Summary
이 방법은 R26R-Confetti (Confetti) 마우스 모델을 사용하여 광물화된 조직을 연구하고 번식 전략에서 이미지 획득에 이르는 모든 단계를 포괄하는 방법을 설명합니다. 모든 연조직에 적용될 수 있는 일반적인 프로토콜과 광물화된 조직에 적용될 수 있는 변형된 프로토콜이 포함된다.
Abstract
어떤 세포 유형을 발생시키고 유기체를 통해 그것의 이동을 추적하거나 그것의 장수를 결정하는 바디에 있는 개별 적인 세포를 표지하는 것은 조직 발달 및 유지의 기계장치를 드러내는 강력한 쪽일 수 있습니다. 현재 생체 내에서 세포를 모니터링하는 데 사용할 수 있는 가장 중요한 도구 중 하나는 Confetti 마우스 모델입니다. Confetti 모델은 세포 유형별 방식으로 다양한 형광 단백질을 가진 살아있는 마우스의 개별 세포를 유전적으로 표시하고 그들의 운명을 감시하기 위하여, 클론 유전 추적에게 불린 프로세스에서 시간이 지남에 따라 그들의 자손의 운명을 감시하기 위하여 이용될 수 있습니다 클론 계보 추적. 이 모형은 거의 10 년 전에 생성되고 많은 생물학 프로세스의 향상한 이해에 기여했습니다, 특히 줄기 세포 생물학, 발달 및 성인 조직의 갱신과 관련. 그러나, 다양한 형광 신호의 이미지 수집 및 동시 캡처까지 형광 신호를 보존하는 것은 기술적으로 도전, 특히 광물화 된 조직에 대한. 본 간행물은 임의의 광물화 또는 비미네랄화 조직에 적용될 수 있는 성장 판연골을 분석하기 위해 Confetti 모델을 사용하기 위한 단계별 프로토콜을 기술한다.
Introduction
세포 거동을 모니터링하는 개선된 방법은 동물 모델을 사용할 때 실험 효율을 높이는 것이 바람직하다. 생체 내에서 세포 거동을 모니터링하는 가장 유익한 방법 중 하나는 널리 사용되는 R26R-색종이(Confetti) 마우스2를포함하는 다색 리포터 마우스 균주1을이용한 클론 계보 추적이다. 형광 성 단백질로 개별 세포를 유전적으로 표시하고 시간이 지남에 따라 그 세포를 따르기 때문에, 많은 필드에 있는 연구원은 다른 생물학 시스템의 다수에 통찰력을 밝히기 위하여 Confetti 마우스를 이용했습니다.
색종이 마우스는 cre 의존DNA 재조합이 여러 가능한 형광 단백질 중 하나의 영구적인 발현을 유발하는 loxP 기반 리포터 시스템2. R26R-Confetti 알레일은 유비쿼터스 표현 CAGG 프로모터를 포함하며, 이는 loxP-측면네오 R-카세트2의바로 상류에 놓여 있으며, 그의 폴리아데닐화 서열은 전사3을종료하고, 그 다음에 무지개 2.1 구조4. 따라서, Cre-mediaed 재조합은 동시에 NeoR-카세트를절제하고 Brainbow 2.1 구성의 어느 부분이 절제되는가에 따라 특정 형광 단백질의 생산으로 이어집니다. 이 기능은 특정 Cre 변형을 사용할 수있는 마우스의 모든 셀룰러 집단을 대상으로 사용할 수 있기 때문에 색종이 마우스를 매우 적응할 수 있습니다. R26R-색종이 변형과 조직 특이적 Cre 변형의 교차는 라벨링의 특이성을 제공한다. 그러나, Cre 균주는 또한 유도할 수 있어야 한다 (예를 들어, CreERT 또는 CreERT2, 이는 그들이 핵을 입력하고 DNA 재조합을 유도할 수 있도록 타목시펜 결합을 필요로하는 5)그래서 라벨링은 지정된 시점에서 달성될 수 있다. 따라서, 세포 집단은 결과 CreERT 양성/색종이 양성 자손을 원하는 시점에서 타목시펜과 주입하여 표지하고 특정 연령으로 추적할 수 있으며, 관심 있는 조직을 분석을 위해 수집될 수 있다. 조직 처리 후, 형광 표지된 세포는 공초점 현미경검사법에 의해 직접 시각화될 수 있으므로, 각 처음에 표지된 세포의 자손은 특정 형광에 기초하여 생성된 다른 표지된 세포로부터 분리될 수 있다. 복제를 평가할 수 있도록 합니다(즉, 복제 유전자 추적).
