रखकर इस कदम को दोहराएँ।
      नोट: यह छोटा decalcification अप करने के लिए 6 महीने पुराने चूहों की फीमर और टिबिया हड्डियों के अनुभागकेल के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त है। अधिक सघन खनिज ऊतकों के लिए आगे decalification ऊतक विज्ञान में सुधार करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  3. ऊतक को पूर्वकूलित 30% सुक्रोज/डीएच2ओ में स्थानांतरित करें, कंटेनर को किनारा में भरना सुनिश्चित करें, और धीरे से 4 डिग्री सेल्सियस पर रात को घुमाएं। ऊतक की तुलना में कम से कम 10x अधिक मात्रा का उपयोग करें। ऊतक अक्सर तैरने जब पहली बार इस समाधान में रखा और सुबह तक बोतल के नीचे सिंक होगा.
  4. अवशिष्ट sucrose समाधान को दूर करने के लिए, संक्षेप में यह संदंश के साथ sucrose समाधान से हटाने और पूरी तरह से कई सेकंड के लिए इष्टतम काटने तापमान यौगिक (OCT) के लगभग 5 मिलीलीटर के साथ नमूने को कवर करके ऊतक धो।
  5. OCT के साथ एक prelabeled cryomold भरें और नीचे ऊतक की स्थिति. बहुत लंबे समय के लिए कमरे के तापमान पर बैठे नमूनों से बचने के लिए जल्दी से काम करते हैं।
    नोट: यह अनुभाग चरण के लिए एक सुविधाजनक अभिविन्यास में नमूना जगह के लिए महत्वपूर्ण है. Col2CreERT के साथ अनुरेखण के बाद पूरे विकास प्लेट कॉलम के माध्यम से अनुभाग की संभावना को बढ़ाने के लिए: Confetti, एक गाइड के रूप में femoral सिर का उपयोग कर नीचे का सामना करना पड़ मध्यस्थ पक्ष जगह है, और संभव के रूप में मोल्ड के नीचे करने के लिए फ्लैट के रूप में नमूना स्थिति.
  6. सूखी बर्फ पर मोल्ड रखकर नमूना एम्बेड और पूरी तरह से ठोस करने के लिए OCT के लिए इंतज़ार कर रहे. मोल्ड में ऊतक के आंदोलन/स्लीडिंग से बचने के लिए क्रायोमल्ड्स को यथासंभव फ्लैट रखें। एक बार समाप्त हो जाने पर, नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, यदि उनका तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है।
    नोट: 12 सप्ताह के भीतर का प्रयोग करें, क्योंकि उम्र के साथ ब्लॉक अनुभाग के लिए और अधिक कठिन हो जाते हैं।

5. अनुभागिंग

नोट: कठोर ऊतक के लिए उपयुक्त डिस्पोजेबल ब्लेड के साथ एक cryostat का उपयोग कर cryosectioning प्रदर्शन करते हैं। किसी भी मानक cryostat उपयुक्त है.

  1. मोल्ड से ब्लॉक निकालें और ब्लॉक के शीर्ष और चक के बीच OCT लागू करने और कम से कम 5 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर cryostat में ठंडा करने से चक को सुरक्षित, ताकि OCT पूरी तरह से जम गया है।
  2. दोनों नमूना धारक और ब्लेड धारक -20 डिग्री सेल्सियस के लिए Precool और फिर चक धारक में नमूना /
    नोट: निर्दिष्ट तापमान cryostat और ब्याज के ऊतकों के आधार पर कई डिग्री से भिन्न हो सकता है.
  3. ब्याज के ऊतक में क्लोन के दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए ब्लॉक ट्रिम और एक उपयुक्त मोटाई के ऊतक वर्गों में कटौती करने के लिए cryostat का प्रयोग करें।
    1. प्रसवोत्तर वृद्धि प्लेट विश्लेषण के लिए, 30-160 डिग्री मीटर के खंड तैयार करें और उन्हें स्लाइड पर एकत्र करें। कुछ cryostat मॉडल केवल ट्रिम सेटिंग का उपयोग कर मोटी वर्गों के संग्रह की अनुमति हो सकती है.
  4. एयर कमरे के तापमान पर स्लाइड सूखी जब तक वे पूरी तरह से शुष्क हैं.
    नोट: इस चरण की अवधि ऊतक गुण और अनुभाग मोटाई के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. कमरे का तापमान भी इस कदम की गति को प्रभावित करने की संभावना है।
  5. 36 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड्स संग्रहीत करें, या यदि तुरंत संसाधित किया जाए, तो चरण 6.2 पर आगे बढ़ें.

