Summary
Dezelluläre extrazelluläre Matrix (dECM) kann geeignete mikroökologische Hinweise liefern, um die inhärenten Funktionen von Zielgeweben in einem konstruierten Konstrukt zu rekapitulieren. Dieser Artikel erläutert die Protokolle für die Dezellularisierung von Bauchspeicheldrüsengewebe, die Bewertung von DECM-Bioink aus Bauchspeicheldrüsengewebe und die Generierung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten mit einer Bioprinting-Technik.
Abstract
Die Transplantation von Pankreasinseln ist eine vielversprechende Behandlung für Patienten, die an Typ-1-Diabetes leiden, begleitet von Hypoglykämie und sekundären Komplikationen. Die Inseltransplantation hat jedoch noch einige Einschränkungen, wie z. B. die geringe Lebensfähigkeit transplantierter Inselchen aufgrund schlechter Inselverordnung und feindlicher Umgebungen. Darüber hinaus haben die Insulin produzierenden Zellen, die sich von menschlichen pluripotenten Stammzellen unterscheiden, nur begrenzte Fähigkeit, ausreichende Hormone zu sezernieren, die den Blutzuckerspiegel regulieren können; Daher ist eine Verbesserung der Reifung durch die Kultivierung von Zellen mit geeigneten mikroökologischen Hinweisen dringend erforderlich. In diesem Artikel erläutern wir Protokolle zur Vorbereitung einer pankreasischen, dezellularisierten extrazellulären Matrix (pdECM)-Bioink, um eine vorteilhafte Mikroumgebung zu schaffen, die die Glukoseempfindlichkeit von Pankreasinseln erhöhen kann, die Prozesse zur Erzeugung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten mit einer Mikroextrusions-basierten Bioprinting-Technik.
Introduction
Kürzlich wurde die Pankreas-Islet-Transplantation als vielversprechende Behandlung für Patienten mit Typ-1-Diabetes angesehen. Die relative Sicherheit und minimale Invasivität des Verfahrens sind große Vorteile dieser Behandlung1. Jedoch, Es hat mehrere Einschränkungen wie die geringe Erfolgsrate der isolierenden Inseln und die Nebenwirkungen von immunsuppressiven Medikamenten. Darüber hinaus nimmt die Zahl der eingepfropften Inselchen nach der Transplantation aufgrund der feindlichen Umgebung stetig ab2. Verschiedene biokompatible Materialien wie Alginat, Kollagen, Poly(Milch-Co-Glykolsäure) (PLGA) oder Polyethylenglykol (PEG) wurden bei der Pankreas-Islet-Transplantation angewendet, um diese Schwierigkeiten zu überwinden.
Die 3D-Zelldrucktechnologie entwickelt sich in der Tissue-Engineering aufgrund ihres großen Potenzials und ihrer hohen Leistung. Selbstverständlich sind Bioinks als wichtige Komponenten bekannt, um eine geeignete Mikroumgebung zu schaffen und die Verbesserung zellulärer Prozesse in gedruckten Gewebekonstrukten zu ermöglichen. Eine beträchtliche Anzahl von scherendünnenden Hydrogelen wie Fibrin, Alginat und Kollagen sind weit verbreitet als Bioinks verwendet. Diese Materialien weisen jedoch einen Mangel an struktureller, chemischer, biologischer und mechanischer Komplexität im Vergleich zur extrazellulären Matrix (ECM) im nativen Gewebe3auf. Mikroökologische Hinweise wie die Wechselwirkungen zwischen Inselchen und ECM sind wichtige Signale zur Verbesserung der Funktion von Inselchen. Dezellularisiertes ECM (dECM) kann die gewebespezifische Zusammensetzung verschiedener ECM-Komponenten wie Kollagen, Glycosaminoglycane (GAGs) und Glykoproteine nachbilden. Beispielsweise weisen primäre Inselchen, die ihre peripheren ECMs (z. B. Typ I, III, IV, V und VI Kollagen, Laminin und Fibronectin) behalten, eine geringe Apoptose und eine bessere Insulinempfindlichkeit auf, was darauf hindeutet, dass gewebespezifische Zellmatrix-Wechselwirkungen wichtig sind, um ihre Fähigkeit zu verbessern, ähnlich wie das ursprüngliche Gewebe zu funktionieren4.
In diesem Beitrag erläutern wir Protokolle zur Vorbereitung von Pankreasgewebe-abgeleiteten dezellularisierten extrazellulären Matrix (pdECM) Bioink, um vorteilhafte mikroökologische Hinweise zur Steigerung der Aktivität und Funktionen der Pankreasinseln zu bieten, gefolgt von den Prozessen zur Erzeugung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten mit einer mikroextrusionbasierten Bioprinting-Technik (Abbildung 1).
