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Cancer Research

परमाणु/

Published: October 23, 2019 doi: 10.3791/60426
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Paul O'Gorman Leukaemia Research Centre, Institute of Cancer Sciences, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल अनुकूलन और प्राथमिक क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं से परमाणु और साइटोप्लाज्मिक भिन्नों के बाद कुशल पीढ़ी सक्षम बनाता है। इन नमूनों को प्रोटीन स्थानीयकरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन की तस्करी है कि सेल उत्तेजना और दवा उपचार पर परमाणु और कोशिका द्रव्य डिब्बों के बीच जगह ले में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है.

Abstract

मैक्रो अणुओं के परमाणु निर्यात अक्सर कैंसर कोशिकाओं में अविनियमित है. ट्यूमर निरोधक प्रोटीन, जैसे p53, aberant सेलुलर स्थानीयकरण कार्रवाई के अपने तंत्र को बाधित करने के कारण निष्क्रिय प्रदान किया जा सकता है. पुरानी लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया (CLL) कोशिकाओं के अस्तित्व, अन्य कैंसर कोशिकाओं के बीच, कोशिका द्रव्य बंद करने के लिए परमाणु के विनियमन द्वारा सहायता प्रदान की है, कम से कम भाग में परिवहन रिसेप्टर XPO1 के विनियमन और के गठन सक्रियण के माध्यम से PI3K-मध्यस्थ संकेतन पथ. रोग के रोग विज्ञान में ऐसे प्रोटीन की भूमिका की गहरी समझ प्राप्त करने के लिए अपने इंट्रासेल्यूलर स्थान के संदर्भ में अलग-अलग प्रोटीन की भूमिका को समझना आवश्यक है। इसके अलावा, प्रक्रियाओं की पहचान है कि underlie सेल उत्तेजना और विशिष्ट औषधीय inhibitors की कार्रवाई के तंत्र, subcellular प्रोटीन तस्करी के संदर्भ में, के तंत्र की एक अधिक व्यापक समझ प्रदान करेगा कार्रवाई. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल अनुकूलन और प्राथमिक क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं से परमाणु और साइटोप्लाज्मिक भिन्नों के बाद कुशल पीढ़ी सक्षम बनाता है। इन अंशों सेल उत्तेजना और दवा उपचार पर परमाणु और साइटोप्लाज्मिक भिन्नों के बीच प्रोटीन की तस्करी में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. डेटा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है और इम्यूनोफ्लोरेसेंट छवियों के साथ समानांतर में प्रस्तुत किया, इस प्रकार मजबूत और परिमाणात्मक डेटा प्रदान.

Introduction

नाभिक और कोशिकाद्रव्य के बीच स्थूल अणुओं का परिवहन लंबे समय से सामान्य कोशिकीय फलन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए स्थापित किया गया है और यह प्राय : कैंसर कोशिकाओं1,2में नियंत्रणमुक्त होता है . इस तरह के विनियमन परमाणु निर्यात को नियंत्रित करने वाले प्रोटीन के अतिअभिव्यक्ति/परिवर्तन से परिणाम कर सकते हैं। ऐसा ही एक प्रोटीन एक्सपोर्टिन-1 (XPO1), एक परिवहन ग्राही है जो नाभिक2से कोशिकाद्रव्य में प्रोटीन का निर्यात करता है। XPO1-कार्गो में p53, FOXO परिवार के सदस्य और आईबी शामिल हैं, जो उनके कार्य तंत्र1,2,3को बाधित करके निष्क्रियता में योगदान देते हैं। इसके अलावा प्रोटीन mislocalization हो सकता है जब सूक्ष्म पर्यावरण संकेतकैंसर कोशिकाओं पर impinge, इस तरह के फॉस्फेटिडिल-inositol-3-kinase (PI3K) / फॉक्सओ परिवार के सदस्यों की निष्क्रियता और बाद में नाभिक से निर्यात4,5. ट्यूमर निरोधक प्रोटीन के इस प्रकार के कुस्थानीकरण को कई हेमेटोलॉजिकल और ठोस ट्यूमर1,2,6की प्रगति में फंसाया गया है .

हेमेटोलॉजिकल द्रोह में नैदानिक उपयोग के लिए छोटे अणु अवरोधकों का विकास (तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल)/CLL), जो XPO1 फ़ंक्शन को बांधता है और चुनिंदा रूप से बाधित करता है, उचित तकनीकों को संबोधित करने के लिए उचित तकनीकों के विकास के महत्व को रेखांकित करता है परमाणु और कोशिकाद्रव्यी डिब्बों के बीच प्रोटीन ों को बंद करने पर औषधीय एजेंटों का प्रभाव6,7,8. इमेजिंग तकनीक काफी दवा उपचार के बाहरी उत्तेजना पर subcellular डिब्बों में प्रोटीन की पहचान को सक्षम करने से उन्नत है, तथापि, मजबूत और सहायक समानांतर तकनीकों के महत्व मज़बूती से महत्वपूर्ण है एक परिणाम की वैधता के एक वैज्ञानिक दर्शकों को सूचित.

आराम लिम्फोसाइटों और घातक CLL-बी कोशिकाओं रोगी रक्त के नमूने से अलग उच्च परमाणु के कारण परमाणु और कोशिका द्रव्य भिन्न की पीढ़ी में एक चुनौती का प्रतिनिधित्व: कोशिका द्रव्य अनुपात. मजबूत और विश्वसनीय प्रयोगात्मक डेटा उत्पन्न करने के लिए प्रयोगात्मक स्थितियों के अनुकूलन भविष्य प्रयोगात्मक कार्यक्रमों की योजना के लिए पाठ्यक्रम महत्वपूर्ण है। यहाँ वर्णित विधि परमाणु और कोशिकाद्रव्यी अंशों में प्रोटीन के परिमाणीकरण सक्षम बनाता है और निर्धारित करता है कि कैसे इन प्रोटीन सेलुलर उत्तेजना और /

Protocol

यहां वर्णित CLL रोगियों से प्राथमिक नमूनों के उपयोग को स्कॉटलैंड अनुसंधान आचार सेवा, एनएचएस ग्रेटर ग्लासगो और क्लाइड (यूके) के पश्चिम द्वारा अनुमोदित किया गया है और सभी कार्य अनुमोदित दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे।