6. स्लाइड तैयारी और बढ़ते

  1. फ्रीजर से स्लाइड निकालें और एक स्लाइड धारक में क्षैतिज कमरे के तापमान तक ले आओ। किसी भी संघनन को वाष्पित होने दें।
  2. धीरे स्लाइड पर कमरे के तापमान पर पीबीएस लागू करने के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके OCT निकालें। अनुभाग मोटा, अब समय की आवश्यकता है. 160 डिग्री मोटी वर्गों के लिए, दो कुल्ला करें: 15 मिनट के लिए एक बार इनक्यूबेट करें और तरल को हटा दें, और फिर 5 मिनट के लिए ताजा पीबीएस लागू करें और तरल को हटा दें।
    नोट: यह कदम OCT को दूर करने के लिए है और ऊतक गुण और अनुभाग मोटाई के आधार पर अलग किया जा सकता है, के रूप में उपयुक्त. कमरे का तापमान इस चरण की गति को प्रभावित करने की संभावना है।
  3. 60 मिमी लंबी कवर पर्चियों के साथ कमरे के तापमान पर 75% 2,2-thiodiethanol/dH2हे के समाधान में स्लाइड माउंट करें।
    नोट: स्लाइड इमेजिंग से पहले तुरंत तैयार किया जा सकता है, लेकिन फ्लोरोसेंट संकेत 1 के लिए स्थिर है 2 सप्ताह अगर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified कक्ष में प्रकाश से बाहर रखा.

7. confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग

  1. सूक्ष्मदर्शी सेट करें.
    1. माइक्रोस्कोप चालू करें और सॉफ्टवेयर खोलें. सिस्टम प्रारंभ करें बटन क्लिक करें.
    2. पहले अधिग्रहण टैब के तहत स्मार्ट सेटअप पर क्लिक करके और फिर लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (RFP), पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP), और सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (CFP) के तहत इसी तीन चैनलों का चयन करके चैनलों का चयन डाई शीर्षक. सबसे अच्छा संकेत क्लिक करें फिर लेज़रों का चयन करने के लिए लागू करें।
      नोट: प्राप्ति टैब की सामग्री अनुपूरक फ़ाइल 1Aमें दिखाई जाती है। यदि आवश्यक चैनल मौजूद नहीं हैं, तो डाई शीर्षक के अंतर्गत '+' बटन का उपयोग करके उन्हें जोड़ें. लेजर, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य, और दर्ज उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य की सीमा के बारे में आवश्यक जानकारी पूरक फ़ाइल 1B-डीमें तीन Confetti फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए दिखाया गया है.
    3. प्राप्ति मोड टैब में उद्देश्य शीर्षक के अंतर्गत 20x उद्देश्य लेंस का चयन करें.
  2. वृद्धि प्लेट या ब्याज के अन्य ऊतक का पता लगाएँ.
    1. एक विशिष्ट दृश्य प्रदान करने के लिए, पहले चैनल टैब में इसका नाम क्लिक करके RFP चैनल का चयन करें। इसके कारण RFP चैनल का विवरण लाइट पथ टैब में प्रदर्शित किया जा सकता है. T-PMTके पास टिक-बॉक्स पर क्लिक करें.
      नोट: टी पीएमटी चैनल nonreflected लेजर प्रकाश, जो ऊतक के nonfluorescent भागों कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है से पता चलता है।
    2. स्लाइड धारक में स्लाइड प्लेस और विकास प्लेट या प्रकाश पथ और उद्देश्य लेंस के बीच सीधे ब्याज के अन्य ऊतक की स्थिति.
    3. ऊतक स्थानीयकरण को सरल बनाने के लिए, चैनल टैब के ट्रैक्स शीर्षक के अंतर्गत टिक-बॉक्स का उपयोग करके YFP और CFP चैनलों को अचयनित करें.
    4. ट्रैक शीर्षक में इसका नाम क्लिक करके टी-पीएमटी चैनल का चयन करें। अधिग्रहण टैब में लाइव क्लिक करें और स्क्रीन पर ऊतक अनुभाग कल्पना करने के लिए टी-पीएमटी चैनल के लिए लाभ (मास्टर) बढ़ाएं, जो ग्रेस्केल में दिखाया गया है।
    5. ब्याज के क्षेत्र का पता लगाने के लिए जॉयस्टिक का उपयोग कर स्लाइड की स्थिति ले जाएँ, तो उचित माइक्रोस्कोप घुंडी का उपयोग ध्यान केंद्रित.
    6. लेज़र जोखिम बंद करने के लिए प्राप्ति टैब में रोकें क्लिक करें.
  3. इमेजिंग पैरामीटर निर्धारित करें.
    1. चैनल टैब में एक चैनल का चयन करने के लिए चेकइन बॉक्स का उपयोग करें और स्क्रीन पर उस चैनल की छवि प्रदर्शित करने के लिए प्राप्ति टैब में लाइव पर क्लिक करें. फिर, माउस पर बाएँ क्लिक करें बटन का उपयोग कर, उत्सर्जित फ्लोरोसेंट संकेत है कि एकत्र किया जाता है की सीमा निर्धारित करने के लिए स्लाइड-बार समायोजित, लेजर शक्ति (लेजर शीर्षक के तहत पट्टी फिसलने), लाभ (मास्टर) और डिजिटल ऑफसेट में चैनल टैब स्क्रीन पर Confetti-लेबल कोशिकाओं कल्पना करने के लिए। इन पैरामीटर के सभी के लिए दिशानिर्देश मान अनुपूरक फ़ाइल 1B-डी में RFP, YFP और CFP के लिए प्रदान किए जाते हैं। हर चैनल के लिए इस कदम को पूरा करें, एक के बाद एक.
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कल्पना संकेत autofluorscence नहीं है, एक Cre नकारात्मक जानवर से एक अनुभाग इस कदम के दौरान एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. के रूप में टी पीएमटी आरएफपी लेजर (चरण 7.2.1) आरएफपी के लिए लेजर शक्ति का समायोजन टी पीएमटी संकेत को प्रभावित करेगा के साथ संयुक्त किया गया है।
    2. यदि आवश्यक हो तो फ्लोरोसेंट का पता लगाने को बढ़ाने के लिए पिनहोल आकार समायोजित करें।
      नोट: उच्च pinhole आकार, और अधिक फ्लोरोसेंट संकेत जेड-दिशा में पता चला है. इस के लिए एक दिशानिर्देश परिणामी हवादार इकाई (AU), जो स्वचालित रूप से Pinhole सूचक के नीचे संकेत दिया है, जहां 1 AU इमेजिंग गुणवत्ता के लिए इष्टतम है. AU बहुत अधिक बढ़ाना बाद में विश्लेषण को ख़राब कर देगा क्योंकि यह अधिक कठिन हो जाता है में अलग-अलग कोशिकाओं भेद करने के लिए $-दिशा).
    3. रिकॉर्ड किए गए सिग्नल ओवरलैप न करें यह सुनिश्चित करने के लिए सेटअप की जाँच करें.
      1. सभी तीन चैनलों का चयन करें और अधिग्रहण टैब में स्नैप बटन दबाएँ करने के लिए चैनल टैब में टिक-बॉक्स पर क्लिक करें।
      2. परिणामी छवि में, आयाम टैब में प्रत्येक सूचीबद्ध चैनल के ऊपर नीले-हाइलाइट किए गए बॉक्सों पर क्लिक करके प्रदर्शित चैनलों के बीच स्क्रॉल करें. मैन्युअल रूप से स्क्रीन पर चैनलों के बीच ओवरलैप की जाँच करें. यदि सिग्नल ओवरलैप होते हैं (उदाहरण के लिए, यदि प्रत्येक लाल कोशिका भी पीली है), तो चरण 7.3 की शुरुआत पर वापस जाएँ और दोहराएँ, ओवरलैपिंग चैनलों के लिए पैरामीटर समायोजित करें जब तक कि उन्हें एक-दूसरे से अलग नहीं किया जा सकता. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक लेबल (यानी, RFP, YFP, या CFP) के लिए, कम से कम एक क्लोन दृश्यित किया जा सकता है जिसमें केवल एक लेबल होता है.
  4. छवि प्राप्त करें.
    1. फ़्रेम आकार, गति,और औसत संख्या मानों का उपयोग करके छवि गुणवत्ता निर्दिष्ट करने के लिए प्राप्ति मोड टैब का चयन करें.
      नोट: इन प्रयोगों के लिए विशिष्ट सेटिंग्स अनुपूरक फ़ाइल 1Aमें इंगित कर रहे हैं। प्राप्ति टैब के भीतर स्कैन क्षेत्र शीर्षक के तहत ज़ूम को कम करने छवि अधिग्रहण के लिए आवश्यक समय बदलने के बिना देखने के क्षेत्र में वृद्धि कर सकते हैं.
    2. प्राप्ति टैब में, आयाम प्राप्ति शीर्षक के अंतर्गत, $-स्टैक टिक-बॉक्स पर क्लिक करें. $-दिशा में छवियों के बीच अंतराल को 2.5 डिग्री करने के लिए सेट करने के लिए $-स्टैक टैब खोलें।
    3. सही स्थान सेट करने के लिए, चैनल टैब में केवल RFP/T-PMT का चयन करें और ऊतक की दृश्यमान बाह्यरेखा के साथ लाल क्लोनों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए Live क्लिक करें. पहले सेट करें पर क्लिक करके पहले और अंतिम टुकड़ा सेट करें और इसी टुकड़ा पर अंतिम सेट करें, माइक्रोस्कोप घुंडी का उपयोग कर ध्यान समायोजित.
    4. अधिग्रहण टैब के भीतर टाइल स्कैन टैब पर क्लिक करें और संबंधित बक्से में क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर दिशाओं में टाइल्स की कुल संख्या दर्ज करें।
    5. छवि कैप्चर के लिए, चैनल टैब में सभी इच्छित चैनलों का चयन करें, फिर एकल छवि एकत्रित करने के लिए स्नैप बटन क्लिक करें, या एक $ स्टैक/टाइल स्कैनएकत्रित करने के लिए प्रारंभ प्रयोग बटन क्लिक करें।
  5. एक बार छवि प्राप्त कर लिया गया है, क्लिक करें फ़ाइल तो इस रूप में सहेजें और एक फ़ाइल प्रकार है कि संभव के रूप में माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के बारे में ज्यादा जानकारी के रूप में संरक्षित में छवि को बचाने के लिए, बाद में समीक्षा और पुन: उपयोग की अनुमति देने के लिए.
  6. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर आगे विश्लेषण प्रदर्शन.