색종이 모델의 유연성으로 인해, 그것은 건강과 질병2,6,7,8,9에서많은 다른 조직의 개발 및 유지 보수를 연구하기 위해 적용되었습니다. 10,11. 모델을 사용하는 한 가지 일반적인 방법은 세포의 특정 집단에 라벨을 부착하고 어떤 조직(및/또는 그들의 자손)에 기여했는지 확인하는 것입니다. 이 접근을 사용하여 그 같은 발견은 성숙한 이 신경교기원을가진 세포로 이루어져 있다는 것이었습니다 6. 모델의 또 다른 응용 프로그램은 줄기 세포 항상성을 연구하는 것입니다. 예를 들어, Confetti 모델은 일부 줄기 세포 클론이 줄기 세포 사이의 경쟁 중에 지배적이기 때문에 장 내 토굴에서 줄기 세포 틈새가 점차 적으로 단클론이 되는 것으로 나타났습니다2. 이 모델은 또한 세포 증식을 평가하는 데 사용될 수 있으며, 이는 천천히 분할된 세포를 연구하는 데 특히 유용합니다. 예를 들어, 관절연골(12)에서의 클론 형성을 평가하고, 5주령 마우스에서 성장판 연골세포에 대한 고슴도치 길항제의 단기 효과를13개연구하였다.
색종이 모델의 상대적 단순성에도 불구하고, 형광 신호는 특히 광물화된 조직을 분석할 때 이미지 수집 전까지 보존하기가 기술적으로 어려울 수 있습니다. 여기에서, 프로토콜은 출생 후 뼈 (생후 뼈를 가진 색종이 마우스를 사용하는 최적화된 모형을 기술합니다,) 형광성 단백질이 면역 검출을 위한 필요 없이 공초점 현미경 검사법에 의해 직접 구상될 수 있게 합니다. 이 단순화 된 프로토콜은 비 미네랄화 된 조직에 적용 될 수 있습니다. 더욱이, 적어도 3년의 장기간 형광신호를 보존하기 위해 시료를 저장하는 방법에 대한 설명이 포함되어 있다. 프로토콜의 개요는 그림 1에표시됩니다.
Protocol
모든 마우스 작업은 동물 실험윤리위원회(스톡홀름 북부 위원회/Norra Djurförsöksetiska Nämd)의 승인을 받았으며 스웨덴 동물기구의 동물 실험 규정 및 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 마우스 사육
- 변형을 생성하려면 관심 의 Cre 라인R26R-색종이 마우스를 건너. 21 일 의 새끼를 wean.
참고: 생쥐는 생후 약 8주부터 또는 현지 지침에 따라 사육에 사용할 수 있습니다. 유질이형(여기에 설명되지 않음)은 유양양에서 수집된 생검으로부터 수행될 수 있다. 현지 지침에 따라 위닝 연령을 조정할 수 있습니다.
2. 색종이 라벨링
참고:이 라벨링 전략은 타목시펜 유도 크레균 균주에 적합합니다.
- 유리 병에 옥수수 기름에 최대 2.5 mg/mL 타목시펜의 용액을 준비합니다. 오븐에서 37°C까지 가열하여 최대 60분 동안 용해시키고, 분말이 용해될 때까지 와류를 사용하여 5분마다 교반합니다.
참고: 타목시펜의 증가 된 복용량에 대 한, 솔루션 최대 20 mg/mL이 방법을 사용 하 여 준비 될 수 있다. - 빛으로부터 보호하여 최대 3개월 동안 4°C에서 보관하십시오.
- 50 μL의 2.5 mg/mL 타목시펜을 옥수수 오일에 용해시켜 첫 번째 산후 날(P1)에 심상 반응으로 투여하여 재조합을 유도합니다.
참고: 원칙적으로 타목시펜은 F1 세대부터 모든 연령대에서 투여할 수 있습니다. 타목시펜의 투여량은 Cre 발현, 마우스 연령 및 실험 적 적용에 따라 달라져야 한다. 자세한 내용은 토론 섹션에서 찾을 수 있습니다. 같은 방법으로 처리된 Cre 음성 마우스는 색종이 형광 신호에 대한 음성 대조군으로 사용될 수 있다.
주의: 동물 취급자가 타목시펜 사용에 대해 경고하고 현지 환경 및 안전 지침에 따라 케이지 소재를 폐기해야 합니다.
3. 조직 수집
- 산후27일(P27)에 마우스를 안락사시켜 생쥐를 이산화탄소를 함유하는 공간을 최소 80%까지 부피까지 채우고 이 농도를 3분 동안 유지한다. 다른 동물의 해부 동안 얼음에 마우스를 유지.
- 관심있는 조직을 해부하십시오. 아래에 설명된 것은 무릎의 근위 경골 및 말단 대퇴 성장 판 및 관절 연골을 수집하기 위한 프로토콜이며, 6개월까지의 산후 마우스에 적합합니다.
- 날카로운 가위와 톱니 집게를 사용하여 발까지 뒷다리 주위의 피부를 제거합니다.
