Summary
Detta protokoll möjliggör optimering och efterföljande effektiv generering av nukleära och cytoplasmiska fraktioner från primära kroniska lymfocytiska leukemiceller. Dessa prover används för att bestämma protein lokalisering samt förändringar i protein handel som sker mellan kärn-och cytoplasmiska fack vid cell stimulering och läkemedelsbehandling.
Abstract
Kärn exporten av makromolekyler är ofta avreglerad i cancerceller. Tumör suppressor proteiner, såsom p53, kan göras inaktiva på grund av avvikande cellulära lokalisering störa deras verkningsmekanism. Överlevnaden för kroniska lymfatisk leukemi (KLL) celler, bland andra cancerceller, biträds av avregleringen av kärnkraft till cytoplasmiska shuttling, åtminstone delvis genom avreglering av transport receptor XPO1 och den konstitutiva aktiveringen av PI3K-medierade signalvägar. Det är viktigt att förstå den roll som enskilda proteiner i samband med deras intracellulära plats för att få en djupare förståelse för den roll som sådana proteiner i patobiologi av sjukdomen. Dessutom kommer identifiering av processer som ligger bakom cellstimulering och verkningsmekanismen för specifika farmakologiska hämmare, i samband med subcellulär protein handel, att ge en mer heltäckande förståelse av mekanismen för Åtgärder. Det protokoll som beskrivs här möjliggör optimering och efterföljande effektiv generering av nukleära och cytoplasmiska fraktioner från primära kroniska lymfocytiska leukemiceller. Dessa fraktioner kan användas för att bestämma förändringar i protein handeln mellan de nukleära och cytoplasmiska fraktioner på cell stimulering och läkemedelsbehandling. Uppgifterna kan kvantifieras och presenteras parallellt med Immunofluorescerande bilder, vilket ger robusta och kvantifierbara data.
Introduction
Transporten av makromolekyler mellan kärnan och cytoplasman har länge etablerats för att spela en nyckelroll i normal cellulär funktion och är ofta avreglerad i cancerceller1,2. En sådan avreglering kan bero på överuttryck/mutation av proteiner som kontrollerar kärn exporten. Ett sådant protein Exportin-1 (XPO1), är en transport receptor som exporterar > 200 nukleär export signal (NES)-innehållande proteiner i cytoplasman från Nucleus2. XPO1-Cargos inkluderar p53, foxo familjemedlemmar och IB, bidrar till deras inaktivering genom att hämma deras verkningsmekanism1,2,3. Ytterligare protein mislocalization kan inträffa när mikromiljö signaler inkräkta på cancerceller, vilket leder till aktivering av intracellulära signalvägar såsom fosfatidyl-inositol-3-Kinas (PI3K)/akt väg, vilket resulterar i inaktivering av foxo familjemedlemmar och efterföljande export från Nucleus4,5. Sådan mislokalisering av tumör suppressor proteiner har varit inblandad i utvecklingen av ett antal hematologiska och solida tumörer1,2,6.
Utvecklingen av små molekyler hämmare för klinisk användning i hematologiska maligniteter (akut myeloisk leukemi (AML)/KLL), som binder till och selektivt hämma XPO1 funktion, understryker vikten av att utveckla lämpliga tekniker för att hantera effekterna av farmakologiska medel på shuttling av proteiner mellan kärn-och cytoplasmiska fack6,7,8. Imaging tekniker har avancerat avsevärt möjliggöra identifiering av proteiner i subcellulära fack vid extern stimulering av läkemedelsbehandlingar, men vikten av robusta och stödjande parallella tekniker är avgörande för att tillförlitligt informera en vetenskaplig publik om giltigheten av ett resultat.
Vilande lymfocyter och maligna CLL-B-celler isolerade från patientens blodprov utgör en utmaning i generering av nukleära och cytoplasmiska fraktioner på grund av den höga nukleära: cytoplasmiska förhållandet. Optimering av experimentella förhållanden för att generera robusta och pålitliga experimentella data är naturligtvis avgörande för att planera framtida experimentella program. Den metod som beskrivs här möjliggör kvantifiering av proteiner i nukleära och cytoplasmiska fraktioner och avgör hur dessa proteiner kan påverkas av cellulär stimulering och/eller läkemedelsbehandling.
Protocol
Användningen av primära prover från KLL-patienter som beskrivs här har godkänts av West of Scotland Research Ethics service, NHS Greater Glasgow och Clyde (UK) och allt arbete utfördes i enlighet med de godkända riktlinjerna.
1. isolering av KLL-celler från patient blodprov
-
Perifera blodprov från tidigare samtyckt KLL patienter tas emot från kliniken i EDTA bloduppsamlingsrör, åtföljd av White cell Count (WCC). Rengör perifert blod KLL prover enligt WCC. För WCC < 40 x 106 celler/ml, gå vidare till steg 1.1.1; för WCC ≥ 40 x 106 celler/ml, gå vidare till steg 1.1.2.
- Häll innehållet i alla EDTA blod rör i en 50 mL koniskt centrifugrör och tillsätt 50 μL av Human B cell berikning cocktail per 1 mL blod. Inkubera i rumstemperatur (RT) under 20 min. Fortsätt till steg 1.1.2.