Representative Results

epiphyseal उपास्थि में कोन्ड्रोसाइट्स लेबल और P1 पर tamoxifen प्रशासन का उपयोग कर उम्र के साथ उनके क्लोनल विस्तार कल्पना करने के लिए, Col2CreERT: Confetti चूहों लेबल थे, और उनके पिछले limbs P27 पर एकत्र किए गए थे. केंद्रीय खंड का निर्धारण क्रूसिएट स्नायु (चित्र 2क) और निकटस्थ टिबियल वृद्धि प्लेट में क्लोनों को विरूपित करके किया गया था (चित्र 2ख) इन आंकड़ों से पता चलता है कि व्यक्तिगत कोशिकाओं है कि P1 पर Col2 सकारात्मक थे और Confetti फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल बन गया जब tamoxifen प्रशासित किया गया था, क्लोनल विस्तार किया गया, और बाद में P27 तक विकास की थाली में बने रहे. इसी प्रकार के विकासात्मक समयांक से क्लोनल विस्तार में प्रारंभिक परिवर्तन हाल ही के प्रकाशन13के चित्र 1 में देखा जा सकता है .

दीर्घकालिक भंडारण (चरण 5.5) के बाद फ्लोरोसेंट सिग्नल का एक उदाहरण देने के लिए, एकत्र किए गए अनुभाग को 3 से अधिक वर्षों के लिए ( चित्र 2A,B) के तुरंत बाद संग्रहीत किया गया था (चित्र 2C, वीडियो 1) .