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Protocol
Schweine-Pankreasgewebe wurden aus einem örtlichen Schlachthof gesammelt. Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Asan Medical Center, Seoul, Korea, genehmigt.
1. Gewebedezellularisierung
- Bereiten Sie die Lösungen für die Dezellularisierung vor.
HINWEIS: 1x phosphatgepufferte Salzsäure (PBS), die in allen Lösungspräparaten verwendet wird, wird durch Zugabe von destilliertem Wasser zu 10x PBS verdünnt.- Für die 1% Triton-X 100 Lösung 100 ml 100% Triton-X 100 Lösung in 900 ml 1x PBS mit einem magnetischen Rührstab mit dem Rühren bei 150 Rpm für 6 h auflösen. Machen Sie 400 ml 1% Triton-X 100 Lösung mit 40 ml 10% Triton-X 100 Lösung und 360 ml 1x PBS kurz vor Gebrauch vorbereitet.
HINWEIS: Die 10% Triton-X 100 Lösung kann bei Raumtemperatur gespeichert werden, bis sie benötigt wird. - Für die 0,1%ige Peressigsäurelösung 8,5 ml 4,7% Peressigsäure in 22,8 ml 70% Ethanol mit 368,7 ml destilliertem Wasser kurz vor Gebrauch verdünnen.
- Für die 1% Triton-X 100 Lösung 100 ml 100% Triton-X 100 Lösung in 900 ml 1x PBS mit einem magnetischen Rührstab mit dem Rühren bei 150 Rpm für 6 h auflösen. Machen Sie 400 ml 1% Triton-X 100 Lösung mit 40 ml 10% Triton-X 100 Lösung und 360 ml 1x PBS kurz vor Gebrauch vorbereitet.
- Entfernen Sie das periphere Gewebe der Bauchspeicheldrüse und schneiden Sie das Gewebe vor der Dezellularisierung.
- Waschen Sie die resected Schweinebauchspeicheldrüse mit fließendem Leitungswasser und entfernen Sie das periphere Gewebe mit einer sterilisierten Schere.
- Die Bauchspeicheldrüse mit Zangen in eine Plastiktüte geben und bei -80 °C für 1 H einfrieren, um die Bauchspeicheldrüse für den nächsten Schritt effektiv zu schneiden.
- Die gefrorene Bauchspeicheldrüse mit einer Reibe in 1 mm dicke Stücke schneiden.
- 50 g des geschnittenen Gewebes in einen 500 ml Kunststoffbehälter geben.
HINWEIS: Ein Kunststoffbehälter mit Deckel wird hier empfohlen, um Gewebe vor Verunreinigungen zu schützen und eine Verdunstung von Lösungen zu verhindern.
- Behandlung mit Reagenzien.
HINWEIS: Der gesamte Dezellularisierungsprozess sollte bei 4 °C an einem digitalen Orbital-Shaker bei 150 Rpm durchgeführt werden. In allen Entzellularisierungsschritten ist eine physische Ablösung mit Zangen erforderlich, um zu verhindern, dass die Scheiben der Bauchspeicheldrüse zusammenkleben. Das Waschen des Behälters mit destilliertem Wasser ist notwendig, um die Restreagenzien vollständig im Behälter zu entfernen.- Waschen Sie vor jeder Reagenzienbehandlung 50 g in Scheiben geschnittene Bauchspeicheldrüse mit 300 ml destilliertem Wasser mit einem Shaker.
- Rühren Sie das Gewebe kontinuierlich bei 150 Umdrehungen pro Minute, bis das trübe Wasser verschwindet (nach ca. 12 h). Ersetzen Sie das destillierte Wasser alle 2 h.
HINWEIS: Es wird empfohlen, das destillierte Wasser stündlich zu wechseln, um das trübe Wasser schneller zu entfernen. - Entsorgen Sie das Wasser und behandeln Sie die 50 g Gewebe mit 400 ml 1% Triton-X 100 in 1x PBS-Lösung für 84 h. Erfrischen Sie die Lösung alle 12 h.
HINWEIS: An diesem Punkt nimmt die Menge an Gewebe ab, da die zellulären Komponenten entfernt werden. - Mit 400 ml Isopropanol (IPA) 2 h behandeln, um das restliche Fett aus der Bauchspeicheldrüse zu entfernen.
HINWEIS: Es ist normal, dass das Gewebe durch die Entfernung von Fett in diesem Prozess hart wird. - Nach 2 h entfernen Sie das IPA und waschen Sie das Gewebe mit 400 ml 1x PBS für 24 h. Erfrischen Sie die 1x PBS alle 12 h.