1. रोगी रक्त नमूनों से CLL कोशिकाओं के अलगाव

  1. पहले से सहमति सीएलएल रोगियों से परिधीय रक्त के नमूने EDTA रक्त संग्रह ट्यूबों में क्लिनिक से प्राप्त कर रहे हैं, सफेद सेल गिनती (WCC) के साथ. डब्ल्यूसीसी के अनुसार परिधीय रक्त सीएलएल नमूनों को शुद्ध करें। WCC और lt; 40 x 106 cells/mL के लिए, चरण 1.1.1 पर आगे बढ़ें; WCC के लिए - 40 x 106 कोशिकाओं /
    1. सभी EDTA रक्त ट्यूबों की सामग्री को 50 एमएल शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूब में डालें और रक्त के 1 एमएल प्रति मानव बी सेल एनरिचमेंट कॉकटेल के 50 डिग्री एल जोड़ें। 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट करें. 1.1.2 कदम करने के लिए आगे बढ़ें।
    2. आरटी CLL धोने बफर (फॉस्फेट-बफर सैलिन (पीबीएस), 0.5% भ्रूण बोवाइन सीरम (FBS) और 2 एमएम EDTA के साथ 1:1 के अनुपात में नमूना पतला।
  2. नमूने के लिए एक उचित आकार शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूब में अलीकोट आरटी घनत्व ग्रेडिएंट मीडिया (10 एमएल नमूने के लिए 30 एमएल के नमूने के लिए 50 एमएल ट्यूब में या 10 एमएल नमूने के लिए 15 एमएल ट्यूब में 4 एमएल)।
  3. ध्यान से घनत्व ढाल मीडिया के शीर्ष पर नमूना परत और सेंट्रीफ्यूज पर 400 x ग्राम के लिए 30 मिनट RT पर.
    नोट: सुनिश्चित करें कि सेंट्रीफ्यूज आरटी में है इससे पहले कि नमूने को सेंट्रीफ्यूज में रखा जाता है क्योंकि तापमान में परिवर्तन मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के खराब संवर्धन में परिणाम देगा, और अपकेंद्रित्र पर ब्रेक बंद कर देगा, क्योंकि अचानक ब्रेक लगाना तरल इंटरफ़ेस को बाधित कर सकता है।
  4. धीरे से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की सफेद परत है कि घनत्व ढाल मीडिया और CLL धोने बफर के इंटरफेस पर इकट्ठा फसल, एक ताजा 50 एमएल शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक प्लास्टिक पाश्चर pippette का उपयोग कर.
  5. आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र को धोने के लिए अलग मोनोलेयर में 40 एमएल वॉश बफर जोड़ें।
  6. supernatant छोड़ें, ट्यूब के नीचे flicking द्वारा गोली resuspend, तो कदम 1.5 में वर्णित धोने कदम दोहराएँ.
  7. supernatant छोड़ें, चरण 1.6 में वर्णित के रूप में गोली resuspend, तो CLL धोने बफर का एक सेट मात्रा में गोली resuspend (अप करने के लिए 40 एमएल, सेल गोली के आकार के आधार पर).
  8. ट्राइपैन ब्लू और एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें। फिर CLL कोशिकाओं की शुद्धता की जांच करने के लिए साइटोमेट्री प्रवाह करने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: इस स्तर पर CLL कोशिकाओं को प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा करने के लिए मीडिया में 10 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर सुसंस्कृत किया जा सकता है, और/या cryopreserved में 10% dimethyl suloxide (DMSO) /

2. CLL कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्री

  1. लेबल 12 मिमी x 75 मिमी गोल तली वाली पॉलीस्टाइरीन ट्यूब, जैसा कि तालिका 1में वर्णित है।
  2. ट्यूब 2 - 5 में, मुआवजा मोती की एक बूंद डाल दिया और बर्फ पर स्टोर. उपयुक्त एंटीबॉडी के 1 $L जोड़ें (विरोधी CD5, CD19, CD23 या CD45, के रूप में तालिका में संकेत दिया 1) ट्यूबों के लिए 2 - 5, और 20 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट, बर्फ बाल्टी पर टिन पन्नी रखकर प्रकाश से संरक्षित.
    नोट: इन ट्यूबों प्रवाह साइटोमेट्री टेम्पलेट की स्थापना के लिए मुआवजा नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं.
  3. 1 x 106 CLL कोशिकाओं को ट्यूबों में 1, 6 और 7 तक रखो, कोशिकाओं को धोने के लिए आरटी में 5 मिनट के लिए प्रत्येक ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज में प्रत्येक ट्यूब और अपकेंद्रण में एफएसीएस बफर (पीबीएस + 2% एफबीएस) के 2 एमएल जोड़ें। सुपरनेंट को छोड़ दें और बर्फ पर सेल छर्रों युक्त ट्यूबों को स्टोर करें।
    1. कोशिका छर्रों को पुन: निलंबित करें और एफएसीएस बफर के साथ 100 डिग्री सेल्सियस के अंतिम खंड में सारणी 1में दिए गए अनुसार ट्यूब 7 में कोशिकाओं में एंटीबॉडी का उपयुक्त संयोजन जोड़ें। निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार एंटीबॉडीज़ का उपयोग उचित एकाग्रता में किया जाता है।
    2. नलों में सेल छर्रों को पुन: निलंबित करें 2 और 6 में 100 $L FACS बफर के.
    3. बर्फ पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट, ट्यूबों में दाग मोती के साथ 2 - 5, 20 मिनट के लिए प्रकाश से संरक्षित.
  4. ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को धोने के लिए आरटी में 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सभी ट्यूबों और अपकेंद्रित्र में 2 एमएल एफएसए बफर जोड़ें। सुपरनेंट को छोड़ दें और धीरे से ट्यूब flicking द्वारा मनका / सेल छर्रों को फिर से निलंबित।
  5. ट्यूबों को पुन: निलंबित करें 1 - 5 में 100 एफएसीएस बफर और बर्फ पर जगह के 100 डिग्री एल में जब तक प्रवाह cytometer पर विश्लेषण करने के लिए तैयार है।
  6. उपयोग करने से ठीक पहले एफएसीएस बफर में डीएपीआई समाधान को 0.05-0.2 ग्राम/एमएल के लिए हल करें। इष्टतम एकाग्रता भिन्न हो सकते हैं, और अनुमापन की सिफारिश की है.
  7. ट्यूबों को पुन: निलंबित 6 और 7 पतला DAPI समाधान के 100 डिग्री सेल्सियस के साथ और कोशिकाओं को दाग करने के लिए अनुमति देने के लिए 5 मिनट की एक न्यूनतम के लिए बर्फ पर ट्यूबइन इनक्यूबेट।
    नोट: कोई और धोने के रूप में DAPI मृत कोशिकाओं लेबल रहने के लिए बफर में मौजूद होना चाहिए आवश्यक है. एक बार DAPI जोड़ा गया है, कोशिकाओं के प्रवाह cytometer पर विश्लेषण किया जाना चाहिए 4 ज के भीतर.
  8. एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं का विश्लेषण करें.