प्रोटोकॉल के साथ कुछ सामान्य समस्याओं को प्रदर्शित करने के लिए, क्रायोसेक्शनिंग चरण के दौरान टूटा हुआ एक खंड चित्र 3कमें दिखाया गया है। खंड के क्षेत्र (वृद्धि की थाली और संधि उपास्थि के बीच) चित्रा 3B में विस्तार से पता चलता है कि tamoxifen की इस खुराक इस क्षेत्र में पुनर्संयोजन के इस तरह के एक उच्च स्तर की ओर जाता है कि यह क्लोनल विश्लेषण रोक नाबंद होगा.

Figure 1
चित्र 1: प्रायोगिक अवलोकन. प्रवाह चार्ट विधि की मुख्य अवस्थाओं को सारांशित करता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक Col2CreERT: Confetti माउस से Confetti छवियों. (क)Col2CreERT: Confetti चूहों के नमूने decalification या दीर्घकालिक भंडारण कदम के बिना संसाधित किया गया. केंद्रीय खंड एक मार्कर के रूप में cruciate स्नायु का उपयोग कर स्थित था. इस छवि को T-PMT (स्केल बार $ 300 $m) के साथ RFP का पता लगाने के बाद टाइल स्कैन का उपयोग करके विज़ुअलाइज़ किया गया था. (ख) क्लोनल कॉलम 3डी पुनर्निर्माण के बाद (क) में दिखाई देने वाली वृद्धि प्लेट के समीपस्थ टिबिया के भीतर दिखाए जाते हैं। (ग) 3 वर्ष से अधिक समय तक दीर्घावधि भंडारण में (ए) और (बी) में दर्शाए गए एक आसन्न स्लाइड को इमेजिंग और 3 डी पुनर्निर्माण के लिए संसाधित किया गया था . RFP, YFP, और CFP में दिखाएजातेहैं ( बी ) और (सी) (स्केल सलाखों $ 50 $m). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: विधि का उपयोग करते समय चुनौतियां. (ए) सफेद डैश्ड रेखाएँ Col2CreERT:Confetti चूहों की वृद्धि प्लेट के माध्यम से अनुभाग में विभाजन की रूपरेखा तैयार करती हैं (स्केल बार ] 50 उ)। श्वेत बॉक्स के भीतर का क्षेत्रफल (B) (स्केल बार ] 25 उ) में दिखाया गया है। RFP, YFP, और CFP दोनों पैनलों में दिखाए जाते हैं, और nonreflected लेजर प्रकाश (टी पीएमटी) चैनल भी में दिखाया गया है(ए) ऊतक कल्पना करने के लिए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: Col2CreERT से एक विकास प्लेट के तीन आयामी पुनर्निर्माण: Confetti माउस. एक Col2CreERT से तैयार स्लाइड: Confetti माउस से अधिक 3 साल के लिए अनुभागीकरण के बाद लंबी अवधि के भंडारण में आयोजित किया गया था, और फिर इमेजिंग के लिए संसाधित. तीन आयामी पुनर्निर्माण छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ स्वचालित रूप से आयोजित किया गया था और एक वीडियो के रूप में निर्यात. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए.

अनुपूरक फ़ाइल 1: confocal माइक्रोस्कोप के विशिष्ट सेट अप. (A) अधिग्रहण टैब में उपस्थित मुख्य नियंत्रण . (B]D) लेजर पैरामीटर, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य, और दर्ज उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य की सीमा तीन Confetti फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए दिखाए जाते हैं. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