- 대략 날카로운 가위로 다리에서 근육과 지방 조직을 손질.
참고 : 주변 조직이 절제 할 때 구조적 지원을 제공하지만 모든 피부를 제거하십시오. - 메스를 사용하여 다리의 상단이 대퇴골 머리가 보일 때까지 신체와 만나는 연조직을 잘라 내고 엉덩이 관절의 인대를 잘라 다리를 제거합니다.
참고 : 대퇴머리를 찾을 수없는 경우, 강한 가위로 엉덩이에 가까운 대퇴골을 잘라. - 메스 나 날카로운 가위를 사용하여 다리의 나머지 부분에서 발을 해부하십시오.
4. 조직 고정 및 처리
참고 : 관심있는 조직에 따라 아래에 자세히 설명 된 두 가지 프로토콜 중 하나를 따르십시오 (연조직의 경우 4.1 또는 약 45 일 동안 미네랄이 공급된 마우스 조직의 경우 4.2, 아래에 자세히 설명된 대로). 두 방법 모두, 해부된 샘플을 3.7% 포름알데히드/인산완식염수(PBS) 용액에 저장하고 나머지 동물을 해부한다.
- 연조직과 미네랄화된 경골과 페모라의 경우, 약 P45의 나이까지, 조직을 미리 냉각된 3.7% 포름알데히드/PBS로 6시간 동안 고정하고 4°C에서 회전자에서 부드럽게 굴려주세요. 조직보다 적어도 10배 더 큰 부피를 사용하십시오. 4.3 단계로 직접 계속하십시오.
- 약 P45의 나이에 경골과 femora를 포함하여 광물화된 조직을 위해, decalcification 단계는 요구됩니다.
- 수산화 나트륨을 사용하여 pH를 8.05로 조정하여 10% EDTA/dH2O 용액 1L을 준비합니다. 다음으로, 이 용액을 사용하여 포름알데히드를 3.7%로 희석한다. EDTA의 작업 농도는 9 %가 될 것입니다.
- 하룻밤 동안 미리 냉각 된 3.7 % 포름 알데히드 / PBS에 넣고 4 °C에서 회전자에서 부드럽게 압연하여 조직을 고정시.
- 조직을 미리 냉각된 3.7% 포름알데히드/9% EDTA/dH2O 용액(pH 8.05)에 넣고, 조직보다 적어도 10배 더 큰 부피에서 4°C에서 부드럽게 회전한다. 다음 48 시간 동안 3 배 동안 신선한, 미리 냉각 된 3.7 % 포름 알데히드 / 9 % EDTA / dH2O에 뼈를 배치하여이 단계를 반복합니다.
참고: 이 짧은 탈석은 최대 6개월 된 쥐의 대퇴골과 경골 뼈를 절제할 수 있을 정도로 충분합니다. 더 조밀하게 광물화된 조직을 위해 조직학을 향상시키기 위하여 추가 decalcification가 요구될 수 있습니다.
- 미리 냉각 된 30 % 자당 / dH2O. 가장자리에 용기를 채우고 4 °C에서 밤새 부드럽게 회전하십시오. 조직보다 적어도 10배 더 큰 부피를 사용하십시오. 조직은 이 용액에 처음 넣었을 때 종종 떠다니고 아침까지 병의 바닥에 가라 앉습니다.
- 잔류 자당 용액을 제거하려면 포셉으로 자당 용액에서 제거하고 몇 초 동안 약 5 ml의 최적의 절삭 온도 화합물 (OCT)으로 샘플을 완전히 덮어 조직을 간단히 씻으하십시오.
- OCT로 미리 표지된 크라이오졸드를 채우고 티슈를 바닥에 놓습니다. 샘플이 실온에서 너무 오래 앉아 있는 것을 피하기 위해 신속하게 작업하십시오.
참고: 단면 단계에 대한 편리한 방향으로 샘플을 배치하는 것이 중요합니다. Col2CreERT:Confetti로 추적한 후 전체 성장 플레이트 컬럼을 통과할 가능성을 높이려면 대퇴머리를 사용하여 내측을 아래로 향하게 하고 샘플을 가능한 한 금형 의 바닥에 평평하게 놓습니다. - 금형을 드라이 아이스에 놓고 OCT가 완전히 고형화될 때까지 기다리면 시료를 임베드합니다. 금형에서 조직의 움직임이나 미끄러짐을 피하기 위해 가능한 한 평평하게 극저온을 놓습니다. 일단 완료되면, 즉시 사용하지 않는 경우, -20 °C에서 샘플을 저장합니다.
참고 : 나이가 들면서 블록이 섹션에 더 어려워지기 때문에 12 주 이내에 사용하십시오.
5. 절편
참고 : 단단한 조직에 적합한 일회용 블레이드로 저온 절제를 수행하십시오. 모든 표준 저온 가온 이면적합합니다.