3. CLL सेल से subcellular अंश की तैयारी

नोट: प्रयोगात्मक सेट-अप की योजना बनाते समय, जिसमें से पूरे सेल एक्सट्रेक्ट उत्पन्न किए जा सकते हैं, unstimulated/अशोधित कोशिकाओं की एक अच्छी तरह से शामिल करें।

  1. 10 - 20 x 106 कोशिकाओं / कोशिकाओं तो subcellular भिन्नण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा (चरण 3.4 और 3.5) या पूरे सेल निकालने उत्पन्न करने के लिए (चरण 3.6).
  2. समाधान/ट्यूब तैयार करना: कोशिकाओं को काटा जाने से पहले, भिन्नण के दिन नए सिरे से सभी समाधान/बफर तैयार करें। आवश्यक जब तक बर्फ पर समाधान स्टोर और तैयारी के 4 घंटे के भीतर का उपयोग करें.
    1. PBS/phosphatase अवरोधक समाधान: 1x PBS में फॉस्फेटेज अवरोधक1:20 (यानी, 0.5 एमएल फॉस्फेटेज अवरोधकों में 9.5 एमएल 1x PBS) को कम करके पीबीएस में फॉस्फेटेज अवरोधक तैयार करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि फॉस्फेटेज अवरोधकों ने तेजी से नहीं किया है। यदि एक वेग मौजूद है, 10 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी.
    2. Hypotonic बफर: आसुत पानी में 10x hypotonic बफर के 1:10 तनुकरण बनाने के द्वारा 1x hypotonic बफर तैयार (यानी, 10x hypotonic बफर के 50 डिग्री सेल्सियस dH2O) में 450 डिग्री एल के.
    3. 10 एमएम डाइथियोथ्रेटोल (डीटीटी): आसुत जल के साथ 1 एम डीटीटी का 1:100 तनुकरण करके 10 एमएम डीटीटी तैयार करें (अर्थात, 1 एम डीटीटी का 10 डिग्री सेल्सियस डी एच2ओ) में।
      नोट: DTT अत्यधिक labile है तो यह ताजा हर बार तैयार करते हैं. बार-बार फ्रीज/थॉ व चक्र से बचें।
    4. पूर्ण lysis बफर: निर्धारित कितना बफर प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक है. प्रत्येक नमूने को पूर्ण lysis बफर के 50 डिग्री एल की आवश्यकता होती है, इसलिए 10 एमएम डीटीटी (चरण 3.2.3) के 5 डिग्री एल को lysis बफर के 44.5 $L में जोड़ें और फिर प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल के 0.5 डिग्री एल जोड़ें। प्रयोग में नमूनों की संख्या के आधार पर इस राशि को बढ़ाया जा सकता है.
    5. लेबल प्रत्येक उत्तेजना के लिए 1.5 एमएल microfuge ट्यूबों के चार सेट और / या ताजा प्रेरित कोशिकाओं के लिए दवा उपचार (कदम 3.3), ताजा उत्पन्न साइटोप्लाज्मिक भिन्न (कदम 3.4.3), ताजा उत्पन्न परमाणु अंश (कदम 3.5.3), और पूरे सेल lysates (चरण 3.6.3). बर्फ पर इन microfuge ट्यूबों को पूर्व ठंडा जब तक आवश्यक.
  3. कोशिकाओं को अलग-अलग लेबल 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगिंग द्वारा गोली। सुपरनेंट निकालें और 1 एमएल बर्फ-ठंडा पीबीएस/फॉस्फेटेज इनहिबिटर (चरण 3.2.1) में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें। supernatant निकालें और बर्फ पर सेल छर्रों रहते हैं.
  4. साइटोप्लाज्मिक भिन्नों की तैयारी: 1x हाइपोटोनिक बफर (चरण 3.2.2) के 50 डिग्री एल में उपकोशिकीय विखंडन के लिए उपयोग किए जाने वाले सेल छर्रों को धीरे-धीरे पुन: स्फूर्ति देना। कोशिकाओं को फूलने की अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस्तेमाल किया hypotonic बफर की मात्रा सेल संख्या के आधार पर अनुभवजन्य वृद्धि की जा सकती है.
    1. जोड़ें 0.8 - 2.5 $L (1:20 करने के लिए 1:60) प्रत्येक नमूना में डिटर्जेंट और 10 s के लिए उच्चतम सेटिंग पर भंवर.
      1. परमाणु और साइटोप्लाज्मिक भिन्नों को अलग करने के लिए एक विशिष्ट सेल प्रकार के लिए उपयोग करने के लिए डिटर्जेंट की इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, शुरू में एक डिटर्जेंट ढाल प्रदर्शन. 1:20 से 1:60 तक की सीमा (यानी, 2.5 डिग्री से 0.8 डिग्री सेल्सियस डिटर्जेंट की 50 डिग्री सेल्सियस में Hypotonic बफर) पर्याप्त होना चाहिए.
        नोट: यदि चरण में hypotonic बफर की मात्रा समायोजित किया जाता है 3.4, सुनिश्चित करें कि उपयुक्त डिटर्जेंट अनुपात बनाए रखा है.
      2. डिटर्जेंट के अलावा और बाद में एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं को देख कर सेल lysis सत्यापित करें। पूरी कोशिकाओं को एक घने, अंधेरे नाभिक के साथ बड़ा दिखाई देते हैं. कोशिकाद्रव्य नाभिक के चारों ओर एक उज्ज्वल परिवेश के रूप में दिखाई देगा।
        नोट: उचित lysis आगे डिटर्जेंट ढाल से उत्पन्न lysed भिन्न के भीतर विशिष्ट प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए पश्चिमी blotting का उपयोग करके पुष्टि की है.
    2. एक बार lysed, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 s के लिए 14,000 x ग्राम पर नमूने centrifuge.
    3. सुपरनेंट को पूर्व-चिल्ड, लेबल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में सावधानी से स्थानांतरित करें। इस कोशिकाद्रव्यी अंश को आगे के विश्लेषण के लिए आवश्यक होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। शेष गोली परमाणु अंश (चरण 3.5) शामिल हैं.
      नोट: नमूनों के बार-बार फ्रीज/थॉव चक्र से बचें।
  5. परमाणु भिन्नों की तैयारी: पूर्ण lysis बफर के 50 $L में प्रत्येक परमाणु गोली resuspend (चरण 3.2.4) ऊपर और नीचे pipeting द्वारा.
    नोट: पूर्ण lysis बफर की मात्रा प्रारंभिक सेल संख्या के अनुसार अनुभवजन्य समायोजित किया जा सकता है.
    1. परमाणु झिल्ली के साथ जुड़े प्रोटीन solubilize करने के लिए डिटर्जेंट के 2.5 $L जोड़ें और 10 s के लिए उच्चतम सेटिंग पर भंवर. 30 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने इनक्यूबेट करें।
    2. 30 s के लिए उच्चतम सेटिंग पर भंवर, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर नमूने centrifuge.
    3. सुपरनेंट को एक पूर्व-चिल्ड, लेबल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस परमाणु अंश को आगे के विश्लेषण के लिए आवश्यक होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: नमूनों के बार-बार फ्रीज/थॉव चक्र से बचें।
  6. सीएलएल कोशिकाओं से पूरे सेल lysates (डब्ल्यूसीएल) की तैयारी
    नोट: पूरे सेल निकालने की तैयारी परमाणु अंशों की तैयारी के रूप में एक ही समय में किया जा सकता है (कदम 3.5).
    1. पूरे सेल निकालने छर्रों को पूर्ण lysis बफर के 100 डिग्री एल में पुन: निलंबित करें (चरण 3.2.4 में तैयार) ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा, फिर पूर्ण सेल lysis सुनिश्चित करने के लिए डिटर्जेंट के 5 डिग्री एल जोड़ें। 30 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने इनक्यूबेट करें।
    2. 30 s के लिए उच्चतम सेटिंग पर भंवर, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर नमूने centrifuge.
    3. सुपरनेटेंट को एक पूर्व-चिल्ड माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस पूरे सेल lysate -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक आगे के विश्लेषण के लिए आवश्यक है.
      नोट: नमूनों के बार-बार फ्रीज/थॉव चक्र से बचें।