Confetti मॉडल बड़े पैमाने पर खनिज उपास्थि ऊतकों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था12,13,14 और अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन. Confetti चूहों2 एक प्रति या R26R-Confetti allele की दो प्रतियों के साथ प्रजनन और प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Brainbow 2.1 निर्माण के एक एलील के साथ चूहों में पुनर्संयोजन चार संभावित लेबल दे देंगे: लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (RFP, साइटोप्लाज्मिक), पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP, साइटोप्लाज्मिक), सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी, झिल्ली-स्थानीयकृत), और हरे रंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP, नाभिक-स्थानीयकृत), जबकि समयुग्मज कंफ़ेटी चूहों में पुनर्संयोजन (यानी, Brainbow 2.1 निर्माण की दो प्रतियां युक्त) 10 संभव रंग outputs दे देंगे (RFP + आरएफपी, आरएफपी + आरएफपी + CFP, आरएफपी + GF, YFP, YFP, YFP+ YFP+ GFP, CFP+CFP, CFP+GFP, GFP+GFP). हालांकि, क्योंकि डीएनए चीरा और व्युत्क्रम घटना एक stochastic तरीके से होते हैं, GFP का उत्पादन करने के लिए पुनर्संयोजन केवल कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश में होता है, के रूप में पहले की सूचना दी2, और प्रतीत होता है सेल प्रकार या Cre लाइन द्वारा अलग है2, 12,13. इसलिए, GFP अभिव्यक्ति के लिए अग्रणी पुनर्संयोजन घटनाओं की कम घटना को देखते हुए, छह रंग outputs समयुग्मज Confetti चूहों में सबसे आम हैं.

एक महत्वपूर्ण विचार जब Confetti माउस के साथ प्रयोगों की योजना बना एक उपयुक्त क्रे तनाव मिल रहा है. सबसे पहले, के बाद से Confetti allele कई loxP साइटों है, एक पुनर्संयोजन घटना एक दूसरे4preclude नहीं करता है. इसका मतलब यह है कि अगर एक सेल लेबल और एक रंग का क्लोन का उत्पादन करने के लिए विभाजित है, अपनी बेटी कोशिकाओं में से एक में एक दूसरी पुनर्संयोजन घटना एक अलग रंग उत्पन्न होता है, जिससे सच क्लोनल विस्तार मास्किंग. इस प्रकार, noninducible Cre उपभेदों, जहां एंजाइम हमेशा सक्रिय है अगर इसी प्रमोटर सक्रिय है, उचित नहीं हैं. दूसरा, कुछ उपभेदों में Cre recombinase की अभिव्यक्ति अक्सर एक अंतर्जात प्रोटीन की कीमत पर आता है, जिससे अपनी खुद की एक phenotype बनाने (उदाहरण के लिए, Prg4-GFPCreERT2 दस्तक में माउस तनाव जिसमें चूहों बंदरगाह दो Creles15), तो Crealle की एक प्रति वांछनीय है. वर्णित प्रयोगों के सभी में, Col2CreERT16 की एक प्रतिलिपि या तो पुरुष या महिला माता पिता द्वारा किया गया था Col2CreERT उत्पन्न करने के लिए: Confetti चूहों, के रूप में वर्णित13. इसके बाद, ब्याज के सेल प्रकार के लिए क्रे लाइन की विशिष्टता एक महत्वपूर्ण विचार है. उदाहरण के लिए, Col2CreERT कोन्ड्रोसाइट-विशिष्ट है, लेकिन प्रारंभिक प्रसवोत्तर प्रसव17में कोन्ड्रोसाइट्स की कई अलग-अलग आबादी को लेबल करता है। अंत में, विभिन्न क्रे उपभेदों की गतिविधि पशु उम्र के साथ काफी बदल सकते हैं, के रूप में क्रे अभिव्यक्ति परिवर्तन के लिए उपयोग प्रमोटर के अंतर्जात गतिविधि, यहां तक कि एक ही प्रकार की कोशिकाओं में (जैसे, Prg4-GFPCreERT2, जो एक बढ़ती आवश्यकता कर सकते हैं चूहों की उम्र15के रूप में सतही क्षेत्र कोशिकाओं लेबल करने के लिए tamoxifen खुराक की संख्या ).