- 몰드에서 블록을 제거하고 블록의 상부와 척 사이에 OCT를 적용하여 척에 고정시키고 최소 5분 동안 -20°C에서 저온 유지에 냉각하여 OCT가 완전히 응고되도록 한다.
- 샘플 홀더와 블레이드 홀더를 -20°C로 예냉한 다음 샘플/척을 척 홀더에 넣고 블레이드 홀더에 몇 분 동안 평형화합니다.
참고 : 지정된 온도는 저온 및 관심조직에 따라 몇 도 씩 변할 수 있습니다. - 저온 극저온을 사용하여 관심있는 조직에서 클론의 시각화를 허용하기 위해 적절한 두께의 블록 및 절단 조직 섹션을 다듬습니다.
- 산후 성장 판 분석을 위해 30-160 μm의 섹션을 준비하고 슬라이드에서 수집하십시오. 일부 저온 중지 모델은 트림 설정을 사용하여 두꺼운 섹션의 컬렉션만 허용할 수 있습니다.
- 슬라이드가 완전히 건조될 때까지 실온에서 건조시면 됩니다.
참고: 이 단계의 지속 기간은 조직 특성 및 단면 두께에 따라 달라질 수 있습니다. 실내 온도도 이 단계의 속도에 영향을 줄 수 있습니다. - 슬라이드를 -20°C에서 최대 36개월 동안 보관하거나 즉시 처리하는 경우 6.2단계로 진행합니다.
6. 슬라이드 준비 및 장착
- 냉동고에서 슬라이드를 제거하고 슬라이드 홀더에서 수평으로 실온까지 올것을 가져옵니다. 결로가 증발할 수 있도록 하십시오.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 실온에서 PBS를 슬라이드에 부드럽게 도루하여 OCT를 제거합니다. 섹션이 두꺼울수록 더 긴 시간이 필요합니다. 160 μm 두께의 섹션의 경우, 두 개의 헹구를 수행하십시오 : 15 분 동안 한 번 배양하고 액체를 제거 한 다음 신선한 PBS를 5 분 동안 적용하고 액체를 제거하십시오.
참고: 이 단계는 OCT를 제거하고 조직 특성 및 단면 두께에 따라 적절히 변화될 수 있다. 실내온도는 이 단계의 속도에 영향을 줄 수 있다. - 60mm 길이의 커버 슬립으로 실온에서 75% 2,2 티오디탄올/dH2O의용액에 슬라이드를 장착합니다.
참고: 슬라이드는 이미징 직전에 준비할 수 있지만, 4°C의 가습 챔버에서 빛을 피하면 형광 신호는 1-2주 동안 안정적입니다.
7. 공초점 현미경 검사법에 의한 이미징
- 현미경을 설정합니다.
- 현미경을 켜고 소프트웨어를 엽니다. 시스템 시작 버튼을 클릭합니다.
- 먼저 획득 탭 에서 스마트 설정을 클릭한 다음 적색 형광 단백질 (RFP), 황색 형광 단백질 (YFP) 및 청색 형광 단백질 (CFP)에 해당하는 세 가지 채널을 선택하여 채널을 선택하십시오. 염료 제목입니다. 최적의 신호를 클릭한 다음 적용하여 레이저를 선택합니다.
참고: 수집 탭의 내용은 추가 파일 1A에표시됩니다. 필요한 채널이 없는 경우 염료 제목 아래에'+' 버튼을 사용하여 추가합니다. 레이저, 여기 파장 및 기록된 방출 파장의 범위에 관한 필요한 정보는 보충 파일 1B-D에있는 3개의 색종이 형광 단백질에 대해 도시된다. - 획득 모드 탭에서 목표 제목 아래에 있는 20x 대물 렌즈를 선택합니다.
- 성장 판 또는 관심있는 다른 조직을 찾습니다.
- 고유한 뷰를 제공하려면 먼저 채널 탭에서 이름을 클릭하여 RFP 채널을 선택합니다. 이렇게 하면 RFP 채널의 세부 정보가 라이트 경로 탭에 표시됩니다.
참고 : T-PMT 채널은 조직의 비형광 부분을 시각화하는 데 사용되는 비반사 레이저 빛을 보여줍니다. - 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓고 성장 플레이트 또는 관심 있는 다른 조직을 광 경로와 대물 렌즈 사이에 직접 배치합니다.
- 조직을 국소화하기 위해 채널 탭의 트랙 제목 아래에 있는 체크 박스를 사용하여 YFP 및 CFP 채널을 선택 해제합니다.
- 트랙 제목에서 이름을 클릭하여 T-PMT 채널을 선택합니다. 수집 탭에서 라이브를 클릭하고 회색조로 표시되는 화면의 조직 섹션을 시각화하기 위해 T-PMT 채널의 게인(마스터)을 늘립니다.