- Späd provet med ett förhållande på 1:1 med RT CLL tvättbuffert (fosfatbuffrad Salin (PBS), 0,5% fetalt bovint serum (FBS) och 2 mM EDTA).
- Alikvot-tonings medium i ett koniskt centrifugrör för provet (10 mL i ett 50 mL-rör för 30 mL prov eller 4 mL i ett 15 mL-rör för 10 mL prov).
- Noggrant skikt provet ovanpå densitetsgradienten media och centrifugera vid 400 x g för 30 min vid RT.
Anmärkning: Säkerställ att centrifugen är vid RT innan proverna placeras i centrifugen som en temperaturförändring leder till dålig anrikning av mononukleära celler och stänger av bromsen på centrifugen, eftersom plötslig bromsning kan störa vätske gränssnittet. - Försiktigt skörda det vita lagret av mononukleära celler som samlar in vid gränssnittet av densitetsgradienten media och CLL tvättbuffert, i en ny 50 mL koniskt centrifug röret med en plast Pasteur pipett.
- Tillsätt 40 ml CLL-tvättbuffert till det isolerade enskiktslager för att tvätta cellerna och centrifugera vid 300 x g i 10 minuter vid RT.
- Kassera supernatanten, Omsuspendera pelleten genom att snärta i botten av röret, upprepa sedan tvättsteget som beskrivs i steg 1,5.
- Kassera supernatanten, Omsuspendera pelleten enligt beskrivningen i steg 1,6, sedan Omsuspendera pelleten i en inställd volym CLL tvättbuffert (upp till 40 mL, beroende på storleken på cellpelleten).
- Räkna cellerna med trypan blå och en hemocytometer. Fortsätt sedan till flödescytometri för att kontrollera renheten hos KLL-celler.
Anmärkning: I detta skede kan KLL-cellerna odlas vid en koncentration av 10 x 106 celler/ml i media för att användas i experiment, och/eller kryopreserverad i 10% dimetylsulfoxid (DMSO)/FBS för framtida arbete vid koncentrationer upp till 100 x 106 celler/injektionsflaska.
2. flödescytometri av KLL-celler
- Etikett 12 mm x 75 mm rundbottnad polystyrenrör enligt beskrivningen i tabell 1.
- I rör 2 – 5, Lägg en droppe kompensations pärlor och förvara på isen. Tillsätt 1 μL av lämplig antikropp (anti-CD5, CD19, CD23 eller CD45, enligt tabell 1) till rören 2 – 5, och inkubera på is under 20 min, skyddat från ljus genom att placera aluminiumfolie över isskopan.
Anmärkning: Dessa rör fungerar som kompensationskontroller för inställning av flödescytometri-mallen. -
Lägg upp till 1 x 106 KLL-celler i rören 1, 6 och 7, tillsätt 2 ml FACS-buffert (PBS + 2% FBS) till varje tub och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid RT för att tvätta cellerna. Kassera supernatanten och förvara rören som innehåller cell pellets på isen.
- Omsuspendera cell pellets och Tillsätt lämplig kombination av antikroppar mot cellerna i tub 7 enligt anvisningarna i tabell 1, i en slutlig volym på 100 μl med FACS-buffert. Antikroppar används i lämplig koncentration enligt tillverkarens riktlinjer.
- Omsuspendera cell pellets i rör 2 och 6 i 100 μL av FACS-bufferten.
- Inkubera cellerna på isen, vid sidan av de färgade pärlorna i rören 2 – 5, skyddade från ljus i 20 min.
- Efter inkuberingen, tillsätt 2 mL FACS-buffert till alla rören och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid RT för att tvätta cellerna. Kassera supernatanten och Omsuspendera pärlorna/cell pelletarna genom att försiktigt snärta rören.
- Omsuspendera rören 1-5 i 100 μL av FACS-bufferten och placera på isen tills den är klar att analyseras på flödescytometern.
- Späd DAPI-lösningen till 0,05-0,2 μg/mL i FACS-bufferten omedelbart före användning. Den optimala koncentrationen kan variera, och titrering rekommenderas.
- Omsuspendera rören 6 och 7 med 100 μL utspädd DAPI-lösning och inkubera rören på is i minst 5 minuter så att cellerna kan färga.
Anmärkning: Ingen ytterligare tvättning krävs eftersom DAPI måste finnas i bufferten för att döda celler ska förbli märkta. När DAPI har lagts till, celler måste analyseras på flödescytometern inom 4 h. - Analysera celler med hjälp av en flödescytometer.
3. beredning av subcellulära fraktioner från KLL-celler
Anmärkning: När du planerar den experimentella uppsättningen, inkludera en brunn av ostimulerade/obehandlade celler från vilka hela cell extraktet kan genereras.
- Utför den önskade stimulering och/eller läkemedelsbehandling av MEC1 CLL cellinjer eller isolerade primära KLL celler med 10 – 20 x 106 celler/skick. Celler kommer sedan att användas för subcellulär fraktionering (steg 3,4 & 3,5) eller för att generera hel cells extrakt (steg 3,6).
- Beredning av lösningar/rör: Förbered alla lösningar/buffertar nyligen på dagen för fraktionering, innan cellerna skördas. Förvara lösningarna på is tills de behövs och Använd inom 4 timmar efter beredning.