लेबल कोशिकाओं की संख्या दिया tamoxifen की राशि से परिलक्षित होगा, तो यह हमेशा के लिए अधिकतम खुराक देने के लिए वांछनीय नहीं है क्योंकि एक दूसरे से क्लोन भेद मुश्किल हो सकता है. क्योंकि क्रे अभिव्यक्ति विभिन्न प्रमोटरों के विनियमन के तहत और साथ ही उम्र के साथ अलग अलग होंगे, tamoxifen खुराक लेबलिंग का अनुकूलन करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता होगी. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को तुरंत पुनर्संयोजन ट्रिगर पर फ्लोरोसेंट नहीं कर रहे हैं क्योंकि समय होने के लिए पुनर्संयोजन के लिए आवश्यक है और जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट प्रोटीन इमेजिंग के लिए पर्याप्त रूप से जमा करने के लिए. घंटे की एक विस्तृत श्रृंखला (24 डिग्री 72 एच के बीच) की जरूरत है, जो क्रे लाइन, सेल प्रकार, और पशु उम्र से प्रभावित प्रतीत होता है. के बाद से tamoxifen जैविक रूप से लंबे समय के बाद प्रशासन सक्रिय किया जा सकताहै 18 यह हमेशा अच्छी तरह से प्रत्येक मॉडल में पुनर्संयोजन दक्षता की जांच करने के लिए सलाह दी जाती है.

confocal माइक्रोस्कोपी कदम के दौरान, Confetti फ्लोरोसेंट प्रोटीन की उत्तेजना लेजर प्रकाश द्वारा ऊतक के प्रवेश की आवश्यकता है. क्योंकि विभिन्न ऊतकों में अलग-अलग गुण होते हैं, लेजर प्रकाश सभी ऊतकों के 160 डिग्री मीटर मोटी वर्गों में प्रवेश नहीं कर सकता है। तथापि, इस प्रकार के मोटे खंडों का उपयोग वृद्धि प्लेट उपास्थि के लिए किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 2चित्र 3में प्रयुक्त किया गया है। ध्यान दें कि हर माइक्रोस्कोप अलग है, और यह संभावना नहीं है कि वर्णित सेटिंग्स (अनुपूरक फाइल 1) मामूली समायोजन के बिना पूरी तरह से काम करेंगे. प्रमुख चुनौतियों में से एक के लिए विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन भेद करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहाँ एक चैनल से दूसरे में कोई संदूषण नहीं है. उदाहरण के लिए, YFP चैनल में संकेत GFP से आने वाले फ्लोरोसेंट के कारण YFP और RFP चैनल के बीच ओवरलैप करता है। YFP और CFP चैनलों को भी सावधानी से जाँच की जानी चाहिए. यह कई तरीकों से किया जा सकता है। सबसे पहले, फ्लोरोसेंट प्रकाश तरंगदैर्ध्य है कि प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए दर्ज कर रहे हैं की उत्सर्जन रेंज सीमित किया जा सकता है. दूसरा, डिजिटल लाभ के साथ संयोजन में लेजर शक्ति का समायोजन संकेत का अनुकूलन कर सकते हैं. इस अध्ययन में इन चरणों के लिए पर्याप्त थे, लेकिन वे एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत पर भरोसा करते हैं. इसका मतलब यह है कि सिद्धांत रूप में, अक्षम ऊतक प्रसंस्करण फ्लोरोसेंट प्रोटीन की गतिविधि को कम कर सकते हैं, या एक कमजोर लेजर प्रकाश स्रोत चैनल जुदाई ख़राब कर सकते हैं.