- 조이스틱을 사용하여 슬라이드의 위치를 이동하여 관심 영역을 찾은 다음 적절한 현미경 손잡이를 사용하여 초점을 맞춥니다.
- 수집 탭에서 중지를 클릭하여 레이저 노출을 끕니다.
- 고유한 뷰를 제공하려면 먼저 채널 탭에서 이름을 클릭하여 RFP 채널을 선택합니다. 이렇게 하면 RFP 채널의 세부 정보가 라이트 경로 탭에 표시됩니다.
- 이미징 매개 변수를 정의합니다.
- 채널 탭의 체크박스를 사용하여 채널 중 하나를 선택하고 수집 탭에서 라이브를 클릭하여 화면에 해당 채널의 이미지를 표시합니다. 그런 다음 마우스의 왼쪽 클릭 버튼을 사용하여 슬라이드 바를 조정하여 수집되는 방출형광 신호의 범위를 설정하고 레이저 전원(레이저 제목 아래의 슬라이딩 바), 게인(Master) 및 디지털 오프셋을 채널 탭을 사용하여 화면에 색종이 레이블이 지정된 셀을 시각화합니다. 이러한 모든 매개 변수에 대한 지침 값은 RFP, YFP 및 CFP에 대한 추가 파일 1B-D에 제공됩니다. 모든 채널에 대해 하나씩 이 단계를 완료합니다.
참고: 시각화된 신호가 자동 형광이 되지 않도록 하기 위해 이 단계에서 Cre 음수 동물의 섹션을 음수 제어로 사용할 수 있습니다. T-PMT가 RFP 레이저(단계 7.2.1)와 결합됨에 따라 RFP용 레이저 전력을 조정하면 T-PMT 신호에 영향을 미칩니다. - 필요한 경우 핀홀 크기를 조정하여 형광 검출을 늘립니다.
참고: 핀홀 크기가 높을수록 Z 방향으로 형광 신호가 더 많이 감지됩니다. 이에 대한 지침은 핀홀 표시기 아래에 자동으로 표시되는 결과 Airy Unit(AU)이며, 여기서 1 AU는 이미징 품질에 최적입니다. AU를 너무 많이 증가시키면 Z 방향으로 개별 세포를 구별하기가 더 어려워지기 때문에 나중에 분석이 손상될 수 있습니다. - 설정을 확인하여 기록된 신호가 겹치지 않도록 합니다.
- 채널 탭의 체크박스를 클릭하여 세 개의 채널을 모두 선택하고 수집 탭에서 스냅 버튼을 누릅니다.
- 결과 이미지에서 치수 탭에 나열된 각 채널 위에 있는 파란색 강조 표시된 상자를 클릭하여 표시된 채널 사이를 스크롤합니다. 신호가 겹치는 경우(예: 모든 적색 셀이 노란색인 경우) 7.3단계의 시작 부분으로 돌아가서 겹치는 채널에 대한 매개변수를 서로 구별할 수 있을 때까지 조정합니다. 각 레이블(예: RFP, YFP 또는 CFP)에 대해 하나 이상의 복제본만 포함하는 복제본을 시각화할 수 있는지 확인합니다.
- 채널 탭의 체크박스를 사용하여 채널 중 하나를 선택하고 수집 탭에서 라이브를 클릭하여 화면에 해당 채널의 이미지를 표시합니다. 그런 다음 마우스의 왼쪽 클릭 버튼을 사용하여 슬라이드 바를 조정하여 수집되는 방출형광 신호의 범위를 설정하고 레이저 전원(레이저 제목 아래의 슬라이딩 바), 게인(Master) 및 디지털 오프셋을 채널 탭을 사용하여 화면에 색종이 레이블이 지정된 셀을 시각화합니다. 이러한 모든 매개 변수에 대한 지침 값은 RFP, YFP 및 CFP에 대한 추가 파일 1B-D에 제공됩니다. 모든 채널에 대해 하나씩 이 단계를 완료합니다.
- 이미지를 수집합니다.
- 수집 모드 탭을 선택하여 프레임 크기, 속도및 평균 숫자 값을 사용하여 이미지 품질을 지정합니다.
참고: 이러한 실험의 일반적인 설정은 보충 파일 1A에표시됩니다. 수집 탭 내에서 스캔 영역 제목 아래에서 확대/축소를 줄이면 이미지 수집에 필요한 시간을 변경하지 않고도 시야를 늘릴 수 있습니다. - 수집 탭에서 차원 획득 제목 아래에서 Z 스택 체크박스를 클릭합니다. Z-스택 탭을 열어 Z 방향의 이미지 사이의 간격을 2.5 μm로 설정합니다.
