Summary
Denne protokollen gjør det mulig for optimalisering og påfølgende effektiv generering av kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner fra primære kroniske lymfatisk leukemi celler. Disse prøvene brukes til å bestemme protein lokalisering samt endringer i protein smugling som finner sted mellom de kjernefysiske og cytoplasmatiske rom på celle stimulering og narkotikabehandling.
Abstract
Kjernefysisk eksport av makromolekyler er ofte deregulerte i kreftceller. Tumor Suppressor proteiner, slik som p53, kan gjengis inaktive på grunn av avvikende mobilnettet lokalisering forstyrre deres virkningsmekanisme. Overlevelse av kronisk lymfatisk leukemi (CLL) celler, blant andre kreftceller, er assistert av dereguleringen av kjernefysiske til cytoplasmatiske skytteltrafikk, i hvert fall delvis gjennom dereguleringen av transport reseptor XPO1 og konstituerende aktivering av PI3K-mediert signal veier. Det er viktig å forstå rollen til individuelle proteiner i sammenheng med deres intracellulære plassering for å få en dypere forståelse av rollen til slike proteiner i pathobiology av sykdommen. Videre, identifisere prosesser som ligger til grunn celle stimulering og virkningsmekanismen av spesifikke farmakologiske hemmere, i sammenheng med subcellulære protein smugling, vil gi en mer helhetlig forståelse av mekanismen av Handling. Protokollen er beskrevet her muliggjør optimalisering og påfølgende effektiv generering av kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner fra primære kroniske lymfatisk leukemi celler. Disse fraksjonene kan brukes til å bestemme endringer i protein smugling mellom kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner på celle stimulering og narkotikabehandling. Dataene kan bli kvantifisert og presentert parallelt med immunofluorescent bilder, og dermed gi robuste og målbare data.
Introduction
Transport av makromolekyler mellom kjernen og cytoplasma har lenge vært etablert for å spille en nøkkelrolle i normal cellulære funksjon og er ofte deregulerte i kreftceller1,2. Slike dereguleringen kan skyldes overuttrykte/mutasjon av proteiner som kontrollerer kjernefysisk eksport. Et slikt protein Exportin-1 (XPO1), er en transport reseptor som eksporterer > 200 kjernefysisk eksport signal (NES)-inneholder proteiner inn i cytoplasma fra nucleus2. XPO1-cargos inkluderer p53, FOXO familiemedlemmer og IB, bidrar til deres deaktivering ved å hemme deres mekanisme av action1,2,3. Ytterligere protein mislocalization kan oppstå når microenvironmental signaler impinge på kreftceller, som fører til aktivering av intracellulære signalering trasé som fosfatidyl-Inositol-3-kinase (PI3K)/akt Pathway, noe som resulterer i Deaktivering av FOXO familiemedlemmer og påfølgende eksport fra nucleus4,5. Slike mislocalization av tumor Suppressor proteiner har vært innblandet i utviklingen av en rekke hematologiske og solide svulster1,2,6.
Utviklingen av små molekyl hemmere for klinisk bruk i hematologiske ondartet (akutt myelogen leukemi (AML)/CLL), som binder seg til og selektivt hemme XPO1 funksjon, understreker viktigheten av å utvikle egnede teknikker for å ta opp virkningen av farmakologiske midler på skytteltrafikk av proteiner mellom kjernefysiske og cytoplasmatiske rom6,7,8. Imaging teknikker har avansert betydelig muliggjør identifisering av proteiner i subcellulære rom ved ekstern stimulering av narkotika behandlinger, men viktigheten av robuste og støttende parallelle teknikker er avgjørende for pålitelig informere et vitenskapelig publikum om gyldigheten av et resultat.
Hvile lymfocytter og ondartede CLL-B celler isolert fra pasientens blodprøver representerer en utfordring i generering av kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner på grunn av den høye kjernefysiske: cytoplasmatiske ratio. Optimalisering av eksperimentelle forhold for å generere robuste og pålitelige eksperimentelle data er selvsagt kritisk for å planlegge fremtidige eksperimentelle programmer. Metoden beskrevet her muliggjør kvantifisering av proteiner i kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner og bestemmer hvordan disse proteinene kan bli påvirket av cellulær stimulering og/eller narkotikabehandling.
Protocol
Bruken av primær prøver fra CLL-pasienter som er beskrevet her, er godkjent av West of Scotland Research etikk service, NHS Greater Glasgow og Clyde (UK), og alt arbeid ble utført i samsvar med de godkjente retningslinjene.
1. isolering av CLL celler fra pasientens blodprøver
-
Perifere blodprøver fra tidligere samtykket CLL pasienter mottas fra klinikken i EDTA blodprøvetakingsrør, ledsaget av den hvite cellen Count (WCC). Rens perifert blod CLL prøver i henhold til WCC. For WCC < 40 x 106 celler/ml, Fortsett til trinn 1.1.1; for WCC ≥ 40 x 106 celler/ml, Fortsett til trinn 1.1.2.
- Hell innholdet i alle EDTA blod rørene inn i et 50 mL konisk sentrifugerør og tilsett 50 μL av Human B Cell berikelse cocktail per 1 mL blod. Ruge ved romtemperatur (RT) i 20 min. gå videre til trinn 1.1.2.