4. उपकोशिकीय अंशों का डाउनस्ट्रीम विश्लेषण

नोट: इस प्रोटोकॉल में, परमाणु और कोशिकाद्रव्यी भिन्नों के लिए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा उत्पन्न सेल अंशों का विश्लेषण किया गया था, समान सेल संख्या/लेन (प्रोटीन के $10 ग्राम के बराबर) लोड किया गया था।

  1. परमाणु और कोशिकाद्रव्यी भिन्नों के बीच प्रोटीन तस्करी की मात्रा: संकेत तीव्रता, या स्वतंत्र रूप से उपलब्ध पश्चिमी धब्बा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर densitometry के परिमाणके माध्यम से मात्रात्मक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रदर्शन.
  2. चित्र आयात करना: विभिन्न विकासशील उपकरणों से जनरेट किया गया पश्चिमी ब्लॉट छवियों JPG, PNG या TIFF फ़ाइलों के रूप में आयात किया जाना चाहिए। एक 16-बिट गहराई रॉ फ़ाइल की सिफारिश की है. किसी चित्र को आयात करने के लिए, सॉफ़्टवेयर चिह्न क्लिक करें और आयात पर होवर करें. फिर तृतीय-पक्ष छवियाँ क्लिक करें. छवि फ़ाइल का चयन करें और खोलेंक्लिक करें.
  3. छवि प्रदर्शित करना: छवि रिबन में, प्रदर्शन समूह में चुनें बटन पर क्लिक करें. यदि आवश्यक हो तो प्रदर्शन समायोजित करें संवाद आगे समायोजन सक्षम करने के लिए खुल जाएगा. छवि LUTs टैब पर समायोज्य स्लाइडर्स का उपयोग करके चमक या कंट्रास्ट सहित अतिरिक्त एन्हांसमेंट्स कार्यान्वित करें. बेहतर समायोजनों के लिए वक्र टैब का उपयोग करें.
  4. डेटा विश्लेषण (चैनल deselection): विश्लेषण रिबन क्लिक करें. केवल एक चैनल का विश्लेषण करने के लिए, विश्लेषण नहीं किए जा रहे चैनल का चयन रद्द करें. छवि LUTs में चैनल थंबनेल न दिखाएँ, केवल प्रदर्शित वांछित चैनल छोड़ने पर क्लिक करें. JPG, PNG या TIFF फ़ाइलों के रूप में आयातित छवियाँ एकाधिक अवांछित RGB चैनलों के deselection की आवश्यकता हो सकती है।
    1. आकृतियाँ जोड़ना: संकेत तीव्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, छवि में आयत जोड़ने के लिए आयत जोड़ें क्लिक करें. किसी सुविधा के केंद्र पर क्लिक करें (उदा., एक प्रोटीन बैंड) इसके चारों ओर एक आयत रखने के लिए. वैकल्पिक रूप से, मैन्युअल रूप से कोई आकृति बनाने के लिए, आयत आरेखित करेंचुनें. सभी इच्छित आकृतियाँ जोड़ने के बाद, कर्सर को चयन उपकरण पर वापस लाने के लिए चयन करें क्लिक करें.
      नोट: डेटा क्रमिक रूप से जनरेट किया गया है जो किसी ID संख्या द्वारा सॉर्ट किया जाता है के रूप में एक तार्किक क्रम में एकाधिक आकृतियाँ जोड़ें।
    2. पृष्ठभूमि घटाव: पृष्ठभूमि शोर घटाने के लिए, पृष्ठभूमि समूह में पहला बटन क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से माध्यका इन का चयन करें. पृष्ठभूमि संवाद में बॉर्डर चौड़ाई को 3 पर सेट करें और पृष्ठभूमि परिकलन के लिए उपयोग किए जाने वाले सेगमेंट का चयन करें. यह चुनते समय कि कौन से सेगमेंट उपयोग करना है, उन सेगमेंट चुनें, जो चित्र पृष्ठभूमि का सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व करते हैं.
      नोट: पृष्ठभूमि शोर संकेत परिमाणीकरण को प्रभावित कर सकते हैं, तो यह सही ब्याज की आकृति से संकेत की गणना करने के लिए घटाया जाना चाहिए.
    3. सिग्नल और ट्रिम पृष्ठभूमि ट्रिम - वैकल्पिक: JPG, PNG या TIFF स्वरूपों में आयातित फ़ाइलें पिक्सेल संतृप्ति प्रदर्शित कर सकती हैं: प्रोटीन बैंड के भीतर हाइलाइट किए गए/ सिग्नल और ट्रिम पृष्ठभूमि (Bkgnd) विश्लेषण से संतृप्त पिक्सल हटा. इन मूल्यों को देखने के लिए, तालिका दृश्य के दाईं ओर कॉलम बटन पर क्लिक करके एक तालिका में ट्रिम सिग्नल और ट्रिम Bkgnd जोड़ें.
      नोट: पिक्सेल संतृप्ति अविश्वसनीय परिमाणीकरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. संतृप्त पिक्सेल केवल तभी निकाला जा सकता है जब किसी आकृति के भीतर 5% पिक्सेल संतृप्त हों.
  5. डेटा निर्यात करें: तालिका के ऊपर आकृतियाँ टैब क्लिक करें. घनत्वमिति के लिए, सिग्नल कॉलम में मान आवश्यक हैं। सिग्नल Bkgnd और क्षेत्र के उत्पाद को शून्य से एक आकार के लिए पिक्सेल तीव्रता मूल्यों (कुल) का योग है. रिपोर्ट करें बटन क्लिक करें. इस रूप में सहेजें क्लिक करें या स्प्रेडशीट लॉन्च करेंपर क्लिक करें.
    सिग्नल - कुल - (Bkgnd x क्षेत्र)
    नोट: आकार टैब सिग्नल, कुल, क्षेत्र और Bkgrnd सहित मात्रात्मक मूल्यों की एक तालिका प्रदान करता है.
  6. प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा: बचाया स्प्रेडशीट के भीतर, इसी प्रोटीन लोड हो रहा है नियंत्रण बैंड के लिए सिग्नल द्वारा ब्याज की प्रोटीन के लिए प्राप्त सिग्नल विभाजित करके प्रत्येक लेन या चर के लिए ब्याज की प्रोटीन की सामान्यीकृत अभिव्यक्ति की गणना.
    नोट: परमाणु और कोशिकाद्रव्यी भिन्नों में ब्याज की एक सामान्यीकृत प्रोटीन की मात्रा के बीच तुलना परमाणु और कोशिकाद्रव्यी भिन्नों भेद करने के लिए इस्तेमाल किया विभिन्न लोडिंग नियंत्रण की वजह से सीधे तुलना नहीं की जा सकती. हालांकि, अलग-अलग भिन्न ों के भीतर तुलना, उदा निम्नलिखित दवा उपचार, उपयुक्त हैं।
  7. प्रकाशन या प्रस्तुति के लिए छवि निर्यात करें: तालिका के ऊपर मिले चित्र टैब पर क्लिक करें और फिर निर्यात किए जाने वाले चित्र पर क्लिक करें. यदि किसी स्लाइड प्रस्तुति या अन्य डिजिटल स्वरूपों के लिए छवि का उपयोग करते हुए, सॉफ़्टवेयर चिह्न क्लिक करें, निर्यात पर होवर करें और डिजिटल मीडियाके लिए छवि पर क्लिक करें. छवि को आवश्यक के रूप में JPG, PNG या TIFF फ़ाइल के रूप में सहेजें।