- 올바른 위치를 설정하려면 채널 탭에서 RFP/T-PMT만 선택하고 라이브를 클릭하여 조직의 윤곽선이 보이는 빨간색 클론을 시각화합니다. 현미경 손잡이를 사용하여 초점을 조정, 해당 슬라이스에 첫 번째 및 마지막 설정을 클릭하여 첫 번째 및 마지막 조각을 설정합니다.
- 수집 탭 에서 타일 스캔 탭을 클릭 하 고 각 상자에 수평 및 수직 방향에 타일의 총 수를 입력 합니다.
- 이미지 캡처를 위해 채널 탭에서 원하는 모든 채널을 선택한 다음 스냅 버튼을 클릭하여 단일 이미지를 수집하거나 실험 시작 버튼을 클릭하여 Z 스택/타일 스캔을수집합니다.
- 수집 모드 탭을 선택하여 프레임 크기, 속도및 평균 숫자 값을 사용하여 이미지 품질을 지정합니다.
- 이미지가 수집되면 파일을 클릭한 다음 As로 저장하고 현미경 설정에 대한 많은 정보를 가능한 한 보존하는 파일 유형에 이미지를 저장하여 나중에 검토하고 다시 사용할 수 있도록 합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 추가 분석을 수행합니다.
Representative Results
표피인 연골에 연골세포에 라벨을 부착하고 P1에 타목시펜 투여를 사용하여 나이가 들면서 클론 팽창을 시각화하기 위해, Col2CreERT:Confetti 마우스를 표기하고, 그들의 뒷사지를 P27에서 수집하였다. 중앙부는 십자 인대를 가시화하여결정하였다(도 2A)및 근위 경골 성장 판에서클론을 가시화하였다(도2B). 이 데이터는 타목시펜이 투여될 때 P1에 Col2 양성이고 색종이 형광 단백질로 표지된 개별 세포가, 클론 팽창을 겪고, 이어서 P27까지 성장 판에 남아 있었다는 것을 보여줍니다. 유사한 발달 시점으로부터의 클론 확장의 초기 변화는 최근 간행물13의도 1에서 확인할 수 있다.
장기 저장 후 형광 신호의 예를 들기 위해(단계 5.5), 수집된 섹션은 3년 이상 준비 및 이미지화하기 전(도 2A, B참조) 직후에 저장되었다(도2C, 비디오 1) .
프로토콜에 대한 몇 가지 일반적인 문제를 설명하기 위해, 동결 절제 단계 동안 깨진 섹션은 그림 3A에도시되어 있습니다. 도 3B에서 확장된 섹션(성장 판과 관절 연골 사이)의 영역은 타목시펜의 이러한 용량이 클론 분석을 배제할 수 있는 이 영역에서 이러한 높은 수준의 재조합으로 이어진다는 것을 보여준다.
그림 1: 실험 개요. 메서드의 주요 단계를 요약하는 플로우 차트입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Col2CreERT:색종이 마우스의 색종이 이미지. (A)Col2CreERT:색종이 마우스의 샘플을 탈석화 또는 장기 저장 단계 없이 처리하였다. 중앙 섹션은 마커로 십자 인대를 사용하여 위치했다. 이 이미지는 T-PMT(스케일 바 = 300 μm)로 RFP를 검출한 후 타일 스캔을 사용하여 시각화하였다. (B)클론 컬럼은 3D 재구성 후(A)에서볼 수 있는 성장 판의 근위 경골 내에 도시된다. (C)3년 이상 장기 보관에 보관된(A)및(B)에도시된 인접한 슬라이드를 이미징 및 3D 재구성을 위해 처리하였다. RFP, YFP 및 CFP는(B)및(C)(스케일 바 = 50 μm)에 도시되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 메서드를 사용할 때 문제가 있습니다. (A)흰색 파선은 Col2CreERT:Confetti 마우스의 성장 판을 통해 단면의 분할을 윤곽을 그었다(스케일 바 = 50 μm). 흰색 상자 내의 영역은(B)(배율 막대 = 25 μm)로 표시됩니다. RFP, YFP, 및 CFP는 두 패널 모두에 도시되고, 비반사 레이저 광(T-PMT) 채널은 또한 조직을 시각화하기 위해(A)에도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: Col2CreERT: 색종이 마우스로부터의 성장 판의 3차원 재구성. Col2CreERT에서 제조된 슬라이드: 색종이 마우스는 3년 이상 단면 처리 후 장기간 보관된 후 이미징을 위해 처리되었습니다. 3차원 재구성은 이미지 분석 소프트웨어로 자동으로 수행되어 비디오로 내보냈습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 공초점 현미경의 일반적인 설치. (A) 획득 탭에 존재하는 주요 대조군(B−D)레이저 파라미터, 여기 파장 및 기록된 방출 파장의 범위는 3개의 색종이 형광 단백질에 대해 도시된다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