- Fortynne prøven i et forhold på 1:1 med RT CLL vaskebuffer (fosfat-bufret Salin (PBS), 0,5% fosterets storfe serum (FBS) og 2 mM EDTA).
- Alikvot RT tetthet gradient Media i en hensiktsmessig størrelse konisk sentrifugerør for prøven (10 mL inn i en 50 mL rør for 30 mL av prøven eller 4 mL i en 15 mL rør for 10 mL av prøven).
- Nøye lag prøven på toppen av tettheten gradient Media og sentrifuger på 400 x g for 30 min på RT.
Merk: Sørg for at sentrifuger er på RT før prøvene er plassert i sentrifuger som en endring i temperatur vil resultere i dårlig berikelse av mononukleære celler, og slå av bremsen på sentrifuger, som plutselig bremsing kan forstyrre væsken grensesnittet. - Forsiktig høste det hvite laget av mononukleære celler som samler seg i grensesnittet av tettheten gradient Media og CLL vaskebuffer, i en frisk 50 mL konisk sentrifugerør ved hjelp av en plast Pasteur pipette.
- Tilsett 40 mL CLL vaskebuffer til den isolerte monolag for å vaske cellene og sentrifuge ved 300 x g i 10 min ved RT.
- Kast supernatanten, resuspend pellet ved å sveipe bunnen av røret, og gjenta deretter vaske trinnet som beskrevet i trinn 1,5.
- Kast supernatanten, resuspend pellet som beskrevet i trinn 1,6, deretter resuspend pellet i et sett volum av CLL vaskebuffer (opp til 40 mL, avhengig av størrelsen på cellen pellet).
- Tell cellene ved hjelp av trypan blå og en haemocytometer. Deretter fortsetter å flyte flowcytometri å sjekke renheten av CLL celler.
Merk: På dette stadiet CLL cellene kan være kultivert ved en konsentrasjon på 10 x 106 celler/ml i Media som skal brukes i eksperimenter, og/eller embryo i 10% dimethyl SULFOXIDE (DMSO)/FBS for fremtidig arbeid ved konsentrasjoner av opptil 100 x 106 celler/hetteglass.
2. Flow flowcytometri av CLL celler
- Label 12 mm x 75 mm rund bunn polystyren rør som beskrevet i tabell 1.
- I rør 2 – 5, Legg en dråpe kompensasjon perler og lagre på isen. Tilsett 1 μL av riktig antistoff (anti-CD5, CD19, CD23 eller CD45, som angitt i tabell 1) til rør 2 – 5, og ruge på is i 20 minutter, beskyttet mot lys ved å plassere tinn folie over is bøtta.
Merk: Disse rørene fungerer som kompensasjons kontroller for å sette opp flyt flowcytometri malen. -
Sett opp til 1 x 106 CLL celler i rør 1, 6 og 7, tilsett 2 ml FACS buffer (PBS + 2% FBS) til hver tube og sentrifuger på 300 x g i 5 min på RT å vaske cellene. Kast supernatanten og oppbevar rørene som inneholder celle pellets på is.
- Resuspend celle pellets og tilsett en passende kombinasjon av antistoffer mot cellene i rør 7 som beskrevet i tabell 1, i et slutt volum på 100 ΜL med FACS buffer. Antistoffer brukes ved en hensiktsmessig konsentrasjon i henhold til produsentens retningslinjer.
- Resuspend celle pellets i rør 2 og 6 100 μL av FACS buffer.
- Ruge cellene på isen, langs fargede perler i rør 2-5, beskyttet mot lys i 20 min.
- Etter inkubasjons, tilsett 2 mL FACS buffer til alle rørene og sentrifuger på 300 x g i 5 min ved RT å vaske cellene. Kast supernatanten og resuspend perle/celle pellets ved å sveipe forsiktig i rørene.
- Resuspend rør 1-5 i 100 μL av FACS buffer og plass på isen til klar til å analysere på strømnings flowcytometer.
- Fortynne DAPI-løsningen til 0,05-0.2 μg/mL i FACS-buffer umiddelbart før bruk. Den optimale konsentrasjonen kan variere, og titrering anbefales.
- Resuspend rør 6 og 7 med 100 μL av fortynnet DAPI-oppløsning og ruge rørene på is i minst 5 minutter for å la cellene få flekker.
Merk: Ingen ytterligere vasking er nødvendig som DAPI må være til stede i buffer for døde celler å forbli merket. Når DAPI er lagt til, må cellene analyseres på flyten flowcytometer innen 4 timer. - Analyser celler ved hjelp av en strømnings flowcytometer.
3. utarbeidelse av Subcellulære fraksjoner fra CLL Cells
Merk: Ved planlegging av eksperimentell oppsett, inkluderer en brønn av unstimulated/ubehandlede celler som hele celle ekstrakt kan genereres.
- Utfør ønsket stimulering og/eller legemiddelbehandling av MEC1 CLL cellelinje eller isolerte primære CLL-celler som bruker 10 – 20 x 106 celler/tilstand. Celler vil da bli brukt for subcellulære fraksjonering (trinn 3,4 & 3,5) eller for å generere hele celle ekstrakt (trinn 3,6).
- Utarbeidelse av løsninger/rør: Forbered alle løsninger/buffere fersk på dagen for fraksjonering, før cellene høstes. Oppbevar løsningene på isen til nødvendig og bruk innen 4 timer etter tilberedning.