- Um das dezellularisierte Gewebe zu sterilisieren, entsorgen Sie die vorherige Lösung und behandeln Sie mit 400 ml 0,1% Peressigsäure in 4% Ethanol für 2 h.
- Um Restwaschmittel zu entfernen, waschen Sie das Gewebe mit 400 ml 1x PBS für 6 h. Erfrischen Sie die Lösung alle 2 h.
- Sammeln Sie das dezelluläre Gewebe in einem 50 ml konischen Rohr mit Zangen.
- Die Probe bei -80 °C für 1 h einfrieren. Bedecken Sie das konische Rohr mit einem fusselfreien Wisch anstelle des Deckels und fixieren Sie es mit einem Gummiband für eine effiziente Lyophilisierung.
- Lyophilisieren Sie das dezellularisierte Gewebe bei -50 °C für 4 d.
HINWEIS: Für Schritt 1.3 sollten 1 g nicht-dezellularisiertes Gewebe auch unter den gleichen Bedingungen gefriergetrocknet werden.
2. Bewertung von dezellularisiertem Gewebe
ANMERKUNG: Um die Restmenge von dsDNA, Glycosaminoglycans (GAGs) und Kollagen im dezellularisierten Gewebe im Vergleich zu nativem Gewebe zu bewerten, werden mindestens 1 g des nicht-dezellularisierten Gewebes (natives Gewebe) und dezellularisiertes Gewebe für Bewertungscharge. Die Menge an dsDNA, GAGs und Kollagen kann basierend auf dem Trockengewicht des Gewebes berechnet werden.
- Bereiten Sie Lösungen für biochemische Assays vor.
- Bereiten Sie Papain-Lösung für die Probenverdauung.
HINWEIS: Die Menge des zu machenden Puffers kann entsprechend der Anzahl der Proben angepasst werden.- 119 mg 0,1 M Natriumphosphat (monobasic), 18,6 mg 0,5 mM Na2-EDTA und 8,8 mg 5 mM Cystein-HCl in 10 ml autoklavem Wasser auflösen.
- Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 6,5 ein, indem Sie eine 10 M NaOH-Lösung hinzufügen.
- Fügen Sie der oben genannten Lösung 125 l von 10 mg/ml Papain-Stammlösung und Wirbel hinzu, sodass sich jedes Element gleichmäßig mischen kann.
- Bereiten Sie Lösungen für Dimethyl-Methylen-Blau (DMMB) Assay vor.
- Um DMMB-Farbstoff herzustellen, lösen Sie 8 mg 1,9-Dimethyl-Methylenblau-Zinkchlorid-Doppelsalz, 1,52 g Glycin und 1,185 g NaCl in 500 ml autoklavem Wasser auf. Stellen Sie den pH-Wert auf 3 ein, indem Sie 0,5 M HCl-Lösung hinzufügen, während Sie den wechselkundigen pH-Wert mit einem pH-Meter messen. Filtern Sie diesen dann durch einen 500 ml Flaschen-Staubsauger-Filter.
- Machen Sie 15 l von 10 mg/ml Chondroitinsulfat Eine Lösung für Standard.
- Bereiten Sie Lösungen für Hydroxyprolin-Assay vor.
- Für die Chloramin-Arbeitslösung 2,4 g Natriumacetat, 1 g Zitronensäure und 0,68 g Natriumhydroxid in 24 ml destilliertem Wasser auflösen und 240 l Eisessig, 10 l Toluol und 6 ml IPA hinzufügen.
HINWEIS: Lösen Sie alle Pulver in Lösung mit einem Wirbelmischer. Chloramin-Arbeitslösung kann bis zu drei Monate bei 4 °C gelagert werden. - Für Chloramin-T-Lösung 0,35 g Chloramin T in 20 ml Chloramin-Arbeitslösung auflösen und 2,5 ml IPA hinzufügen. Vortex, um alle Komponenten zu mischen.
HINWEIS: Bereiten Sie sich unmittelbar vor der Verwendung vor. - Für P-DAB-Lösung 3,75 g P-DAB in 6,5 ml Perchlorsäure und 15 ml IPA setzen; in Aluminiumfolie einwickeln.
HINWEIS: Bereiten Sie sich unmittelbar vor der Verwendung vor.
- Für die Chloramin-Arbeitslösung 2,4 g Natriumacetat, 1 g Zitronensäure und 0,68 g Natriumhydroxid in 24 ml destilliertem Wasser auflösen und 240 l Eisessig, 10 l Toluol und 6 ml IPA hinzufügen.