색종이 모델은 광물화된 연골 조직12,13,14를 연구하고 최적화된 프로토콜을 설명하기 위해 광범위하게 사용되었다. R26R-색종이 알레일의 사본 1개 또는 2개의 사본이 있는 색종이 마우스2는 사육 및 실험에 사용될 수 있다. Brainbow 2.1 구성의 한 대틀로 마우스를 재결합하면 적색 형광 단백질 (RFP, 세포질), 황색 형광 단백질 (YFP, 세포질), 청록색 형광 단백질 (CFP, 막 국소화) 및 녹색의 네 가지 잠재적 인 라벨을 제공합니다. 형광 단백질 (GFP, 핵 국소화), 동형 색종이 마우스 (즉, Brainbow 2.1 구성의 두 사본을 포함)에서 재조합하는 반면, 10 가능한 색상 출력을 제공합니다 (RFP + RFP, RFP + YFP, RFP + GFP, YFP + YFP+ GFP, CFP + CFP, CFP + GFP, GFP + GFP). 그러나, DNA 절제 및 반전 사건이 스토카방식으로 발생하기 때문에, GFP를 생성하기 위한 재조합은 이전에 보고된 바와 같이 세포의 극히 일부에서만 발생하며,2를사용하였고, 세포형 또는 Cre 라인에 의해 겉보기에 다르다2. 12,13. 따라서 GFP 발현으로 이어지는 재조합 이벤트의 발생이 낮다는 점을 감안할 때, 6가지 색상 출력은 동형색종이 쥐에서 가장 일반적이다.
색종이 마우스로 실험을 계획할 때 중요한 고려 사항은 적합한 Cre 변형을 찾는 것입니다. 첫째, 색종이 알레일여러 loxP 사이트를 가지고 있기 때문에, 하나의 재결합 이벤트는 두 번째4를배제하지 않습니다. 즉, 세포가 표지되고 분할되어 한 색상의 복제본을 생성하면 딸 셀 중 하나에서 두 번째 재결합 이벤트가 다른 색상을 생성하여 진정한 클론 확장을 마스킹합니다. 따라서 해당 프로모터가 활성화되면 효소가 항상 활성화되는 비 유도성 Cre 균주는 권장되지 않습니다. 둘째, 일부 균주에서 는 Cre 재조합의 발현은 종종 내인성 단백질의 희생으로 제공되어, 그로 인하여 자체의 표현형을 생성한다(예를 들어, 생쥐가 2개의 Cre alleles15를품고 있는 Prg4-GFPCreERT2노크인 마우스 균주에대해), 그래서 Cre 알레일의 단일 사본이 바람직하다. 기재된 모든 실험에서, Col2CreERT16의 단일 사본은13에기재된 바와 같이 Col2CreERT:Confetti 마우스를 생성하기 위해 남성 또는 여성 부모에 의해 수행되었다. 다음으로, 관심 있는 세포 유형에 대한 Cre 라인의 특이성은 중요한 고려 사항이다. 예를 들어, Col2CreERT는 연골 세포 특이적이지만 초기 출생 후 연골17에서연골 세포의 여러 뚜렷한 집단을 표시합니다. 마지막으로, 상이한 Cre 균주의 활성은 동물 나이에 따라 상당히 변화할 수 있으며, 동일한 유형의 세포에서도 Cre 발현 변화에 활용되는 프로모터의 내인성 활성이 증가함에 따라 상당히 변화할 수 있다( 예를 들어,Prg4-GFPCreERT2) 타목시펜 투여량의 수는15세()로피상적 지대 세포에 라벨을 붙인다.
표지된 세포의 수는 주어진 타목시펜의 양에 의해 반영될 것이므로, 클론을 서로 구별하기 어렵기 때문에 항상 최대 용량을 부여하는 것이 바람직하지는 않다. Cre 발현은 나이뿐만 아니라 다른 프로모터의 조절에 따라 달라질 수 있기 때문에, 타목시펜 투여량은 라벨링을 최적화하기 위해 조정되어야 할 것이다. 재조합이 발생하고 그 결과로 생긴 형광 단백질이 이미징을 위해 충분히 축적되기 위해서는 시간이 필요하기 때문에 세포가 재조합을 트리거하는 즉시 형광되지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. Cre 라인, 세포 유형 및 동물 연령에 의해 영향을 받는 것으로 보이는 광범위한 시간(24-72시간 사이)이 필요합니다. 타목시펜은 투여 후 오랫동안 생물학적활성이 가능하기때문에(18)은 항상 각 모델에서 재조합 효율을 철저히 확인하는 것이 바람직하다.