- Lösning av PBS/fosfatashämmare: Bered fosfatashämmare i PBS genom att späda fosfatashämmare 1:20 i 1x PBS (dvs. 0,5 mL fosfatashämmare i 9,5 mL 1x PBS).
Anmärkning: Se till att fosfatashämmare inte har fälls ut. Om en fällate finns, Värm till 50 ° c i 10 min. - Hypotonisk buffert: Förbered 1x hypotonisk buffert genom att göra en 1:10 utspädning av 10X hypotonisk buffert i destillerat vatten (dvs., 50 μL av 10X hypotonisk buffert i 450 μ L av dH2O).
- 10 mm Ditiotreitol (dTT): Förbered 10 mm DTT genom att göra en 1:100 utspädning av 1m DTT med destillerat vatten (dvs. 10 μl 1 M DTT i 990 μl DH2O).
Anmärkning: DTT är mycket labila så Förbered detta färskt varje gång. Undvik upprepade frysnings-/Tina-cykler. - Komplett lyseringsbuffert: Bestäm hur mycket buffert som krävs för varje experiment. Varje prov kräver 50 μL komplett lyseringsbuffert, så Tillsätt 5 μL 10 mM DTT (steg 3.2.3) till 44,5 μL lyseringsbuffert och tillsätt sedan 0,5 μL av proteashämmare cocktail. Det här beloppet kan skalas upp beroende på antalet exempel i experimentet.
- Märk fyra uppsättningar med 1,5 ml mikrofugrör-rör för varje stimulering och/eller läkemedelsbehandling för de nyligen stimulerade cellerna (steg 3,3), de nyligen genererade cytoplasmiska fraktionerna (steg 3.4.3), de nyligen genererade nukleära fraktionerna (steg 3.5.3) och hela cellen celllysat (steg 3.6.3). Pre-Chill dessa mikrofugrör rör på is tills det behövs.
- Lösning av PBS/fosfatashämmare: Bered fosfatashämmare i PBS genom att späda fosfatashämmare 1:20 i 1x PBS (dvs. 0,5 mL fosfatashämmare i 9,5 mL 1x PBS).
- Överför cellerna till individuellt märkta 1,5 ml mikrofugrör rör och pellet genom centrifugering vid 200 x g i 5 min vid 4 ° c. Avlägsna supernatanten och Omsuspendera cellerna i 1 mL iskall PBS/fosfatashämmare (steg 3.2.1). Pelleten cellerna genom centrifugering vid 200 x g i 5 min vid 4 ° c. Ta bort supernatanten och hålla cell pellets på is.
- Beredning av cytoplasmiska fraktioner: Försiktigt Omsuspendera cell pellets som ska användas för subcellulär fraktionering i 50 μL 1x hypotonisk buffert (steg 3.2.2). Inkubera cellerna på isen i 15 minuter så att cellerna kan svällas.
Anmärkning: Volymen av hypotonisk buffert som används kan ökas empiriskt beroende på cell nummer.- Tillsätt 0,8-2,5 μL (1:20 till 1:60) av tvättmedel i varje prov och virvel på den högsta inställningen för 10 s.
- För att bestämma den optimala koncentrationen av tvättmedel för att använda för en specifik celltyp för att isolera nukleära och cytoplasmiska fraktioner, utföra en tvättmedel lutning initialt. En räckvidd på 1:20 till 1:60 (dvs. 2,5 μL till 0,8 μL av tvättmedel till 50 μL hypotonisk buffert) bör vara adekvat.
Anmärkning: om volymen av hypotonisk buffert i steg 3,4 justeras, se till att lämplig tvättmedels kvot bibehålls. - Kontrollera cell lysis genom att observera celler med hjälp av ett faskontrastmikroskop före och efter tillsats av rengöringsmedel. Hela celler verkar större med en tät, mörk kärna. Cytoplasman kommer att visas som en ljus Gloria runt kärnan.
Anmärkning: Lämplig Lys bekräftas ytterligare genom att använda Western blotting för att analysera specifika proteiner inom de lyserade fraktioner som genereras från tvättmedlet gradient.
- För att bestämma den optimala koncentrationen av tvättmedel för att använda för en specifik celltyp för att isolera nukleära och cytoplasmiska fraktioner, utföra en tvättmedel lutning initialt. En räckvidd på 1:20 till 1:60 (dvs. 2,5 μL till 0,8 μL av tvättmedel till 50 μL hypotonisk buffert) bör vara adekvat.
- Centrifugera proverna vid 4 ° c 14 000 x g för 30 s när de är lyserade.
- Överför försiktigt supernatanten till ett förkyld, märkt mikrofugrör-rör. Denna cytoplasmiska fraktion kan lagras vid-80 ° c tills krävs för ytterligare analys. Den kvarvarande pelleten innehåller den nukleära fraktionen (steg 3,5).
Anmärkning: Undvik upprepade frysnings-/Taw-cykler för proverna.
- Tillsätt 0,8-2,5 μL (1:20 till 1:60) av tvättmedel i varje prov och virvel på den högsta inställningen för 10 s.
- Beredning av nukleära fraktioner: Omsuspendera varje kärnpelletpellet i 50 μL komplett lyseringsbuffert (steg 3.2.4) genom att Pipettera upp och ner.