- Bereiten Sie Papain-Lösung für die Probenverdauung.
- Fügen Sie 1 ml Papainlösung zu 10 mg lyophilisiertem Gewebe in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr hinzu und wirbeln Sie das Rohr, um die Probe besser zu verdauen.
- Legen Sie das 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr in ein Gummiregal und verdauen Sie die Proben in einem 500 ml Becher, der 300 ml Wasser bei 60 °C für 16 h enthält.
- Zentrifugieren Sie bei 9.500 x g für 20 min, sammeln Sie den Überstand und übertragen Sie ihn in ein neues Rohr.
- Quantifizieren Sie die Rest-DNA und die wichtigsten Proteine im dezellularisierten Gewebe.
- Laden Sie 1 L der verdauten Probe in das Spektrometer und messen Sie die Menge an dsDNA gemäß den Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Der Experimentator sollte sein Haar zurückbinden und eine Maske tragen, um eine Kontamination der Probe zu vermeiden.
- Laden Sie 1 L der verdauten Probe in das Spektrometer und messen Sie die Menge an dsDNA gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Führen Sie einen DMMB-Test durch, um die Menge an GAGs zu quantifizieren, die im dezellularisierten Gewebe verbleibt.
- Mischen Sie 1 L Chondroitinsulfat A-Lösung und 499 l 1x PBS, um Standards zu bilden. Die Chondroitinsulfat-Lösung Eine Lösung mit destilliertem Wasser in Konzentrationen von 0, 4, 8, 12, 16 und 20 g/ml verdünnen.
- Last-Triplicate von 50 l jeder Konzentration des Standards und verdauen Proben in eine 96-Well-Platte.
- Fügen Sie mit einer Mehrkanalpipette 200 L des DMMB-Farbstoffs zu jedem Brunnen hinzu.
- Lesen Sie sofort die Absorption bei 525 nm auf einem Mikroplattenleser.
- Führen Sie einen Hydroxyprolin-Assay durch, um die Kollagenmenge zu quantifizieren.
- Um einen Hydroxyprolin-Assay durchzuführen, inkubieren Sie 250 l der verdauten Probe mit gleichen HCl-Volumen bei 120 °C für 16 h.
- Trocknen Sie die Rückstände bei Raumtemperatur für 3 h, um die Proben zu kühlen und lösen Sie die Proben dann in 1 ml 1x PBS wieder auf.
- Zentrifuge bei 2.400 x g für 10 min bei 4 °C.
- Bereiten Sie standardmäßig eine 100-g/ml-Hydroxyprolinlösung vor.
- Hydroxyprolinlösung mit destilliertem Wasser in einer Konzentration von 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 g/ml für eine Standardlösung verdünnen.
- Last-Triplicate von 50 l Proben und Standardlösung in eine 96-Well-Platte.
- Fügen Sie 50 l Chloramin-T-Lösung hinzu und inkubieren Sie dann 20 min bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie 50 l p-DAB-Lösung hinzu und brüten Sie 30 min bei 60 °C.
HINWEIS: Aliquot in einem dunklen Raum. Nach der Zugabe die Platte mit Aluminiumfolie umwickeln. - Bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
- Messen Sie nach dem Abkühlen die Absorption bei 540 nm auf einem Mikroplattenleser.
3. Bioink-Präparation
HINWEIS: pdECM-Pulver kann mindestens ein Jahr lang stabil bei -80 °C gelagert werden. Vor der pH-Einstellung kann die verdaute pdECM-Lösung einen Monat lang bei -20 °C gelagert werden. Vor der Verwendung die Probe der gefrorenen pdECM-Lösung über Nacht bei 4 °C auftauen. Die pH-angepasste pdECM-Lösung kann bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden. Die verdaute pdECM-Lösung kann mindestens ein paar Tage bei 4 °C gelagert werden, sollte aber 1 Woche nicht überschreiten.
- Das gefriergetrocknete pdECM mit Pepsin verdauen.
- Zur effektiven Verdauung von Bioink pulverisieren Sie das lyophilisierte pdECM mit flüssigem Stickstoff mit einem Mörtel und Stößel.
- Sammeln Sie 200 mg des pdECM-Pulvers in der 50 ml konischen Röhre und fügen Sie 20 mg Pepsin und 8,4 ml der 0,5 M Essigsäure (Endkonzentration beträgt 2 w/v%).
- Den magnetischen Rührstab in das 50 ml kegelförmige Rohr legen und bei 300 U/min 96 h rühren.
- Stellen Sie den pH-Wert der verdauten pdECM-Lösung ein.