Representative Results

जब प्राथमिक CLL कोशिकाओं पर प्रयोगों की योजना बना, अगर परख कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है (gt; 50 x 106 कोशिकाओं), वहाँ एक प्राथमिकता के लिए ताजा अलग CLL कोशिकाओं का उपयोग करें, बजाय cryopreserved कोशिकाओं है कि thawing की आवश्यकता है, लेकिन यह हमेशा नहीं है संभव. इसका कारण यह है कि फ्रीज/थॉव प्रक्रिया के परिणामस्वरूप CLL कोशिकाओं के 50% तक की मृत्यु हो सकती है, हालांकि यह नमूना निर्भर है। एक WCC के साथ सीएलएल कोशिकाओं के संवर्धन और 40 x 106/mL यहाँ वर्णित के रूप में घनत्व centrifugation का उपयोग कर (कदम 1.3 - 1.5) उच्च शुद्धता के साथ एक उच्च सेल वसूली सक्षम बनाता है ($ 95%) प्राथमिक CLL कोशिकाओं की. दिखाए गए नमूने में, WCC $ 177 x 106/mL: एक 30 एमएल रक्त नमूना से 5 x 109 कोशिकाओं, जो कुल कोशिकाओं के 94% की एक सेल उपज का प्रतिनिधित्व करता है बरामद किया गया. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा इस नमूने के विश्लेषण से पता चला कि CLL कोशिकाओं की शुद्धता के रूप में CLL सेल मार्करCD19 और CD5 की दोहरी सतह अभिव्यक्ति द्वारा संकेत के रूप में FSC/SSC पर gating के बाद, एकल कोशिकाओं कि DAPI नकारात्मक थे (व्यवहार्य कोशिकाओं) (चित्र 1).

कोशिकाद्रव्यी भिन्न (चरण 3.4) की तैयारी के दौरान अपमार्जक अनुपात (1:20 से 1:60) की एक श्रेणी का उपयोग करके उपकोशिकीय प्रभाजन प्रक्रिया का अनुकूलन किया गया था। इसके बाद, परमाणु अंश और डब्ल्यूसीएल तैयार किए गए (क्रमशः 3.5 और 3.6 कदम)। सीएलएल सेल लाइन MEC1 (चित्र 2ए) और प्राथमिक CLL कोशिकाओं (चित्र 2ठ) के परिणामी भिन्नों पर इम्युनोबलॉट्स का प्रदर्शन किया गया . सफल सेल प्रभाजकों की पुष्टि करने के लिए अंश मार्कर लामिन ए/सी (न्यूक्लियर; 74/63 केडीए) और जेड-टुबुलिन (साइटोप्लाज्मिक; 55 केडीए) के लिए ब्लॉट्स की जांच की गई। प्रभाजन इंगित करता है कि MEC1 कोशिकाओं के लिए इष्टतम डिटर्जेंट स्तर एक 1:60 तनुकरण है (चित्र 2A),प्राथमिक CLL कोशिकाओं के लिए इष्टतम किया जा रहा एक 1:30 कमजोर पड़ने के साथ तुलना में (चित्र 2B), के रूप में एक संवर्धन द्वारा संकेत दिया नाभिकीय प्रोटीन और कोशिकाद्रव्यी प्रोटीन की कमी भिन्नों में और इसके विपरीत. WCLs कुल प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करते हैं और subcellular अंशों की जांच करने के लिए इस्तेमाल एंटीबॉडी के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य. भिन्न मार्कर के रूप में उपयुक्त प्रोटीन का चयन करना महत्वपूर्ण है: चित्र 2सी MEC1 कोशिकाओं से तैयार परमाणु/साइटोप्लाज्मिक अंशों के इम्यूनोब्रोलॉट्स दिखाता है जिसमें आरएनए पॉलिमरेज II (Rpb1 CTD; 250 kDa) और Lamin A/ परमाणु अंश, जबकि जेड-ट्यूबुलिन और जेड-टूबुलिन (50 केडीए) को साइटोप्लाज्मिक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था। यह स्पष्ट है कि कोशिका द्रव्य में जेड-ट्यूबुलिन समृद्ध है, हालांकि अभिव्यक्ति नाभिक में स्पष्ट है, जैसा कि पहले9दिखाया गया है।