- PBS/fosfatase inhibitor løsning: klargjør fosfatase hemmere i PBS ved å fortynne fosfatase hemmere 1:20 i 1x PBS (dvs. 0,5 mL fosfatase hemmere i 9,5 mL 1x PBS).
Merk: Sørg for at fosfatase hemmere ikke har utløst. Hvis det finnes en utfelling, varme til 50 ° c i 10 min. - Hypotonisk buffer: klargjør 1x hypotonisk buffer ved å lage en 1:10 fortynning av 10x hypotonisk buffer i destillert vann (dvs. 50 μL av 10x hypotonisk buffer i 450 μ L av dH2O).
- 10 mM dithiotreitol (DTT): klargjør 10 mM DTT ved å lage en 1:100 fortynning av 1M DTT med destillert vann (dvs. 10 μL av 1 M DTT i 990 μL av dH2O).
Merk: DTT er svært labilt så forberede denne ferske hver gang. Unngå gjentatte fryse/tine sykluser. - Fullstendig lyseringsbuffer: Bestem hvor mye buffer som kreves for hvert eksperiment. Hvert utvalg krever 50 μL av komplett lyseringsbuffer, så tilsett 5 μL 10 mM DTT (trinn 3.2.3) til 44,5 μL av lyseringsbuffer og legg deretter til 0,5 μL av protease inhibitor cocktail. Dette beløpet kan skaleres opp avhengig av antall prøver i eksperimentet.
- Label fire sett med 1,5 mL microfuge rør for hver stimulering og/eller narkotikabehandling for de ferske stimulert cellene (trinn 3,3), den nylig genererte cytoplasmatiske fraksjoner (trinn 3.4.3), den nylig genererte kjernefysiske fraksjoner (trinn 3.5.3), og hele cellen lysater (trinn 3.6.3). Pre-chill disse microfuge rørene på isen til nødvendig.
- PBS/fosfatase inhibitor løsning: klargjør fosfatase hemmere i PBS ved å fortynne fosfatase hemmere 1:20 i 1x PBS (dvs. 0,5 mL fosfatase hemmere i 9,5 mL 1x PBS).
- Overfør cellene til individuelt merkede 1,5 mL microfuge rør og pellets ved sentrifugering ved 200 x g i 5 min ved 4 ° c. Fjern supernatanten og resuspend cellene i 1 mL iskald PBS/fosfatase hemmere (trinn 3.2.1). Pellet cellene ved sentrifugering ved 200 x g i 5 min ved 4 ° c. Fjern supernatanten og holde celle pellets på isen.
- Utarbeidelse av cytoplasmatiske fraksjoner: Resuspend forsiktig celle pellets som skal brukes til subcellulære fraksjonering i 50 μL av 1x hypotonisk buffer (trinn 3.2.2). Ruge cellene på isen i 15 min slik at cellene til å hovne opp.
Merk: Volumet av hypotonisk buffer som brukes kan økes empirisk avhengig av celle nummer.- Tilsett 0,8-2,5 μL (1:20 til 1:60) vaskemiddel i hver prøve og Vortex på den høyeste innstillingen i 10 s.
- For å bestemme den optimale konsentrasjonen av vaskemiddel til bruk for en bestemt celle type for å isolere kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner, utføre en vaskemiddel gradient utgangspunktet. Et utvalg på 1:20 til 1:60 (dvs. 2,5 μL til 0,8 μL av vaskemiddel i 50 μL av hypotonisk buffer) bør være tilstrekkelig.
Merk: Hvis volumet av hypotonisk buffer i trinn 3,4 er justert, må du sørge for at det korrekte vaskemiddel forholdet opprettholdes. - Kontroller cellelyse ved å observere celler ved hjelp av en fase kontrast mikroskop før og etter tilsetning av vaskemiddel. Hele celler vises større med en tett, mørk kjerne. Cytoplasma vises som en lys Halo rundt kjernen.
Merk: Passende lyse er ytterligere bekreftet ved hjelp av vestlig blotting å analysere spesifikke proteiner innenfor lysert fraksjoner generert fra vaskemiddel gradient.
- For å bestemme den optimale konsentrasjonen av vaskemiddel til bruk for en bestemt celle type for å isolere kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner, utføre en vaskemiddel gradient utgangspunktet. Et utvalg på 1:20 til 1:60 (dvs. 2,5 μL til 0,8 μL av vaskemiddel i 50 μL av hypotonisk buffer) bør være tilstrekkelig.
- Når lysert, sentrifuger prøvene ved 14 000 x g for 30 s ved 4 ° c.
- Overfør supernatanten forsiktig inn i en pre-kjølt, merket microfuge tube. Dette cytoplasmatiske brøk kan lagres ved-80 ° c til det kreves for videre analyse. Den resterende pellet inneholder kjernefysiske fraksjon (trinn 3,5).
Merk: Unngå gjentatte fryse/tine sykluser av prøvene.
- Tilsett 0,8-2,5 μL (1:20 til 1:60) vaskemiddel i hver prøve og Vortex på den høyeste innstillingen i 10 s.
- Utarbeidelse av kjernefysiske fraksjoner: Resuspend hver kjernefysiske pellet i 50, μL av komplett lyseringsbuffer (trinn 3.2.4) ved pipettering opp og ned.