HINWEIS: Um eine Gelation vor der pH-Einstellung zu vermeiden, sollte dieser Prozess auf Eis durchgeführt werden.- Filtern Sie die unverdauten Partikel in der pdECM-Lösung mit einem 40-m-Zellsieb mit einer positiven Verdrängungspipette auf Eis heraus, um die optimale Verdauung der Teile zu erhalten.
- Fügen Sie 1 ml der 10x PBS und Wirbel vor der Verwendung von NaOH.
- Stellen Sie den pH-Wert auf 7 ein, wobei 10 M NaOH den pH-Wert mit pH-Indikatorstreifen überprüft.
HINWEIS: Wirbel jedes Mal, wenn NaOH hinzugefügt wird, so dass der Bioink gründlich mit den anderen Reagenzien gemischt wird.
4. Rheologische Analyse
- Experimentelle Einrichtung
- Bereiten Sie die 1,5% (w/v) von pdECM bioink vor, um die rheologischen Eigenschaften zu bewerten.
- Richten Sie im ratengesteuerten Modus eines Rheometers eine 20 mm Kegelplattengeometrie (Kegeldurchmesser von 20 mm mit einem Winkel von 2°) ein.
- Erstellen Sie experimentelle Sequenzen in der installierten Software (TRIOS), um die Viskosität, Gelationskinetik und den dynamischen Modul des pdECM-Bioinks zu messen.
- Viskosität: Legen Sie den pdECM-Bioink auf die Platte. Messen Sie die komplexe Viskosität (Pas) von pdECM bioink unter einer steigenden Scherrate von 1 bis 1.000 s-1 bei einer konstanten Temperatur von 15 °C.
- Gelationskinetik: Legen Sie den pdECM-Bioink auf die Platte. Berechnen Sie den komplexen Modul (G*), indem Sie den Speicher- und Verlustmodul von pdECM-Bioink bei 4-37 °C mit einer inkrementellen Steigerungsrate von 5 °C/min (Time-Sweep-Modus) messen.
- Dynamischer Modul: Legen Sie den pdECM-Bioink vor der Messung 60 min bei 37 °C auf die Platte. Messen Sie den frequenzabhängigen Speichermodul (G') und den Verlustmodul (G'') des pdECM-Bioinks im Bereich von 0,1-100 rad/s bei 2% Dehnung.
5. 3D-Zelldruck von Pankreasgewebekonstrukten mit einer Islet
- Vorbereitung isolierter Inselchen
- Isolieren Sie primäre Inselchen von einer Ratte gemäß den Protokollen, die in einem früheren Werk beschrieben wurden5.
- Um Trümmer und abgestorbene Zellen von der isolierten Zelle zu trennen, passieren Sie die Zellsuspension durch ein 70 m zelleigenes Sieb. Insellets mit einem Durchmesser von weniger als 70 m gelten als tot oder abnormal.
- Die isolierten Inselchen in RPMI-1640 medium aussetzen und auf die Petrischale legen. Entfernen Sie Mit einer P200-Volumenpipette unter dem Mikroskop (4x Objektivlinse) im Biosicherheitsschrank Inselchen mit einem Durchmesser von mehr als 300 m.
- Islet-Verkapselung in pdECM-Bioink
- Bereiten Sie pH-angepasste pdECM-Bioink und isolierte Islet vor.
HINWEIS: Um eine Gelation vor der pH-Anpassung zu vermeiden, sollte dieser Prozess auf Eis durchgeführt werden. - Mischen Sie den pdECM-Bioink und die mit Inselchen (Verhältnis 3:1) aufgehängten Medien vorsichtig mit einer positiven Verdrängungspipette, bis sie gleichmäßig vermischt ist.
HINWEIS: Die Endkonzentration des pdECM-Bioinks beträgt 1,5% und die Zelldichte im pdECM-Bioink 3.000 IEQ/ml.
- Bereiten Sie pH-angepasste pdECM-Bioink und isolierte Islet vor.
- 3D-Zelldruck von Pankreasgewebekonstrukten
- Bereiten Sie eine sterilisierte Spritze und 22 G Düse vor.
HINWEIS: Dieses Messgerät wurde für den Druck von Inselchen mit einem Durchmesser von 100-250 m ausgewählt. - Mit der Islet beladenen pdECM-Bioink in die Spritze einladen.
- Drucken Sie den Bioink mit dem optimierten Druckzustand (Vorschubleistung: 150 mm/min; pneumatischer Druck: 15 kPa) bei 18 °C in Form eines Gitters.
- Um den Bioink zu vernetzen, legen Sie das gedruckte Konstrukt 30 min im Inkubator auf.
- Tauchen Sie das gedruckte Konstrukt in die Isletkulturmedien ein, die RPMI-1640 Medium sind, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin.