Anmärkning: Volymen av fullständig lyseringsbuffert kan justeras empiriskt enligt start cells numret.- Tillsätt 2,5 μL rengöringsmedel för att lösgöra proteiner som är förknippade med kärn membranet och Vortex på den högsta inställningen i 10 s. Inkubera proverna på is i 30 min.
- Vortex på den högsta inställningen för 30 s, sedan Centrifugera proverna på 14 000 x g för 20 min vid 4 ° c.
- Överför supernatanten till ett förkyld, märkt mikrofugrör-rör. Denna nukleära fraktion kan lagras vid-80 ° c tills krävs för ytterligare analys.
Anmärkning: Undvik upprepade frysnings-/Taw-cykler för proverna.
- Beredning av hela cell celllysat (WCL) från KLL celler
Anmärkning: Beredningen av hela cell extraktet kan utföras samtidigt som framställningen av de nukleära fraktionerna (steg 3,5).- Omsuspendera hela cell extraktet pellets i 100 μL komplett lyseringsbuffert (preparerade i steg 3.2.4) genom pipettering upp och ner, tillsätt sedan 5 μL rengöringsmedel för att säkerställa fullständig cell Lys. Inkubera proverna på is i 30 min.
- Vortex på den högsta inställningen för 30 s, sedan Centrifugera proverna på 14 000 x g för 20 min vid 4 ° c.
- Överför supernatanten till ett förkyld microfugetub. Hela cellen lysate kan lagras vid-80 ° c tills krävs för ytterligare analys.
Anmärkning: Undvik upprepade frysnings-/Taw-cykler för proverna.
4. nedströms analys av subcellulära fraktioner
Anmärkning: I detta protokoll, analys av de genererade cell fraktioner utfördes av Western blotting med hjälp av standardprotokoll, lastning lika cell nummer/Lane (motsvarande ~ 10 μg protein) för nukleära och cytoplasmiska fraktioner.
- Kvantifiering av protein handeln mellan nukleära och cytoplasmiska fraktioner: Utför kvantitativ Western blot-analys genom kvantifiering av signalintensitet eller densitometri med hjälp av fritt tillgängliga program från Western blot-analys.
- Importera bilder: Western blot-bilder som genereras från olika utvecklingsinstrument måste importeras som JPG-, PNG-eller TIFF-filer. Ett 16-bitars djup RAW-fil rekommenderas. Om du vill importera en bild klickar du på programikonen och håller muspekaren över importen. Klicka sedan på bilder från tredje part. Markera bildfilen och klicka på Öppna.
- Visar bilden: I menyfliken bild klickar du på knappen Välj i gruppen Visa . Dialogrutan Justera bildskärm öppnas för att aktivera ytterligare justeringar om det behövs. Implementera ytterligare förbättringar, inklusive ljusstyrka eller kontrast , med hjälp av de justerbara skjutreglagen på fliken bild luts . Använd fliken kurvor för finare justeringar.
- Data analys (kanal Avmarkering): Klicka på menyfliken analys. Om du bara vill analysera en kanal avmarkerar du den eller de kanaler som inte analyseras. Klicka på en kanals Visa inte Kanalminiatyr i bilden LUTs, vilket innebär att endast önskad kanal visas. Bilder som importeras som JPG-, PNG-eller TIFF-filer kan kräva Avmarkering av flera oönskade RGB-kanaler.
-
Lägga till former: Om du vill kvantifiera signalintensiteten klickar du på Lägg till rektangel för att lägga till en rektangel i bilden. Klicka på mitten av en funktion (t. ex. ett protein band) för att placera en rektangel runt den. Du kan också rita en form manuellt genom att välja Rita rektangel. När du har lagt till alla önskade former klickar du på Välj för att returnera markören till markeringsverktyget.
Anmärkning: Lägg till flera former i en logisk ordning, eftersom data sorteras efter ett ID-nummer som genereras sekventiellt. -
Bakgrund subtraktion: Om du vill subtrahera bakgrundsbrus klickar du på den första knappen i gruppen bakgrund och väljer median på rullgardinsmenyn. Ange kantbredden till 3 i bakgrunds dialogen och välj de segment som ska användas för bakgrunds beräkningen. När du väljer vilka segment som ska användas väljer du segment som bäst representerar bildens bakgrund.
Anmärkning: Bakgrundsbrus kan påverka signalkvantifiering, så det måste subtraberas för att korrekt beräkna signalen från de former av intresse. -
Trim-signal och trim-bakgrund-tillval: Filer som importeras i JPG, PNG eller TIFF-format kan uppvisa pixelmättnad: markerade/ljusa områden inom ett protein band. Trim signal och trim bakgrund (BKGND) tar bort mättade pixlar från analys. Om du vill visa dessa värden lägger du till trim-signalen och Beskär BKGND till en tabell genom att klicka på knappen kolumner till höger om tabellvyn.
Anmärkning: Pixelmättnad kan leda till opålitlig kvantifiering. Mättade pixlar kan bara tas bort om färre än 5% av pixlarna i en form är mättade.
-
Lägga till former: Om du vill kvantifiera signalintensiteten klickar du på Lägg till rektangel för att lägga till en rektangel i bilden. Klicka på mitten av en funktion (t. ex. ett protein band) för att placera en rektangel runt den. Du kan också rita en form manuellt genom att välja Rita rektangel. När du har lagt till alla önskade former klickar du på Välj för att returnera markören till markeringsverktyget.