공초점 현미경 검사법 단계 도중, 색종이 형광 성 단백질의 흥분은 레이저 빛에 의하여 조직의 침투를 요구합니다. 다른 조직은 다른 특성을 가지고 있기 때문에, 레이저 빛은 모든 조직의 160 μm 두꺼운 섹션을 관통하지 않을 수 있습니다. 그러나, 이러한 두꺼운 섹션은 도 2,도 3에사용되는 바와 같이 성장 판 연골을 사용할 수 있습니다. 모든 현미경은 서로 다르며 설명된 설정(보충파일 1)이사소한 조정 없이 완벽하게 작동할 가능성은 거의 없습니다. 주요 과제 중 하나는 다른 형광 단백질을 구별하여 한 채널에서 다른 채널로 오염이 없도록 하는 것입니다. 예를 들어, GFP로부터 오는 형광에 의해 야기된 YFP 채널의 신호는 YFP와 RFP 채널 사이에 중첩됩니다. YFP 및 CFP 채널도 신중하게 확인해야 합니다. 이 작업은 여러 가지 방법으로 수행할 수 있습니다. 첫째, 각 형광 단백질에 대해 기록되는 형광광 파장의 방출 범위를 좁힐 수 있다. 둘째, 디지털 게인과 함께 레이저 전력을 조정하면 신호를 최적화할 수 있다. 이 연구에서 이 단계는 충분했습니다, 그러나 강한 형광 신호에 의존합니다. 이것은 이론적으로 비효율적인 조직 처리가 형광 단백질의 활성을 감소시킬 수 있거나 약한 레이저 광원이 채널 분리를 손상시킬 수 있음을 의미합니다.
Confetti 마우스의 장점 중 하나는 클론 역학에 대한 특정 유전자의 영향을 연구 할 수 있도록 사용할 수있는 많은 수의 유전자 돌연변이 균주와 결합 될 수 있다는 것입니다10,11,12 ,13,14,19,20, 일부 제한 사항이 기이하지만. 예를 들어, 색종이 대립 유전자와 관심 유전자의 재조합은 클론 계보 추적과 결합된 Cre loxP 기반 돌연변이체를 사용할 때 분리될 수 없다. 그럼에도 불구하고, 이러한 일치하는 재조합 이벤트는10,14,20일유효할 수 있다. 예를 들어, 이러한 가능성은 생후 연골세포-성장판(21)에서 TSC1의 산후 연골세포 특이적 절제에 따른 마우스의 휴식 구역에서 증가된 세포 수를 탐구하는 데 사용되었고, 시간이 지남에 따라 이들 세포 들 사이의 클론 관계를 밝혀 13. 추가적으로, 색종이 마우스를 이용한 조직 특이적 클론 분석은 비-Cre loxP 계 돌연변이마우스(11)와함께 사용될 수 있으며, 이러한 접근법을 약리학적8,9와 결합하는 것도 가능하다. ,13 및 / 또는 수술 모델8은 다른 기능 적 섭동에 대한 클론 반응을 시각화합니다. 면역 형광에 의한 내인성 단백질의 면역 검출과 색종이 표지 된 섹션을 결합 할 때 추가 기회가 발생합니다. 이러한 분석은 추적 된 세포와 알려진 마커와의 동국화를 식별 할 수 있습니다. 본 명세서에 기재된 고정 방법을 사용하면, 면역형광을 실시하고 여전히 색종이형광단백질(12,13)으로부터의형광을 가시화할 수 있다. 그러나, 언급 된 논문에서, 항원 검색이 필요하지 않았다. 구연산염 완충액에서 끓는 것과 같은 가혹한 항원 회수 방법은 색종이 형광의 완전한 손실로 이끌어 냅니다. 색종이 형광 단백질은 항체22를사용하여 검출될 수 있지만, 클론 정체성의 손실이 발생할 수 있다.
요약하자면, 색종이 모델을 사용하여 생체 내 세포에 라벨을 붙이는 것은 시간이 지남에 따라 해당 세포의 운명을 분석하는 유익한 도구입니다. 기술된 방법은 광물화된 조직에서 형광 단백질 발현을 직접 시각화하는 빠르고 효율적인 방법을 제공한다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 방법론적 조언에 대한 예브게니 이바슈킨 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 스웨덴 연구위원회 (A.S.C),러시아 과학 재단 (ASC에 #19-15-00241 부여), 카롤린스카 연구소 (A.S.C.), 스트랫 레겐 KI와 스티프 텔 센 Konung 구스타프 V : 80-årsfond (A.S.C.), Stiftelsen에 의해 재정적으로 지원되었다 프리무라레 반후셋과 살스카펫 바르나바드(P.T.N.), 중국 장학금 위원회(B.Z.). 공초점 현미경은 너트와 앨리스 월렌버그 재단에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
| 60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | |
| Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
| Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
| Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
| EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
| Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
| Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
| Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
| Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
| OCT | Sakura | 102094-104 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| PBS | Gibco | 14200075 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |
References
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