- Bereiten Sie eine sterilisierte Spritze und 22 G Düse vor.
6. 3D-Zelldruck von Bauchspeicheldrüsenkonstrukt mit gemusterter Struktur
- Herstellung von zwei Arten des Bioinks
- Um die Druckvielfalt mit mehreren Bioinks zu validieren, bereiten Sie zwei Sätze von pdECM-Biotinten vor und färben Sie sie, indem Sie jedem pdECM-Bioink 0,4% Trypan Blue und Rose Bengal Lösung im Verhältnis 1:20 hinzufügen.
HINWEIS: Um eine Gelation vor der pH-Anpassung zu vermeiden, sollte dieser Prozess auf Eis durchgeführt werden. - Mischen Sie den pdECM-Bioink und die mit Inselchen (Verhältnis 3:1) aufgehängten Medien vorsichtig mit einer positiven Verdrängungspipette, bis sie gleichmäßig vermischt ist.
HINWEIS: Die Endkonzentration des pdECM-Bioinks beträgt 1,5% und die Zelldichte im pdECM-Bioink 3.000 IEQ/ml.
- Um die Druckvielfalt mit mehreren Bioinks zu validieren, bereiten Sie zwei Sätze von pdECM-Biotinten vor und färben Sie sie, indem Sie jedem pdECM-Bioink 0,4% Trypan Blue und Rose Bengal Lösung im Verhältnis 1:20 hinzufügen.
- 3D-Zelldruck von multimaterialbasierten Pankreasgewebekonstrukten
- Bereiten Sie sterilisierte Spritzen und eine 25 G Düse vor.
- Jeder Bioink (blau und rot) in zwei verschiedene Spritzen geben.
- Drucken Sie den Biok mit optimiertem Druckzustand (Vorschubleistung: 150 mm/min; pneumatischer Druck: 15 kPa) bei 18 °C in Form eines Gitters mit abwechselnden Linien von blau und rot.
- Um den Bioink zu vernetzen, legen Sie das gedruckte Konstrukt 30 min im Inkubator auf.
- Tauchen Sie das gedruckte Konstrukt in Islet Kulturmedien ein, die RPMI-1640 Medium mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin ergänzt sind.
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Representative Results
Dezellularisierung von Bauchspeicheldrüsengewebe
Wir haben das Verfahren zur Herstellung von pdECM-Bioink entwickelt, um pankreasgewebespezifische Mikroumgebungen zur Verbesserung der Funktionalität von Inselchen in einem 3D-Biodruckgewebekonstrukt bereitzustellen (Abbildung 2A). Nach dem Dezellularisierungsprozess wurden 97,3 % der dsDNA entfernt und repräsentative ECM-Komponenten wie Kollagen und GAGs blieben bei 1278,1% bzw. 96,9% im Vergleich zu dem nativen Bauchspeicheldrüsengewebe (Abbildung 2B).
Bioink-Zubereitung
Um das pdECM im Druckprozess anzuwenden, wurde das pdECM-Pulver in schwacher Säure mit Pepsin löslich und mit 10 M NaOH-Lösung neutralisiert. Die verdaute pdECM-Lösung könnte dann durch Mischen mit einem Zellkulturmedium oder 1x PBS verdünnt werden. In dieser Studie haben wir pdECM bioink mit einer Endkonzentration von 1,5% für weitere Studien vorbereitet. Der pdECM-Bioink hielt eine Lösungsphase bei, wenn er unter Raumtemperatur gestellt und nach der Inkubation bei 37 °C für 30 min sofort in eine Gelphase umgewandelt wurde. Um die Wirkung des pdECM-Bioinks auf Inselchen zu untersuchen, wurden isolierte Inselchen in den pdECM-, Alginat- und Kollagenbioinks mit einer Konzentration von 1,5% eingekapselt. Das Ergebnis des glukosestimulierten Insulinsekretionstests zeigte, dass Inselchen im pdECM-Bioink den höchsten Index (ca. 3.174) unter den Versuchsgruppen darstellten, was auf eine höhere Funktionalität als die weit verbreiteten Hydrogele für die Inselverkapselung5hindeutet.