Merk: Volumet av fullstendig lyseringsbuffer kan justeres empirisk i henhold til Start celle nummeret.- Tilsett 2,5 μL vaskemiddel i solubilize proteiner forbundet med kjerne membranen og Vortex på den høyeste innstillingen i 10 s. ruge prøvene på isen i 30 min.
- Vortex på den høyeste innstillingen for 30 s, deretter sentrifuger prøvene ved 14 000 x g i 20 min ved 4 ° c.
- Overfør supernatanten til en pre kjølt, merket microfuge tube. Denne kjernefysiske fraksjonen kan lagres ved-80 ° c til det kreves for videre analyse.
Merk: Unngå gjentatte fryse/tine sykluser av prøvene.
- Utarbeidelse av hele celle lysater (WCL) fra CLL celler
Merk: Utarbeidelse av hele celle ekstrakt kan utføres på samme tid som utarbeidelse av kjernefysiske fraksjoner (trinn 3,5).- Resuspend hele celle ekstrakt pellets 100 μL av komplett lyseringsbuffer (fremstilt i trinn 3.2.4) ved pipettering opp og ned, tilsett deretter 5 μL vaskemiddel for å sikre fullstendig cellelyse. Ruge prøvene på isen i 30 min.
- Vortex på den høyeste innstillingen for 30 s, deretter sentrifuger prøvene ved 14 000 x g i 20 min ved 4 ° c.
- Overfør supernatanten til en pre-kjølt microfuge tube. Hele denne celle lysat kan lagres ved-80 ° c til det kreves for videre analyse.
Merk: Unngå gjentatte fryse/tine sykluser av prøvene.
4. nedstrøms analyse av Subcellulære fraksjoner
Merk: I denne protokollen ble analyse av de genererte celle fraksjonene utført av vestlige blotting ved hjelp av standardprotokoller, lasting av like celle tall/kjørefelt (tilsvarer ~ 10 μg protein) for kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner.
- Kvantifisering av protein smugling mellom kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner: Utfør kvantitativ Western Blot analyse gjennom kvantifisering av signal intensitet, eller densitometri ved hjelp av fritt tilgjengelige Western Blot analyseprogramvare.
- Importere bilder: Western Blot bilder generert fra ulike utviklingsland instrumenter må importeres som JPG, PNG eller TIFF-filer. En 16-bits dybde RAW-fil anbefales. Hvis du vil importere et bilde, klikker du programvareikonet og holder pekeren over Importer. Klikk deretter bilder fra tredjeparter. Velg bildefilen og klikk på Åpne.
- Vise bildet: Inne bildet bånd, falle i staver på foretrekker knapp inne utfoldelsen gruppe. Dialogboksen Juster skjerm åpnes for å aktivere ytterligere justeringer hvis det er nødvendig. Implementer flere forbedringer, inkludert lysstyrke eller kontrast , ved hjelp av de justerbare glidebryterne på Lutsk -fanen. Bruk kurver -fanen til å utføre finere justeringer.
- Data analyse (kanal oppheving): Klikk på analyse-båndet. Hvis du vil analysere bare én kanal, fjerner du markeringen for kanalen (e) som ikke analyseres. Falle i staver opp på en kanalene ' dont ' viser kanalen thumbnail inne bildet Lutsk, innlevering bare det ønsket kanalen vist. Bilder som importeres som JPG-, PNG-eller TIFF-filer, kan kreve Oppheving av flere uønskede RGB-kanaler.
-
Legge til figurer: Hvis du vil kvantifisere signal intensiteten, klikker du Legg til rektangel for å legge til et rektangel i bildet. Klikk på midten av en funksjon (for eksempel et protein bånd) for å plassere et rektangel rundt det. Du kan også tegne en figur manuelt ved å velge tegn rektangel. Etter at du har lagt til alle de ønskede figurene, klikker du Velg for å returnere markøren til markeringsverktøyet.
Merk: Legg til flere figurer i en logisk rekkefølge, siden dataene sorteres etter et ID-nummer som genereres sekvensielt. -
Bakgrunn subtraksjon: Hvis du vil trekke fra bakgrunnsstøyen, klikker du på den første knappen i bakgrunns gruppen og velger median fra rullegardinmenyen. Sett kantlinjebredden til 3 i bakgrunns dialogen, og velg segmentene som skal brukes til bakgrunns beregningen. Når du velger hvilke segmenter du vil bruke, velger du segmenter som best representerer bildebakgrunnen.
Merk: Bakgrunnsstøy kan påvirke signal kvantifisering, så det må trekkes til nøyaktig beregne signal fra figurene av interesse. -
Trim signal og trim bakgrunn-Valgfritt: Filer som importeres i formatene JPG, PNG eller TIFF kan vise piksel metning: uthevede/lyse områder i et protein bånd. Trim signal og trim bakgrunn (Bkgnd) fjerner mettede bildepunkter fra analyse. For å se disse verdiene, Legg trim signal og trim Bkgnd til en tabell ved å klikke på kolonnene knappen til høyre for tabellvisningen.
Merk: Piksel metning kan føre til upålitelige kvantifisering. Mettede bildepunkter kan bare fjernes hvis færre enn 5% av bildepunktene i en figur er mettet.