एक बार प्रयोगात्मक शर्तों अनुकूलित कर रहे हैं, एक प्रयोग किया जा सकता है. दिखाए गए उदाहरणों में, परमाणु और कोशिकाद्रव्यी भिन्नों में FOXO1 के subcellular स्थानीयकरण की उपस्थिति या दोहरी mTORC1/2 अवरोधक की अनुपस्थिति में बी सेल प्रतिजन रिसेप्टर (BCR) के साथ कोशिकाओं की उत्तेजना पर निर्धारित किया गया था ( चित्र 3क) और प्राथमिक CLL कक्ष ( चित्र3ठ)5,10. दोनों उदाहरणों में, अत्यधिक समृद्ध परमाणु और कोशिकाद्रव्यी भिन्नों की पीढ़ी को परमाणु अंश में लैमिन की लगभग अनन्य अभिव्यक्ति और साइटोप्लाज्मिक भिन्नों में जेड-टूबुलिन द्वारा दर्शाई गई थी। दोनों प्रकार के कक्ष में, FOXO1 अभिव्यक्ति NDC की तुलना में A$D8055 के साथ उपचार के बाद कोशिका द्रव्य में कम हो गया था, परमाणु डिब्बे में FOXO1 अभिव्यक्ति की वृद्धि के साथ, इस प्रकार प्रोटीन स्थानांतरण का प्रदर्शन (चित्र 3) . डेटा व्याख्या की व्यक्तिपरकता को दूर करने के लिए, पांच प्राथमिक CLL नमूनों से अलग-अलग इम्यूनोब्लॉट्स को उपकोशिकीय अंशों के भीतर मात्रा निर्धारित किया गया था (चरण 4; चित्र ाा्वित4क),प्रत्येक नमूने के लिए आंतरिक लोडिंग नियंत्रण के रूप में संबंधित नाभिकीय या कोशिकाद्रव्यी प्रोटीन का उपयोग करना, और फिर प्रत्येक अंश को अउत्तेजित (यूएस) कोई दवा नियंत्रण (एनडीसी) नियंत्रण को सामान्य करना, जैसा कि संकेत दिया गया है। परिणामी ग्राफ परमाणु और कोशिकाद्रव्यीय भिन्नों के बीच FOXO1 आंदोलन के रुझान को दर्शाता है, एजेडडी8055 के साथ कोशिकाद्रव्य में FOXO1 अभिव्यक्ति के स्तर को कम करने, जबकि साथ ही नाभिक में अभिव्यक्ति में वृद्धि. इसके अलावा, साइटोप्लाज्मिक FOXO1 अभिव्यक्ति में एक ऊंचाई बीसीआर क्रॉसलिंकिंग पर स्पष्ट है।

ट्यूब ट्यूब का नाम कक्ष/बीड्स Antigen फ्लोरोफोर
1 बेदाग कक्षों ना ना
2 एकल दाग मनका सीडी 5 FITC
3 एकल दाग मनका CD19 पीई-Cy7
4 एकल दाग मनका CD23 Apc
5 एकल दाग मनका CD45 एपीसी-साइ7
6 एकल दाग कक्षों व्यवहार्यता डीएपीआई
7 CLL दाग कक्षों CD5, CD19, CD23, CD45 और व्यवहार्यता FITC, पीई-Cy7, APC, APC-Cy7 और DAPI

तालिका 1: CLL कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री के लिए आवश्यक नमूना ट्यूबों के आदर्श सेट दिखा तालिका. प्रत्येक प्रयोग में प्राप्त परिणामों के सटीक विश्लेषण के लिए सभी उपयुक्त नियंत्रण शामिल होने चाहिए.