Rheologische Analyse
Viskosität ist eine der kritischen Eigenschaften bei der Betrachtung eines bedruckbaren Biomaterials. Wir haben die Viskosität des pdECM-Bioinks mit einer Frequenz von 1 bis 1.000 Hz bei 15 °C für den Druck verschiedener dECM-Bioinks6,7,8gemessen. Der pdECM-Bioink zeigte ein scherendes Verdünnungsverhalten und der Wert betrug etwa 10 Pa s bei der Scherrate von 1/s, was darauf hindeutet, dass der pdECM-Bioink geeignete rheologische Eigenschaften für die Extrusion durch eine Düse hatte (Abbildung 3A). Die Gelationskinetik bei einer Temperatur von 4 bis 37 °C zeigte das Gelationsverhalten des pdECM-Bioinks bei physiologisch relevanten Temperaturen an. Der komplexe Modul begann zu steigen, als die Temperatur 15 °C erreichte, und er stieg schnell an, wenn die Temperatur bei 37 °C gehalten wurde, was auf den Sol-Gel-Übergang des pdECM-Bioinks hindeutet (Abbildung 3B). Die dynamischen G' und G" von pdECM bioink wurden bei physiologisch relevanten Temperaturen untersucht, um ihre Stabilität nach dem Druckprozess zu gewährleisten, was zu einem stabilen Modul unter der Frequenz-Sweep-Bedingung führte (Abbildung 3C).
3D-Zelldruck
3D-Zell-beladene Pankreasgewebekonstrukte wurden mit Hilfe eines Mikroextrusions-basierten Druckverfahrens hergestellt. Um ein Konstrukt mit mindestens 3.000 Islet-Äquivalenten (IEQ) zu bauen, das dem Gewebevolumen einer perfekt kugelförmigen Islet mit einem Durchmesser von 150 'm9entspricht, haben wir das Konstrukt mit einer Dimension von 10 mm x 10 mm x 3 mm entworfen(Abbildung 4A). Die Prozessparameter und Bedingungen für den Druck von Pankreasinseln wurden ausgewählt, um Inselchen zu kapseln, bei denen es sich um große Zellhaufen im Durchmesser von 100-250 m handelt(Abbildung 4B). Mit Hilfe eines Mehrkopfdrucksystems wurden verschiedene Arten von 3D-Konstrukten - wie die Form des Gitters mit alternativen Linien von blau und rot - mit dem entwickelten pdECM (Abbildung 4C) hergestellt, was auf die Vielseitigkeit von pdECM für den Zweck des 3D-Bioprintings hinweist, um zwei oder mehr Arten von lebenden Zellen in einer gewebeähnlichen Anordnung zu harmonisieren.
Abbildung 1: Schematische Entwicklung von dezellularisiertem Bauchspeicheldrüsengewebe, Bewertung der pdECM-Bioink und Herstellung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder des Dezellularisierungsprozesses und der biochemischen Charakterisierung von pdECM. (A) Überblick über die Dezellularisierung des Pankreasgewebes. (B) Ergebnisse biochemischer Assays von nativem Gewebe und pdECM. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Copyright (2019) The Royal Society of Chemistry5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Rheologische Analyse von pdECM-Bioink. (A) Viskosität von pdECM- und Kollagenbioinks, die ein Scherverdünnungsverhalten aufwiesen. (B) Gelationskinetik von pdECM und Kollagenbioinks während der Temperaturänderung. (C) Der komplexe Modul der vernetzten pdECM und Kollagen-Bioinks. Copyright (2019) der Royal Society of Chemistry5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: 3D-Zelldruck von zellbeladenem pdECM-Bioink für 3D-Pankreasgewebekonstrukte. (A) Die Abmessungen von 3D-Pankreasgewebekonstrukten. (B) Pankreas-Islet-beladene und (C) multimaterialbasierte 3D-Pankreasgewebekonstrukte. Copyright (2019) der Royal Society of Chemistry5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschrieb die Entwicklung von pdECM-Bioinks und die Herstellung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten unter Verwendung von 3D-Zelldrucktechniken. Um die Mikroumgebung des Zielgewebes im 3D-Technischen Gewebekonstrukt zu rekapitulieren, ist die Wahl des Bioinks entscheidend. In einer früheren Studie haben wir validiert, dass gewebespezifische dECM-Bioinks vorteilhaft sind, um die Stammzelldifferenzierung und Proliferation zu fördern10. Im Vergleich zu synthetischen Polymeren kann dECM aufgrund der gewebespezifischen Zusammensetzung und Architektur als zellgünstige Umgebung dienen11. Daher sollte der Dezellularisierungsprozess ernsthaft für die hohe Retention wichtiger Komponenten im dECM in Betracht gezogen werden.