-
Legge til figurer: Hvis du vil kvantifisere signal intensiteten, klikker du Legg til rektangel for å legge til et rektangel i bildet. Klikk på midten av en funksjon (for eksempel et protein bånd) for å plassere et rektangel rundt det. Du kan også tegne en figur manuelt ved å velge tegn rektangel. Etter at du har lagt til alle de ønskede figurene, klikker du Velg for å returnere markøren til markeringsverktøyet.
- Eksportere data: Klikk kategorien figurer over tabellen. For densitometri kreves verdier i signal Kol onnen. Signal er summen av verdiene for piksel intensitet (total) for en figur minus produktet av Bkgnd og området. Klikk rapport-knappen. Klikk Lagre som eller Start regneark.
Signal = totalt – (Bkgnd x-område)
Merk: Figurer-fanen inneholder en tabell med kvantitative verdier, inkludert signal, sum, areal og Bkgrnd. - Kvantifisere protein uttrykk: Innenfor det lagrede regnearket, beregne normalisert uttrykk for protein av interesse for hvert felt eller variabel ved å dele den oppnådde signal for protein av interesse av signalet for tilsvarende protein lasting kontroll bandet.
Merk: Sammenligninger mellom mengdene av en normalisert protein av interesse på tvers av kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner kan ikke direkte sammenlignes på grunn av de ulike lasting kontrollene brukes til å skille kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner. Sammenligninger i individuelle fraksjoner, for eksempel etter behandling av narkotika, er imidlertid passende. - Eksporter bilde for publikasjon eller presentasjon: Klikk på bilder -fanen som du finner over tabellen, og klikk deretter på bildet som skal eksporteres. Hvis du bruker bildet til en lysbildepresentasjon eller andre digitale formater, klikker du på programvareikonet, holder markøren over eksport og klikker på bildet for digitale medier. Lagre bildet som en JPG-, PNG-eller TIFF-fil etter behov.
Representative Results
Ved planlegging eksperimenter på primære CLL celler, hvis analysene krever et stort antall celler (> 50 x 106 celler), er det en preferanse for å bruke nylig isolerte CLL celler, i stedet embryo celler som krever tine, men dette er ikke alltid Mulig. Dette er fordi fryse/tine prosessen kan føre til død opp til 50% av CLL cellene, selv om dette er sample avhengig. Berikelse av CLL celler med en WCC > 40 x 106/ml ved hjelp av tetthet sentrifugering som beskrevet her (trinn 1,3-1,5) muliggjør en høy celle utvinning med høy renhet (≥ 95%) av primære CLL-celler. I eksempelet som vises, WCC = 177 x 106/ml: fra en 30 ml blodprøve 5 x 109 celler ble gjenopprettet, som representerer en celle yield på 94% av totalt celler. Analyse av denne prøven ved flyt flowcytometri avdekket en renhet av CLL celler på > 95% som indikert av dual overflate uttrykk for CLL celle markører CD19 og CD5 etter gating på FSC/SSC, enkeltceller som var DAPI negative (levedyktige celler) (figur 1).
Optimalisering av subcellulære fraksjonering prosedyren ble utført ved hjelp av en rekke vaskemiddel forhold (1:20 til 1:60) under utarbeidelsen av cytoplasmatiske brøkdel (trinn 3,4). Deretter ble de kjernefysiske fraksjoner og WCLs forberedt (trinn 3,5 og 3,6 henholdsvis). Immunoblots ble utført på de resulterende fraksjoner av CLL cellelinje MEC1 (figur 2A) og primære CLL celler (figur 2B). Blots ble analysert for brøk markørene Lamin A/C (kjernefysisk; 74/63 kDa) og β-tubulin (cytoplasmatiske; 55 kDa) for å bekrefte vellykket celle fraksjonering. Fraksjonering indikerer at optimalt vaskemiddel nivå for MEC1-celler er en 1:60 fortynning (figur 2a), sammenlignet med en 1:30 fortynning som er optimal for primære CLL-celler (figur 2B), som indikert av en berikelse av kjernefysisk protein og mangel på cytoplasmatiske protein i fraksjoner og vice versa. WCLs representerer det totale proteinet og fungerer som en positiv kontroll for antistoffer som brukes til å undersøke subcellulære fraksjoner. Det er viktig å velge passende proteiner som brøk markører: figur 2C viser immunoblots av kjernefysiske/CYTOPLASMATISKE fraksjoner fremstilt fra MEC1 celler der RNA POLYMERASE II (Rpb1 CTD; 250 KDa) og Lamin A/C ble blotted som markører for kjernefysiske fraksjoner, mens β-tubulin og γ-tubulin (50 kDa) ble brukt som cytoplasmatiske markører. Det er klart at γ-tubulin er beriket i cytoplasma men uttrykket er tydelig i kjernen, som vist tidligere9.