- Exportera data: Klicka på fliken former ovanför tabellen. För densitometri krävs värden i signal kolumnen. Signal är summan av pixelintensitetsvärden (totalt) för en form minus produkten från BKGND och området. Klicka på rapport knappen. Klicka på Spara som eller Starta kalkylblad.
Signal = totalt – (BKGND x område)
Anmärkning: På fliken former finns en tabell med kvantitativa värden, inklusive signal, total, Area och Bkgrnd. - Kvantifiera proteinuttryck: I det sparade kalkylbladet, beräkna normaliserat uttryck av proteinet av intresse för varje körfält eller variabel genom att dividera den erhållna signalen för proteinet av intresse genom signalen för motsvarande protein lastning kontroll band.
Anmärkning: Jämförelser mellan de mängder av ett normaliserat protein av intresse över nukleära och cytoplasmiska fraktioner kan inte jämföras direkt på grund av de olika lastning kontroller som används för att skilja nukleära och cytoplasmiska fraktioner. Jämförelser inom enskilda fraktioner, till exempel efter läkemedelsbehandling, är emellertid lämpliga. - Exportera bild för publicering eller presentation: Klicka på fliken bilder ovanför tabellen och klicka sedan på den bild som ska exporteras. Om du använder bilden för en bildpresentation eller andra digitala format, klicka på programikonen, Hovra över export och klicka på bilden för digitala medier. Spara bilden som en JPG-, PNG-eller TIFF-fil efter behov.
Representative Results
Vid planering av experiment på primära KLL-celler, om analyser kräver ett stort antal celler (> 50 x 106 celler), det finns en preferens att använda nyligen isolerade KLL-celler, snarare än kryopreserverade celler som kräver upptining, men detta är inte alltid Möjligt. Detta beror på att frysa/Tina processen kan resultera i döden av upp till 50% av KLL celler, även om detta är prov beroende. Berikning av KLL-celler med en WCC-> 40 x 106/ml med densitetscentrifugering enligt beskrivningen här (steg 1,3 – 1,5) möjliggör en hög cell återhämtning med hög renhet (≥ 95%) av primära KLL-celler. I det visade provet, den WCC = 177 x 106/ml: från en 30 ml blodprov 5 x 109 celler återfanns, vilket motsvarar en cell avkastning på 94% av totala celler. Analys av detta prov med flödescytometri visade en renhet av KLL-celler av > 95% som indikeras av Dual yta uttrycket av KLL cell markörer CD19 och CD5 efter gating på FSC/SSC, enstaka celler som var DAPI negativa (livskraftiga celler) (figur 1).
Optimering av det subcellulära fraktioneringsförfarandet utfördes med hjälp av en rad olika tvättmedels kvoter (1:20 till 1:60) under beredningen av cytoplasmiska fraktionen (steg 3,4). Därefter var de nukleära fraktionerna och WCLs beredda (steg 3,5 respektive 3,6). Immunoblots utfördes på de resulterande fraktionerna av CLL-celllinjen MEC1 (figur 2a) och primära KLL-celler (figur 2B). De blotting var sonderade för fraktions markörer Lamin a/C (nukleära, 74/63 kDa) och β-tubulin (cytoplasmiska; 55 kDa) för att bekräfta lyckad cellfraktionering. Fraktioneringen indikerar att den optimala tvättmedels nivån för MEC1 celler är en 1:60 utspädning (figur 2a), jämfört med en 1:30 utspädning som är optimal för primära KLL-celler (figur 2B), vilket indikeras av en anrikning av kärn protein och brist på cytoplasmiska proteiner i fraktioner och vice versa. WCLs representerar det totala proteinet och fungerar som en positiv kontroll för antikroppar som används för att avsöka de subcellulära fraktioner. Det är viktigt att välja lämpliga proteiner som fraktions markörer: figur 2C visar Immunoblots av nukleära/cytoplasmiska fraktioner som framställts från MEC1 celler där RNA-polymeras II (Rpb1 CTD; 250 kDa) och Lamin A/c har utplånats som markörer för nukleära fraktioner, medan β-tubulin och γ-tubulin (50 kDa) användes som cytoplasmiska markörer. Det är tydligt att γ-tubulin är berikat i cytoplasman men uttrycket är tydligt i kärnan, som visats tidigare9.