Figure 1
चित्र 1: समृद्ध CLL रोगियों के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण साजिश. एक व्यक्ति CLL रोगी के परिधीय रक्त से समृद्ध मोनोन्यूक्लियर-CLL कोशिकाओं FSC-A बनाम एसएससी-ए का उपयोग कर द्वार थे, और doubts तो FSC-A बनाम FSC-H (ए) का उपयोग कर बाहर रखा गया था. Unstained कोशिकाओं (ट्यूब 1) और मुआवजा नियंत्रण (ट्यूब 2-6) कोशिकाओं का पता लगाने और फ्लोरोसेंट चैनलों के बीच क्षतिपूर्ति करने के लिए प्रवाह cytometer स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया, इस प्रकार यह सुनिश्चित करना है कि फ्लोरोसेंट संकेतों को सही ढंग से पता लगाया गया. (ख)सीडी 19 और सीडी 5 फ्लोरोसेंट चैनलों में नकारात्मक दाग (बिना दाग वाली कोशिकाओं; ट्यूब 1) का एक उदाहरण है। लाइव (DAPI नकारात्मक) और CD45 सकारात्मक कोशिकाओं gated थे (सी) और CD19 के अनुपात+CD5+ (95.5%) और CD19+CD23+ (91.2%) DAPI के भीतर कक्ष-CD45+ जनसंख्या निर्धारित किया गया था (डी) कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: नाभिकीय/कोशिकाद्रव्यी प्रभाकरण का अनुकूलन। कोशिकाद्रव्यी और नाभिकीय भिन्नों, और पूरे सेल lysates (WCL), सेल छर्रों से तैयार किए गए थे (10 - 20 x 106 कोशिकाओं) सीएलएल सेल लाइन के (ए) MEC1 या(बी) प्राथमिक सीएलएल कोशिकाओं में वर्णित के रूप में रोगियों के परिधीय रक्त से समृद्ध चरण 3. कोशिकाद्रव्यी भिन्न (जैसा कि चरण 3.4 में वर्णित) तैयार करते समय उपकोशिकीय प्रभाजन का अनुकूलन अपर्णा अनुपात (1:20 से 1:60) की एक श्रेणी का उपयोग करके किया गया था। परिणामी नमूनों को प्रतिरक्षा-रोधी किया गया और डब्ल्यूसीएल के साथ सफल सेल प्रभाजन की पुष्टि करने के लिए एंटी-लेमिन ए/सी (न्यूक्लियर) और एंटी-जेड-टूबुलिन (साइटोप्लाज्मिक) एंटीबॉडी के साथ जांच की गई। आण्विक भार मार्कर दाग (एम) के बाईं ओर दिखाए जाते हैं। * सेल lysis के लिए इष्टतम डिटर्जेंट की स्थिति को इंगित करता है. (ग)उत्तेजना की अनुपस्थिति की उपस्थिति में नियंत्रण स्थितियों (एनडीसी) या औषध उपचार (8055) के साथ एमईसी 1 कोशिकाओं से परमाणु और कोशिकाद्रव्यी भिन्नों का प्रतिरक्षण (+ या - बीसीआर क्रॉसलिंकिंग)। Blots विरोधी Rbp1 सीटीडी (क्लोन 4H8; आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय subunit B1 पहचानने के साथ जांच की गई), विरोधी Lamin A/C, विरोधी-जेड-tubulin या विरोधी-जेड-tubulin (क्लोन GTU-88) एंटीबॉडी, subcellular भिन्न की पहचान करने के लिए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: उपकोशिकीय विखंडन CLL में नाभिक और कोशिका द्रव्य के बीच FOXO1 की समाप्ति को दर्शाता है. (क) एमईसी-1 कोशिकाओं और(बी) प्राथमिक सी एल एल कोशिकाओं का पूर्व इलाज 30 मिनट के लिए 100 एनएम एजेडडी8055 (8055) या अनुपचारित (एनडीसी) के साथ किया गया था और फिर बीसीआर को 1 एच या बाएं यूएस के लिए लगाया गया था। परमाणु और कोशिकाद्रव्यी भिन्न तो तैयार किए गए थे और इम्यूनोब्लाट. एंटी-लेमिन ए/सी (न्यूक्लियर) और एंटी-जेड-टूबुलिन (साइटोप्लाज्मिक) एंटीबॉडी के साथ जांच करके भिन्नीकरण की पुष्टि के बाद, एंटी-एफओ1 एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, दवा उपचार और बीसीआर लिगेशन दोनों के प्रभाव का मूल्यांकन किया गया था। एम आणविक वजन मार्कर इंगित करता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: मात्रात्मक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (डेन्सिटोमेट्री) का एक कार्य उदाहरण। (ए) डेन्सिटोमेट्री पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण सॉफ्टवेयर ऑनलाइन उपलब्ध का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था। संक्षेप में, विश्लेषण रिबन के भीतर, आयतों संकेत तीव्रता की गणना करने के लिए छवि में प्रोटीन बैंड के आसपास तैयार किए गए थे. चित्रित एक प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा एक CLL रोगी नमूने है कि कोशिका द्रव्य/ कोशिकाद्रव्यी और नाभिकीय भिन्नों को कोशिकाद्रव्यी (जेड-टूबुलिन) और परमाणु (लैमिन ए/सी) मार्करों की अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित किया जाता है। किसी दी गई स्थिति के लिए FOXO1 की सामान्य अभिव्यक्ति का विश्लेषण किए जा रहे अंश के आधार पर, $-Tubulin या Lamin A/C के लिए इसी संकेत द्वारा FOXO1 के लिए प्राप्त संकेत को विभाजित करके गणना की जा सकती है। सापेक्ष FOXO1 अभिव्यक्ति (अमेरिकी वाहन नियंत्रण के सापेक्ष), एक दिया सेलुलर अंश के अमेरिकी वाहन नियंत्रण के सामान्यीकृत FOXO1 अभिव्यक्ति द्वारा दिए गए हालत के सामान्यीकृत FOXO1 अभिव्यक्ति विभाजित करके गणना की जा सकती है. (बी)प्रत्येक सेलुलर अंश के भीतर यूएस-एनडीसी नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत कोशिकाद्रव्य (बाएं) या परमाणु (दाएं) अंशों में FOXO1 अभिव्यक्ति के स्तर को दर्शाने वाला ग्राफ। ग्राफ पर लाल बिंदु काम किया उदाहरण दिखाया गया है. यह डेटा FOXO1 अभिव्यक्ति में औसत गुना परिवर्तन से पता चलता है अमेरिका-एनडीसी की तुलना में - SEM. P मूल्यों दो पूंछ छात्रयुग्मित टी परीक्षण द्वारा निर्धारित किए गए थे। द ] 5 अलग-अलग CLL रोगी नमूने। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

प्रोटोकॉल वर्णित प्राथमिक CLL कोशिकाओं से परमाणु और कोशिकाद्रव्यी भिन्नों की पीढ़ी के लिए एक तेज और कुशल विधि प्रदान करता है, और सेल उत्तेजना पर परमाणु और कोशिकाद्रव्यी भिन्नों के बीच प्रोटीन की तस्करी के बाद परिमाणीकरण और दवा उपचार. प्रस्तुत किए गए डेटा विशिष्ट प्रोटीन की तस्करी का पता लगाने की क्षमता को दर्शाता है, उदाहरण के लिए, FOXO1, परमाणु और कोशिकाद्रव्यी भिन्नों के बीच, एक दोहरी TOR अवरोध करनेवाला के साथ उपचार पर A$D8055 की उपस्थिति में / ab')2 खंड उत्तेजना(चित्र 3 और चित्र 4)। व्यक्तिगत CLL रोगी नमूनों से पश्चिमी blots के परिमाणीकरण के साथ इन प्रयोगों युग्मन, उत्पन्न डेटा का उद्देश्य विश्लेषण सक्षम बनाता है और में प्रोटीन स्थानीयकरण में वैश्विक परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए वर्णित परख की मजबूती को दर्शाता है CLL कोशिकाओं रोगी सहगण से अलग (चित्र 4) . आंकड़ों से यह स्पष्ट है कि कोशिकाद्रव्यी अंशों में औसतन पांच रोगी नमूने महत्व के निकट पहुंच गए हैं। CLL रोगियों की नैदानिक विषमता को देखते हुए11, इन विश्लेषणों आमतौर पर बड़े रोगी सहगण पर किया जाएगा, और / विशिष्ट दवा उपचार के लिए कोशिकाओं.