Confetti माउस के फायदे में से एक यह है कि यह आनुवंशिक रूप से उत्परिवर्ती उपभेदों की एक बड़ी संख्या है कि उपलब्ध हैं ताकि क्लोनल गतिशीलता पर विशिष्ट जीन के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है के साथ जोड़ा जा सकता है10,11,12 ,13,14,19,20, हालांकि कुछ सीमाओं के साथ . उदाहरण के लिए, Confetti alleles और ब्याज के जीन के पुनर्संयोजन अलग नहीं किया जा सकता है जब Cre loxP आधारित उत्परिवर्ती क्लोनल वंश अनुरेखण के साथ संयुक्त का उपयोग कर. फिर भी , इस तरह के संयोग पुनर्संयोजन की घटनाओं प्रभावी हो सकताहै 10,14,20. उदाहरण के लिए, इस संभावना के लिए चूहों के आराम क्षेत्र में वृद्धि हुई कोशिका संख्या का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था प्रसव के बाद कोन्ड्रोसाइट-विशिष्ट विकास प्लेट21 में TSC1 के ablation और समय के साथ इन कोशिकाओं के बीच क्लोनल संबंध से पता चला 13. इसके अतिरिक्त, कंफ़ेटी चूहों का उपयोग कर ऊतक-विशिष्ट क्लोनल विश्लेषण गैर-Cre loxP-आधारित उत्परिवर्ती चूहों11के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है , और यह भी औषधीय8,9 के साथ इन तरीकों गठबंधन करने के लिए संभव है ,13 और / या शल्य मॉडल8 अन्य कार्यात्मक क्षोभ के लिए क्लोनल प्रतिक्रियाओं कल्पना करने के लिए. इसके अलावा अवसर उत्पन्न तब होते हैं जब कॉन्फेटी लेबल वाले वर्गों को इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा अंतर्जात प्रोटीन के इम्यूनोडिटेक्शन के साथ संयोजित किया जाता है। इस तरह के विश्लेषण का पता लगाया कोशिकाओं की पहचान और एक ज्ञात मार्कर के साथ उनके colocalization की अनुमति देता है. इसमें वर्णित निर्धारण विधि के साथ, इम्यूनोफ्लोरेसी का संचालन करना और अभी भी कंफ़ेटी फ्लोरोसेंट प्रोटीन12,13से फ्लोरोसेंट की कल्पना करना संभव है। तथापि, उल्लिखित पत्रों में प्रतिजन पुनः प्राप्ति की आवश्यकता नहीं थी। इस तरह के साइट्रेट बफर में उबलते के रूप में हर्ष प्रतिजन पुनर्प्राप्ति तरीकों, Confetti फ्लोरोसेंट की एक पूरी हानि की ओर जाता है। हालांकि Confetti फ्लोरोसेंट प्रोटीन तो एंटीबॉडी का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है22, क्लोनल पहचान का नुकसान हो सकता है.

सारांश में, Vivo में कोशिकाओं लेबल करने के लिए Confetti मॉडल का उपयोग कर समय के साथ उन कोशिकाओं के भाग्य का विश्लेषण करने के लिए एक जानकारीपूर्ण उपकरण है. वर्णित विधि खनिज ऊतकों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति सीधे कल्पना करने के लिए एक तेज और कुशल तरीका प्रदान करता है।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम methodological सलाह के लिए डॉ Evgeny Ivashkin धन्यवाद. यह काम आर्थिक रूप से स्वीडिश अनुसंधान परिषद (ए.एस.सी), रूसी वैज्ञानिक फाउंडेशन (एएससी के लिए #19-15-00241 अनुदान), Karolinska संस्थान (ए.एस.सी.), StratRegen KI और Stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-rsfond (ए.एस.सी.), Stiftelsen द्वारा समर्थित किया गया था फ्रिमुरे बरनहुसेट और सालस्कापेट बार्नवार्ड (पी.टी.एन.), चीनी छात्रवृत्ति परिषद (बी.जेड.)। confocal माइक्रोस्कोप Knut और ऐलिस Wallenberg फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,2-thiodiethanol Sigma MKCF9328
60 mm-long cover slips Mendel-Gläzer 220588
Confocal laser scanning microscope Zeiss LSM 710
Corn oil Sigma C8267
Cryomold (standard) Sakura 4557
Cryostat Thermo Model: NX70
Disposable cryostat blades Histolab 207500014 Specifically for use with hard tissue
EDTA Scharlan AC0960005P
Formaldehyde concentrate Merck 8.18708.1000
Glass bottles Sigma V7130 Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing
Imaris software Oxford Instruments N/A Image analysis software for 3D reconstruction
Isoflurane Zoetis 11-8162
OCT Sakura 102094-104
Pasteur pipette Sarstedt 86.1171
PBS Gibco 14200075
Sodium hydroxide Merck 1.06498.1000
Sucrose Sigma S0389
Superfrost UltraPlus slides Mendel-Gläzer J3800AMNZ
Tamoxifen Sigma T5648
Zen2 software Zeiss N/A Freeware for Confocal laser scanning microscopy

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References

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Zhou, B., Kaucka, M., Chagin, A. S., Newton, P. T. Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues. J. Vis. Exp. (152), e60424, doi:10.3791/60424 (2019).

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