När experimentella förhållanden har optimerats kan ett experiment utföras. I exemplen som visas var den subcellulära lokaliseringen av FOXO1 i nukleära och cytoplasmiska fraktioner fastställd vid stimulering av celler med B-cellantigen-receptorn (BCR) i närvaro eller frånvaro av den dubbla mTORC1/2-hämmaren AZD8055, i MEC1 celler ( Figur 3a) och primära KLL-celler (figur 3B)5,10. I båda exemplen uppnåddes generering av höganrikade nukleära och cytoplasmiska fraktioner som indikeras av det nästan uteslutande uttrycket av Lamin i den nukleära fraktionen och β-tubulin i cytoplasmiska fraktioner. I båda celltyperna, FOXO1 uttryck reducerades i cytoplasman efter behandling med AZD8055 jämfört med NDC, åtföljd av en ökning av FOXO1 uttryck i kärnkrafts facket, vilket visar protein flyttning (figur 3). För att undanröja subjektivitet vid data tolkning kvantifierades enskilda Immunoblots från fem primära KLL-prover inom subcellulära fraktioner (steg 4; Figur 4A), med hjälp av respektive nukleära eller cytoplasmiska proteiner som interna lastnings kontroller för varje prov, och sedan normalisera varje fraktion till den OSTIMULERADE (US) ingen narkotikakontroll (NDC) kontroll, som anges. Den resulterande grafen visar trender FOXO1 rörelse mellan nukleära och cytoplasmiska fraktioner, med AZD8055 minska nivåerna av FOXO1 uttryck i cytoplasman, samtidigt öka uttrycket i kärnan. Dessutom, en höjd i cytoplasmiska FOXO1 uttryck är uppenbar vid BCR crosslinking.
| Tube | Tube namn | Celler/pärlor | Antigen | Fluorophore |
| 1 | Ofärgade | Celler | Na | Na |
| 2 | Enda fläck | Pärlor | CD5 | Fitc |
| 3 | Enda fläck | Pärlor | CD19 | PE-Cy7 |
| 4 | Enda fläck | Pärlor | CD23 | Apc |
| 5 | Enda fläck | Pärlor | CD45 | APC-Cy7 |
| 6 | Enda fläck | Celler | Livskraft | DAPI |
| 7 | KLL fläck | Celler | CD5, CD19, CD23, CD45 & lönsamhet | FITC, PE-Cy7, APC, APC-Cy7 & DAPI |
Tabell 1: tabell som visar den idealiska uppsättningen provrör som krävs för flödescytometri av KLL-celler. Varje experiment måste innehålla alla lämpliga kontroller för korrekt analys av de erhållna resultaten.
Figur 1: representativ flödescytometrianalys av anrikade KLL-patienter. Mononukleära KLL-celler som berikats från perifert blod från en individuell KLL-patient var gated med FSC-a kontra SSC-a, och dubletter exkluderades sedan med FSC-a vs. FSC-H (a). Ofärgade celler (rör 1) och kompensationskontroller (rör 2-6) användes för att ställa in flödescytometern för att detektera celler och kompensera mellan de fluorescerande kanalerna, vilket säkerställt att fluorescenssignalerna detekterades korrekt. (B) ett exempel på negativ färgning (ofärgade celler, tub 1) i CD19-och CD5-fluorescenskanalerna. Live (DAPI Negative) och CD45 positiva celler var gated (C) och andelen CD19+CD5+ (95,5%) och CD19+CD23+ (91,2%) celler inom populationen DAPI-CD45+ bestämdes (D). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: optimering av nukleär/cytoplasmisk fraktionering. Cytoplasmiska och nukleära fraktioner, och hela cellen celllysat (WCL), bereddes från cell pellets (10-20 x 106 celler) av CLL-celllinjen (a) MEC1 eller (B) primära KLL-celler berikats från perifert blod av patienter som beskrivs i Steg 3. Optimering av den subcellulära fraktioneringen utfördes med hjälp av en rad olika diskmedels förhållanden (1:20 till 1:60) vid beredning av cytoplasmiska fraktionen (enligt beskrivningen i steg 3,4). De resulterande proverna var immunoblotted och sonderade med anti-Lamin a/C (nukleär) och anti-β-tubulin (cytoplasmiska) antikroppar för att bekräfta framgångsrik cellfraktionering vid sidan av WCL. Molekylvikt markörer visas till vänster om blot (M). * indikerar optimala tvättmedels förhållanden för cell Lys. C) immunoblot av nukleära och cytoplasmiska fraktioner från MEC1-celler med kontroll tillstånd (NDC) eller läkemedelsbehandling (8055) i närvaro av frånvaro av stimulering (+ eller – BCR crosslinking respektive). Blots var sonderade med anti-Rbp1 CTD (klon 4h8; erkänna RNA-polymeras II subenhet B1), anti-Lamin A/C, anti-β-tubulin eller anti-γ-tubulin (klon GTU-88) antikroppar, att identifiera subcellulära fraktioner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: subcellulär fraktionering demonstrerar shuttling av FOXO1 mellan kärnan och cytoplasman i KLL. (A) MEC-1-celler och (B) primära KLL-celler förbehandlats i 30 minuter med 100 nm AZD8055 (8055) eller lämnas obehandlad (NDC) enligt indikationen och sedan BCR var och ligaturer för 1 h eller lämnade oss. Nukleära och cytoplasmiska fraktioner var sedan förberedda och immunoblotted. Efter bekräftelse av fraktionering genom sondering med anti-Lamin A/C (nukleär) och anti-β-tubulin (cytoplasmiska) antikroppar, utvärderades effekten av både läkemedelsbehandling och BCR-ligering på FOXO1 proteinuttryck, med hjälp av en anti-FOXO1 antikropp. M indikerar molekylvikt markör. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: ett arbetat exempel på kvantitativ Western blot-analys (densitometri). (A) densitometri utfördes med hjälp av Western blot analysprogramvara tillgänglig online. Kortfattat, inom analys bandet, rektanglar drogs runt protein band i bilden för att beräkna signalintensitet. Avbildad är densitometri av en representativ Western blot bild av en KLL patientprover som genomgick cytoplasmiska/nukleär fraktionering. Cytoplasmiska och nukleära fraktioner kännetecknas av uttrycket av cytoplasmiska (β-tubulin) och nukleära (Lamin A/C) markörer. Normaliserat uttryck av FOXO1 för ett givet villkor kan beräknas genom att dividera den signal som erhålls för FOXO1 med motsvarande signal för β-tubulin eller Lamin A/C, beroende på vilken fraktion som analyseras. Relativ FOXO1 uttryck (i förhållande till amerikanska fordonskontroll), kan beräknas genom att dividera normaliserade FOXO1 uttryck för ett givet villkor genom det normaliserade FOXO1 uttrycket av den amerikanska fordonskontrollen av en given cell fraktion. (B) diagram som visar FOXO1 uttrycks nivåer i cytoplasmiska (vänster) eller nukleära (höger) fraktioner normaliserade till US-NDC kontroll inom varje cell fraktion. Den röda pricken på grafen är det fungerade exemplet som visas. Dessa data visar den genomsnittliga vik förändringen i FOXO1 uttryck jämfört med US-NDC ± SEM. P -värden bestämdes av tvåsidiga studenter Parade t -test. n = 5 individuella KLL patientprover. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det beskrivna protokollet ger en snabb och effektiv metod för generering av nukleära och cytoplasmiska fraktioner från primära KLL-celler, och efterföljande kvantifiering av protein handel mellan nukleära och cytoplasmiska fraktioner vid cellstimulering och läkemedelsbehandling. De data som presenteras visar förmågan att upptäcka handel med specifika proteiner, till exempel FOXO1, mellan de nukleära och cytoplasmiska fraktioner, vid behandling med en dual mTOR hämmare AZD8055 i närvaro/frånvaro av BCR tvärbindning genom F ( AB ')2 fragment stimulering (figur 3 och figur 4). Koppling dessa experiment med kvantifiering av västerländska blotting från enskilda KLL patientprover, möjliggör objektiva analyser av de data som genereras och visar robustheten av analysen beskrivs för att kvantifiera globala förändringar i protein lokalisering i CLL-celler som isolerats från patient kohorter (figur 4). Det framgår av uppgifterna att ett genomsnitt av fem patientprover i cytoplasmiska fraktioner nådde nära betydelse. Med tanke på den kliniska heterogeniteten hos KLL-patienter11, skulle dessa analyser normalt utföras på större patient kohorter, och/eller fokuserat på specifika prognostiska undergrupper av patienter för att få en fylligare förståelse för cellulär respons av KLL celler till specifika läkemedelsbehandlingar.
De uppgifter som presenteras visar vikten av att välja protein markörer som uteslutande vistas i antingen cytoplasmiska eller nukleära fraktioner, som renhet av fraktionering kommer att bekräftas av dessa markörer. β-tubulin valdes för att bekräfta cytoplasmiska fraktion och Lamin A/C som en nukleär markör. Ytterligare proteiner som vanligen används är GAPDH och α-tubulin för att identifiera cytoplasmiska fraktionen eller Brg1 (SMARCA4), TFIID och RNA-polymeras II för kärn fraktion renhet4,5. Emellertid, försiktighet måste iakttas när man väljer proteiner som är mycket berikade i specifika fraktioner, och inte förekommer i båda fraktioner (t. ex., γ-tubulin) (figur 2C)9. Faktum GAPDH och aktin medan allmänt anses vara cytoplasmiska proteiner kan lokalisera till kärnan12,13, belyser vikten av att välja en bråkdel markör som inte flyttar när stimulering eller behandling är appliceras på cellerna. Dessutom är det viktigt att bekräfta att den valda protein markören uttrycks i cellen av intresse genom att köra WCL vid sidan av de subcellulära fraktionationerna.
I det representativa experiment som visas användes samma antal KLL-celler för varje tillstånd (stimulering/läkemedelsbehandling), och därefter bereddes fraktioneringsproverna omedelbart. Lastning 10 μg fraktionerat protein/Lane ger tillräckligt med material för detektion av proteiner av intresse. Eftersom dessa prover endast genomgick en kortsiktig läkemedelsbehandling och stimulering (upp till 4 timmar), antogs det att proteinnivån skulle förbli densamma i varje prov, och en proteinanalys utfördes inte. Men om cell behandlingar förlängs (18-72 h), nivån av celldöd eller spridning i celler kan avsevärt förändra kvaliteten och mängden av protein som utvinns, beroende på drogen/cell stimulering tillämpas, därmed förändra proteinnivåer i den behandlade /stimulerade prover. I dessa fall för längre sikt läkemedelsbehandlingar, är det tillrådligt att utföra protein kvantifiering med hjälp av en Bradford analys eller motsvarande, före Western blotting att se till att samma mängd protein körs i varje körfält i immunoblot. Förekomsten av tvätt-och rengöringsmedel kan störa specifika protein analyser14, kan denna störning minskas genom att späda cell fraktion protein prover. Använd dessutom hela lyseringsbufferten som blind, med samma utspädning som i proven som testas.