प्रस्तुत डेटा प्रोटीन मार्करों है कि विशेष रूप से या तो कोशिका द्रव्य या परमाणु भिन्नों में रहते हैं चुनने के महत्व को प्रदर्शित करता है, के रूप में भिन्नीकरण की शुद्धता इन मार्करों द्वारा पुष्टि की जाएगी. साइटोप्लाज्मिक अंश पुष्टि के लिए जेड-ट्यूबुलिन को चुना गया था, और एक परमाणु मार्कर के रूप में Lamin A/ आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले अतिरिक्त प्रोटीन कोशिकाद्रव्यी अंश या ब्रज1 (SMARCA4), TFIID और RNA पॉलिमरेज II को परमाणु अंश शुद्धता के लिए4,5की पहचान करने के लिए जीएपीडीएच और जेड-टूबुलिन हैं। हालांकि, प्रोटीन है कि अत्यधिक विशिष्ट भागों में समृद्ध हैं चुनने के दौरान ध्यान रखा जाना चाहिए, और दोनों भागों में मौजूद नहीं (उदा., जेड-ट्यूबुलिन) (चित्र 2ब्)9. वास्तव में, GAPDH और actin जबकि आम तौर पर कोशिका द्रव्य प्रोटीन माना जाता है नाभिक के लिए स्थानीयकृत कर सकते हैं12,13, एक अंश मार्कर है कि जब उत्तेजना या उपचार स्थानांतरित नहीं करता है चुनने के महत्व पर प्रकाश डाला कोशिकाओं पर लागू होता है. इसके अलावा, यह पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है कि चुना प्रोटीन मार्कर उपकोशिकीय अंशकेतः के साथ WCL चलाकर ब्याज की कोशिका में व्यक्त किया जाता है.

दिखाए गए प्रतिनिधि प्रयोग में, प्रत्येक स्थिति (उत्तेजना/दवा उपचार) के लिए कुलाकोशिका कोशिकाओं की समान संख्या का उपयोग किया गया था, और उसके बाद भिन्नण नमूने तुरंत तैयार किए गए थे। भिन्नप्रोटीन/लेन के 10 डिग्री ग्राम लोड करने से ब्याज के प्रोटीन का पता लगाने के लिए पर्याप्त सामग्री उपलब्ध होती है। के रूप में इन नमूनों को केवल एक अल्पकालिक दवा उपचार और उत्तेजना लिया (अप करने के लिए 4 ज), यह माना गया था कि प्रोटीन स्तर प्रत्येक नमूने में ही रहेगा, और एक प्रोटीन परख नहीं किया गया था. हालांकि, अगर सेल उपचार बढ़ा रहे हैं (18 - 72 एच), कोशिकाओं में सेल मौत या प्रसार के स्तर काफी गुणवत्ता और निकाले गए प्रोटीन की मात्रा को बदल सकते हैं, दवा पर निर्भर / / प्रेरित नमूने. लंबी अवधि के दवा उपचार के लिए इन मामलों में, यह एक ब्रैडफोर्ड परख या समकक्ष का उपयोग कर प्रोटीन परिमाणीकरण बाहर ले जाने के लिए सलाह दी जाती है, पश्चिमी blotting से पहले यह सुनिश्चित करने के लिए प्रोटीन की एक ही राशि इम्यूनोब्लॉट के प्रत्येक लेन में चलाया जाता है. डिटर्जेंट की उपस्थिति विशिष्ट प्रोटीन assays14के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, इस हस्तक्षेप सेल अंश प्रोटीन नमूने को कम करके कम किया जा सकता है. इसके अलावा, रिक्त के रूप में पूरा lysis बफर का उपयोग करें, नमूनों में परीक्षण किया जा रहा है के रूप में एक ही कमजोर पड़ने का उपयोग.

यहाँ वर्णित निष्कर्षों के लिए सहायक साक्ष्य प्रदान करने के लिए, इननिष्कर्षोंके दृश्य को सक्षम करने के लिए CLL कोशिकाओं के भीतर FOXO1 के स्थान का विश्लेषण करने के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके समानांतर प्रयोग किए जा सकते हैं। इसके अलावा, उत्पन्न subcellular अंश भी आगे बहाव विश्लेषण में एंजाइम गतिविधि assays या proteomics विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि की समीक्षा के लिए डॉ नताशा मलिक को धन्यवाद देना चाहेंगे। इस अध्ययन को एएमएम (18003) को दिए गए रक्तवार परियोजना अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। FACS विश्लेषण सुविधाओं Howat फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया. MWM पॉल O'Gorman Lekaemia अनुसंधान केंद्र के दोस्तों से एक पीएचडी छात्र द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जेसी पॉल O'Gorman Lekaemia अनुसंधान केंद्र के दोस्तों द्वारा वित्त पोषित किया गया था और जेएच एक रक्तवार परियोजना अनुदान (18003) द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge Tubes Griener Bio one 616201
3 mL Pasteur Pipettes Griener Bio one 612398
12 mm x 75 mm FACS Tubes Elkay 2052-004
15 mL Tube Griener Bio one 188271
50 mL Tube Griener Bio one 227261
anti-CD5 FITC antibody BD Biosciences 555352 phenotypic surface marker
anti-CD19 PE Cy7 antibody BD Biosciences 557835 phenotypic surface marker
anti-CD23 APC antibody BD Biosciences 558690 phenotypic surface marker
anti-CD45 APC Cy7 antibody BD Biosciences 557833 phenotypic surface marker
anti-β-Tubulin antibody Cell Signaling 2146 cytoplasmic marker
anti-γ-Tubulin Mouse antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T5326
anti-FoxO1 (C29H4) Rabbit antibody Cell Signaling 2880
anti-Lamin A/C antibody Cell Signaling 2032 nuclear marker
anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling 7076 Secondary antibody
anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling 7074 Secondary antibody
anti-Rpb1 CTD antibody (clone 4H8) Cell Signaling 2629 nuclear marker
BDFACS Canto II BD Biosciences By Request Flow Cytometer
DAPI Solution BD Biosciences 564907 live/dead discriminator
DMSO Sigma D2650
EDTA Sigma EDS
Fetal Bovine Serum Thermofisher 10500064
GraphPad Prism 6 GraphPad Software Software
Histopaque1077 density gradient media Sigma H8889
HyperPAGE 10 - 190 kDa protein marker Bioline BIO-33066 Molecular weight marker
Image Studio Lite (version 5.2.5) LI-COR www.licor.com Software
Labnet VX100 Fisher Scientific Vortex
Nucelar Extract Kit Active Motif 40010
OneComp eBeads Thermofisher 01-111-42
Trypan Blue Solution Thermofisher 15250061
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26619 Molecular weight marker
PBS Tablets Fisher Scientific BR0014G
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail Stem Cell Technologies 15064
Sigma 3-16P SciQuip Centrifuge
Sigma 1-15PK SciQuip Centrifuge

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References

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  14. Friedenauer, S., Berlet, H. H. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry. 178, 263-268 (1989).

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कैंसर अनुसंधान अंक 152 परमाणु / साइटोप्लाज्मिक प्रभाजन क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया सेलुलर संकेतन दवा उपचार FOXO प्रोटीन तस्करी
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Hay, J., Moles, M. W., Cassels, J.,… More

Hay, J., Moles, M. W., Cassels, J., Michie, A. M. Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking. J. Vis. Exp. (152), e60426, doi:10.3791/60426 (2019).

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