Når eksperimentelle forhold er optimalisert, kan et eksperiment utføres. I eksemplene som vises, ble den subcellulære lokalisering av FOXO1 i kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner bestemmes ved stimulering av celler med B-cellen antigen reseptor (BCR) i nærvær eller fravær av den doble mTORC1/2 inhibitor AZD8055, i MEC1 celler ( Figur 3A) og primær CLL celler (Figur 3B)5,10. I begge eksemplene ble generasjonen av svært beriket kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner oppnådd som indikert av nesten eksklusivt uttrykk for Lamin i den kjernefysiske fraksjonen og β-tubulin i cytoplasmatiske fraksjoner. I begge celletyper ble FOXO1 uttrykk redusert i cytoplasma etter behandling med AZD8055 sammenlignet med NDC, ledsaget av en økning på FOXO1 uttrykk i det kjernefysiske rommet, og dermed demonstrere protein translokasjon (Figur 3). For å fjerne subjektivitet av data tolkning ble individuelle immunoblots fra fem primære CLL-prøver kvantifisert innenfor subcellulære fraksjoner (trinn 4; Figur 4A), ved hjelp av de respektive kjernefysiske eller cytoplasmatiske proteiner som interne lasting kontroller for hver prøve, og deretter normalisere hver brøkdel til unstimulated (US) ingen narkotikakontroll (NDC) kontroll, som indikert. Den resulterende grafen viser trender i FOXO1 bevegelse mellom kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner, med AZD8055 redusere nivåene av FOXO1 uttrykk i cytoplasma, mens samtidig økende uttrykk i kjernen. Videre er en høyde i cytoplasmatiske FOXO1 uttrykk tydelig på BCR Cross Linking.
| Tube | Tube navn | Celler/perler | Antigen | Fluoroforen |
| 1 | Unstained | Celler | Na | Na |
| 2 | Enkel beis | Perler | CD5 | FITC |
| 3 | Enkel beis | Perler | CD19 | PE-Cy7 |
| 4 | Enkel beis | Perler | CD23 | Apc |
| 5 | Enkel beis | Perler | CD45 | APC-Cy7 |
| 6 | Enkel beis | Celler | Levedyktighet | DAPI |
| 7 | CLL beis | Celler | CD5, CD19, CD23, CD45 & levedyktighet | FITC, PE-Cy7, APC, APC-Cy7 & DAPI |
Tabell 1: tabell som viser det ideelle settet med prøverør som er nødvendig for strømnings flowcytometri av CLL-celler. Hvert eksperiment må inneholde alle de riktige kontrollene for nøyaktig analyse av resultatene som oppnås.
Figur 1: representant flyt flowcytometri analyse tomten av BERIKET CLL pasienter. Mononukleære-CLL celler beriket fra perifert blod av en individuell CLL pasienten var gated bruker FSC-A vs SSC-a, og doublets ble deretter ekskludert ved hjelp av FSC-A vs. FSC-H (A). Unstained celler (rør 1) og kompensasjon kontroller (rør 2-6) ble brukt til å sette opp flyten flowcytometer å oppdage celler og kompensere mellom fluorescerende kanaler, og dermed sikre at fluorescens signalene ble oppdaget på riktig måte. (B) et eksempel på negative flekker (unstained celler; rør 1) i CD19-og CD5 fluorescens-kanalene. Live (DAPI negative) og CD45 positive celler var gated (C) og andelen CD19+CD5+ (95,5%) og CD19+CD23+ (91,2%) celler i DAPI-CD45+ befolkningen ble fastslått (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: optimalisering av kjernefysiske/cytoplasmatiske fraksjonering. Cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner, og hele celle lysater (WCL), ble fremstilt fra celle pellets (10 – 20 x 106 celler) av CLL cellelinje (A) MEC1 eller (B) primær CLL celler beriket fra perifert blod hos pasienter som beskrevet i Trinn 3. Optimalisering av subcellulære fraksjonering ble utført ved å bruke en rekke vaskemiddel forhold (1:20 til 1:60) ved fremstilling av cytoplasmatiske fraksjon (som beskrevet i trinn 3,4). Den resulterende prøvene var immunoblotted og analysert med anti-Lamin A/C (kjernefysiske) og anti-β-tubulin (cytoplasmatiske) antistoffer for å bekrefte vellykket celle fraksjonering sammen WCL. Molekylvekt markører vises til venstre for blot (M). * Angir de optimale rengjørings betingelsene for cellelyse. (C) Immunoblot av kjernefysiske og cytoplasmatiske FRAKSJONER fra MEC1 celler med kontroll betingelser (NDC) eller behandling (8055) i nærvær av fravær av stimulering (henholdsvis + eller – BCR Cross Linking). Blots ble analysert med anti-Rbp1 CTD (klone 4H8; gjenkjenne RNA polymerase II delenhet B1), anti-Lamin A/C, anti-β-tubulin eller anti-γ-tubulin (Clone GTU-88) antistoffer, for å identifisere subcellulære fraksjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: subcellulære fraksjonering demonstrerer skytteltrafikk av FOXO1 mellom kjernen og cytoplasma i CLL. (A) MEC-1 celler og (B) primær CLL celler ble pre-behandlet i 30 minutter med 100 nM AZD8055 (8055) eller venstre ubehandlet (NDC) som indikert og deretter BCR ble ligaturer for 1 t eller venstre US. Kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner ble deretter forberedt og immunoblotted. Etter bekreftelse av fraksjonering av undersøkelser med anti-Lamin A/C (kjernefysisk) og anti-β-tubulin (cytoplasmatiske) antistoffer, ble effekten av både narkotikabehandling og BCR ligation vurdert på FOXO1 protein uttrykk ved hjelp av et anti-FOXO1 antistoff. M indikerer molekylvekt markør. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: en jobbet eksempel på kvantitativ Western Blot analyse (densitometri). (A) densitometri ble utført ved hjelp av Western Blot analyseprogramvare tilgjengelig på nettet. Kort, innenfor analyse bånd, rektangler ble tegnet rundt protein band i bildet for å beregne signal intensitet. Avbildet er densitometri av en representativ vestlig blot bilde av en CLL pasientprøve som gjennomgikk cytoplasmatiske/kjernefysiske fraksjonering. Cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner er preget av uttrykk for cytoplasmatiske (β-tubulin) og kjernefysiske (Lamin A/C) markører. Normalisert uttrykk for FOXO1 for en gitt tilstand kan beregnes ved å dele signalet innhentet for FOXO1 av tilsvarende signal for β-Tubulin eller Lamin A/C, avhengig av brøk blir analysert. Relativ FOXO1 uttrykk (i forhold til amerikansk kjøretøy kontroll), kan beregnes ved å dele normalisert FOXO1 uttrykk for en gitt tilstand ved normalisert FOXO1 uttrykk for den amerikanske kjøretøyets kontroll av en gitt cellulær brøk. (B) graf som viser FOXO1 uttrykks nivåer i cytoplasmatiske (venstre) eller kjernefysiske (høyre) fraksjoner NORMALISERT til US-NDC kontroll innenfor hver Cellular brøkdel. Den røde prikken på grafen er arbeidet eksempelet vist. Disse dataene viser gjennomsnittlig fold endring i FOXO1 uttrykk i forhold til US-NDC ± SEM. P verdier ble bestemt av tosidige studenter sammenkoblet t test. n = 5 individuelle CLL pasientprøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Protokollen beskrevet gir en rask og effektiv metode for generering av kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner fra primære CLL celler, og påfølgende kvantifisering av protein smugling mellom kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner på celle stimulering og narkotikabehandling. Dataene som presenteres demonstrerer evnen til å oppdage smugling av spesifikke proteiner, for eksempel FOXO1, mellom kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner, ved behandling med en dobbel mTOR-hemmer AZD8055 i nærvær/fravær av BCR Cross Linking gjennom F ( AB ')2 fragment stimulering (Figur 3 og Figur 4). Kopling disse eksperimentene med kvantifisering av vestlige blots fra individuelle CLL pasientprøver, muliggjør objektive analyser av data generert og demonstrerer robusthet av analysen som er beskrevet for å kvantifisere globale endringer i protein lokalisering i CLL celler isolert fra pasient kohorter (Figur 4). Det er klart fra data som et gjennomsnitt på fem pasientprøver i cytoplasmatiske fraksjoner nådde nær betydning. Gitt den kliniske heterogenitet av CLL pasienter11, ville disse analysene vanligvis utføres på større pasient kohorter, og/eller fokusert på bestemte Prognostisk undergrupper av pasientene for å få en fyldigere forståelse av den cellulære RESPONSEN til CLL celler til spesifikke medikament behandlinger.
Dataene som presenteres demonstrerer viktigheten av å velge protein markører som utelukkende bor i enten cytoplasmatiske eller kjernefysiske fraksjoner, som renheten av fraksjonering vil bli bekreftet av disse markørene. β-tubulin ble valgt for cytoplasmatiske brøk bekreftelse, og Lamin A/C som en kjernefysisk markør. Ytterligere proteiner som vanligvis brukes er GAPDH og α-tubulin for å identifisere cytoplasmatiske fraksjon eller Brg1 (SMARCA4), TFIID og RNA polymerase II for kjernefysisk brøk renhet4,5. Det må imidlertid utvises forsiktighet ved valg av proteiner som er svært beriket med bestemte fraksjoner, og som ikke finnes i begge fraksjoner (f.eks. γ-tubulin) (figur 2C)9. Faktisk, GAPDH og utgangen mens generelt anses å være cytoplasmatiske proteiner kan lokalisere til kjernen12,13, fremhever viktigheten av å velge en brøk markør som ikke flytte når stimulering eller behandling er brukt på cellene. Videre er det viktig å bekrefte at protein markør valgt uttrykkes i cellen av interesse ved å kjøre WCL sammen med subcellulære fraksjoneringer.
I det representative eksperimentet som vises, ble det samme antall CLL-celler brukt for hver tilstand (stimulering/legemiddelbehandling), og deretter ble de fraksjonering prøvene klargjort umiddelbart. Innlasting av 10 mikrogram fraksjonert protein/kjørefelt gir tilstrekkelig materiale for påvisning av proteiner av interesse. Ettersom disse prøvene bare gjennomgikk en kortsiktig behandling og stimulering (opp til 4 h), ble det antatt at protein nivået ville forbli det samme i hver prøve, og et protein analysen ble ikke utført. Men hvis celle behandlinger er utvidet (18-72 h), kan nivået av celle død eller spredning i cellene betydelig endre kvaliteten og mengden av protein ekstrahert, avhengig av narkotika/celle stimulering brukt, og dermed endre protein nivået i den behandlede /stimulated prøver. I disse tilfellene for lengre sikt narkotika behandlinger, er det tilrådelig å utføre protein kvantifisering ved hjelp av en Bradford analysen eller tilsvarende, før vestlige blotting å sikre samme mengde protein kjøres i hvert kjørefelt av immunoblot. Tilstedeværelsen av vaskemidler kan forstyrre spesifikke protein analyser14, kan denne forstyrrelsen reduseres ved å fortynne celle brøk protein prøver. I tillegg, bruk den komplette lyseringsbufferen som blank, med samme fortynning som i prøvene som testes.