För att tillhandahålla stödjande bevis för fynd som beskrivs här kan parallella experiment utföras med fluorescensmikroskopi för att analysera placeringen av FOXO1 inom KLL-celler för att möjliggöra visualisering av dessa fynd5. Dessutom kan de subcellulära fraktioner som genereras också användas för enzymaktivitet analyser eller proteomik analys i ytterligare nedströms analyser.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja tacka Dr Natasha Malik för kritiskt granska manuskriptet. Denna studie finansierades av ett Blodklokt projektbidrag som tilldelades AMM (18003). FACS analys anläggningar finansierades av Howat Foundation. MWM finansierades av en doktorandanställning från Friends of Paul o ' Gorman leukemi Research Centre, JC finansierades av Friends of Paul o ' Gorman leukemi Research Centre och JH finansierades av en Bloodwise projekt Grant (18003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge Tubes | Griener Bio one | 616201 | |
| 3 mL Pasteur Pipettes | Griener Bio one | 612398 | |
| 12 mm x 75 mm FACS Tubes | Elkay | 2052-004 | |
| 15 mL Tube | Griener Bio one | 188271 | |
| 50 mL Tube | Griener Bio one | 227261 | |
| anti-CD5 FITC antibody | BD Biosciences | 555352 | phenotypic surface marker |
| anti-CD19 PE Cy7 antibody | BD Biosciences | 557835 | phenotypic surface marker |
| anti-CD23 APC antibody | BD Biosciences | 558690 | phenotypic surface marker |
| anti-CD45 APC Cy7 antibody | BD Biosciences | 557833 | phenotypic surface marker |
| anti-β-Tubulin antibody | Cell Signaling | 2146 | cytoplasmic marker |
| anti-γ-Tubulin Mouse antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T5326 | |
| anti-FoxO1 (C29H4) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2880 | |
| anti-Lamin A/C antibody | Cell Signaling | 2032 | nuclear marker |
| anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | Secondary antibody |
| anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody |
| anti-Rpb1 CTD antibody (clone 4H8) | Cell Signaling | 2629 | nuclear marker |
| BDFACS Canto II | BD Biosciences | By Request | Flow Cytometer |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | live/dead discriminator |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 10500064 | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | Software | |
| Histopaque1077 density gradient media | Sigma | H8889 | |
| HyperPAGE 10 - 190 kDa protein marker | Bioline | BIO-33066 | Molecular weight marker |
| Image Studio Lite (version 5.2.5) | LI-COR | www.licor.com | Software |
| Labnet VX100 | Fisher Scientific | Vortex | |
| Nucelar Extract Kit | Active Motif | 40010 | |
| OneComp eBeads | Thermofisher | 01-111-42 | |
| Trypan Blue Solution | Thermofisher | 15250061 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26619 | Molecular weight marker |
| PBS Tablets | Fisher Scientific | BR0014G | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15064 | |
| Sigma 3-16P | SciQuip | Centrifuge | |
| Sigma 1-15PK | SciQuip | Centrifuge | |
References
- Kau, T. R., Way, J. C., Silver, P. A. Nuclear transport and cancer: from mechanism to intervention. Nature Reviews Cancer. 4, 106-117 (2004).
- Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer. Biochemical Pharmacology. 83, 1021-1032 (2012).
- Nakamura, N., et al. Forkhead transcription factors are critical effectors of cell death and cell cycle arrest downstream of PTEN. Molecular and Cellular Biology. 20, 8969-8982 (2000).
- Calnan, D. R., Brunet, A. The FoxO code. Oncogene. 27, 2276-2288 (2008).
- Cosimo, E., et al. AKT/mTORC2 inhibition activates FOXO1 function in CLL cells reducing B cell receptor-mediated survival. Clinical Cancer Research. 25, 1574-1587 (2019).
- Mahipal, A., Malafa, M. Importins and exportins as therapeutic targets in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 135-143 (2016).
- Hing, Z. A., et al. Next-generation XPO1 inhibitor shows improved efficacy and in vivo tolerability in hematological malignancies. Leukemia. 30, 2364-2372 (2016).
- Lapalombella, R., et al. Selective inhibitors of nuclear export show that CRM1/XPO1 is a target in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 120, 4621-4634 (2012).
- Hořejší, B., et al. Nuclear γ-tubulin associates with nucleoli and interacts with tumor suppressor protein C53. Journal of Cellular Physiology. 227, 367-382 (2012).
- McCaig, A. M., Cosimo, E., Leach, M. T., Michie, A. M. Dasatinib inhibits B cell receptor signalling in chronic lymphocytic leukaemia but novel combination approaches are required to overcome additional pro-survival microenvironmental signals. British Journal of Haematology. 153, 199-211 (2011).
- Fischer, K., Hallek, M. Optimizing frontline therapy of CLL based on clinical and biological factors. Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2017, 338-345 (2017).
- Butera, G., et al. Regulation of autophagy by nuclear GAPDH and its aggregates in cancer and neurodegenerative disorders. International Journal of Molecular Sciences. 20, 2062 (2019).
- Virtanen, J. A., Vartiainen, M. K. Diverse functions for different forms of nuclear actin. Current Opinion in Cell Biology. 46, 33-38 (2017).
- Friedenauer, S., Berlet, H. H. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry. 178, 263-268 (1989).