Die Auswahl verschiedener Waschmittel zur Dezellularisierung des Bauchspeicheldrüsengewebes variiert den verbleibenden ECM-Bestandteil12. Im Prozess der Dezellularisierung bemerkten wir, dass die Verwendung von Natriumdodecylsulfat (SDS) den Verlust der ECM-Proteine beeinflussen kann13. So haben wir unser vorheriges Protokoll geändert, indem wir den Schritt zur Behandlung von SDS-Lösung eliminiert haben, einem ionischen Tensid, das in vielen Reinigungs- und Dezellularisierungsprozessen mit relativ harten Eigenschaften im Vergleich zu anderen wie Trion-X 100 oder 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethyl-lammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS) verwendet wird. In diesem Protokoll verwendeten wir 1% Triton-X 100 Lösung für 84 h anstelle von SDS-Lösung, die in der Lage war, die zellulären Komponenten effektiv zu entfernen, während GAGs und kollagene Proteine zu erhalten. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Entfernung von Restlipiden durch Behandlung mit IPA auch ein sehr entscheidender Prozess für die Induktion der Vernetzung von pdECM-Bioink ist und im gleichen Kontext wie ein zuvor veröffentlichter Artikel4verstanden werden kann. Die Behandlung mit Peressigsäurelösung wurde auch für die Sterilisation von dezellularisiertem Gewebe angewendet. Darüber hinaus ist die Entfernung der verbleibenden Waschmittel und Chemikalien im dezellularisierten Gewebe ein entscheidender Schritt, um die entzündungshemmende Wirtsreaktion zu verhindern. Wir haben dieses Problem jedoch in diesem Protokoll nicht erörtert. Protokolle, die einen Desinfektionsprozess am Ende der Dezellularisierung beinhalten, verbessern die Biokompatibilität des dezellularisierten Materials. Darüber hinaus sollten Standards für Bewertungskriterien in Betracht gezogen werden, um sicherzustellen, dass Detergenzien und Chemikalien vollständig entfernt werden.
Die Verdauung von pdECM-Bioink mit Pepsin wurde durchgeführt, um die homogene Mischung von pdECM-Pulver in der sauren Lösung durch Spaltung der Telopeptidregion im Kollagenprotein zu erreichen. Bei der pH-Anpassung ist es entscheidend, den pdECM-Bioink auf Eis zu halten. Danach können wir physikalisch vernetzbare pdECM-Vorgel-Bioinks herstellen, die durch Inkubation bei 37 °C in einen Gelzustand gelangen können, was einer der Hauptvorteile von dECM-basierten Bioinks ist. Die Auswahl der richtigen Konzentration des pdECM-Bioinks ist ebenfalls wichtig10. Ein idealer Bioink sollte Zellen vor äußeren Schäden schützen, die während des Druckprozesses auftreten, wie z. B. pneumatischer Druck und Temperaturwechsel. Es ist bekannt, dass die aufgebrachte Scherkraft Schäden an den Zellen verursachen und die Zelllebensfähigkeit in den gedruckten Konstrukten10reduzieren kann. Auch, Erhöhung der Konzentrationen von Bioink könnte Zelltod induzieren5. Im Gegensatz dazu führen niedrige Konzentrationen von Bioink zu einer niedrigen Viskosität, was eine schlechte Bedruckbarkeit und Formtreue beim Drucken bedeutet. Es ist notwendig, die Viskosität von Bioink zu überprüfen und seine Konzentration zu optimieren.
Derzeit untersuchen Forscher aktiv die Entwicklung verschiedener Arten von Gewebe-abgeleiteten Bioinks für den Druck von 3D-Gewebekonstrukten14,15,16. Die Ergebnisse dieser Studien deuten darauf hin, dass die Bioink gewebespezifische Mikroumgebungen für Zellen liefern könnte. Diese einzigartigen Bedingungen können die Differenzierung oder Reifung von Stammzellen und die Proliferation von Zellen fördern. Darüber hinaus ermöglicht der Einsatz des mit mehreren Kopf ausgestatteten 3D-Zelldrucksystems das gleichzeitige Drucken mehrerer Bioinkstypen mit hoher Präzision. Mit dieser Technik kann eine Struktur mit einem bestimmten Muster hergestellt werden, die Design-Vielseitigkeit zeigt. Darüber hinaus ist es möglich, verschiedene Arten von Zellen in jedem Bioink zu kapseln, um die native Zellanordnung nachzuahmen17. Diese gemusterten Strukturen können bei der Induktion von Vaskularisation oder Co-Kultur-Effekt durch die Verbesserung der Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen, die Schlüsselfaktoren für das langfristige Überleben bestimmter Zellen18,19sein können.
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Disclosures
nichts.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch das Bio & Medical Technology Development Program der National Research Foundation (NRF) unterstützt, das von der koreanischen Regierung (MSIT) (2017M3A9C6032067) und dem "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) gefördert wurde. iITP (Institute for Information & Communications Technology Planning & Evaluation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
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