For å gi støtte bevis for funnene beskrevet her, kan parallelle eksperimenter utføres ved hjelp av fluorescens mikroskopi å analysere plasseringen av FOXO1 innen CLL celler for å muliggjøre visualisering av disse funnene5. Videre kan subcellulære fraksjoner generert også brukes for enzym aktivitet analyser eller Proteomikk analyse i ytterligere nedstrøms analyser.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Dr. Natasha Malik for kritisk gjennomgang av manuskriptet. Denne studien ble finansiert av en Bloodwise prosjekt stipend tildelt AMM (18003). FACS analyse anlegg ble finansiert av Howat Foundation. MWM ble finansiert av en PhD-studentship fra Friends of Paul O ' Gorman leukemi Research Centre, JC ble finansiert av Friends of Paul O ' Gorman leukemi Research Centre og JH ble finansiert av en Bloodwise prosjekt stipend (18003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge Tubes | Griener Bio one | 616201 | |
| 3 mL Pasteur Pipettes | Griener Bio one | 612398 | |
| 12 mm x 75 mm FACS Tubes | Elkay | 2052-004 | |
| 15 mL Tube | Griener Bio one | 188271 | |
| 50 mL Tube | Griener Bio one | 227261 | |
| anti-CD5 FITC antibody | BD Biosciences | 555352 | phenotypic surface marker |
| anti-CD19 PE Cy7 antibody | BD Biosciences | 557835 | phenotypic surface marker |
| anti-CD23 APC antibody | BD Biosciences | 558690 | phenotypic surface marker |
| anti-CD45 APC Cy7 antibody | BD Biosciences | 557833 | phenotypic surface marker |
| anti-β-Tubulin antibody | Cell Signaling | 2146 | cytoplasmic marker |
| anti-γ-Tubulin Mouse antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T5326 | |
| anti-FoxO1 (C29H4) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2880 | |
| anti-Lamin A/C antibody | Cell Signaling | 2032 | nuclear marker |
| anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | Secondary antibody |
| anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody |
| anti-Rpb1 CTD antibody (clone 4H8) | Cell Signaling | 2629 | nuclear marker |
| BDFACS Canto II | BD Biosciences | By Request | Flow Cytometer |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | live/dead discriminator |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 10500064 | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | Software | |
| Histopaque1077 density gradient media | Sigma | H8889 | |
| HyperPAGE 10 - 190 kDa protein marker | Bioline | BIO-33066 | Molecular weight marker |
| Image Studio Lite (version 5.2.5) | LI-COR | www.licor.com | Software |
| Labnet VX100 | Fisher Scientific | Vortex | |
| Nucelar Extract Kit | Active Motif | 40010 | |
| OneComp eBeads | Thermofisher | 01-111-42 | |
| Trypan Blue Solution | Thermofisher | 15250061 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26619 | Molecular weight marker |
| PBS Tablets | Fisher Scientific | BR0014G | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15064 | |
| Sigma 3-16P | SciQuip | Centrifuge | |
| Sigma 1-15PK | SciQuip | Centrifuge | |
References
- Kau, T. R., Way, J. C., Silver, P. A. Nuclear transport and cancer: from mechanism to intervention. Nature Reviews Cancer. 4, 106-117 (2004).
- Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer. Biochemical Pharmacology. 83, 1021-1032 (2012).
- Nakamura, N., et al. Forkhead transcription factors are critical effectors of cell death and cell cycle arrest downstream of PTEN. Molecular and Cellular Biology. 20, 8969-8982 (2000).
- Calnan, D. R., Brunet, A. The FoxO code. Oncogene. 27, 2276-2288 (2008).
- Cosimo, E., et al. AKT/mTORC2 inhibition activates FOXO1 function in CLL cells reducing B cell receptor-mediated survival. Clinical Cancer Research. 25, 1574-1587 (2019).
- Mahipal, A., Malafa, M. Importins and exportins as therapeutic targets in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 135-143 (2016).
- Hing, Z. A., et al. Next-generation XPO1 inhibitor shows improved efficacy and in vivo tolerability in hematological malignancies. Leukemia. 30, 2364-2372 (2016).
- Lapalombella, R., et al. Selective inhibitors of nuclear export show that CRM1/XPO1 is a target in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 120, 4621-4634 (2012).
- Hořejší, B., et al. Nuclear γ-tubulin associates with nucleoli and interacts with tumor suppressor protein C53. Journal of Cellular Physiology. 227, 367-382 (2012).
- McCaig, A. M., Cosimo, E., Leach, M. T., Michie, A. M. Dasatinib inhibits B cell receptor signalling in chronic lymphocytic leukaemia but novel combination approaches are required to overcome additional pro-survival microenvironmental signals. British Journal of Haematology. 153, 199-211 (2011).
- Fischer, K., Hallek, M. Optimizing frontline therapy of CLL based on clinical and biological factors. Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2017, 338-345 (2017).
- Butera, G., et al. Regulation of autophagy by nuclear GAPDH and its aggregates in cancer and neurodegenerative disorders. International Journal of Molecular Sciences. 20, 2062 (2019).
- Virtanen, J. A., Vartiainen, M. K. Diverse functions for different forms of nuclear actin. Current Opinion in Cell Biology. 46, 33-38 (2017).
- Friedenauer, S., Berlet, H. H. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry. 178, 263-268 (1989).
